Summary
Este artículo presenta un protocolo detallado para diseccionar ligamentos uterosacros y otros tejidos del piso pélvico, incluyendo el cuello uterino, el recto y la vejiga en ratones, para ampliar el estudio de los tejidos reproductivos femeninos.
Abstract
El prolapso de órganos pélvicos (POP) es una afección que afecta la integridad, la estructura y el soporte mecánico del suelo pélvico. Los órganos en el piso pélvico están soportados por diferentes estructuras anatómicas, incluidos músculos, ligamentos y fascia pélvica. El ligamento uterosacro (USL) es una estructura crítica de carga, y la lesión del USL resulta en un mayor riesgo de desarrollar POP. El presente protocolo describe la disección de USL murinas y los órganos del suelo pélvico junto con la adquisición de datos únicos sobre la composición y función bioquímica de USL utilizando espectroscopia Raman y la evaluación del comportamiento mecánico. Los ratones son un modelo invaluable para la investigación preclínica, pero diseccionar el USL murino es un proceso difícil e intrincado. Este procedimiento presenta un enfoque para guiar la disección de los tejidos murinos del suelo pélvico, incluida la USL, para permitir múltiples evaluaciones y caracterización. Este trabajo tiene como objetivo ayudar a la disección de los tejidos del suelo pélvico por científicos e ingenieros básicos, ampliando así la accesibilidad de la investigación sobre el USL y las condiciones del suelo pélvico y el estudio preclínico de la salud de la mujer utilizando modelos de ratón.
Introduction
Aproximadamente 50% de las mujeres están afectadas por el prolapso de órganos pélvicos (POP)1,2. Alrededor del 11% de estas mujeres cumplen con los criterios para someterse a una reparación quirúrgica, que tiene una baja tasa de éxito (~ 30%)3,4. El POP se caracteriza por el descenso de cualquiera o todos los órganos pélvicos (es decir, vejiga, útero, cuello uterino y recto) de su posición natural debido a la falla de los músculos del USL y del piso pélvico para proporcionar un soporte adecuado5. Esta condición implica disfunción anatómica y alteración del tejido conectivo, así como lesión neuromuscular, además de factores predisponentes 3,6. El POP se asocia con múltiples factores como la edad, el peso, la paridad y el tipo de parto (es decir, partos vaginales o cesáreas). Se cree que estos factores afectan la integridad mecánica de todos los tejidos del suelo pélvico, y se cree que el embarazo y la paridad son los principales impulsores de la POP 5,7,8.
Los ligamentos uterosacros (USL) son estructuras de soporte importantes para el útero, el cuello uterino y la vagina y atan el cuello uterino al sacro4. El daño a los USL pone a las mujeres en mayor riesgo de desarrollar POP. Se cree que el embarazo y el parto imponen una presión adicional sobre el USL, lo que potencialmente induce lesiones y aumenta las posibilidades de POP. La USL es un tejido complejo compuesto de células musculares lisas, vasos sanguíneos y linfáticos distribuidos heterogéneamente a lo largo del ligamento, que se puede dividir en tres secciones distintas: cervical, intermedia y región sacra9. La integridad mecánica de la USL se deriva de componentes de la matriz extracelular (ECM) como colágenos, elastina y proteoglicanos 5,9,10. Se sabe que las fibras de colágeno tipo I son un componente de tracción importante que soporta la carga de los tejidos ligamentosos y, por lo tanto, es probable que estén involucradas en la falla de USL y POP11.
Hay una falta de conocimiento con respecto a las causas, la prevalencia y los efectos del POP en las mujeres. El desarrollo de un modelo animal apropiado de COP es necesario para avanzar en nuestra comprensión del suelo pélvico femenino. Los ratones y los humanos tienen puntos de referencia anatómicos similares dentro de la pelvis, como los uréteres, el recto, la vejiga, los ovarios y los ligamentos redondos9, así como puntos de intersección similares de la USL con el útero, el cuello uterino y el sacro. Además, los ratones ofrecen facilidad de manipulación genética y tienen el potencial de ser un modelo rentable y de fácil acceso para el estudio de POP9.
Este estudio desarrolló un método para acceder y aislar el USL y los diferentes tejidos del suelo pélvico de ratones nulíparos (es decir, nunca embarazadas). Las USL extraídas se sometieron a digestión enzimática (es decir, para eliminar colágenos y glicosaminoglicanos), se probaron para determinar la respuesta mecánica bajo carga de tracción y se evaluó su composición bioquímica en un estudio de prueba de concepto. La capacidad de aislar tejidos intactos facilitará más caracterizaciones mecánicas y bioquímicas de los componentes del suelo pélvico, que es un primer paso crucial para mejorar nuestra comprensión de los riesgos de lesiones relacionados con el parto, el embarazo y el POP.
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Protocol
Todos los experimentos y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo #2705, aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado Boulder. Se utilizaron ratones hembra C57BL / 6J de seis semanas de edad para el presente estudio. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación de animales
- Eutanasia al animal siguiendo el método aprobado institucionalmente.
NOTA: El presente estudio utilizó la inhalación deCO2 en alineación con las pautas de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (una tasa de desplazamiento del 30% al 70% del volumen de la cámara con CO2 por minuto), seguida de la dislocación cervical, para garantizar una eutanasia exitosa.- Trabaje bajo una capucha, si es posible, para minimizar la propagación de alérgenos en ratones. Una vez que el ratón deje de moverse y respirar, espere 2 minutos o más para verificar la falta de respuesta.
NOTA: Si el ratón está embarazada o después del parto, los cachorros deben ser sacrificados individualmente. Los cachorros E15.5 y mayores deben ser decapitados durante la disección.
- Trabaje bajo una capucha, si es posible, para minimizar la propagación de alérgenos en ratones. Una vez que el ratón deje de moverse y respirar, espere 2 minutos o más para verificar la falta de respuesta.
- Prepare la configuración de disección con una almohadilla de disección, un bisturí de 11 hojas, tijeras delgadas y afiladas curvas, dos pares de fórceps, pinzas curvas, sutura de poliglactina 5-0, un microscopio de disección y seis alfileres (Figura 1, consulte la Tabla de materiales).
- Coloque el ratón sobre la almohadilla y fije las extremidades anteriores hacia abajo (Figura 2A). Hacer una incisión de aproximadamente 1-1,5 cm en el abdomen con tijeras (Figura 2B). Use suavemente las tijeras para separar la piel en los lados craneal, caudal y lateral de la incisión (Figura 2C, D).
- Gire el ratón hacia su lado dorsal y retire suavemente la piel hacia las extremidades posteriores para alejar la piel del sitio de disección (Figura 2E-H).
- Fije el ratón en las extremidades (Figura 2I) y haga una incisión de aproximadamente 1 cm en el abdomen desde el tórax hasta la pelvis (Figura 2J).
NOTA: Asegúrese de no dañar los órganos subyacentes. - Empuje suavemente los órganos hacia el tórax para despejar el campo de visión (Figura 2K).
NOTA: Irrigar los tejidos con 1x PBS para mantener la hidratación. - Limpie todo el tejido graso del piso pélvico (Figura 2L-N).
NOTA: Use fórceps para extraer suavemente y eliminar la grasa de los órganos y tejidos de interés.
Figura 1: Un espacio de trabajo limpio con todas las herramientas necesarias para realizar las disecciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Eliminación de la piel y apertura de las cavidades pélvica y torácica del ratón. (A) Fijación de todas las extremidades. (B) Incisión inicial. (C) Separar la piel de la fascia subyacente con tijeras. (D) Corte de la piel y preparación para la extracción. (E-G) Arrancar la piel dando vueltas alrededor del ratón. (H) Eliminar completamente la piel del lado dorsal. (I) Eliminación completa de la piel del torso y recolocación de las extremidades del ratón. (J) Abertura del abdomen. (K) Vista del abdomen abierto. (L) Mover los órganos fuera del campo de visión. (M) Eliminación de la grasa. (N) Vista del suelo pélvico despejado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Cosecha USL
- Corte los cuernos uterinos de los ovarios (Figura 3B), retírese del campo de visión y corte en la conexión cervical (Figura 3C).
NOTA: Los cuernos uterinos se pueden identificar siguiendo el esquema de la Figura 3A. Irrigar los tejidos con 1x PBS para mantener la hidratación. - Corte los uréteres lejos de la conexión de la vejiga (Figura 3D).
NOTA: Esto es para evitar confusiones con la USL. - Corte el colon lo más cerca posible del cuello uterino (Figura 3E, F).
NOTA: Irrigar los tejidos con 1x PBS para mantener la hidratación. - Coloque el ratón junto con la almohadilla de disección debajo del ámbito de disección para visualizar los USL (Figura 3G).
- Use suavemente los fórceps para limpiar la grasa circundante de las USL.
NOTA: Use un segundo par de fórceps para sostener el cuello uterino en un ángulo pequeño para mejorar la visualización de dónde se cruza el USL con el cuello uterino. Irrigar los tejidos con 1x PBS para mantener la hidratación. - Ate una sutura de poliglactina 5-0 alrededor del extremo cervical de ambas USL (Figura 4B, C).
NOTA: Los USL se pueden identificar utilizando las imágenes esquemáticas y de ampliación (Figura 4I-K) - En este estudio, se utiliza una USL para análisis morfológicos o bioquímicos (es decir, microscopía Raman, inmunohistoquímica, histología). Corte el extremo cervical de la USL, dejando un pedazo del cuello uterino unido, y corte un pedazo de músculo de la parte inferior de la USL (Figura 4D). Coloque el tejido disecado en un baño con 1x PBS para mantener el tejido hidratado (Figura 4G, H).
- Utilice el USL restante para pruebas mecánicas e imágenes. Corte el extremo cervical de la USL, dejando un pedazo de cuello uterino unido, para facilitar la configuración mecánica (Figura 4D).
NOTA: El tejido cervical actuará como un anclaje para asegurar el USL durante la prueba mecánica. - Una vez recolectados todos los tejidos de interés (pasos 3-5), dislocar los fémures de la pelvis (Figura 4E).
NOTA: Uno debe escuchar un leve chasquido cuando la cabeza femoral se desarticula de la copa acetabular. - Cortar el hueso pélvico de los extremos distal y proximal del hueso pélvico, dejando aproximadamente 10 mm de tejido total (Figura 4F). Coloque el tejido disecado en 1x PBS.
Figura 3: Suelo pélvico despejado para disección de USL . (A) Esquema de la anatomía. (B) Cortar los cuernos uterinos en la conexión ovárica. (C) Cortar cuernos uterinos. (D) Corte de los uréteres. (E) Corte del colon. (F) Una visión clara del recto y los USL. (G) Colocar el mouse y la almohadilla de disección debajo del alcance de disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Vista del USL y los tejidos circundantes y disección de los USL. (A) Esquema de puntos de referencia anatómicos que rodean el USL. (B) Atar una sutura alrededor de los extremos cervicales. (C) Cortar los extremos cervicales de la USL. (D) Corte del USL para ser utilizado para los análisis bioquímicos en la conexión sacra. (E) Corte de los fémures del hueso pélvico. (F) Cortar el extremo proximal de la pelvis. (G) Disección del USL en una placa de Petri de 35 mm. (H) El USL con la pelvis unida en una placa de Petri de 35 mm. (I) El USL y el recto con un aumento de 0,75x. (J) Eliminación de grasa de la USL. (K) Limpieza de los USL con un aumento de 1,0x. Barra de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Recolección de vejiga
- Después de eliminar la grasa, sostenga la vejiga con los fórceps y levántela suavemente en un ángulo de aproximadamente 40° (Figura 5A).
- Con las tijeras, corte la vejiga desde el lado distal, justo encima del cuello uterino (Figura 5B).
- Coloque el tejido en un baño con 1x PBS para mantener el tejido hidratado (Figura 5H).
4. Recolección del recto
- Una vez que las USL se desconectan del cuello uterino y se disecciona la vejiga, levante el cuello uterino en un ángulo de aproximadamente 40 ° con los fórceps. Existe la fascia rectovaginal que conecta el recto y el cuello uterino. Con el bisturí, corte suavemente esta conexión (Figura 5C, D).
- Cortar el hueso púbico en la sínfisis púbica con tijeras. Amplíe suavemente el espacio de trabajo para aumentar el acceso visual a las inserciones de tejido.
- Con los fórceps, tire suavemente del recto hacia el tórax y use las tijeras para seguir el recto desde su lado posterior hasta el ano. Cortar el recto en el ano (Figura 5E).
- Coloque el tejido en 1x PBS para mantener el tejido hidratado (Figura 5I).
5. Recolección del complejo cérvix-vagina
- Después de extraer las USL del cuello uterino, use los fórceps para sostener el cuello uterino. Corte el cuello uterino lo más cerca posible de la vulva con tijeras (Figura 5F, G).
NOTA: Asegúrese de cortar la sínfisis púbica para ver visualmente el extremo distal de la vagina. - Coloque el tejido en 1x PBS para mantener el tejido hidratado (Figura 5J).
Figura 5: Disecciones de vejiga, recto y cuello uterino/vagina . (A) Sostener la vejiga en ángulo. (B) Cortar la vejiga. (C) Cortar el tendón que conecta el cuello uterino y el recto. (D) El tendón con un aumento de 1.0x. (E) Corte del recto. (F) Agarrar el cuello uterino con fórceps. (G) Corte en el extremo distal de la vagina. (H) La vejiga en una placa de Petri de 35 mm. (I) El recto en una placa de Petri de 35 mm. (J) El complejo tejido cérvix-vagina en una placa de Petri de 35 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Preparación de la muestra para la caracterización tisular
- Análisis mecánicos y visuales de la USL
- Coloque el USL con el accesorio pélvico sobre una pared en forma de T dentro de un pocillo de tinción personalizado para garantizar una inmersión total en la solución de tinción (los dibujos CAD del pozo se pueden encontrar en el Archivo de codificación suplementario 1 y en el Archivo de codificación complementaria 2).
NOTA: Use sutura y fórceps para ayudar con la colocación. - Diluir un colorante disponible comercialmente que tiñe grupos amina libres (5 μL, ver Tabla de materiales) en 2.5 ml de 1x PBS, agregar la solución al pozo de tinción personalizado y teñir el tejido durante 2 h en un balancín a 4 ° C.
NOTA: Vortex la solución antes de agregarla al pozo de tinción. - Durante los últimos 15 minutos de tinción, agregue 2.5 μL de una tinción de núcleos de células muertas disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) a la solución.
NOTA: Vortex la solución antes de agregarla al pozo de tinción.
- Coloque el USL con el accesorio pélvico sobre una pared en forma de T dentro de un pocillo de tinción personalizado para garantizar una inmersión total en la solución de tinción (los dibujos CAD del pozo se pueden encontrar en el Archivo de codificación suplementario 1 y en el Archivo de codificación complementaria 2).
- Análisis Raman de los USL
- Fije el USL en línea recta en un bloque de polidimetilsiloxano (PDMS) que está contenido en un pocillo personalizado.
NOTA: El PDMS se utiliza como sustrato blando para permitir la fijación de la muestra en la configuración deseada. Se pueden hacer bloques de diferentes dimensiones mezclando los dos componentes siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), fundiendo en una placa de Petri y, después de la polimerización, cortando el PDMS en la geometría requerida con una cuchilla de bisturí. - Pin con alfileres de insectos en el asa de sutura y en el músculo pélvico. Hidratar el tejido con 1x PBS.
- Fije el USL en línea recta en un bloque de polidimetilsiloxano (PDMS) que está contenido en un pocillo personalizado.
- Tejidos restantes
- Congele rápidamente los tejidos restantes con nitrógeno líquido o en un compuesto de incrustación apropiado, dependiendo de los análisis deseados.
- Guardar los tejidos a -80 °C hasta análisis posteriores (p. ej., ensayos inmunohistoquímicos o bioquímicos).
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Representative Results
Cada paso de la disección de un ratón de tipo salvaje se detalla en el vídeo asociado y las figuras relacionadas con el protocolo. Para este estudio, se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de 6 semanas de edad (Tabla suplementaria 1). Se analizaron tres grupos de muestra con USL tratados con diferentes enzimas: control (ningún tratamiento), tratados con colagenasa y grupos tratados con condroitinasa. El músculo liso, los nervios y los linfáticos en la USL están rodeados por una ECM rica en colágenos fibrilares y glicosaminoglicanos (GAG)5, que se cree que proporcionan integridad mecánica al tejido. Los tratamientos enzimáticos se eligieron para interrumpir estos componentes de la ECM y demostrar la viabilidad de resolver las diferencias bioquímicas y mecánicas mediante espectroscopia Raman y pruebas mecánicas (tracción).
Para la digestión, todos los USL se colocaron en un termomezclador durante 3 h en una solución de 1 ml a 37 °C y 300 rpm. Las USL de control se colocaron en una solución de 1x PBS, las USL tratadas con colagenasa se colocaron en una solución de 1.0 U/ml de colagenasa tipo I, y las USL tratadas con condroitinasa se colocaron en una solución de 2.0 U/ml de condroitinasa ABC (ver Tabla de materiales).
Los USL para pruebas mecánicas se prepararon en base al paso 6.1. Las muestras se colocaron en una cámara de carga personalizada (un dibujo CAD de la cámara se puede encontrar en el Archivo de codificación suplementario 3) para el protocolo de prueba mecánica12. La pelvis se fijó en una configuración estacionaria, y el extremo cervical de la USL se unió a un actuador de boya, que se basó en el diseño descrito en Jiménez et al.12 (Figura 6B; Archivo de codificación suplementario 4), bajo un microscopio confocal vertical y conectado a una célula de carga de 100 mN (Figura 6A). El sistema de boyas reduce el ruido causado por el brazo del actuador al medir la fuerza12. Se utilizó una precarga de aproximadamente 500 μN para establecer la configuración de referencia del USL, y se obtuvo una imagen de cada USL mientras estaba en esta posición. Luego, se aplicó un desplazamiento global de 750 μm y se mantuvo durante 5 minutos antes de volver a obtener imágenes. El USL fue devuelto a la configuración de referencia, y este proceso se repitió para un desplazamiento global de 1.000 μm. Este protocolo se siguió para los tres grupos de muestra (n = 1/grupo) para obtener las curvas de relajación de tensiones (Figura 7), y se determinaron las tensiones pico y de equilibrio soportadas por cada USL (Tabla 1). La tensión se calculó dividiendo la fuerza medida por el área de la sección transversal promedio (Tabla complementaria 2 y Tabla complementaria 3).
Figura 6: Configuración de pruebas mecánicas . (A) Cámara de carga bajo el microscopio confocal y conectada al actuador. (B) USL en la cámara de carga; La pelvis permanece estacionaria, mientras que el extremo cervical está atado a un sistema de boyas interconectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Gráfica macroscópica axial de tensión-relajación de USL murinos sometidos a diferentes tratamientos enzimáticos. El tratamiento enzimático pareció reducir el pico axial promedio y relajó las tensiones que experimenta el USL en los desplazamientos globales prescritos. (*) indica valores de estrés relajado, que se midieron 200 s después del pico de estrés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | Desplazamiento global (μm) | Estrés máximo (kPa) | Estrés de equilibrio relajado (kPa) |
| Control | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| Tratada con colagenasa | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| Tratamiento con condroitinasa | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
Tabla 1: El efecto del tratamiento enzimático en las mediciones de estrés de las USL.
A partir de las imágenes tomadas (Figura 8), los campos de deformación se estimaron utilizando una combinación de seguimiento manual y automático de la textura ("función imregdemons" en MATLAB) del ligamento entre los estados de referencia (descargado) y deformado13. El seguimiento manual se realizó seleccionando los mismos núcleos celulares en las imágenes de referencia y deformadas. Los campos de deformación de Green-Lagrange se calcularon a partir de los campos de desplazamiento estimados (Figura 9). Se calcularon las cepas axiales medias (E11) para la porción intermedia de cada espécimen (Tabla 2).
Figura 8: Imágenes de estados deformados y de referencia de un espécimen control (no tratado) después de desplazamientos globales. (A) Un desplazamiento global de 750 μm. (B) Un desplazamiento global de 1.000 μm. El verde representa el estado de referencia, y el púrpura es el estado deformado (barra de escala = 500 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Estimación de campos de deformación. Los campos de deformación estimados para las muestras en cada grupo de tratamiento demuestran que las cepas axial (E11), transversal (E22) y cizalladora (E12) no eran espacialmente homogéneas, y la deformación axial aumentaba con el aumento del desplazamiento aplicado (δ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Desplazamiento global (μm) | Control | Tratamiento con colagenasa | Tratamiento con condroitinasa |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
Tabla 2: Deformaciones axiales medias. Las cepas axiales promedio para cada muestra analizada mecánicamente indican que la deformación axial global en las muestras tratadas con enzimas fue similar o mayor que en la muestra de control, lo que sugiere que la reducción del estrés macroscópico se debió al tratamiento enzimático en lugar de cepas más pequeñas.
La espectroscopia Raman confocal (láser de 785 nm, tamaño de punto de 1,06 μm) se realizó en las USL preparadas como se describe en los pasos 6.2 y siguiendo a O'Brien et al.14 para evaluar semicuantitativamente la bioquímica del tejido. Se identificaron y eliminaron los rayos cósmicos, se restó la línea de base lineal y se normalizó la intensidad para cada espectro. Se compararon los mismos grupos de tratamiento (n = 3/grupo). Se muestran espectros representativos para la sección intermedia de cada USL (Figura 10), así como los extremos cervical y sacro (Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2).
Figura 10: Influencia del tratamiento enzimático en la composición de USL. La espectroscopia Raman de la sección intermedia USL sugiere que los tratamientos enzimáticos alteraron la composición bioquímica del USL murino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los picos se correlacionaron con diferentes componentes biológicos basados en la espectroscopia Raman in vivo del cuello uterino humano realizada por O'Brien et al.15. Nuestros datos se normalizaron utilizando el pico de fosfatidiletanolamina (1.769 nm), un fosfolípido que se encuentra en las membranas celulares, que debe permanecer sin cambios después de los tratamientos enzimáticos. La comparación entre espectros representativos reveló que el contenido de agua, colágenos, ácido hialurónico, proteoglicanos y GAG disminuyeron tanto en las USL tratadas con colagenasa como en las tratadas con condroitinasa (Figura 10, Figura suplementaria 1 y Figura complementaria 2).
Figura complementaria 1: Influencia del tratamiento enzimático en la composición de USL. La espectroscopia Raman de la sección cervical USL sugiere que los tratamientos enzimáticos alteraron la composición bioquímica del USL murino. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Influencia del tratamiento enzimático en la composición de USL. La espectroscopia Raman de la sección sacra USL sugiere que los tratamientos enzimáticos alteraron la composición bioquímica del USL murino. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 1: El peso, la edad y el análisis de USL de los ratones utilizados en el estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 2: Influencia del tratamiento enzimático en las mediciones de fuerza USL. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Cuadro complementario 3: Cálculos del área transversal de los USL probados mecánicamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación complementaria 1: Archivo CAD para teñir el pozo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación complementaria 2: archivo CAD para teñir la tapa del pozo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación complementaria 3: Archivo CAD de la cámara de carga. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación complementario 4: Archivo CAD del sistema de boyas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El efecto del daño estructural en los tejidos reproductivos femeninos está poco estudiado, y se necesita un modelo animal de fácil acceso para la investigación de COP. El ratón es un modelo rentable que puede imitar los estudios reproductivos humanos16. Debido al creciente interés en el estudio del sistema reproductor femenino, existe la necesidad de métodos que ayuden al estudio de estos tejidos. Para abordar esta necesidad, en este trabajo, se establece un método para diseccionar y preparar tejidos murinos del suelo pélvico para análisis estructurales y funcionales.
Para el éxito de la disección, se necesita tiempo y atención adecuados. Los tejidos reproductivos murinos son pequeños y frágiles. Se requiere atención al detalle, especialmente al limpiar la grasa que rodea el USL y los órganos pélvicos, para evitar dañar el USL u otros tejidos cuando se elimina la grasa. Es importante usar el microscopio de disección para ayudar a identificar las diferencias entre el USL y la grasa, que el ojo no entrenado puede confundir fácilmente. La extracción de los uréteres puede ser útil para evitar confusiones con el USL, ya que los puntos de inserción de la vejiga y el cuello uterino están cerca uno del otro. Al atar la sutura alrededor de la USL, se debe tener cuidado para evitar perforar cualquier tejido mediante el uso de fórceps para levantar suavemente las USL para hacer espacio para la aguja. Para extraer las USL, la identificación de la estructura tisular correcta y los puntos de referencia anatómicos clave puede ser difícil, pero con este método y práctica, los resultados de la disección serán repetibles.
El método propuesto describe un procedimiento detallado para diseccionar tejidos del suelo pélvico a partir de una sola muestra. Una limitación es que no es posible mantener todos los tejidos completamente intactos ya que una pieza del cuello uterino permanece unida a la USL diseccionada para actuar como un ancla durante las pruebas mecánicas y ayudar a identificar la orientación. Otra limitación es que la anatomía del ratón y la anatomía humana tienen diferencias en la forma, el tamaño y la orientación del tejido9. POP se ha investigado utilizando varios modelos animales, como roedores 17,18, conejos19,20 ovejas 20,21, cerdos5,22,23,24 y primates no humanos 25,26, así como en cadáveres humanos24,26,27, y algunos de estos modelos se han centrado en el papel de la USL. Si bien cada uno de estos modelos es beneficioso para el estudio de POP, un beneficio adicional del ratón es la facilidad de manipulación genética para crear nuevos modelos de enfermedades, lo que no es posible en animales más grandes27.
Con el fin de aprovechar el ratón como modelo, este método se desarrolla para ayudar en la disección exitosa de las USL y la preparación de los tejidos para diversos análisis, incluyendo pruebas mecánicas, microscopía Raman, inmunohistoquímica y ensayos bioquímicos. Con este método, es posible extraer el USL con su conexión anatómica para identificar su orientación, atar el USL y probar mecánicamente el USL en condiciones similares a las encontradas in vivo.
La integridad mecánica del USL se deriva de los componentes de ECM, incluidos colágenos, proteoglicanos y GAG. El colágeno tipo I es una proteína importante que soporta carga de tracción, y se cree que el daño a este componente de ECM contribuye a la falla de USL y POP. En este procedimiento, se compararon dos tratamientos enzimáticos diferentes para probar cómo la variación de la composición de la ECM afecta la respuesta mecánica y la composición de la USL. El análisis mecánico sugirió que el colágeno y los GAG contribuyeron a la rigidez axial del USL, reduciendo el pico axial promedio y las tensiones de equilibrio (Figura 7). Las USL tratadas con enzimas experimentaron una cepa axial promedio similar o mayor (Tabla 2). La espectroscopia Raman demostró que el USL tratado con colagenasa había disminuido el contenido de colágeno, así como la disminución del agua y el ácido hialurónico, mientras que el USL tratado con condroitinasa tenía menos ácido hialurónico, así como un menor contenido de agua y colágeno. Para estos resultados, la espectroscopia Raman validó que los componentes se eliminaron debido a la digestión. Se prevé que este método hará que los estudios basados en el suelo pélvico sean más accesibles y aumente el número de investigadores que se centran en esta área poco estudiada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención del Programa de Oportunidades de Investigación Subterránea de Verano (UROP) de CU Boulder (CB), la Beca de Investigación de Posgrado de NSF (L.S.), la Beca de Ciencias Schmidt (CL), el Programa de Subvenciones de Semillas de Investigación e Innovación de la Universidad de Colorado (premio 2020 a V.F., S.C. y K.C.) y la Beca Anschutz Boulder Nexus Seed en la Universidad de Colorado (a V.F. y K.C.). Un reconocimiento especial para el Dr. Tyler Tuttle por su ayuda con el diseño de la cámara de carga, así como para los miembros del laboratorio Calve por sus útiles discusiones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
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