Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتشريح الأربطة الرحمية العجزية وأنسجة قاع الحوض الأخرى ، بما في ذلك عنق الرحم والمستقيم والمثانة في الفئران ، لتوسيع دراسة الأنسجة التناسلية الأنثوية.
Abstract
هبوط أعضاء الحوض (POP) هو حالة تؤثر على سلامة قاع الحوض وهيكله ودعمه الميكانيكي. يتم دعم الأعضاء الموجودة في قاع الحوض بواسطة هياكل تشريحية مختلفة ، بما في ذلك العضلات والأربطة واللفافة الحوضية. الرباط الرحمي العجزي (USL) هو هيكل حامل حرج، وتؤدي إصابة USL إلى زيادة خطر الإصابة بالملوثات العضوية الثابتة. يصف هذا البروتوكول تشريح USLs الفئران وأعضاء قاع الحوض جنبا إلى جنب مع الحصول على بيانات فريدة عن التركيب الكيميائي الحيوي USL ووظيفته باستخدام مطيافية رامان وتقييم السلوك الميكانيكي. الفئران هي نموذج لا يقدر بثمن للبحوث قبل السريرية، ولكن تشريح الفئران USL هو عملية صعبة ومعقدة. يقدم هذا الإجراء نهجا لتوجيه تشريح أنسجة قاع الحوض الفئران، بما في ذلك USL، لتمكين العديد من التقييمات والتوصيف. يهدف هذا العمل إلى المساعدة في تشريح أنسجة قاع الحوض من قبل العلماء والمهندسين الأساسيين، وبالتالي توسيع إمكانية الوصول إلى الأبحاث حول USL وظروف قاع الحوض والدراسة قبل السريرية لصحة المرأة باستخدام نماذج الفئران.
Introduction
يتأثر ما يقرب من 50٪ من النساء بهبوط أعضاء الحوض (POP)1,2. حوالي 11٪ من هؤلاء النساء يتناسبن مع معايير الخضوع للإصلاح الجراحي ، والتي لديها معدل نجاح ضعيف (~ 30٪) 3,4. يتميز الملوثات العضوية الثابتة بنزول أي من أعضاء الحوض أو جميعها (أي المثانة والرحم وعنق الرحم والمستقيم) من وضعها الطبيعي بسبب فشل USL وعضلات قاع الحوض في توفير الدعم الكافي5. تتضمن هذه الحالة اختلالا تشريحيا واضطرابا في النسيج الضام ، بالإضافة إلى إصابة عصبية عضلية ، بالإضافة إلى العوامل المؤهبة 3,6. يرتبط الملوثات العضوية الثابتة بعوامل متعددة مثل العمر والوزن والتكافؤ ونوع الولادة (أي الولادات المهبلية أو القيصرية). ويعتقد أن هذه العوامل تؤثر على السلامة الميكانيكية لجميع أنسجة قاع الحوض، ويعتقد أن الحمل والتكافؤ هما المحركان الرئيسيان للملوثات العضوية الثابتة5،7،8.
الأربطة الرحمية العجزية (USLs) هي هياكل داعمة مهمة للرحم وعنق الرحم والمهبل وتربط عنق الرحم بالعجز4. إن الأضرار التي لحقت بالمثقفين الجامعيين الطارئين (USLs) تعرض النساء لخطر متزايد للإصابة بالملوثات العضوية الثابتة. ويعتقد أن الحمل والولادة يفرضان ضغطا إضافيا على USL، مما قد يؤدي إلى الإصابة ويزيد من فرص الإصابة بالملوثات العضوية الثابتة. USL هو نسيج معقد يتكون من خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية والليمفاوية موزعة بشكل غير متجانس على طول الرباط ، والتي يمكن تقسيمها إلى ثلاثة أقسام متميزة: عنق الرحم والمنطقة المتوسطة والعجزية9. تستمد السلامة الميكانيكية ل USL من مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) مثل الكولاجين والإيلاستين والبروتيوغليكان5،9،10. من المعروف أن ألياف الكولاجين من النوع الأول هي مكون شد رئيسي حامل للأنسجة الرباطية ، وبالتالي من المحتمل أن تكون متورطة في فشل USL والملوثات العضوية الثابتة11.
وهناك نقص في المعرفة فيما يتعلق بأسباب الملوثات العضوية الثابتة وانتشارها وآثارها على النساء. يعد تطوير نموذج حيواني مناسب للملوثات العضوية الثابتة ضروريا لتعزيز فهمنا لقاع الحوض الأنثوي. للفئران والبشر معالم تشريحية متشابهة داخل الحوض، مثل الحالب والمستقيم والمثانة والمبيضين والأربطة المستديرة9، بالإضافة إلى نقاط تقاطع مماثلة ل USL مع الرحم وعنق الرحم والعجز. وعلاوة على ذلك، توفر الفئران سهولة التلاعب الجيني ولديها القدرة على أن تكون نموذجا يسهل الوصول إليه وفعالا من حيث التكلفة لدراسة الملوثات العضوية الثابتة9.
طورت هذه الدراسة طريقة للوصول إلى USL وأنسجة قاع الحوض المختلفة وعزلها من الفئران الخالية من الحمل (أي التي لم تكن حاملا أبدا). خضعت USLs المستخرجة للهضم الأنزيمي (أي لإزالة الكولاجين والجليكوزامينوجليكان)، وتم اختبارها لتحديد الاستجابة الميكانيكية تحت تحميل الشد، وتم تقييمها للتركيب الكيميائي الحيوي في دراسة إثبات المفهوم. ستسهل القدرة على عزل الأنسجة السليمة المزيد من الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية لمكونات قاع الحوض ، وهي خطوة أولى حاسمة نحو تحسين فهمنا لمخاطر الإصابة المتعلقة بالولادة والحمل والملوثات العضوية الثابتة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب والإجراءات على الحيوانات وفقا للبروتوكول # 2705 ، الذي وافقت عليه لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة كولورادو بولدر. تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر ستة أسابيع في الدراسة الحالية. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. إعداد الحيوان
- القتل الرحيم للحيوان باتباع الطريقة المعتمدة مؤسسيا.
ملاحظة: استخدمت الدراسة الحالية استنشاق CO 2 بما يتماشى مع إرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (معدل إزاحة من 30٪ إلى 70٪ من حجم الغرفة مع CO2 في الدقيقة) ، يليه خلع عنق الرحم ، لضمان القتل الرحيم الناجح.- العمل تحت غطاء محرك السيارة ، إن أمكن ، لتقليل انتشار مسببات الحساسية الفئران. بمجرد توقف الماوس عن الحركة والتنفس ، اترك 2 دقيقة أو أكثر للتحقق من عدم الاستجابة.
ملاحظة: إذا كان الفأر حاملا أو بعد الولادة ، فيجب القتل الرحيم للجراء بشكل فردي. يجب قطع رأس الجراء E15.5 وما فوق أثناء التشريح.
- العمل تحت غطاء محرك السيارة ، إن أمكن ، لتقليل انتشار مسببات الحساسية الفئران. بمجرد توقف الماوس عن الحركة والتنفس ، اترك 2 دقيقة أو أكثر للتحقق من عدم الاستجابة.
- قم بإعداد إعداد التشريح باستخدام وسادة تشريح ، ومشرط مكون من 11 شفرة ، ومقص حاد رفيع منحني ، وزوجان من الملقط ، وملقط منحني ، وخياطة بولي جلاكتين 5-0 ، ومجهر تشريح ، وستة دبابيس (الشكل 1 ، انظر جدول المواد).
- ضع الماوس على الوسادة ، وقم بتثبيت الأطراف الأمامية لأسفل (الشكل 2 أ). قم بعمل شق حوالي 1-1.5 سم في البطن بالمقص (الشكل 2 ب). استخدم المقص برفق لفصل الجلد عند الجوانب القحفية والذيلية والجانبية للشق (الشكل 2 ج ، د).
- اقلب الماوس إلى جانبه الظهري ، وقشر الجلد برفق نحو الأطراف الخلفية لإزالة الجلد بعيدا عن موقع التشريح (الشكل 2E-H).
- ثبت الفأر على الأطراف (الشكل 2I) ، وقم بعمل شق يبلغ حوالي 1 سم في البطن من الصدر إلى الحوض (الشكل 2J).
ملاحظة: تأكد من عدم إتلاف الأعضاء الكامنة. - ادفع الأعضاء برفق نحو الصدر لمسح مجال الرؤية (الشكل 2K).
ملاحظة: ري الأنسجة باستخدام 1x PBS للحفاظ على الترطيب. - قم بإزالة جميع الأنسجة الدهنية من قاع الحوض (الشكل 2L-N).
ملاحظة: استخدم الملقط لسحب الدهون وإزالتها بلطف من الأعضاء والأنسجة ذات الأهمية.
الشكل 1: مساحة عمل نظيفة مع جميع الأدوات اللازمة لإجراء التشريح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: إزالة الجلد وفتح تجاويف الحوض والصدر في الفأر. أ: تثبيت جميع الأطراف. ب: الشق الأولي. ج: فصل الجلد عن اللفافة الكامنة باستخدام المقص. د: قطع الجلد والتحضير لإزالته. (E-G) سحب الجلد عن طريق الالتفاف حول الماوس. (ح) إزالة الجلد تماما من الجانب الظهري. (ط) الإزالة الكاملة للجلد من الجذع ، وإعادة تثبيت أطراف الفأر. ي: فتح البطن. (ك) منظر للبطن المفتوح. (ل) نقل الأعضاء خارج مجال الرؤية. م: إزالة الدهون. (N) منظر لقاع الحوض النظيف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. حصاد USL
- قطع قرون الرحم من المبيضين (الشكل 3B) ، والابتعاد عن مجال الرؤية ، وقطع عند اتصال عنق الرحم (الشكل 3C).
ملاحظة: يمكن تحديد قرون الرحم باتباع الرسم التخطيطي في الشكل 3 أ. ري الأنسجة باستخدام 1x PBS للحفاظ على الترطيب. - قطع الحالب بعيدا عن اتصال المثانة (الشكل 3D).
ملاحظة: هذا لتجنب الالتباس مع USL. - قطع القولون بالقرب من عنق الرحم قدر الإمكان (الشكل 3E ، F).
ملاحظة: ري الأنسجة باستخدام 1x PBS للحفاظ على الترطيب. - ضع الماوس مع لوحة التشريح تحت نطاق التشريح لتصور USLs (الشكل 3G).
- استخدم الملقط برفق لتنظيف الدهون المحيطة من USLs.
ملاحظة: استخدمي زوجا ثانيا من الملقط لتثبيت عنق الرحم بزاوية صغيرة لتحسين تصور مكان تقاطع USL مع عنق الرحم. ري الأنسجة باستخدام 1x PBS للحفاظ على الترطيب. - اربط درز بولي جلاكتين 5-0 حول نهاية عنق الرحم لكلا USLs (الشكل 4B ، C).
ملاحظة: يمكن التعرف على USLs باستخدام الصور التخطيطية والتكبير (الشكل 4I-K) - في هذه الدراسة، يستخدم USL واحد للتحليلات المورفولوجية أو البيوكيميائية (أي مجهر رامان، والكيمياء الهيستولوجية المناعية، وعلم الأنسجة). قطع الطرف العنقي ل USL ، وترك قطعة من عنق الرحم متصلة ، وقطع قطعة من العضلات من أسفل USL (الشكل 4D). ضع الأنسجة التي تم تشريحها في حمام مع 1x PBS للحفاظ على رطوبة الأنسجة (الشكل 4G ، H).
- استخدم USL المتبقي للاختبار الميكانيكي والتصوير. قطع الطرف العنقي ل USL ، مع ترك قطعة من عنق الرحم متصلة ، لتسهيل الإعداد الميكانيكي (الشكل 4D).
ملاحظة: سيعمل نسيج عنق الرحم كمرساة لتأمين USL أثناء الاختبار الميكانيكي. - بمجرد حصاد جميع الأنسجة ذات الأهمية (الخطوات 3-5) ، خلع عظم الفخذ من الحوض (الشكل 4E).
ملاحظة: يجب على المرء أن يسمع صوت نقر خافت عندما يتم فصل رأس الفخذ عن كوب الحق. - قطع عظم الحوض من الأطراف البعيدة والقريبة من عظم الحوض ، وترك حوالي 10 مم من الأنسجة الكلية (الشكل 4F). ضع الأنسجة المشرحة في 1x PBS.
الشكل 3: تنظيف قاع الحوض لتشريح USL. أ: رسم تخطيطي للتشريح. ب: قطع قرني الرحم عند وصلة المبيض. ج: قطع قرون الرحم. د: قطع الحالبين. ه: قطع القولون. (F) رؤية واضحة للمستقيم وUSLs. (ز) وضع الماوس ولوحة التشريح تحت نطاق التشريح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: منظر ل USL والأنسجة المحيطة بها وتشريح USLs . (أ) رسم تخطيطي للمعالم التشريحية المحيطة ب USL. ب: ربط خياطة حول طرفي عنق الرحم. (ج) قطع الأطراف العنقية ل USL. (د) تقطيع USL لاستخدامها في التحليلات الكيميائية الحيوية عند الوصلة المقدسة. ه: قطع عظم الفخذ من عظم الحوض. (و) قطع الطرف القريب من الحوض. (ز) تشريح USL في طبق بتري 35 مم. (H) USL مع الحوض المتصل في طبق بتري 35 مم. (I) USL والمستقيم عند تكبير 0.75x. (ي) إزالة الدهون من USL. (ك) تنظيف USLs عند تكبير 1.0x. شريط المقياس = 2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. حصاد المثانة
- بعد إزالة الدهون ، أمسك المثانة بالملقط ، وارفعها برفق بزاوية 40 درجة تقريبا (الشكل 5 أ).
- باستخدام المقص ، قم بقطع المثانة من الجانب البعيد ، فوق عنق الرحم مباشرة (الشكل 5 ب).
- ضع المنديل في الحمام مع 1x PBS للحفاظ على رطوبة الأنسجة (الشكل 5H).
4. حصاد المستقيم
- بمجرد فصل USLs عن عنق الرحم وتشريح المثانة، ارفعي عنق الرحم بزاوية 40 درجة تقريبا بالملقط. هناك اللفافة المستقيمية المهبلية التي تربط المستقيم وعنق الرحم. باستخدام المشرط ، قم بقطع هذا الاتصال برفق (الشكل 5C ، D).
- قطع عظم العانة في ارتفاق العانة باستخدام مقص. قم بتوسيع مساحة العمل برفق لزيادة الوصول البصري إلى إدخالات الأنسجة.
- باستخدام الملقط ، اسحب المستقيم برفق نحو الصدر ، واستخدم المقص لمتابعة المستقيم من جانبه الخلفي إلى فتحة الشرج. قطع المستقيم في فتحة الشرج (الشكل 5E).
- ضع المنديل في 1x PBS للحفاظ على رطوبة الأنسجة (الشكل 5I).
5. حصاد عنق الرحم المهبلي المعقد
- بعد إزالة USLs من عنق الرحم، استخدمي الملقط لتثبيت عنق الرحم. قطع عنق الرحم بالقرب من الفرج قدر الإمكان باستخدام مقص (الشكل 5F ، G).
ملاحظة: تأكد من قطع ارتفاق العانة لرؤية الطرف البعيد من المهبل بصريا. - ضع المنديل في 1x PBS للحفاظ على رطوبة الأنسجة (الشكل 5J).
الشكل 5: تشريح المثانة والمستقيم وعنق الرحم / المهبل. أ: إمساك المثانة بزاوية. ب: قطع المثانة. ج: قطع الوتر الواصل بين عنق الرحم والمستقيم. د: الوتر عند تكبير 1.0x. ه: قطع المستقيم. (و) التمسك بعنق الرحم بالملقط. (ز) القطع في الطرف البعيد من المهبل. (ح) المثانة في طبق بتري 35 مم. (I) المستقيم في طبق بتري 35 مم. (ي) مجمع أنسجة عنق الرحم والمهبل في طبق بتري 35 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. إعداد عينة لتوصيف الأنسجة
- التحليلات الميكانيكية والبصرية ل USL
- ضع USL مع ملحق الحوض فوق جدار على شكل حرف T داخل بئر تلطيخ مخصص لضمان الانغماس الكامل في محلول التلوين (يمكن العثور على رسومات CAD للبئر في ملف الترميز التكميلي 1 وملف الترميز التكميلي 2).
ملاحظة: استخدم الخيط والملقط للمساعدة في التنسيب. - قم بتخفيف صبغة متاحة تجاريا تلطخ مجموعات الأمين الخالية من البقع (5 ميكرولتر ، انظر جدول المواد) في 2.5 مل من 1x PBS ، وأضف المحلول إلى بئر التلوين المخصص ، وقم بتلطيخ الأنسجة لمدة ساعتين على الروك عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: دوامة الحل قبل إضافته إلى بئر تلطيخ. - خلال آخر 15 دقيقة من التلوين ، أضف 2.5 ميكرولتر من صبغة نوى الخلايا الميتة المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) إلى المحلول.
ملاحظة: دوامة الحل قبل إضافة إلى بئر تلطيخ.
- ضع USL مع ملحق الحوض فوق جدار على شكل حرف T داخل بئر تلطيخ مخصص لضمان الانغماس الكامل في محلول التلوين (يمكن العثور على رسومات CAD للبئر في ملف الترميز التكميلي 1 وملف الترميز التكميلي 2).
- تحليل رامان للمثقفين الجامعيين (USLs)
- قم بتثبيت USL في خط مستقيم على كتلة polydimethylsiloxane (PDMS) الموجودة في بئر مخصص.
ملاحظة: يتم استخدام PDMS كركيزة ناعمة لتمكين تثبيت العينة في التكوين المطلوب. يمكن صنع كتل ذات أبعاد مختلفة عن طريق خلط المكونين باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) ، والصب في طبق بتري ، وبعد البلمرة ، قطع PDMS إلى الهندسة المطلوبة بشفرة مشرط. - دبوس مع دبابيس الحشرات في حلقة خياطة وفي عضلة الحوض. رطب الأنسجة مع 1x PBS.
- قم بتثبيت USL في خط مستقيم على كتلة polydimethylsiloxane (PDMS) الموجودة في بئر مخصص.
- الأنسجة المتبقية
- قم بتجميد الأنسجة المتبقية باستخدام النيتروجين السائل أو في مركب تضمين مناسب ، اعتمادا على التحليلات المطلوبة.
- احفظ الأنسجة عند -80 درجة مئوية حتى التحليلات اللاحقة (على سبيل المثال ، المقايسات المناعية أو الكيميائية الحيوية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تفصيل كل خطوة من خطوات تشريح الماوس من النوع البري في الفيديو المرتبط والأرقام المتعلقة بالبروتوكول. في هذه الدراسة ، تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 6 أسابيع (الجدول التكميلي 1). تم تحليل ثلاث مجموعات عينات مع USLs المعالجة بإنزيمات مختلفة: المجموعة الضابطة (بدون علاج) ، والمجموعات المعالجة بالكولاجيناز ، والمجموعات المعالجة بالكوندرويتيناز. العضلات الملساء والأعصاب والخلايا اللمفاوية في USL محاطة بوحدة تحكم إلكترونية غنية بالكولاجين الليفي والجليكوزامينوجليكان (GAGs)5، والتي يعتقد أنها توفر السلامة الميكانيكية للأنسجة. تم اختيار المعالجات الإنزيمية لتعطيل مكونات ECM هذه وإثبات جدوى حل الاختلافات الكيميائية الحيوية والميكانيكية باستخدام التحليل الطيفي Raman والاختبار الميكانيكي (الشد).
للهضم، تم وضع جميع USLs في خلاط حراري لمدة 3 ساعات في محلول 1 مل عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة. تم وضع USLs الضابطة في محلول 1x PBS ، وتم وضع USLs المعالجة بالكولاجيناز في محلول من 1.0 U / mL كولاجيناز من النوع الأول ، وتم وضع USLs المعالجة بالكوندرويتيناز في محلول 2.0 U / mL chondroitinase ABC (انظر جدول المواد).
تم إعداد USLs للاختبار الميكانيكي بناء على الخطوة 6.1. تم وضع العينات في غرفة تحميل مخصصة (يمكن العثور على رسم CAD للغرفة في ملف الترميز التكميلي 3) لبروتوكول الاختبار الميكانيكي12. تم تثبيت الحوض في تكوين ثابت ، وتم ربط الطرف العنقي ل USL بمشغل عوامة ، والذي استند إلى التصميم الموصوف في Jimenez et al.12 (الشكل 6B; ملف الترميز التكميلي 4) ، تحت مجهر متحد البؤر قائم ومتصل بخلية تحميل 100 مللي نيوتن (الشكل 6 أ). يقلل نظام العوامة من الضوضاء التي يسببها ذراع المشغل عند قياس القوة12. تم استخدام تحميل أولي يبلغ حوالي 500 μN لتعيين التكوين المرجعي ل USL ، وتم تصوير كل USL أثناء وجوده في هذا الموضع. بعد ذلك ، تم تطبيق إزاحة عالمية تبلغ 750 ميكرومتر والاحتفاظ بها لمدة 5 دقائق قبل التصوير مرة أخرى. ثم أعيدت USL إلى التكوين المرجعي، وتكررت هذه العملية لإزاحة عالمية قدرها 1000 ميكرومتر. تم اتباع هذا البروتوكول لجميع مجموعات العينات الثلاث (n = 1 / مجموعة) للحصول على منحنيات استرخاء الإجهاد (الشكل 7) ، وتم تحديد ضغوط الذروة والتوازن التي صمدت أمام كل USL (الجدول 1). تم حساب الإجهاد بقسمة القوة المقاسة على متوسط مساحة المقطع العرضي (الجدول التكميلي 2 والجدول التكميلي 3).
الشكل 6: إعداد الاختبار الميكانيكي . (أ) غرفة التحميل تحت المجهر متحد البؤر ومتصلة بالمشغل. (ب) USL في غرفة التحميل؛ يبقى الحوض ثابتا ، بينما ترتبط نهاية عنق الرحم بنظام عوامة مترابط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: مخطط انبساط الإجهاد المحوري العياني لمصابيح USLs للفئران التي خضعت لعلاجات إنزيمية مختلفة. يبدو أن العلاج بالإنزيم يقلل من متوسط الذروة المحورية ويخفف من الضغوط التي يتعرض لها USL عند عمليات النزوح العالمية الموصوفة. (*) يشير إلى قيم الإجهاد المريحة ، والتي تم قياسها بعد 200 ثانية من ذروة الإجهاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عينة | النزوح العالمي (ميكرومتر) | ذروة الإجهاد (كيلو باسكال) | إجهاد التوازن المريح (كيلو باسكال) |
| تحكم | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| كولاجيناز- معالج | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| علاج شوندرويتيناز | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
الجدول 1: تأثير العلاج بالإنزيم على قياسات الإجهاد ل USLs.
من الصور الملتقطة (الشكل 8) ، تم تقدير حقول الإجهاد باستخدام مزيج من تتبع نسيج الرباط اليدوي والتلقائي ("وظيفة imregdemons" في MATLAB) للرباط بين الحالة المرجعية (غير المحملة) والحالة المشوهة13. تم إجراء التتبع اليدوي عن طريق اختيار نفس نوى الخلية في الصور المرجعية والمشوهة. تم حساب حقول سلالة جرين-لاغرانج من حقول الإزاحة المقدرة (الشكل 9). تم حساب متوسط السلالات المحورية (E11) للجزء الوسيط من كل عينة (الجدول 2).
الشكل 8: صور الحالات المشوهة والمرجعية لعينة مراقبة (غير معالجة) بعد الإزاحات العالمية. أ: إزاحة عالمية مقدارها 750 ميكرومتر. (ب) إزاحة عالمية مقدارها 1000 ميكرومتر. يمثل اللون الأخضر الحالة المرجعية ، والأرجواني هو الحالة المشوهة (شريط المقياس = 500 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: تقدير حقول الإجهاد. أظهرت حقول الانفعال المقدرة للعينات في كل مجموعة معالجة أن السلالات المحورية (E11) والمستعرضة (E22) والقص (E12) كانت غير متجانسة مكانيا ، وزادت السلالة المحورية مع زيادة الإزاحة المطبقة (δ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| النزوح العالمي (ميكرومتر) | تحكم | المعالجة بالكولاجين | علاج شوندرويتيناز |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
الجدول 2: متوسط السلالات المحورية. يشير متوسط السلالات المحورية لكل عينة مختبرة ميكانيكيا إلى أن السلالة المحورية العالمية في العينات المعالجة بالإنزيم كانت مماثلة أو أكبر من عينة التحكم ، مما يشير إلى أن الانخفاض في الإجهاد العياني كان بسبب العلاج بالإنزيم وليس السلالات الأصغر.
تم إجراء مطيافية رامان متحدة البؤر (ليزر 785 نانومتر، حجم بقعة 1.06 ميكرومتر) على USLs المعدة كما هو موضح في الخطوات 6.2 وبعد O'Brien et al.14 لتقييم الكيمياء الحيوية للأنسجة بشكل شبه كمي. تم تحديد الأشعة الكونية وإزالتها ، وتم طرح خط الأساس الخطي ، وتم تطبيع الشدة لكل طيف. تمت مقارنة نفس مجموعات العلاج (ن = 3 / مجموعة). يتم عرض الأطياف التمثيلية للقسم الوسيط من كل USL (الشكل 10) ، وكذلك الأطراف العنقية والعجزية (الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2).
الشكل 10: تأثير العلاج بالإنزيم على تركيب USL. يشير التحليل الطيفي لرامان في القسم الوسيط USL إلى أن العلاجات بالإنزيم غيرت التركيب الكيميائي الحيوي ل USL الفأر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ارتبطت القمم بمكونات بيولوجية مختلفة بناء على التحليل الطيفي لرامان في الجسم الحي لعنق الرحم البشري الذي أجراه أوبراين وآخرون.15. تم تطبيع بياناتنا باستخدام ذروة فوسفاتيديل إيثانولامين (1,769 نانومتر) ، وهو فوسفوليبيد موجود في أغشية الخلايا ، والذي يجب أن يظل دون تغيير بعد العلاجات الأنزيمية. كشفت المقارنة عبر الأطياف التمثيلية أن محتوى الماء والكولاجين وحمض الهيالورونيك والبروتيوغليكان و GAGs قد انخفض في كل من USLs المعالجة بالكولاجيناز والمعالجة بالكوندرويتيناز (الشكل 10 ، الشكل التكميلي 1 ، والشكل التكميلي 2).
الشكل التكميلي 1: تأثير العلاج بالإنزيم على تركيب USL. يشير التحليل الطيفي لرامان في قسم عنق الرحم USL إلى أن العلاجات بالإنزيم غيرت التركيب الكيميائي الحيوي ل USL الفأر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: تأثير العلاج بالإنزيم على تركيب USL. يشير التحليل الطيفي لرامان في القسم العجزي USL إلى أن العلاجات بالإنزيم غيرت التركيب الكيميائي الحيوي للفأر USL. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: الوزن والعمر وتحليل USL للفئران المستخدمة في الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 2: تأثير العلاج بالإنزيم على قياسات قوة USL. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 3: حسابات المساحة المقطعية لUSLs المختبرة ميكانيكيا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 1: ملف CAD لتلطيخ البئر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 2: ملف CAD لتلطيخ غطاء البئر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 3: ملف CAD لغرفة التحميل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 4: ملف CAD لنظام العوامة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ولم يدرس تأثير الضرر الهيكلي على الأنسجة التناسلية الأنثوية، وهناك حاجة إلى نموذج حيواني يسهل الوصول إليه لبحوث الملوثات العضوية الثابتة. الفأر هو نموذج فعال من حيث التكلفة يمكن أن يحاكي الدراسات التناسلية البشرية16. بسبب الاهتمام المتزايد بدراسة الجهاز التناسلي للأنثى ، هناك حاجة إلى طرق تساعد في دراسة هذه الأنسجة. لتلبية هذه الحاجة ، في هذا العمل ، تم إنشاء طريقة لتشريح وإعداد أنسجة قاع الحوض الفئران للتحليلات الهيكلية والوظيفية.
لنجاح التشريح ، هناك حاجة إلى الوقت الكافي والرعاية. الأنسجة التناسلية للفأر صغيرة وهشة. يجب الاهتمام بالتفاصيل، خاصة أثناء إزالة الدهون المحيطة ب USL وأعضاء الحوض، لتجنب إتلاف USL أو الأنسجة الأخرى عند إزالة الدهون. من المهم استخدام مجهر التشريح للمساعدة في تحديد الاختلافات بين USL والدهون ، والتي يمكن للعين غير المدربة أن تخلطها بسهولة. يمكن أن تكون إزالة الحالب مفيدة لتجنب الالتباس مع USL، حيث أن نقاط الإدخال إلى المثانة وعنق الرحم قريبة من بعضها البعض. عند ربط الخيط حول USL، يجب توخي الحذر لتجنب ثقب أي نسيج باستخدام ملقط لرفع USLs برفق لتوفير مساحة للإبرة. لاستخراج USLs ، قد يكون من الصعب تحديد بنية الأنسجة الصحيحة والمعالم التشريحية الرئيسية ، ولكن مع هذه الطريقة والممارسة ، ستكون نتائج التشريح قابلة للتكرار.
تحدد الطريقة المقترحة إجراء مفصلا لتشريح أنسجة قاع الحوض من عينة واحدة. أحد القيود هو أنه لا يمكن الحفاظ على جميع الأنسجة سليمة تماما لأن قطعة من عنق الرحم تظل متصلة ب USL الذي تم تشريحه ليكون بمثابة مرساة أثناء الاختبار الميكانيكي والمساعدة في تحديد الاتجاه. هناك قيد آخر هو أن تشريح الفأر والتشريح البشري لهما اختلافات في شكل الأنسجة وحجمها واتجاهها9. تم فحص الملوثات العضوية الثابتة باستخدام العديد من النماذج الحيوانية ، مثل القوارض 17،18 ، الأرانب19،20 الأغنام 20،21 ، الخنازير5،22،23،24 ، والرئيسيات غير البشرية 25،26 ، وكذلك في الجثث البشرية 24،26،27، وركزت بعض هذه النماذج على دور USL. في حين أن كل نموذج من هذه النماذج مفيد لدراسة الملوثات العضوية الثابتة ، فإن الفائدة الإضافية للفأر هي سهولة التلاعب الجيني لإنشاء نماذج مرض جديدة ، وهو أمر غير ممكن في الحيوانات الأكبرحجما 27.
من أجل الاستفادة من الفأر كنموذج، تم تطوير هذه الطريقة للمساعدة في التشريح الناجح للمثقفين الجامعيين الجامعيين (USLs) وإعداد الأنسجة لإجراء تحليلات مختلفة، بما في ذلك الاختبارات الميكانيكية، ومجهر رامان، والكيمياء الهيستولوجية المناعية، والمقايسات البيوكيميائية. باستخدام هذه الطريقة، من الممكن استخراج USL بوصلته التشريحية لتحديد اتجاهه، وربط USL، واختبار USL ميكانيكيا في ظروف مشابهة لتلك الموجودة في الجسم الحي.
تستمد السلامة الميكانيكية ل USL من مكونات ECM ، بما في ذلك الكولاجين والبروتيوغليكان و GAGs. الكولاجين من النوع الأول هو بروتين رئيسي حامل للشد، ويعتقد أن تلف مكون ECM هذا يساهم في فشل USL والملوثات العضوية الثابتة. في هذا الإجراء، تمت مقارنة معالجتين إنزيميتين مختلفتين لاختبار مدى تأثير اختلاف تركيبة ECM على الاستجابة الميكانيكية وتكوين USL. اقترح التحليل الميكانيكي أن الكولاجين و GAGs ساهما في الصلابة المحورية ل USL ، مما قلل من متوسط الذروة المحورية وضغوط التوازن (الشكل 7). شهدت USLs المعالجة بالإنزيم سلالة محورية متوسطة مماثلة أو أكبر (الجدول 2). أظهر التحليل الطيفي لرامان أن USL المعالج بالكولاجيناز قد قلل من محتوى الكولاجين ، بالإضافة إلى انخفاض الماء وحمض الهيالورونيك ، في حين أن USL المعالج بالكوندرويتيناز يحتوي على حمض الهيالورونيك أقل ، بالإضافة إلى انخفاض محتوى الماء والكولاجين. لهذه النتائج ، تحقق التحليل الطيفي رامان من أن المكونات قد تمت إزالتها بسبب الهضم. من المتوقع أن تجعل هذه الطريقة الدراسات القائمة على قاع الحوض أكثر سهولة وزيادة عدد الباحثين الذين يركزون على هذه المنطقة غير المدروسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة برنامج فرص البحث تحت الأرض الصيفية CU Boulder (UROP) (CB) ، وزمالة أبحاث الدراسات العليا NSF (LS) ، وزمالة شميدت للعلوم (CL) ، وبرنامج منحة البذور للأبحاث والابتكار بجامعة كولورادو (جائزة 2020 إلى VF و SC و KC) ، ومنحة Anschutz Boulder Nexus Seed في جامعة كولورادو (إلى VF و KC). شكر خاص للدكتور تايلر تاتل للمساعدة في تصميم غرفة التحميل وكذلك أعضاء مختبر Calve لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y.
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D.
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O'Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
