Summary
이 기사는 여성 생식 조직에 대한 연구를 확장하기 위해 생쥐의 자궁경부, 직장 및 방광을 포함한 자궁천골 인대 및 기타 골반저 조직을 해부하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
골반 장기 탈출증(POP)은 골반저의 무결성, 구조 및 기계적 지지에 영향을 미치는 상태입니다. 골반저의 장기는 근육, 인대 및 골반 근막을 포함한 다양한 해부학적 구조에 의해 지지됩니다. 자궁천골 인대(uterosacral ligament, USL)는 하중을 지탱하는 중요한 구조이며, USL의 손상은 POP 발병 위험을 높입니다. 현재 프로토콜은 라만 분광법을 사용한 USL 생화학적 구성 및 기능에 대한 고유한 데이터 수집 및 기계적 거동 평가와 함께 쥐 USL 및 골반저 장기의 해부에 대해 설명합니다. 마우스는 전임상 연구를 위한 매우 중요한 모델이지만, 쥐 USL을 해부하는 것은 어렵고 복잡한 과정입니다. 이 절차는 USL을 포함한 쥐 골반저 조직의 해부를 안내하여 여러 평가 및 특성화를 가능하게 하는 접근 방식을 제시합니다. 이 작업은 기초 과학자와 엔지니어가 골반저 조직의 해부를 지원하여 USL 및 골반저 상태에 대한 연구와 마우스 모델을 사용한 여성 건강에 대한 전임상 연구의 접근성을 확대하는 것을 목표로 합니다.
Introduction
여성의 약 50%가 골반 장기 탈출증(POP)의 영향을 받습니다1,2. 이 여성의 약 11%는 성공률이 낮은 외과적 치료를 받기 위한 기준에 부합합니다(~30%)3,4. POP는 USL과 골반저 근육이 적절한 지지력을 제공하지 못하여 골반 장기(방광, 자궁, 자궁경부, 직장)의 일부 또는 전부가 자연적인 위치에서 하강하는 것을 특징으로 한다5. 이 상태는 해부학 적 기능 장애와 결합 조직의 파괴, 신경근 손상뿐만 아니라 predisposing 요인 3,6을 포함합니다. POP는 연령, 체중, 출산 및 분만 유형(예: 질 분만 또는 제왕절개)과 같은 여러 요인과 관련이 있습니다. 이러한 요인은 모든 골반저 조직의 기계적 무결성에 영향을 미치는 것으로 생각되며, 임신과 출산율이 POP 5,7,8의 주요 동인으로 생각됩니다.
자궁천골 인대(uterosacral ligaments, USL)는 자궁, 자궁경부, 질을 지지하는 중요한 구조이며, 자궁경부를 천골에 묶어 준다4. USL이 손상되면 여성은 POP 발병 위험이 높아집니다. 임신과 출산은 USL에 추가적인 부담을 주어 잠재적으로 부상을 유발하고 POP의 가능성을 높이는 것으로 믿어집니다. USL은 평활근 세포, 혈관 및 림프관이 인대를 따라 이질적으로 분포되어 있는 복합 조직으로, 경추, 중간, 천골 부위의 세 부분으로 나눌 수 있다9. USL의 기계적 무결성은 콜라겐, 엘라스틴 및 프로테오글리칸과 같은 세포외 기질(ECM) 성분에서 파생됩니다 5,9,10. 유형 I 콜라겐 섬유는 인대 조직의 주요 하중 지지 인장 성분으로 알려져 있으므로 USL 실패 및 POP11에 관여할 가능성이 높습니다.
여성에서 POP의 원인, 유병률 및 영향에 대한 지식이 부족합니다. 여성의 골반저에 대한 이해를 높이기 위해서는 적절한 POP 동물 모델의 개발이 필요합니다. 생쥐와 인간은 골반 내에서 요관, 직장, 방광, 난소, 원형 인대9와 같은 유사한 해부학적 랜드마크를 가지고 있을 뿐만 아니라 자궁, 자궁경부, 천골과 USL의 유사한 교차점을 가지고 있다. 또한, 마우스는 유전자 조작이 용이하며 POP9 연구를 위해 쉽게 접근할 수 있고 비용 효율적인 모델이 될 가능성이 있습니다.
이 연구는 미산(즉, 임신한 적이 없는) 마우스에서 USL과 다양한 골반저 조직에 접근하고 분리하는 방법을 개발했습니다. 추출된 USL은 효소 분해(즉, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸 제거)를 거쳤고, 인장 하중 하에서 기계적 반응을 결정하기 위해 테스트했으며, 개념 증명 연구에서 생화학적 구성에 대해 평가했습니다. 온전한 조직을 분리하는 능력은 골반저 구성 요소의 기계적 및 생화학적 특성화를 용이하게 하며, 이는 출산, 임신 및 POP와 관련된 부상 위험에 대한 이해를 향상시키는 중요한 첫 번째 단계입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 실험 및 절차는 콜로라도 볼더 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜 #2705에 따라 수행되었습니다. 6주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 본 연구에 사용하였다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조).
1. 동물 준비
- 제도적으로 승인된 방법에 따라 동물을 안락사시킵니다.
참고: 본 연구는 성공적인 안락사를 보장하기 위해 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)의 지침(분당 CO2로 챔버 부피의 30% 내지 70%의 변위율)에 따라 CO2 흡입을 사용한 후 자궁경부 탈구를 사용했습니다.- 가능하면 쥐 알레르겐의 확산을 최소화하기 위해 후드 아래에서 작업하십시오. 마우스가 움직이고 호흡을 멈추면 2분 이상 기다렸다가 반응이 없는지 확인합니다.
참고: 마우스가 임신 중이거나 산후인 경우 새끼를 개별적으로 안락사시켜야 합니다. E15.5 이상의 새끼는 해부 중에 참수해야 합니다.
- 가능하면 쥐 알레르겐의 확산을 최소화하기 위해 후드 아래에서 작업하십시오. 마우스가 움직이고 호흡을 멈추면 2분 이상 기다렸다가 반응이 없는지 확인합니다.
- 해부 패드, 11날 메스, 구부러진 얇은 날카로운 가위, 두 쌍의 집게, 구부러진 집게, 5-0 폴리글락틴 봉합사, 해부 현미경 및 6개의 핀으로 해부 설정을 준비합니다(그림 1, 재료 표 참조).
- 마우스를 패드에 놓고 앞다리를 아래로 고정합니다(그림 2A). 가위로 복부에 약 1-1.5cm를 절개하십시오 (그림 2B). 가위를 사용하여 절개 부위의 두개골, 꼬리 및 측면 피부를 부드럽게 분리합니다(그림 2C, D).
- 마우스를 등쪽으로 뒤집고 피부를 뒷다리 쪽으로 부드럽게 벗겨내어 해부 부위에서 피부를 제거합니다(그림 2E-H).
- 마우스를 팔다리에 고정하고(그림 2I) 흉부에서 골반까지 복부에 약 1cm를 절개합니다(그림 2J).
알림: 기본 장기가 손상되지 않도록 하십시오. - 장기를 흉부 쪽으로 부드럽게 밀어 시야를 확보합니다(그림 2K).
알림: 수분 공급을 유지하기 위해 1x PBS로 조직을 관개합니다. - 골반저에서 모든 지방 조직을 제거합니다(그림 2L-N).
알림: 집게를 사용하여 관심 있는 장기와 조직에서 지방을 부드럽게 잡아당기고 제거합니다.
그림 1: 해부를 수행하는 데 필요한 모든 도구가 있는 깨끗한 작업 공간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 마우스의 피부 제거 및 골반 및 흉강 개방. (A) 모든 팔다리를 고정합니다. (B) 초기 절개. (C) 가위를 사용하여 밑에 있는 근막에서 피부를 분리합니다. (D) 피부 절단 및 제거 준비. (예) 마우스 주위를 돌아다니며 피부를 떼어냅니다. (H) 등쪽에서 피부를 완전히 제거합니다. (I) 몸통에서 피부를 완전히 제거하고 마우스 사지를 다시 고정합니다. (J) 복부의 개방. (K) 열린 복부의 모습. (L) 장기를 시야 밖으로 이동. (M) 지방을 제거한다. (N) 깨끗해진 골반저의 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. USL 수확
- 난소에서 자궁 뿔을 잘라내고(그림 3B), 시야에서 떼어내고, 자궁경부 연결부에서 잘라냅니다(그림 3C).
알림: 자궁 뿔은 그림 3A의 회로도에 따라 식별할 수 있습니다. 수분을 유지하기 위해 1x PBS로 조직을 관개하십시오. - 방광 연결부에서 요관을 잘라냅니다(그림 3D).
참고: 이는 USL과의 혼동을 피하기 위한 것입니다. - 결장을 자궁경부에 최대한 가깝게 자릅니다(그림 3E,F).
알림: 수분 공급을 유지하기 위해 1x PBS로 조직을 관개합니다. - 해부 범위 아래에 해부 패드와 함께 마우스를 놓아 USL을 시각화합니다(그림 3G).
- 집게를 사용하여 USL에서 주변 지방을 부드럽게 청소합니다.
참고: 두 번째 집게를 사용하여 자궁경부를 작은 각도로 들어 올려 USL이 자궁경부와 교차하는 위치의 시각화를 향상시킵니다. 수분을 유지하기 위해 1x PBS로 조직을 관개하십시오. - 두 USL의 자궁경부 말단 주위에 5-0 폴리글락틴 봉합사를 묶습니다(그림 4B, C).
참고: USL은 회로도 및 배율 이미지를 사용하여 식별할 수 있습니다(그림 4I-K) - 이 연구에서는 하나의 USL이 형태학적 또는 생화학적 분석(즉, 라만 현미경, 면역조직화학, 조직학)에 사용됩니다. 자궁경부 일부를 부착한 채로 USL의 자궁경부 끝을 절단하고 USL의 바닥에서 근육 조각을 절단합니다(그림 4D). 해부된 조직을 1x PBS가 있는 수조에 넣어 조직을 수화된 상태로 유지한다(도 4G, H).
- 나머지 USL은 기계적 테스트 및 이미징에 사용합니다. 기계적 설정을 용이하게 하기 위해 자궁경부 조각을 부착한 채로 USL의 자궁경부 끝을 절단합니다(그림 4D).
참고: 경추 조직은 기계적 테스트 중에 USL을 고정하는 앵커 역할을 합니다. - 관심 있는 모든 조직을 채취한 후(3-5단계) 골반에서 대퇴골을 탈구합니다(그림 4E).
참고: 대퇴골두가 비구 컵에서 분리될 때 희미한 딸깍 소리가 들려야 합니다. - 골반 뼈의 원위 및 근위 끝에서 골반 뼈를 잘라내어 약 10mm의 전체 조직을 남깁니다(그림 4F). 해부된 조직을 1x PBS에 넣습니다.
그림 3: USL 해부를 위해 치워진 골반저 . (A) 해부학의 개략도. (B) 난소 연결부에서 자궁 뿔을 절단합니다. (C) 자궁 뿔 절단. (D) 요관 절단. (E) 결장 절단. (F) 직장 및 USL의 명확한 시야. (G) 마우스와 해부 패드를 해부 범위 아래에 놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: USL과 주변 조직 및 USL의 해부. (A) USL을 둘러싼 해부학적 랜드마크의 개략도. (B) 자궁 경부 주위에 봉합사를 묶습니다. (C) USL의 경추 끝을 잘라냅니다. (D) 천골 연결부에서 생화학적 분석에 사용할 USL을 잘라냅니다. (E) 골반 뼈에서 대퇴골 절단. (F) 골반의 근위 끝을 잘라냅니다. (G) 35mm 페트리 접시에서 USL을 해부합니다. (H) 35mm 페트리 접시에 골반이 부착된 USL. (I) 0.75x 배율의 USL 및 직장. (J) USL에서 지방 제거. (K) 1.0x 배율에서 USL 세척. 스케일 바 = 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 방광 채취
- 지방이 제거된 후 집게로 방광을 잡고 약 40° 각도로 부드럽게 들어 올립니다(그림 5A).
- 가위로 자궁경부 바로 위의 말단부에서 방광을 잘라냅니다(그림 5B).
- 조직을 1x PBS가 있는 욕조에 넣어 조직을 수화 상태로 유지합니다(그림 5H).
4. 직장 적출
- USL이 자궁경부에서 분리되고 방광이 해부되면 집게로 자궁경부를 약 40° 각도로 들어 올립니다. 직장과 자궁 경부를 연결하는 직장질 근막이 있습니다. 메스로 이 연결부를 부드럽게 자릅니다(그림 5C, D).
- 가위를 사용하여 치골 symphysis에서 치골을 자릅니다. 작업 공간을 부드럽게 넓혀 조직 삽입물에 대한 시각적 접근성을 높입니다.
- 집게로 직장을 흉부 쪽으로 부드럽게 당기고 가위를 사용하여 직장을 뒤쪽에서 항문까지 따라갑니다. 항문에서 직장을 자릅니다 (그림 5E).
- 조직을 1x PBS에 넣어 조직을 수화 상태로 유지한다(도 5I).
5. 자궁경부-질 복합 수확
- 자궁경부에서 USL을 제거한 후 집게를 사용하여 자궁경부를 고정합니다. 가위를 사용하여 자궁 경부를 가능한 한 외음부에 가깝게 자릅니다 (그림 5F, G).
참고: 질의 말단부를 시각적으로 볼 수 있도록 치골 결합을 절단해야 합니다. - 조직을 1x PBS에 넣어 조직을 수화된 상태로 유지한다(도 5J).
그림 5: 방광, 직장 및 자궁경부/질 박리. (A) 방광을 비스듬히 잡습니다. (B) 방광을 절단합니다. (C) 자궁 경부와 직장을 연결하는 힘줄을 절단합니다. (D) 1.0x 배율의 힘줄. (E) 직장 절단. (F) 집게로 자궁 경부를 잡습니다. (G) 질의 말단부 절단. (H) 35mm 페트리 접시의 방광. (I) 35mm 페트리 접시의 직장. (J) 35mm 페트리 접시에 담긴 자궁경부-질 조직 복합체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 조직 특성 분석을 위한 시료 전처리
- USL의 기계적 및 시각적 분석
- 골반 부착물이 있는 USL을 맞춤형 염색 웰 내의 T자형 벽 위에 놓아 염색 용액에 완전히 잠길 수 있도록 합니다(웰의 CAD 도면은 보충 코딩 파일 1 및 보충 코딩 파일 2).
알림: 배치를 돕기 위해 봉합사와 집게를 사용하십시오. - 유리 아민기를 염색하는 시판되는 염료(5 μL, 재료 표 참조)를 1x PBS 2.5mL에 희석하고, 용액을 맞춤형 염색 웰에 추가하고, 4°C에서 로커에서 2시간 동안 조직을 염색합니다.
알림: 용액을 염색 웰에 추가하기 전에 소용돌이칩니다. - 염색의 마지막 15분 동안 시중에서 판매되는 죽은 세포 핵 염색( 재료 표 참조) 2.5μL를 용액에 추가합니다.
알림: 염색 웰에 추가하기 전에 용액을 소용돌이칩니다.
- 골반 부착물이 있는 USL을 맞춤형 염색 웰 내의 T자형 벽 위에 놓아 염색 용액에 완전히 잠길 수 있도록 합니다(웰의 CAD 도면은 보충 코딩 파일 1 및 보충 코딩 파일 2).
- USL의 라만 분석
- 맞춤형 웰에 포함된 폴리디메틸실록산(PDMS) 블록에 USL을 직선으로 고정합니다.
참고: PDMS는 원하는 구성으로 샘플을 고정할 수 있는 소프트 기판으로 사용됩니다. 다양한 치수의 블록은 제조업체의 지침( 재료 표 참조)에 따라 두 구성 요소를 혼합하고, 페트리 접시에서 주조하고, 중합 후 메스 블레이드를 사용하여 PDMS를 필요한 형상으로 절단하여 만들 수 있습니다. - 봉합 루프와 골반 근육에 곤충 핀으로 고정하십시오. 1x PBS로 조직을 수화시킵니다.
- 맞춤형 웰에 포함된 폴리디메틸실록산(PDMS) 블록에 USL을 직선으로 고정합니다.
- 남은 조직
- 원하는 분석에 따라 액체 질소 또는 적절한 포매 화합물로 나머지 조직을 급속 동결합니다.
- 후속 분석(예: 면역조직화학적 또는 생화학적 분석)이 수행될 때까지 조직을 -80°C에서 보관합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
야생형 마우스의 해부의 각 단계는 프로토콜과 관련된 관련 비디오 및 그림에 자세히 설명되어 있습니다. 본 연구에서는 6주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다(보충표 1). 서로 다른 효소로 처리된 USL을 사용한 3개의 샘플 그룹, 즉 대조군(무처리), 콜라게나제 처리 및 콘드로이티나제 처리 그룹을 분석했습니다. USL의 평활근, 신경 및 림프관은 섬유소 콜라겐과 글리코사미노글리칸(GAG)5이 풍부한 ECM으로 둘러싸여 있으며, 이는 조직에 기계적 무결성을 제공하는 것으로 생각됩니다. 효소 처리는 이러한 ECM 구성 요소를 파괴하고 라만 분광법 및 기계적(인장) 테스트를 사용하여 생화학적 및 기계적 차이를 해결할 수 있는 가능성을 입증하기 위해 선택되었습니다.
분해를 위해 모든 USL을 37°C 및 300rpm에서 1mL의 용액에 3시간 동안 열혼합기에 넣었습니다. 대조군 USL은 1x PBS 용액에, 콜라게나제 처리 USL은 1.0 U/mL 콜라게나제 유형 I 용액에, 콘드로이티나제 처리 USL은 2.0 U/mL 콘드로이티나제 ABC 용액에 넣었습니다( 재료 표 참조).
기계적 테스트를 위한 USL은 6.1단계에 따라 준비되었습니다. 샘플은 기계적 테스트 프로토콜12에 대한 맞춤형 로딩 챔버(챔버의 CAD 도면은 보충 코딩 파일 3에서 찾을 수 있음)에 배치되었습니다. 골반은 고정된 구성으로 고정되었고, USL의 경추 말단은 Jimenez et al.12에 기술된 설계를 기반으로 한 부표 액추에이터에 부착되었습니다(그림 6B; Supplementary Coding File 4), 직립 컨포칼 현미경 하에서 100mN 로드셀에 부착하였다(도 6A). 부표 시스템은 힘12를 측정할 때 액추에이터의 암으로 인한 소음을 줄입니다. 약 500 μN의 사전 하중이 USL의 기준 구성을 설정하는 데 사용되었으며, 각 USL은 이 위치에 있는 동안 이미지화되었습니다. 그런 다음 750μm의 전역 변위를 적용하고 5분 동안 유지한 후 다시 이미징했습니다. 그런 다음 USL을 기준 구성으로 되돌려 놓았고, 이 과정을 1,000 μm 전역 변위에 대해 반복했습니다. 응력 완화 곡선을 얻기 위해 세 개의 샘플 그룹(n = 1/그룹) 모두에 대해 이 프로토콜을 따랐고(그림 7), 각 USL이 견뎌낸 피크 및 평형 응력을 측정했습니다(표 1). 응력은 측정된 힘을 평균 단면적으로 나누어 계산하였다(보충표 2 및 보충표 3).
그림 6: 기계적 테스트 설정 . (A) 컨포칼 현미경 아래의 로딩 챔버와 액추에이터에 연결됨. (B) 로딩 챔버의 USL; 골반은 고정되어 있고 자궁 경부 끝은 상호 연결된 부표 시스템에 묶여 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 다양한 효소 처리를 받은 쥐 USL의 거시적 축 응력 완화 플롯. 효소 처리는 평균 축 피크를 감소시키고 USL이 규정된 전역 변위에서 경험하는 응력을 완화하는 것으로 나타났습니다. (*)는 최대 응력 200초 후에 측정된 완화된 응력 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 견본 | 전역 변위 (μm) | 피크 응력(kPa) | 이완된 평형 응력(kPa) |
| 제어 | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| 콜라게나제 처리 | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| 콘드로이티나제 처리 | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
표 1: USL의 스트레스 측정에 대한 효소 처리의 효과.
촬영된 이미지(그림 8)로부터, 변형률 필드는 기준(언로드)과 변형 상태 사이의 인대의 수동 및 자동(MATLAB의 "imregdemons" 기능) 텍스처 추적의 조합을 사용하여 추정되었다13. 수동 추적은 참조 및 변형된 이미지에서 동일한 세포핵을 선택하여 수행되었습니다. Green-Lagrange 변형률 필드는 추정된 변위 필드에서 계산되었습니다(그림 9). 평균 축 방향 변형률 (E11)은 각 시편의 중간 부분에 대해 계산되었습니다 (표 2).
그림 8: 전체 변위 후 대조군(처리되지 않은) 시편의 변형된 상태 및 참조 상태 이미지. (A) 750μm 전역 변위. (B) 1,000 μm 전역 변위. 녹색은 기준 상태를 나타내고 보라색은 변형 상태를 나타냅니다(스케일 바 = 500μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 스트레인 필드 추정. 각 처리 그룹의 샘플에 대해 추정된 변형률 필드는 축(E11), 횡방향(E22) 및 전단(E12) 변형이 공간적으로 불균일하고 적용된 변위(δ)가 증가함에 따라 축 변형률이 증가함을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 전역 변위 (μm) | 제어 | 콜라게나제 처리 | 콘드로이티나제 처리 |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
표 2: 평균 축 변형률. 기계적으로 테스트된 각 표본의 평균 축 변형률은 효소 처리된 샘플의 전체 축 변형률이 대조군 샘플과 유사하거나 더 컸음을 나타내며, 이는 거시적 응력의 감소가 더 작은 균주가 아닌 효소 처리로 인한 것임을 시사합니다.
공초점 라만 분광법(785nm 레이저, 1.06μm 스폿 크기)은 조직 생화학을 반정량적으로 평가하기 위해 O'Brien et al.14에 따라 6.2단계에 설명된 대로 제조된 USL에 대해 수행되었습니다. 우주선을 식별하고 제거하고, 선형 기준선을 빼고, 각 스펙트럼에 대해 강도를 정규화했습니다. 동일한 처리군을 비교하였다(n=3/그룹). 각 USL의 중간 부분(그림 10)과 자궁경부 및 천골 말단(보충 그림 1 및 보충 그림 2)에 대한 대표적인 스펙트럼이 표시됩니다.
그림 10: 효소 처리가 USL 조성에 미치는 영향. USL 중간 부분의 라만 분광법은 효소 처리가 쥐 USL의 생화학적 구성을 변경시켰음을 시사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
피크는 O'Brien et al.15에 의해 수행된 인간 자궁경부의 생체 내 라만 분광법을 기반으로 하는 다양한 생물학적 구성 요소와 상관관계가 있었습니다. 우리의 데이터는 세포막에서 발견되는 인지질 인 포스파티딜 에탄올 아민 (1,769 nm)의 피크를 사용하여 정규화되었으며, 이는 효소 처리 후에도 변하지 않아야합니다. 대표적인 스펙트럼을 비교한 결과, 콜라게나제 처리 및 콘드로이티나제 처리 USL 모두에서 수분 함량, 콜라겐, 히알루론산, 프로테오글리칸 및 GAG가 감소한 것으로 나타났습니다(그림 10, 보충 그림 1 및 보충 그림 2).
보충 그림 1: 효소 처리가 USL 구성에 미치는 영향. USL 자궁경부 절편의 라만 분광법은 효소 처리가 쥐 USL의 생화학적 구성을 변화시켰음을 시사합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 효소 처리가 USL 구성에 미치는 영향. USL 천골 절편의 라만 분광법은 효소 처리가 쥐 USL의 생화학적 구성을 변경시켰음을 시사합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 연구에 사용된 마우스의 체중, 연령 및 USL 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 효소 처리가 USL 힘 측정에 미치는 영향. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 3: 기계적으로 테스트된 USL의 단면적 계산. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: 웰 염색을 위한 CAD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 2: 웰 뚜껑을 염색하기 위한 CAD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 3: 로딩 챔버의 CAD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 4: 부표 시스템의 CAD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
구조적 손상이 여성 생식 조직에 미치는 영향은 충분히 연구되지 않았으며 POP 연구를 위해 쉽게 접근할 수 있는 동물 모델이 필요합니다. 마우스는 인간의 생식 연구를 모방할 수 있는 비용 효율적인 모델이다16. 여성 생식 기관 연구에 대한 관심이 높아짐에 따라 이러한 조직의 연구를 돕는 방법이 필요합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 이 작업에서는 구조 및 기능 분석을 위해 쥐 골반저 조직을 해부하고 준비하는 방법을 확립합니다.
해부의 성공을 위해서는 적절한 시간과 관리가 필요합니다. 쥐의 생식 조직은 작고 깨지기 쉽습니다. 특히 USL과 골반 장기를 둘러싼 지방을 제거할 때, 지방이 제거될 때 USL 또는 다른 조직이 손상되는 것을 방지하기 위해 세부 사항에 주의를 기울여야 합니다. 해부 현미경을 사용하여 USL과 지방의 차이를 식별하는 데 도움을 주는 것이 중요하며, 이는 훈련되지 않은 눈이 쉽게 혼동할 수 있습니다. 요관을 제거하면 방광과 자궁경부의 삽입 지점이 서로 가깝기 때문에 USL과의 혼동을 피하는 데 도움이 될 수 있습니다. USL 주위에 봉합사를 묶을 때, 바늘을 위한 공간을 만들기 위해 집게를 사용하여 USL을 부드럽게 들어 올려 조직에 구멍이 뚫리지 않도록 주의해야 합니다. USL을 추출하기 위해 올바른 조직 구조와 주요 해부학적 랜드마크를 식별하는 것이 어려울 수 있지만 이 방법과 실습을 통해 해부 결과를 반복할 수 있습니다.
제안된 방법은 단일 표본에서 골반저 조직을 해부하기 위한 자세한 절차를 간략하게 설명합니다. 한 가지 한계는 자궁경부 조각이 해부된 USL에 부착된 상태로 남아 기계적 테스트 중에 앵커 역할을 하고 방향을 식별하는 데 도움이 되기 때문에 모든 조직을 완전히 온전하게 유지하는 것이 불가능하다는 것입니다. 또 다른 한계는 생쥐의 해부학적 구조와 인체 해부학적 구조가 조직 형태, 크기, 방향에 차이가 있다는 것이다9. POP는 설치 류 17,18, 토끼19,20 양 20,21, 돼지5,22,23,24, 비인간 영장류 25,26 및 인간 사체 24,26,27과 같은 여러 동물 모델을 사용하여 조사되었습니다 , 그리고 이러한 모델 중 일부는 USL의 역할에 초점을 맞췄습니다. 이들 모델 각각은 POP 연구에 유익하지만, 마우스의 또 다른 이점은 새로운 질병 모델을 만들기 위한 유전자 조작의 용이성이며, 이는 더 큰 동물에서는 불가능합니다27.
마우스를 모델로 활용하기 위해 이 방법은 USL의 성공적인 해부와 기계적 테스트, 라만 현미경, 면역조직화학 및 생화학적 분석을 포함한 다양한 분석을 위한 조직 준비를 돕기 위해 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 해부학적 연결이 있는 USL을 추출하여 방향을 식별하고, USL을 묶고, 생체 내에서 발견되는 것과 유사한 조건에서 USL을 기계적으로 테스트할 수 있습니다.
USL의 기계적 무결성은 콜라겐, 프로테오글리칸 및 GAG를 포함한 ECM 성분에서 파생됩니다. 유형 I 콜라겐은 주요 인장 하중 지지 단백질이며 이 ECM 구성 요소의 손상은 USL 실패 및 POP에 기여하는 것으로 생각됩니다. 이 절차에서는 ECM 조성의 변화가 USL의 기계적 반응과 조성에 어떤 영향을 미치는지 테스트하기 위해 두 가지 다른 효소 처리를 비교했습니다. 기계적 분석에 따르면 콜라겐과 GAG가 USL의 축 방향 강성에 기여하여 평균 축 피크 및 평형 응력을 낮추는 것으로 나타났습니다(그림 7). 효소 처리된 USL은 유사하거나 더 큰 평균 축 변형을 경험했습니다(표 2). 라만 분광법은 콜라게나제 처리 USL이 콜라겐 함량이 감소하고 물과 히알루론산이 감소한 반면, 콘드로이티나제 처리 USL은 히알루론산이 적고 수분 및 콜라겐 함량이 낮다는 것을 입증했습니다. 이러한 결과를 위해 라만 분광법은 소화로 인해 성분이 제거되었음을 검증했습니다. 이 방법은 골반저 기반 연구에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하고 이 연구가 부족한 영역에 집중하는 조사자의 수를 늘릴 것으로 예상됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) 보조금 (CB), NSF 대학원 연구 펠로우쉽 (LS), 슈미트 과학 펠로우쉽 (CL), 콜로라도 대학교 연구 및 혁신 종자 보조금 프로그램 (2020 년 V.F., S.C. 및 KC) 및 콜로라도 대학의 Anschutz Boulder Nexus Seed Grant (VF 및 KC). 로딩 챔버 설계에 도움을 주신 Tyler Tuttle 박사와 유용한 토론을 해주신 Calve 연구실 구성원에게 특별한 감사를 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y.
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D.
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O'Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
