Summary
この記事では、女性の生殖組織の研究を拡大するために、マウスの子宮頸部、直腸、膀胱を含む子宮仙靭帯およびその他の骨盤底組織を解剖するための詳細なプロトコルを紹介します。
Abstract
骨盤臓器脱(POP)は、骨盤底の完全性、構造、および機械的サポートに影響を与える状態です。骨盤底の臓器は、筋肉、靭帯、骨盤筋膜など、さまざまな解剖学的構造によって支えられています。子宮仙靭帯(USL)は重要な耐荷重構造であり、USLの損傷によりPOPを発症するリスクが高くなります。本プロトコルでは、ラマン分光法を用いたUSL生化学的組成と機能に関する独自のデータの取得、および機械的挙動の評価とともに、マウスUSLと骨盤底器官の解剖について説明します。マウスは前臨床研究にとって非常に貴重なモデルですが、マウスUSLの解剖は困難で複雑なプロセスです。この手順は、USLを含むマウス骨盤底組織の解剖をガイドし、複数の評価と特性評価を可能にするアプローチを提示します。この研究は、基礎科学者やエンジニアによる骨盤底組織の解剖を支援し、USLおよび骨盤底の状態に関する研究や、マウスモデルを使用した女性の健康の前臨床試験へのアクセスを拡大することを目的としています。
Introduction
女性の約50%が骨盤臓器脱(POP)の影響を受けています1,2。これらの女性の約11%は、成功率が低い外科的修復を受けるための基準を満たしています(~30%)3,4。POPは、USLと骨盤底筋が適切なサポートを提供できないために、骨盤内臓器(すなわち、膀胱、子宮、子宮頸部、および直腸)のいずれかまたはすべてが自然な位置から降下することを特徴としています5。この状態は、素因3,6に加えて、解剖学的機能障害および結合組織の破壊、ならびに神経筋損傷を伴う。POPは、年齢、体重、パリティ、分娩タイプ(すなわち、経腟分娩または帝王切開出産)などの複数の要因に関連しています。これらの要因は、すべての骨盤底組織の機械的完全性に影響を与えると考えられており、妊娠と同等性がPOP5,7,8の主な推進力であると考えられています。
子宮仙骨靭帯(USL)は、子宮、子宮頸部、膣の重要な支持構造であり、子宮頸部を仙骨につなぎます4。USLの損傷により、女性はPOPを発症するリスクが高くなります。妊娠と出産はUSLに追加の負担をかけ、怪我を誘発し、POPの可能性を高める可能性があると考えられています。USLは、靭帯に沿って不均一に分布する平滑筋細胞、血管、リンパ管で構成される複雑な組織であり、頸部、中間部、仙骨部の9つの異なるセクションに分けることができます。USLの機械的完全性は、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカンなどの細胞外マトリックス(ECM)成分に由来します5、9、10。I型コラーゲン線維は、靭帯組織の主要な耐荷重引張成分であることが知られているため、USL障害およびPOP11に関与している可能性があります。
女性におけるPOPの原因、有病率、および影響に関する知識が不足しています。POPの適切な動物モデルの開発は、女性の骨盤底の理解を深めるために必要です。マウスとヒトは、尿管、直腸、膀胱、卵巣、丸い靭帯など、骨盤内に同様の解剖学的ランドマークを持っています9、およびUSLと子宮、子宮頸部、仙骨との同様の交点。さらに、マウスは遺伝子操作が容易であり、POP9の研究のための容易にアクセスでき、費用効果の高いモデルになる可能性があります。
この研究では、未経産(つまり、妊娠していない)マウスからUSLとさまざまな骨盤底組織にアクセスして分離する方法を開発しました。抽出したUSLを酵素消化(すなわち、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを除去する)にかけ、引張荷重下での機械的応答を決定するために試験し、概念実証研究において生化学的組成を評価した。無傷の組織を分離する能力は、骨盤底コンポーネントのさらなる機械的および生化学的特性評価を容易にし、これは出産、妊娠、およびPOPに関連する傷害リスクの理解を深めるための重要な第一歩です。
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Protocol
すべての動物実験および手順は、コロラド大学ボルダー校の動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコル#2705に従って実施されました。本研究では、6週齢の雌C57BL / 6Jマウスを使用しました。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。
1.動物の準備
- 制度的に承認された方法に従って動物を安楽死させる。
注:本研究では、米国獣医師会のガイドラインに沿ってCO 2吸入を使用しました(チャンバー容積の30%から70%の変位率 CO2 /分)、続いて頸部脱臼、成功した安楽死を確実にするために。- 可能であれば、マウスアレルゲンの拡散を最小限に抑えるためにフードの下で作業してください。マウスの動きと呼吸が止まったら、2分以上待って応答がないことを確認します。
注意: マウスが妊娠中または産後の場合、子犬は個別に安楽死させる必要があります。子犬E15.5以上は、解剖中に斬首する必要があります。
- 可能であれば、マウスアレルゲンの拡散を最小限に抑えるためにフードの下で作業してください。マウスの動きと呼吸が止まったら、2分以上待って応答がないことを確認します。
- 解剖パッド、11枚羽根メス、湾曲した細い鋭利なハサミ、2対の鉗子、湾曲した鉗子、5-0ポリグラクチン縫合糸、解剖顕微鏡、および6本のピンを使用して解剖セットアップを準備します(図1、 材料表を参照)。
- パッドの上にマウスを置き、前肢を下に固定します(図2A)。ハサミで腹部を約1〜1.5 cm切開します(図2B)。はさみをそっと使用して、切開部の頭蓋側、尾側、および外側の皮膚を分離します(図2C、D)。
- マウスを背側にひっくり返し、後肢に向かって皮膚をそっと剥がして、解剖部位から皮膚を取り除きます(図2E-H)。
- マウスを四肢に固定し(図2I)、胸部から骨盤まで腹部を約1cm切開します(図2J)。
注意: 下にある臓器を傷つけないように注意してください。 - 臓器を胸部に向かってそっと押して、視野をクリアします(図2K)。
注意: 水分補給を維持するために、1x PBSで組織を洗浄します。 - 骨盤底からすべての脂肪組織を取り除きます(図2L-N)。
注意: 鉗子を使用して、目的の臓器や組織から脂肪をそっと引き抜き、取り除きます。
図1:解剖を実行するために必要なすべてのツールを備えたクリーンなワークスペース。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスの骨盤腔と胸腔の皮膚の除去と開口部。 (A)すべての手足を固定します。(B)初期切開。(C)はさみを使用して下にある筋膜から皮膚を分離します。(D)皮膚を切断し、除去の準備をします。(E-G)マウスの周りを回って皮膚を引き剥がします。(H)背側から皮膚を完全に除去する。(I)胴体から皮膚を完全に除去し、マウスの手足を再び固定します。(J)腹部の開口部。(K)開いた腹部のビュー。(L)臓器を視野外に移動する。(m)脂肪を除去する。(N)クリアされた骨盤底のビュー。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. USLハーベスティング
- 卵巣から子宮角を切り取り(図3B)、視野から引き離し、頸部接続部で切断します(図3C)。
注意: 子宮角は、 図3Aの回路図に従って識別できます。水分補給を維持するために1x PBSで組織を洗浄します。 - 尿管を膀胱接続部から切り離します(図3D)。
注:これは、USLとの混同を避けるためです。 - 結腸を子宮頸部のできるだけ近くで切ります(図3E、F)。
注意: 水分補給を維持するために、1x PBSで組織を洗浄します。 - マウスと解剖パッドを解剖スコープの下に置き、USLを視覚化します(図3G)。
- 鉗子をそっと使用して、USLから周囲の脂肪を取り除きます。
注意: 2番目の鉗子のペアを使用して子宮頸部を小さな角度で持ち上げ、USLが子宮頸部と交差する場所の視覚化を強化します。水分補給を維持するために1x PBSで組織を洗浄します。 - 両方のUSLの頸部端の周りに5-0ポリグラクチン縫合糸を結びます(図4B、C)。
注意: USLは、回路図と倍率画像を使用して識別できます(図4I-K) - この研究では、1つのUSLを形態学的または生化学的分析(すなわち、ラマン顕微鏡、免疫組織化学、組織学)に使用します。USLの頸部の端を切り取り、子宮頸部の一部を取り付けたままにし、USLの底から筋肉の一部を切り取ります(図4D)。解剖した組織を1x PBSの浴に入れて、組織を水和状態に保ちます(図4G、H)。
- 残りのUSLは、機械的テストとイメージングに使用します。機械的セットアップを容易にするために、子宮頸部を取り付けたまま、USLの頸部端を切断します(図4D)。
注意: 子宮頸部組織は、機械的テスト中にUSLを固定するためのアンカーとして機能します。 - 関心のあるすべての組織が採取されたら(ステップ3〜5)、大腿骨を骨盤から脱臼させます(図4E)。
注意: 大腿骨頭が寛骨臼カップから関節を離すと、かすかなカチッという音が聞こえるはずです。 - 骨盤骨の遠位端と近位端から骨盤骨を切り取り、約10 mmの全組織を残します(図4F)。解剖した組織を1x PBSに入れます。
図3:USL解剖のための骨盤底のクリア 。 (A)解剖学の概略図。(B)卵巣接続部で子宮角を切断する。(C)子宮角を切り落とす。(D)尿管の切断。(E)結腸の切断。(F)直腸とUSLの明確なビュー。(G)マウスと解剖パッドを解剖スコープの下に置きます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:USLとその周辺組織の図とUSLの解剖。 (A)USLを取り巻く解剖学的ランドマークの概略図。(B)頸部の端に縫合糸を結ぶ。(C)USLの頸部端を切り取る。(D)仙骨接続部での生化学的分析に使用するUSLを切り取る。(E)骨盤骨からの大腿骨の切断。(F)骨盤の近位端を切断する。(G)USLを35mmのペトリ皿で解剖する。(H)35mmのペトリ皿に骨盤が取り付けられたUSL。(I)0.75倍の倍率でのUSLと直腸。(J)USLから脂肪を除去する。(K)1.0倍の倍率でのUSLのクリーニング。スケールバー = 2 mm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3.膀胱摘出
- 脂肪が取り除かれたら、鉗子で膀胱を持ち、約40°の角度でゆっくりと持ち上げます(図5A)。
- はさみで、子宮頸部の真上の遠位側から膀胱を切り取ります(図5B)。
- 組織を1x PBSの入った浴に入れて、組織を水和状態に保ちます(図5H)。
4.直腸収穫
- USLが子宮頸部から切り離され、膀胱が解剖されたら、鉗子で子宮頸部を約40°の角度で持ち上げます。直腸と子宮頸部をつなぐ直腸膣筋膜があります。メスで、この接続をそっと切断します(図5C、D)。
- ハサミを使用して恥骨結合で恥骨を切ります。ワークスペースをゆっくりと広げて、組織の挿入物への視覚的なアクセスを増やします。
- 鉗子で直腸を胸部に向かってそっと引っ張り、ハサミを使って直腸を後側から肛門までたどります。肛門で直腸を切断します(図5E)。
- 組織を1x PBSに入れて、組織を水和状態に保ちます(図5I)。
5.子宮頸部 - 膣複合体収穫
- USLが子宮頸部から取り外された後、鉗子を使用して子宮頸部を保持します。ハサミを使用して子宮頸部を外陰部のできるだけ近くで切ります(図5F、G)。
注意: 膣の遠位端を視覚的に見るために、恥骨結合を必ず切断してください。 - 組織を1x PBSに入れて、組織を水和状態に保ちます(図5J)。
図5:膀胱、直腸、および子宮頸部/膣の解剖。 (A)膀胱を斜めに保持します。(B)膀胱を切断する。(C)子宮頸部と直腸をつなぐ腱を切断する。(D)1.0倍の倍率での腱。(E)直腸を切断する。(F)鉗子で子宮頸部をつかむ。(G)膣の遠位端での切断。(H)35mmのペトリ皿に入った膀胱。(I)35mmのペトリ皿に入った直腸。(J)35mmのペトリ皿に入った子宮頸部-膣組織複合体。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6.組織特性評価のためのサンプル調製
- USLの機械的および視覚的分析
- 骨盤アタッチメント付きのUSLをカスタム染色ウェル内のT字型壁に配置して、染色溶液に完全に浸るようにします(ウェルのCAD図面は、補足コーディングファイル1および補足コーディングファイル2にあります)。
注意: 縫合糸と鉗子を使用して、配置に役立ててください。 - 遊離アミン基を染色する市販の色素(5 μL、 材料表を参照)を2.5 mLの1x PBSで希釈し、溶液をカスタム染色ウェルに加え、4°Cのロッカーで組織を2時間染色します。
注:染色ウェルに加える前に、溶液をボルテックスしてください。 - 染色の最後の15分間に、市販の死細胞核染色剤2.5 μL( 材料表を参照)を溶液に加えます。
注:染色ウェルに加える前に溶液をボルテックスします。
- 骨盤アタッチメント付きのUSLをカスタム染色ウェル内のT字型壁に配置して、染色溶液に完全に浸るようにします(ウェルのCAD図面は、補足コーディングファイル1および補足コーディングファイル2にあります)。
- USLのラマン分析
- カスタムウェルに含まれるポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロックにUSLを直線で固定します。
注:PDMSは、サンプルを目的の構成にピン留めできるように、ソフト基板として使用されます。さまざまな寸法のブロックは、製造元の指示に従って2つの成分を混合し( 材料表を参照)、ペトリ皿に鋳造し、重合後、メスの刃でPDMSを必要な形状に切断することによって作成できます。 - 縫合ループと骨盤筋に昆虫ピンでピン留めします。1x PBSで組織を水和します。
- カスタムウェルに含まれるポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロックにUSLを直線で固定します。
- 残りの組織
- 残りの組織を液体窒素または適切な包埋化合物でスナップ凍結します, 目的の分析に応じて.
- その後の分析(免疫組織化学的または生化学的アッセイなど)まで、組織を-80°Cで保存します。
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Representative Results
野生型マウスの解剖の各ステップは、プロトコルに関連する関連ビデオおよび図に詳述されている。この研究では、6週齢の雌C57BL / 6Jマウスを使用しました(補足表1)。異なる酵素で処理されたUSLを含む3つのサンプルグループ、対照(無処理)、コラゲナーゼ処理群、およびコンドロイチナーゼ処理群を分析しました。USLの平滑筋、神経、リンパ管は、原線維性コラーゲンとグリコサミノグリカン(GAG)5が豊富なECMに囲まれており、組織に機械的完全性をもたらすと考えられています。酵素処理は、これらのECM成分を破壊し、ラマン分光法と機械的(引張)試験を使用して生化学的および機械的違いを解決する可能性を実証するために選択されました。
消化のために、すべてのUSLをサーモミキサーに入れ、1 mLの溶液中で37°Cおよび300 rpmで3時間入れました。対照USLを1x PBSの溶液に入れ、コラゲナーゼ処理したUSLを1.0 U/mLのコラゲナーゼタイプIの溶液に入れ、コンドロイチナーゼで処理したUSLを2.0 U/mLのコンドロイチナーゼABCの溶液に入れました( 材料の表を参照)。
機械的試験用のUSLは、ステップ6.1に基づいて作成されました。サンプルは、機械的試験プロトコル12のためにカスタムローディングチャンバー(チャンバーのCAD図面は補足コーディングファイル3にあります)に入れられました。骨盤は静止した構成で固定され、USLの頸部端は、Jimenezら12に記載されている設計に基づいたブイアクチュエータに取り付けられました(図6B;補足コーディングファイル4)、正立共焦点顕微鏡下で、100mNのロードセルに取り付けた(図6A)。ブイシステムは、力12を測定するときにアクチュエータのアームによって引き起こされるノイズを低減します。約500μNのプリロードを使用してUSLの基準構成を設定し、各USLはこの位置で画像化されました。次に、750μmのグローバル変位を適用し、5分間保持してから再度イメージングしました。その後、USLを基準構成に戻し、このプロセスを1,000μmのグローバル変位に対して繰り返しました。このプロトコルを3つのサンプルグループすべて(n = 1 /グループ)で追跡して応力緩和曲線を取得し(図7)、各USLが耐えるピーク応力と平衡応力を決定しました(表1)。応力は、測定した力を平均断面積で割って算出した(付表2及び付表3)。
図6:機械的テストのセットアップ 。 (A)共焦点顕微鏡の下にローディングチャンバーがあり、アクチュエータに接続されています。(B)ローディングチャンバー内のUSL。骨盤は静止したままで、頸部の端は相互接続されたブイシステムに結び付けられています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:異なる酵素処理を施したマウスUSLの巨視的な軸方向応力緩和プロット。 酵素処理は、USLが所定の全球変位で経験する平均軸方向ピークと緩和応力を減少させるように見えた。(*)は、ピーク応力の200秒後に測定された弛緩応力値を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 見本 | グローバル変位(μm) | ピーク応力(キロパスカル) | 緩和平衡応力(kPa) |
| コントロール | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| コラゲナーゼ処理 | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| コンドロイチナーゼ処理 | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
表1:USLのストレス測定に対する酵素処理の効果。
撮影された画像(図8)から、基準(無負荷)と変形状態の間の靭帯の手動および自動(MATLABの「imregdemons」機能)テクスチャトラッキングの組み合わせを使用してひずみ場を推定しました13。手動追跡は、参照画像および変形画像で同じ細胞核を選択することによって行われた。緑-ラグランジュひずみ場は、推定変位場から計算されました(図9)。各試験片の中間部分について平均軸ひずみ(E11)を算出した(表2)。
図8:グローバル変位後のコントロール(未処理)試験片の変形状態と参照状態の画像 。 (A)750μmのグローバル変位。(B)1,000μmのグローバル変位。緑は基準状態を表し、紫は変形状態(スケールバー=500μm)です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:ひずみ場の推定。 各処理群のサンプルについて推定されたひずみ場は、軸方向(E11)、横方向(E22)、およびせん断(E12)ひずみが空間的に不均一であり、軸方向ひずみが加えられた変位(δ)の増加とともに増加することを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| グローバル変位(μm) | コントロール | コラゲナーゼ処理 | コンドロイチナーゼ処理 |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
表2:平均軸ひずみ。 機械的に試験された各試料の平均軸ひずみは、酵素処理された試料の全体的な軸ひずみが対照試料と同等またはそれ以上であったことを示しており、巨視的応力の減少は、より小さな株ではなく酵素処理によるものであることが示唆された。
共焦点ラマン分光法(785 nmレーザー、1.06 μmスポットサイズ)は、組織生化学を半定量的に評価するために、ステップ6.2およびO'Brienら14に従って調製されたUSLに対して実施されました。宇宙線を特定して除去し、線形ベースラインを差し引き、強度を各スペクトルについて正規化しました。同じ治療群を比較した(n = 3/群)。各USLの中間切片(図10)、ならびに頸部および仙骨端部(補足図1および補足図2)の代表的なスペクトルを示す。
図10:USL組成に対する酵素処理の影響。 USL中間部のラマン分光法は、酵素処理がマウスUSLの生化学的組成を変化させたことを示唆しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ピークは、O'Brienらによって行われたヒト子宮頸部のin vivoラマン分光法に基づいて異なる生物学的成分と相関した15。私たちのデータは、細胞膜に見られるリン脂質であるホスファチジルエタノールアミン(1,769 nm)のピークを使用して正規化されましたが、酵素処理後も変化しないはずです。代表的なスペクトルを比較したところ、コラゲナーゼ処理USLとコンドロイチナーゼ処理USLの両方で水分量、コラーゲン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、GAGが減少していることが明らかになりました(図10、補足図1、補足図2)。
補足図1:USL組成に対する酵素処理の影響。 USL頸部断面のラマン分光法は、酵素処理がマウスUSLの生化学的組成を変化させたことを示唆しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:USL組成に対する酵素処理の影響。 USL仙骨切片のラマン分光法は、酵素処理がマウスUSLの生化学的組成を変化させたことを示唆しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:研究に使用したマウスの体重、年齢、およびUSL分析。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:USL力測定に対する酵素処理の影響。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表3:機械的にテストされたUSLの断面積の計算。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:ウェルを染色するためのCADファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル2:ウェル蓋を染色するためのCADファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル3:ローディングチャンバーのCADファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル4:ブイシステムのCADファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
女性の生殖組織に対する構造的損傷の影響は十分に研究されておらず、POP研究のために簡単にアクセスできる動物モデルが必要です。マウスは、ヒトの生殖研究を模倣できる費用対効果の高いモデルです16。女性の生殖器系の研究への関心が高まっているため、これらの組織の研究を支援する方法が必要です。このニーズに対処するために、この研究では、構造的および機能的分析のためにマウス骨盤底組織を解剖および準備する方法が確立されています。
解剖を成功させるためには、十分な時間と注意が必要です。マウスの生殖組織は小さくてもろいです。脂肪が除去されたときにUSLまたは他の組織に損傷を与えないように、特にUSLと骨盤内臓器の周囲の脂肪を取り除くときは、細部に注意を払う必要があります。解剖顕微鏡を使用して、訓練を受けていない目が簡単に混乱する可能性のあるUSLと脂肪の違いを特定するのに役立つことが重要です。尿管を取り外すと、膀胱と子宮頸部への挿入ポイントが互いに接近しているため、USLとの混同を避けるのに役立ちます。USLの周りに縫合糸を結ぶときは、鉗子を使用してUSLをそっと持ち上げて針のためのスペースを作ることにより、組織に穴を開けないように注意する必要があります。USLを抽出するには、適切な組織構造と主要な解剖学的ランドマークを特定するのが難しい場合がありますが、この方法と実践により、解剖の結果は再現可能です。
提案法は,単一標本から骨盤底組織を解剖するための詳細な手順を概説する.1つの制限は、子宮頸部の一部が解剖されたUSLに付着したままであり、機械的試験中にアンカーとして機能し、向きを特定するのに役立つため、すべての組織を完全に無傷に保つことができないことです。別の制限は、マウスの解剖学的構造と人体の解剖学的構造には、組織の形状、サイズ、および向きの違いがあることです9。POPは、げっ歯類17,18、ウサギ19,20ヒツジ20,21、ブタ5,22,23,24、非ヒト霊長類25,26、およびヒト死体24,26,27などのいくつかの動物モデルを使用して調査されています。、そしてこれらのモデルのいくつかはUSLの役割に焦点を合わせています。これらのモデルのそれぞれはPOPの研究に有益ですが、マウスの追加の利点は、より大きな動物では不可能な新しい疾患モデルを作成するための遺伝子操作の容易さです27。
マウスをモデルとして活用するために、この方法は、USLの解剖の成功と、機械的試験、ラマン顕微鏡、免疫組織化学、生化学的アッセイなどのさまざまな分析のための組織の準備を支援するために開発されています。この方法では、解剖学的接続を持つUSLを抽出して、その向きを特定し、USLをつなぎ、 in vivoで見られるものと同様の条件でUSLを機械的にテストすることができます。
USLの機械的完全性は、コラーゲン、プロテオグリカン、GAGなどのECMコンポーネントに由来します。I型コラーゲンは主要な引張荷重負荷タンパク質であり、このECM成分の損傷はUSLの障害とPOPの一因となると考えられています。この手順では、ECM組成の変化がUSLの機械的応答と組成にどのように影響するかをテストするために、2つの異なる酵素処理を比較しました。機械的解析の結果、コラーゲンとGAGがUSLの軸方向の剛性に寄与し、平均軸方向のピークと平衡応力を低下させることが示唆されました(図7)。酵素処理されたUSLは、同等以上の平均軸方向ひずみを経験しました(表2)。ラマン分光法では、コラゲナーゼ処理USLはコラーゲン含量が減少し、水分とヒアルロン酸が減少し、コンドロイチナーゼ処理USLはヒアルロン酸が少なく、水分とコラーゲン含量が低いことが示されました。これらの結果について、ラマン分光法は、消化によって成分が除去されたことを検証しました。この方法は、骨盤底ベースの研究をより利用しやすくし、この未研究領域に焦点を当てる研究者の数を増やすことが期待されます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、CUボルダーサマーアンダーグラウンドリサーチオポチュニティプログラム(UROP)助成金(CB)、NSF大学院研究フェローシップ(LS)、シュミットサイエンスフェローシップ(C.L.)、コロラド大学リサーチ&イノベーションシードグラントプログラム(V.F.、S.C.、およびK.C.への2020年賞)、およびコロラド大学のアンシュッツボルダーネクサスシードグラント(VFおよびK.C.に)によってサポートされました。ローディングチャンバーの設計を手伝ってくれたタイラー・タトル博士と、有益な議論をしてくれたCalveラボのメンバーに特別な謝辞を送ります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y.
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D.
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O'Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
