Summary
本文提出了解剖子宫骶韧带和其他盆底组织（包括小鼠的子宫颈、直肠和膀胱）的详细方案，以扩大对女性生殖组织的研究。
Abstract
盆腔器官脱垂 （POP） 是一种影响盆底完整性、结构和机械支撑的疾病。骨盆底的器官由不同的解剖结构支撑，包括肌肉、韧带和骨盆筋膜。子宫骶韧带 （USL） 是一种关键的承重结构，USL 损伤导致发生 POP 的风险更高。本协议描述了小鼠USL和盆底器官的解剖，以及使用拉曼光谱获取有关USL生化组成和功能的独特数据以及机械行为的评估。小鼠是临床前研究的宝贵模型，但解剖小鼠USL是一个困难而复杂的过程。该程序提供了一种指导解剖鼠盆底组织（包括USL）的方法，以实现多种评估和表征。这项工作旨在帮助基础科学家和工程师解剖盆底组织，从而扩大USL和盆底条件研究以及使用小鼠模型进行女性健康的临床前研究的可及性。
Introduction
大约 50% 的女性受盆腔器官脱垂 （POP） 的影响1，2。这些女性中约有11%符合接受手术修复的标准，成功率很低（~30%）3，4。POP的特征是由于USL和盆底肌肉无法提供足够的支撑，任何或所有盆腔器官（即膀胱，子宫，子宫颈和直肠）从其自然位置下降5。除了诱发因素3，6外，这种情况还涉及解剖功能障碍和结缔组织的破坏，以及神经肌肉损伤。POP 与多种因素相关，例如年龄、体重、胎次和分娩类型（即阴道分娩或剖腹产）。这些因素被认为会影响所有盆底组织的机械完整性，怀孕和胎次被认为是POP5，7，8的主要驱动因素。
子宫骶韧带 （USL） 是子宫、子宫颈和阴道的重要支撑结构，并将子宫颈与骶骨相连4.对USL的损害使妇女患POP的风险增加。据信，怀孕和分娩会给USL带来额外的压力，这可能会诱发损伤并增加POP的机会。USL 是由沿韧带异质分布的平滑肌细胞、血管和淋巴管组成的复杂组织，可分为三个不同的部分：颈部、中间和骶区9。USL 的机械完整性来源于细胞外基质 （ECM） 成分，如胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖5、9、10。已知 I 型胶原纤维是韧带组织的主要承重拉伸成分，因此可能与 USL 衰竭和 POP11 有关。
目前还缺乏关于持久性有机污染物在妇女中的病因、患病率和影响的知识。开发适当的POP动物模型对于促进我们对女性盆底的理解是必要的。小鼠和人类在骨盆内具有相似的解剖标志，例如输尿管，直肠，膀胱，卵巢和圆形韧带9，以及USL与子宫，子宫颈和骶骨的相似交点。此外，小鼠提供了遗传操作的便利性，并有可能成为POP9研究的易于获得，具有成本效益的模型。
这项研究开发了一种从未生育（即从未怀孕）小鼠中获取和分离USL和不同盆底组织的方法。对提取的USL进行酶消化（即去除胶原蛋白和糖胺聚糖），测试以确定拉伸载荷下的机械响应，并在概念验证研究中评估生化成分。分离完整组织的能力将有助于进一步对骨盆底成分进行机械和生化表征，这是提高我们对分娩、怀孕和 POP 相关损伤风险的理解的关键第一步。
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Protocol
所有动物实验和程序均根据科罗拉多大学博尔德分校动物护理和使用委员会批准的协议#2705进行。6周龄雌性C57BL / 6J小鼠用于本研究。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 动物制备
- 按照机构批准的方法对动物实施安乐死。
注意：本研究使用符合美国兽医协会指南的CO 2吸入（置换率为腔室体积的30%至70%，每分钟CO2），然后颈椎脱位，以确保成功安乐死。- 如果可能的话，在引擎盖下工作，以尽量减少小鼠过敏原的传播。一旦鼠标停止移动和呼吸，等待 2 分钟或更长时间以验证无反应。
注意：如果小鼠怀孕或产后，幼崽必须单独安乐死。在解剖过程中，必须将幼犬 E15.5 及以上斩首。
- 如果可能的话，在引擎盖下工作，以尽量减少小鼠过敏原的传播。一旦鼠标停止移动和呼吸，等待 2 分钟或更长时间以验证无反应。
- 用解剖垫，11刀片手术刀，弯曲的细尖剪刀，两对镊子，弯曲的镊子，5-0聚乳糖缝合线，解剖显微镜和六个针准备解剖装置（图1，见 材料表）。
- 将鼠标放在垫上，然后将前肢向下固定（图2A）。用剪刀在腹部切开约1-1.5厘米的切口（图2B）。轻轻地使用剪刀将切口的颅骨，尾部和侧面的皮肤分开（图2C，D）。
- 将鼠标翻转到其背面，然后轻轻地将皮肤剥离到后肢，以将皮肤从解剖部位移开（图2E-H）。
- 将鼠标固定在四肢上（图2I），并在腹部从胸部到骨盆切开约1厘米的切口（图2J）。
注意：确保不要损坏下面的器官。 - 轻轻地将器官推向胸部以清除视野（图2K）。
注意：用 1x PBS 冲洗组织以保持水分。 - 清除骨盆底的所有脂肪组织（图2L-N）。
注意：使用镊子轻轻拉出并清除感兴趣的器官和组织中的脂肪。
图 1：干净的工作区，包含执行解剖所需的所有工具。 请点击此处查看此图的大图。
图2：去除小鼠的皮肤并打开骨盆和胸腔。 （A）固定所有四肢。（B） 初始切口。（C）用剪刀将皮肤与下面的筋膜分开。（D）切割皮肤并准备去除。（E-G）通过绕过鼠标将皮肤拉下来。（H）从背侧完全去除皮肤。（I）从躯干上完全去除皮肤，并重新固定小鼠四肢。（J） 开腹。（K）开放腹部的视图。（L）将器官移出视野。（M） 去除脂肪。（N）清除的骨盆底视图。请点击此处查看此图的大图。
2. USL 收获
- 从卵巢上切下子宫角（图3B），拉离视野，并在宫颈连接处切断（图3C）。
注意：子宫角可以按照图 3A中的原理图进行识别。用 1x PBS 冲洗组织以保持水分。 - 将输尿管从膀胱连接处切开（图3D）。
注意：这是为了避免与 USL 混淆。 - 将结肠切得尽可能靠近子宫颈（图3E，F）。
注意：用 1x PBS 冲洗组织以保持水分。 - 将鼠标和解剖垫一起放在解剖镜下方以可视化 USL（图 3G）。
- 轻轻地用镊子清除USL周围的脂肪。
注意：使用第二对镊子以小角度将子宫颈向上支撑，以增强USL与子宫颈相交位置的可视化。用 1x PBS 冲洗组织以保持水分。 - 在两个USL的颈端周围绑一条5-0多乳糖缝合线（图4B，C）。
注意：可以使用原理图和放大图像识别 USL（图 4I-K） - 在这项研究中，一种USL用于形态学或生化分析（即拉曼显微镜，免疫组织化学，组织学）。切开USL的颈端，留下一块子宫颈附着，并从USL底部切下一块肌肉（图4D）。将解剖的组织放入具有1x PBS的浴中以保持组织水分（图4G，H）。
- 使用剩余的 USL 进行机械测试和映像。切开USL的颈端，留下一块子宫颈，以方便机械设置（图4D）。
注意：在机械测试期间，宫颈组织将充当固定USL的锚。 - 一旦收获了所有感兴趣的组织（步骤3-5），将股骨从骨盆脱位（图4E）。
注意：当股骨头与髋臼杯脱节时，应听到微弱的咔嗒声。 - 从盆骨的远端和近端切开盆骨，留下约10毫米的总组织（图4F）。将解剖的组织置于1x PBS中。
图 3：用于 USL 解剖的清除盆底 。 （A）解剖示意图。（B）在卵巢连接处切割子宫角。（三）切掉子宫角。（D） 切断输尿管。（E） 切结肠。（F）直肠和USL的清晰视图。（G）将鼠标和解剖垫放在解剖镜下。 请点击此处查看此图的大图。
图4：USL和周围组织的视图以及USL的解剖。 （A）USL周围的解剖标志示意图。（B）在颈椎末端绑一根缝合线。（C）切掉USL的颈端。（D）切下USL以用于骶连接处的生化分析。（E）从盆骨上切开股骨。（F）切断骨盆的近端。（G）在35毫米培养皿中解剖USL。（H） USL与附着的骨盆在35毫米培养皿中。（I） 0.75倍放大倍率下的USL和直肠。（J） 去除USL中的脂肪。（K） 以1.0倍放大倍率清洁USL。比例尺 = 2 mm。请点击此处查看此图的大图。
3. 膀胱摘取
- 脂肪清除后，用镊子握住膀胱，并以大约40°的角度轻轻提起（图5A）。
- 用剪刀从子宫颈正上方的远端切掉膀胱（图5B）。
- 将组织放入具有1x PBS的浴中以保持组织水分（图5H）。
4. 直肠摘取术
- 一旦 USL 与子宫颈断开并解剖膀胱，用镊子以大约 40° 的角度提起子宫颈。有连接直肠和子宫颈的直肠阴道筋膜。用手术刀轻轻切断这个连接（图5C，D）。
- 用剪刀在耻骨联合处剪开耻骨。轻轻地扩大工作空间，以增加对组织插入物的视觉访问。
- 用镊子轻轻地将直肠拉向胸部，然后用剪刀沿着直肠从其后侧到肛门。在肛门处切开直肠（图5E）。
- 将组织置于1x PBS中以保持组织水分（图5I）。
5. 子宫颈阴道复合体摘取
- 从子宫颈取出 USL 后，用镊子固定子宫颈。用剪刀尽可能靠近外阴剪开子宫颈（图5F，G）。
注意：确保切开耻骨联合，以目视阴道远端。 - 将组织置于1x PBS中以保持组织水分（图5J）。
图 5：膀胱、直肠和子宫颈/阴道夹层 。 （A） 保持膀胱一定角度。（B）切断膀胱。（C）切断连接子宫颈和直肠的肌腱。（D）1.0倍放大倍率下的肌腱。（E）切开直肠。（F）用镊子抓住子宫颈。（G）在阴道远端切开。（H）膀胱在35毫米培养皿中。（I）35毫米培养皿中的直肠。（J）35毫米培养皿中的子宫颈阴道组织复合物。 请点击此处查看此图的大图。
6. 用于组织表征的样品制备
- USL的机械和视觉分析
- 将带有骨盆附件的USL放在定制染色孔内的T形壁上，以确保完全浸入染色溶液中（孔的CAD图纸可在补充编码文件1和补充编码文件2中找到）。
注意：使用缝合线和镊子来帮助放置。 - 在2.5mL的1x PBS中稀释对游离胺基团（5μL，参见 材料表）进行染色的市售染料，将溶液添加到定制染色孔中，并在4°C的摇臂上染色组织2小时。
注意：在将溶液添加到染色孔之前，请涡旋溶液。 - 在染色的最后 15 分钟内，向溶液中加入 2.5 μL 市售死细胞核染色剂（参见 材料表）。
注意：在加入染色孔之前涡旋溶液。
- 将带有骨盆附件的USL放在定制染色孔内的T形壁上，以确保完全浸入染色溶液中（孔的CAD图纸可在补充编码文件1和补充编码文件2中找到）。
- USL的拉曼分析
- 将 USL 直线固定在定制孔中包含的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 块上。
注意： PDMS 用作软基板，以便将样品固定在所需的配置中。通过按照制造商的说明（见 材料表）混合两种组分，在培养皿中铸造，并在聚合后用手术刀刀片将PDMS切割成所需的几何形状，可以制成不同尺寸的块。 - 在缝合环和骨盆肌肉处用昆虫针别针。用 1x PBS 水合组织。
- 将 USL 直线固定在定制孔中包含的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 块上。
- 剩余组织
- 根据所需的分析，用液氮或适当的包埋化合物快速冷冻剩余的组织。
- 将组织保存在-80°C直至后续分析（例如，免疫组织化学或生化测定）。
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Representative Results
解剖野生型鼠标的每个步骤在与协议相关的相关视频和图中都有详细说明。在本研究中，使用6周龄雌性C57BL / 6J小鼠（补充表1）。分析了用不同酶处理USL的三个样品组：对照组（无处理组），胶原酶处理组和软骨素酶处理组。USL中的平滑肌，神经和淋巴管被富含原纤维胶原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）的ECM包围5，这些物质被认为为组织提供机械完整性。选择酶处理来破坏这些ECM组分，并证明使用拉曼光谱和机械（拉伸）测试解决生化和机械差异的可行性。
为了消化，将所有USL置于热混合器中，在37°C和300rpm的1mL溶液中放置3小时。将对照USL置于1x PBS溶液中，将胶原酶处理的USL置于1.0 U/mL I型胶原酶溶液中，将软骨素酶处理的USL置于2.0 U/mL软骨素酶ABC溶液中（见 材料表）。
机械测试的USL是根据步骤6.1制备的。将样品放置在定制的装载室中（可以在补充编码文件3中找到该室的CAD图纸），用于机械测试协议12。骨盆固定在固定配置中，USL的颈端连接到浮标致动器，该致动器基于Jimenez等人12中描述的设计（图6B;补充编码文件4），在正置共聚焦显微镜下并连接到100 mN称重传感器（图6A）。浮标系统减少了测量力12时由执行器臂引起的噪音。使用大约500 μN的预载荷来设置USL的参考配置，并且在此位置对每个USL进行成像。然后，施加750μm的全局置换并保持5分钟，然后再次成像。然后将USL带回参考配置，并对1，000 μm的全局位移重复此过程。所有三个样品组（n = 1 /组）都遵循该协议以获得应力松弛曲线（图7），并确定每个USL承受的峰值和平衡应力（表1）。通过将测量的力除以平均横截面积来计算应力（补充表2和补充表 3）。
图 6：机械测试设置 。 （A）共聚焦显微镜下的装载室并连接到执行器。（B） 装载室中的USL;骨盆保持静止，而颈椎末端与相互连接的浮标系统相连。 请点击此处查看此图的大图。
图7：不同酶处理下小鼠USL的宏观轴向应力松弛图。 酶处理似乎降低了USL在规定的全球位移下经历的平均轴向峰并放松了应力。（*） 表示松弛应力值，该值是在峰值应力后 200 秒测量的。 请点击此处查看此图的大图。
| 样本 | 全球位移（μm） | 峰值应力（千帕） | 松弛平衡应力 （kPa） |
| 控制 | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| 胶原酶处理 | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| 软骨素酶处理 | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
表1：酶处理对USL应力测量的影响。
根据拍摄的图像（图 8），使用参考（未加载）和变形状态之间的韧带的手动和自动（MATLAB 中的“imregdemons”功能）纹理跟踪的组合估计应变场13。通过在参考图像和变形图像中选择相同的细胞核来完成手动跟踪。根据估计的位移场计算格林-拉格朗日应变场（图9）。计算每个试样中间部分的平均轴向应变（E11）（表2）。
图 8：全局位移后对照（未处理）标本的变形和参考状态图像。 （A） 750 μm 全局位移。（B） 1，000微米的全球位移。绿色代表参考状态，紫色表示变形状态（比例尺= 500 μm）。请点击此处查看此图的大图。
图 9：应变场估计。 各处理组样品的应变场估计表明，轴向（E11）、横向（E22）和剪切（E12）应变在空间上是不均匀的，轴向应变随着施加的位移（δ）的增加而增加。 请点击此处查看此图的大图。
| 全球位移（μm） | 控制 | 胶原酶处理 | 软骨素酶处理 |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
表2：平均轴向应变。 每个力学测试样品的平均轴向应变表明，酶处理样品中的全局轴向应变与对照样品相似或更大，表明宏观应力的降低是由于酶处理而不是较小的菌株。
对按照步骤6.2和O'Brien等人14 制备的USL进行共聚焦拉曼光谱（785nm激光，1.06μm光斑尺寸），以半定量评估组织生物化学。识别并去除宇宙射线，减去线性基线，并对每个光谱的强度进行归一化。比较相同的治疗组（n = 3 /组）。显示了每个USL中间部分（图10）以及宫颈和骶端（补充图1 和 补充图2）的代表性光谱。
图10：酶处理对USL组成的影响。 USL中间部分的拉曼光谱表明，酶处理改变了小鼠USL的生化组成。 请点击此处查看此图的大图。
这些峰与基于O'Brien等人进行的人体子宫颈体内拉曼光谱的不同生物成分相关15。我们的数据使用磷脂酰乙醇胺（1，769nm）的峰进行归一化，磷脂是一种在细胞膜中发现的磷脂，在酶处理后应保持不变。比较代表性光谱显示，胶原酶处理和软骨素酶处理的USL的含水量、胶原蛋白、透明质酸、蛋白聚糖和GAG均降低（图10、补充图1和补充图2）。
补充图1：酶处理对USL组成的影响。 USL宫颈切片的拉曼光谱表明，酶处理改变了小鼠USL的生化组成。 请点击此处下载此文件。
补充图2：酶处理对USL组成的影响。 USL骶部的拉曼光谱表明，酶处理改变了小鼠USL的生化组成。 请点击此处下载此文件。
补充表1：研究中使用的小鼠的体重，年龄和USL分析。请点击此处下载此文件。
补充表2：酶处理对USL力测量的影响。请点击此处下载此文件。
补充表3：机械测试USL的横截面积计算。请点击此处下载此文件。
补充编码文件1：用于染色孔的CAD文件。请点击此处下载此文件。
补充编码文件2：用于染色孔盖的CAD文件。请点击此处下载此文件。
补充编码文件3：装载室的CAD文件。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件4：浮标系统的CAD文件。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
结构损伤对女性生殖组织的影响研究不足，需要一个易于访问的动物模型进行POP研究。小鼠是一种具有成本效益的模型，可以模仿人类生殖研究16。由于对女性生殖系统研究的兴趣日益浓厚，因此需要有助于研究这些组织的方法。为了满足这一需求，在这项工作中，建立了一种解剖和制备小鼠盆底组织以进行结构和功能分析的方法。
为了解剖的成功，需要足够的时间和护理。小鼠生殖组织小而脆弱。需要注意细节，尤其是在清除USL和盆腔器官周围的脂肪时，以避免在去除脂肪时损坏USL或其他组织。使用解剖显微镜来帮助识别USL和脂肪之间的差异非常重要，未经训练的眼睛很容易混淆。移除输尿管有助于避免与USL混淆，因为膀胱和子宫颈的插入点彼此靠近。在USL周围绑线时，必须注意避免刺穿任何组织，使用镊子轻轻提起USL，为针头腾出空间。为了提取USL，识别正确的组织结构和关键的解剖标志可能很困难，但通过这种方法和实践，解剖结果将是可重复的。
所提出的方法概述了从单个标本中解剖盆底组织的详细程序。一个限制是不可能保持所有组织完全完整，因为子宫颈的一部分仍然附着在解剖的USL上，以在机械测试期间充当锚并帮助确定方向。另一个限制是小鼠解剖学和人体解剖学在组织形状、大小和方向上存在差异9.POP已经使用几种动物模型进行了研究，例如啮齿动物17，18，兔子19，20绵羊20，21，猪5，22，23，24和非人灵长类动物25，26，以及人类尸体24，26，27，其中一些模型侧重于USL的作用。虽然这些模型中的每一个都有利于POP的研究，但小鼠的另一个好处是易于进行基因操作以创建新的疾病模型，这在大型动物中是不可能的27。
为了利用小鼠作为模型，开发了该方法以帮助成功解剖USL和准备组织以进行各种分析，包括机械测试，拉曼显微镜，免疫组织化学和生化测定。使用这种方法，可以提取USL及其解剖学连接，以确定其方向，系住USL，并在类似于 体内发现的条件下机械测试USL。
USL 的机械完整性来源于 ECM 成分，包括胶原蛋白、蛋白聚糖和 GAG。I型胶原蛋白是一种主要的拉伸承重蛋白，这种ECM成分的损伤被认为是导致USL衰竭和POP的原因。在此过程中，比较了两种不同的酶处理，以测试ECM组成的变化如何影响USL的机械反应和组成。力学分析表明，胶原蛋白和GAG有助于USL的轴向刚度，降低平均轴向峰值和平衡应力（图7）。酶处理的USL经历了相似或更大的平均轴向应变（表2）。拉曼光谱表明，胶原酶处理的USL降低了胶原蛋白含量，以及水和透明质酸的减少，而软骨素酶处理的USL具有较少的透明质酸，以及较低的水和胶原蛋白含量。对于这些结果，拉曼光谱验证了由于消化而去除的组分。预计这种方法将使基于骨盆底的研究更容易获得，并增加专注于这一研究不足领域的研究人员数量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了CU Boulder夏季地下研究机会计划（UROP）资助（C.B.），NSF研究生研究奖学金（L.S.），施密特科学奖学金（C.L.），科罗拉多大学研究与创新种子资助计划（2020年授予V.F.，S.C.和K.C.）和科罗拉多大学的Anschutz Boulder Nexus种子资助（授予V.F.和K.C.）。特别感谢 Tyler Tuttle 博士在装载室设计方面的帮助，以及 Calve 实验室成员的有益讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
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