Summary
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for dissekering av uterosacral leddbånd og andre bekkenbunnsvev, inkludert livmorhalsen, endetarmen og blæren hos mus, for å utvide studien av kvinnelige reproduktive vev.
Abstract
Pelvic organ prolaps (POP) er en tilstand som påvirker integriteten, strukturen og mekanisk støtte av bekkenbunnen. Organene i bekkenbunnen støttes av forskjellige anatomiske strukturer, inkludert muskler, leddbånd og bekkenfascia. Uterosacral ligament (USL) er en kritisk bærende struktur, og skade på USL resulterer i en høyere risiko for å utvikle POP. Denne protokollen beskriver disseksjon av murine USL og bekkenbunnsorganene sammen med innsamling av unike data om USL biokjemiske sammensetning og funksjon ved hjelp av Raman-spektroskopi og evaluering av mekanisk oppførsel. Mus er en uvurderlig modell for preklinisk forskning, men dissekering av murine USL er en vanskelig og intrikat prosess. Denne prosedyren presenterer en tilnærming for å veilede disseksjonen av murine bekkenbunnsvev, inkludert USL, for å muliggjøre flere vurderinger og karakterisering. Dette arbeidet tar sikte på å hjelpe disseksjon av bekkenbunnsvev av grunnleggende forskere og ingeniører, og dermed utvide tilgjengeligheten til forskning på USL og bekkenbunnsforhold og den prekliniske studien av kvinners helse ved hjelp av musemodeller.
Introduction
Omtrent 50% av kvinnene er rammet av bekkenorganprolaps (POP)1,2. Omtrent 11% av disse kvinnene passer kriteriene for å gjennomgå kirurgisk reparasjon, som har en dårlig suksessrate (~ 30%)3,4. POP er preget av nedstigningen av noen eller alle bekkenorganene (dvs. blære, livmor, livmorhals og endetarm) fra deres naturlige posisjon på grunn av svikt i USL og bekkenbunnsmusklene for å gi tilstrekkelig støtte5. Denne tilstanden innebærer anatomisk dysfunksjon og forstyrrelse av bindevevet, samt nevromuskulær skade, i tillegg til predisponerende faktorer 3,6. POP er forbundet med flere faktorer som alder, vekt, paritet og leveringstype (dvs. vaginale eller keiserlige fødsler). Disse faktorene antas å påvirke den mekaniske integriteten til alle bekkenbunnsvevene, med graviditet og paritet antatt å være de viktigste driverne for POP 5,7,8.
Uterosacral ligaments (USLs) er viktige støttestrukturer for livmor, livmorhals og vagina og binder livmorhalsen til sakrummet4. Skader på USL setter kvinner i økt risiko for å utvikle POP. Det antas at graviditet og fødsel påfører USL ekstra belastning, noe som potensielt induserer skade og øker sjansene for POP. USL er et komplekst vev sammensatt av glatte muskelceller, blodkar og lymfe fordelt heterogent langs ligamentet, som kan deles inn i tre forskjellige seksjoner: livmorhalskreft, mellomliggende og sakral region9. Den mekaniske integriteten til USL er avledet fra ekstracellulære matrikskomponenter (ECM) som kollagen, elastin og proteoglykaner 5,9,10. Type I kollagenfibre er kjent for å være en viktig bærende strekkkomponent i ligamentøst vev og er derfor sannsynligvis involvert i USL-svikt og POP11.
Det mangler kunnskap om årsaker, utbredelse og effekter av POP hos kvinner. Utviklingen av en passende dyremodell av POP er nødvendig for å fremme vår forståelse av den kvinnelige bekkenbunnen. Mus og mennesker har lignende anatomiske landemerker i bekkenet, som urinledere, endetarm, blære, eggstokker og runde leddbånd9, samt lignende skjæringspunkter i USL med livmor, livmorhals og sakrum. Videre tilbyr mus enkel genetisk manipulasjon og har potensial til å være en lett tilgjengelig, kostnadseffektiv modell for studiet av POP9.
Denne studien utviklet en metode for å få tilgang til og isolere USL og de forskjellige bekkenbunnsvevene fra nulliparøse (dvs. aldri gravide) mus. De ekstraherte USLene ble utsatt for enzymatisk fordøyelse (dvs. å fjerne kollagener og glykosaminoglykaner), testet for å bestemme den mekaniske responsen under strekkbelastning, og evaluert for biokjemisk sammensetning i en proof-of-concept-studie. Evnen til å isolere intakte vev vil legge til rette for ytterligere mekaniske og biokjemiske karakteriseringer av bekkenbunnskomponentene, noe som er et viktig første skritt mot å forbedre vår forståelse av skaderisikoen knyttet til fødsel, graviditet og POP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk og prosedyrer ble utført i henhold til protokoll #2705, godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of Colorado Boulder. Seks uker gamle kvinnelige C57BL/6J-mus ble brukt til denne studien. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell).
1. Dyr forberedelse
- Avlive dyret etter institusjonelt godkjent metode.
MERK: Den foreliggende studien brukte CO 2 -innånding i samsvar med American Veterinary Medical Associations retningslinjer (en forskyvningshastighet på 30% til 70% av kammervolumet med CO2 per minutt), etterfulgt av cervikal dislokasjon, for å sikre vellykket avlivning.- Arbeid under en hette, om mulig, for å minimere spredningen av musallergener. Når musen slutter å bevege seg og puste, la 2 minutter eller mer bekrefte mangelen på respons.
MERK: Hvis musen er drektig eller etter fødselen, må valpene avlives individuelt. Valper E15.5 og eldre må halshugges under disseksjonen.
- Arbeid under en hette, om mulig, for å minimere spredningen av musallergener. Når musen slutter å bevege seg og puste, la 2 minutter eller mer bekrefte mangelen på respons.
- Forbered disseksjonsoppsettet med en disseksjonspute, en 11-blads skalpell, buet tynn skarp saks, to par tang, buet tang, 5-0 polyglaktinsutur, et dissekerende mikroskop og seks pinner (figur 1, se materialtabell).
- Plasser musen på puten, og fest forbenene ned (figur 2A). Gjør et snitt på ca 1-1,5 cm i magen med saks (figur 2B). Bruk saksen forsiktig til å skille huden på kranial-, caudal- og laterale sider av snittet (figur 2C, D).
- Vend musen til dorsalsiden, og riv forsiktig av huden mot baklemmene for å fjerne huden bort fra disseksjonsstedet (figur 2E-H).
- Fest musen til ekstremitetene (figur 2I), og gjør et snitt på ca. 1 cm inn i abdomen fra thorax til bekken (figur 2J).
MERK: Pass på at du ikke skader de underliggende organene. - Skyv organene forsiktig mot brystkassen for å fjerne synsfeltet (figur 2K).
NOTAT: Skyll vevet med 1x PBS for å opprettholde hydrering. - Fjern alt fettvevet fra bekkenbunnen (figur 2L-N).
MERK: Bruk tang til å forsiktig trekke og fjerne fett av organer og vev av interesse.
Figur 1: Et rent arbeidsområde med alle verktøyene som trengs for å utføre disseksjonene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Fjerning av hud og åpning av musens bekken- og thoraxhulrom. (A) Pinning ned alle lemmer. (B) Innledende snitt. (C) Separere huden fra underliggende fascia ved hjelp av saks. (D) Skjæring av huden og forberedelse til fjerning. (VG Nett) Trekker huden av ved å gå rundt musen. (H) Fjerne huden helt fra dorsalsiden. (I) Fullstendig fjerning av huden fra overkroppen, og re-festing av musen lemmer. (J) Åpning av magen. (K) Utsikt over den åpne magen. (L) Flytte organene ut av synsfeltet. (M) Fjerne fettet. (N) Utsikt over den ryddede bekkenbunnen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. USL høsting
- Klipp livmorhornene fra eggstokkene (figur 3B), trekk vekk fra synsfeltet og skjær av ved livmorhalsforbindelsen (figur 3C).
MERK: Livmorhornene kan identifiseres etter skjemaet i figur 3A. Skyll vevet med 1x PBS for å opprettholde hydrering. - Klipp urinlederne bort fra blæreforbindelsen (figur 3D).
MERK: Dette er for å unngå forveksling med USL. - Skjær tykktarmen så nær livmorhalsen som mulig (figur 3E,F).
NOTAT: Skyll vevet med 1x PBS for å opprettholde hydrering. - Plasser musen sammen med disseksjonsblokken under dissekeringsomfanget for å visualisere USL-ene (figur 3G).
- Bruk tangen forsiktig til å rense det omkringliggende fettet fra USL-ene.
MERK: Bruk et andre par tang for å holde livmorhalsen opp i en liten vinkel for å forbedre visualiseringen av hvor USL krysser med livmorhalsen. Skyll vevet med 1x PBS for å opprettholde hydrering. - Bind en 5-0 polyglactin sutur rundt den cervikale enden av begge USL (figur 4B, C).
MERK: USL-ene kan identifiseres ved hjelp av skjematiske bilder og forstørrelsesbilder (figur 4I-K) - I denne studien brukes en USL til morfologiske eller biokjemiske analyser (dvs. Raman-mikroskopi, immunhistokjemi, histologi). Klipp den cervicale enden av USL, la et stykke av livmorhalsen være festet, og kutt et stykke muskel fra bunnen av USL (figur 4D). Plasser det dissekerte vevet i et bad med 1x PBS for å holde vevet hydrert (figur 4G, H).
- Bruk gjenværende USL til mekanisk testing og avbildning. Klipp den cervikale enden av USL, la et stykke livmorhals være festet, for å lette det mekaniske oppsettet (figur 4D).
MERK: Livmorhalsvevet vil fungere som et anker for å sikre USL under den mekaniske testen. - Når alle vevene av interesse er høstet (trinn 3-5), forflytt lårbenene fra bekkenet (figur 4E).
MERK: Man skal høre en svak klikkelyd når lårhodet er disartikulert fra acetabular koppen. - Klipp bekkenbenet fra de distale og proksimale endene av bekkenbenet, og etterlater ca. 10 mm totalt vev (figur 4F). Plasser det dissekerte vevet i 1x PBS.
Figur 3 Ryddet bekkenbunn for USL-disseksjon. (A) Skjematisk fremstilling av anatomien. (B) Kutting av livmorhornene ved eggstokkforbindelsen. (C) Kutte av livmorhorn. (D) Skjæring av urinlederne. (E) Skjæring av tykktarmen. (F) En klar utsikt over endetarmen og USL. (G) Plassering av musen og disseksjonsblokken under dissekeringsomfanget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Utsikt over USL og omkringliggende vev og disseksjon av USL. (A) Skjematisk oversikt over anatomiske landemerker rundt USL. (B) Knytte en sutur rundt livmorhalsendene. (C) Skjære av livmorhalsendene på USL. (D) Skjære av USL som skal brukes til de biokjemiske analysene ved sakralforbindelsen. (E) Skjæring av lårbenene fra bekkenbenet. (F) Kutte av den proksimale enden av bekkenet. (G) Dissekere USL i en 35 mm petriskål. (H) USL med det påfestede bekkenet i en 35 mm petriskål. (I) USL og endetarm ved 0,75x forstørrelse. (J) Fjerne fett fra USL. (K) Rengjøring av USL-ene ved 1,0x forstørrelse. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Blære høsting
- Etter at fettet er fjernet, hold blæren med tangen, og løft den forsiktig i en vinkel på ca. 40 ° (figur 5A).
- Med saksen skjærer du av blæren fra distal side, rett over livmorhalsen (figur 5B).
- Plasser vevet i et bad med 1x PBS for å holde vevet hydrert (figur 5H).
4. Høsting av endetarm
- Når USL er koblet fra livmorhalsen og blæren er dissekert, løft livmorhalsen i en vinkel på ca 40 ° med tangen. Det er rektovaginal fascia som forbinder endetarmen og livmorhalsen. Kutt denne forbindelsen forsiktig med skalpellen (figur 5C, D).
- Klipp skambenet ved kjønnssymfysen ved hjelp av saks. Utvid arbeidsområdet forsiktig for å øke visuell tilgang til vevsinnsettingene.
- Med tangen, trekk forsiktig endetarmen mot thoraxen, og bruk saksen til å følge endetarmen fra bakre side til anus. Kutt endetarmen ved anus (figur 5E).
- Plasser vevet i 1x PBS for å holde vevet hydrert (figur 5I).
5. Cervix-vagina kompleks høsting
- Etter at USL er fjernet fra livmorhalsen, bruk tangen til å holde livmorhalsen. Klipp livmorhalsen så nær vulva som mulig ved hjelp av saks (figur 5F, G).
MERK: Sørg for å kutte kjønnssymfysen for å se den distale enden av skjeden visuelt. - Plasser vevet i 1x PBS for å holde vevet hydrert (figur 5J).
Figur 5: Blære-, endetarms- og cervix/vagina-disseksjoner . (A) Holde blæren i vinkel. (B) Kutte av blæren. (C) Kutting av senen som forbinder livmorhalsen og endetarmen. (D) Senen ved 1,0x forstørrelse. (E) Kutte endetarmen. (F) Holde på livmorhalsen med tang. (G) Skjæring i den distale enden av skjeden. (H) Blæren i en 35 mm petriskål. (I) Endetarmen i en 35 mm petriskål. (J) Livmorhalsen-vagina vevskompleks i en 35 mm petriskål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Prøvepreparering for vevskarakterisering
- Mekaniske og visuelle analyser av USL
- Plasser USL med bekkenfestet over en T-formet vegg i en tilpasset fargebrønn for å sikre full nedsenking i fargeløsningen (CAD-tegninger av brønnen finnes i Supplementary Coding File 1 og Supplementary Coding File 2).
MERK: Bruk sutur og tang for å hjelpe til med plasseringen. - Fortynn et kommersielt tilgjengelig fargestoff som flekker frie amingrupper (5 μL, se materialfortegnelse) i 2,5 ml 1x PBS, tilsett løsningen i den tilpassede fargebrønnen og farg vevet i 2 timer på en vippe ved 4 °C.
MERK: Virv løsningen før du legger den til fargebrønnen. - I løpet av de siste 15 minuttene med farging, tilsett 2,5 μL av en kommersielt tilgjengelig dødcellekjerneflekk (se materialfortegnelse) til løsningen.
MERK: Vortex løsningen før du legger til fargebrønnen.
- Plasser USL med bekkenfestet over en T-formet vegg i en tilpasset fargebrønn for å sikre full nedsenking i fargeløsningen (CAD-tegninger av brønnen finnes i Supplementary Coding File 1 og Supplementary Coding File 2).
- Raman-analyse av USL-ene
- Fest USL i en rett linje på en polydimetylsiloksan (PDMS) blokk som finnes i en tilpasset brønn.
MERK: PDMS brukes som et mykt substrat for å muliggjøre festing av prøven i ønsket konfigurasjon. Blokker av varierende dimensjoner kan gjøres ved å blande de to komponentene etter produsentens instruksjoner (se materialtabell), støping i en petriskål, og etter polymerisering kutte PDMS i ønsket geometri med et skalpellblad. - Pin med insektpinner ved sutursløyfen og ved bekkenmuskelen. Hydrater vevet med 1x PBS.
- Fest USL i en rett linje på en polydimetylsiloksan (PDMS) blokk som finnes i en tilpasset brønn.
- Gjenværende vev
- Snap-frys de gjenværende vevene med flytende nitrogen eller i en passende innebyggingsforbindelse, avhengig av de ønskede analysene.
- Lagre vevet ved -80 °C inntil påfølgende analyser (f.eks. immunhistokjemiske eller biokjemiske analyser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvert trinn i disseksjonen av en villtypemus er detaljert i den tilhørende videoen og figurene relatert til protokollen. For denne studien ble 6 uker gamle kvinnelige C57BL/6J mus brukt (tilleggstabell 1). Tre prøvegrupper med USL behandlet med forskjellige enzymer ble analysert: kontroll (ingen behandling), kollagenasebehandlede og kondroitinasebehandlede grupper. Den glatte muskelen, nerver og lymfe i USL er omgitt av en ECM rik på fibrillære kollagener og glykosaminoglykaner (GAGs)5, som antas å gi mekanisk integritet til vevet. Enzymbehandlingene ble valgt for å forstyrre disse ECM-komponentene og demonstrere muligheten for å løse de biokjemiske og mekaniske forskjellene ved hjelp av Raman-spektroskopi og mekanisk (strekk) testing.
For fordøyelsen ble alle USL plassert i en thermomixer i 3 timer i en oppløsning på 1 ml ved 37 ° C og 300 o / min. Kontroll-USL ble plassert i en løsning av 1x PBS, kollagenasebehandlede USL ble plassert i en løsning av 1,0 U / ml kollagenase type I, og de kondroitinasebehandlede USL ble plassert i en løsning av 2,0 U / ml chondroitinase ABC (se materialtabell).
USLene for mekanisk testing ble utarbeidet basert på trinn 6.1. Prøvene ble plassert i et tilpasset lastekammer (en CAD-tegning av kammeret finnes i Supplementary Coding File 3) for den mekaniske testprotokollen12. Bekkenet var festet i en stasjonær konfigurasjon, og den cervikale enden av USL var festet til en bøyeaktuator, som var basert på designet beskrevet i Jimenez et al.12 (figur 6B; Supplementary Coding File 4), under et oppreist konfokalmikroskop og festet til en 100 mN lastcelle (figur 6A). Bøyesystemet reduserer støyen forårsaket av armen til aktuatoren ved måling av kraft12. En forhåndsbelastning på ca. 500 μN ble brukt til å angi referansekonfigurasjonen til USL, og hver USL ble avbildet mens de var i denne posisjonen. Deretter ble en global forskyvning på 750 μm påført og holdt i 5 minutter før avbildning igjen. USL ble deretter brakt tilbake til referansekonfigurasjonen, og denne prosessen ble gjentatt for en 1000 μm global forskyvning. Denne protokollen ble fulgt for alle tre utvalgsgruppene (n = 1/gruppe) for å oppnå stressrelaksasjonskurvene (figur 7), og topp- og likevektsspenningene som ble motstått av hver USL ble bestemt (tabell 1). Spenningen ble beregnet ved å dele den målte kraften på gjennomsnittlig tverrsnittsareal (tilleggstabell 2 og tilleggstabell 3).
Figur 6: Oppsett for mekanisk testing . (A) Lastekammer under konfokalmikroskopet og koblet til aktuatoren. (B) USL i lastekammeret; Bekkenet forblir stasjonært, mens den cervikale enden er bundet til et sammenkoblet bøyesystem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Makroskopisk aksial stress-relaksasjonsplott av murine USL utsatt for ulike enzymbehandlinger. Enzymbehandlingen så ut til å redusere den gjennomsnittlige aksiale toppen og avslappede påkjenninger som USL opplever ved foreskrevne globale forskyvninger. (*) indikerer avslappede stressverdier, som ble målt 200 s etter toppspenning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Eksempel | Global fordrivelse (μm) | Toppspenning (kPa) | Avslappet likevektsstress (kPa) |
| Kontroll | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| Kollagenase-behandlet | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| Chondroitinase-behandlet | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
Tabell 1: Effekten av enzymbehandling på stressmålinger av USL.
Fra bildene som ble tatt (figur 8) ble tøyningsfeltene estimert ved hjelp av en kombinasjon av manuell og automatisk ("imregdemoner" -funksjon i MATLAB) tekstursporing av ligamentet mellom referansen (uladet) og deformerte tilstander13. Manuell sporing ble gjort ved å velge de samme cellekjernene i referanse- og deformerte bilder. Green-Lagrange-stammefelt ble beregnet fra de estimerte forskyvningsfeltene (figur 9). Gjennomsnittlige aksiale stammer (E11) ble beregnet for mellomdelen av hvert preparat (tab 2).
Figur 8: Bilder av deformerte og referansetilstander av et kontrollprøve (ubehandlet) etter globale forskyvninger. (A) En 750 μm global forskyvning. (B) En 1000 μm global forskyvning. Grønn representerer referansetilstanden, og lilla er den deformerte tilstanden (skalalinje = 500 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Estimering av tøyningsfelt. Tøyningsfeltene estimert for prøvene i hver behandlingsgruppe viser at de aksiale (E11), tverrgående (E22) og skjærstammene (E12) var romlig inhomogene, og den aksiale stammen økte med økende påført forskyvning (δ). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Global fordrivelse (μm) | Kontroll | Kollagenase-behandlet | Chondroitinase-behandlet |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
Tabell 2: Gjennomsnittlige aksiale stammer. De gjennomsnittlige aksiale stammene for hver mekanisk testet prøve indikerer at den globale aksiale stammen i de enzymbehandlede prøvene var lik eller større enn i kontrollprøven, noe som tyder på at reduksjonen i makroskopisk stress skyldtes enzymbehandling i stedet for mindre stammer.
Konfokal Raman-spektroskopi (785 nm laser, 1,06 μm punktstørrelse) ble utført på USL utarbeidet som beskrevet i trinn 6.2 og etter O'Brien et al.14 for å semi-kvantitativt evaluere vevsbiokjemien. Kosmisk stråling ble identifisert og fjernet, den lineære grunnlinjen ble trukket fra, og intensiteten ble normalisert for hvert spektrum. De samme behandlingsgruppene ble sammenliknet (n = 3/gruppe). Representative spektra for mellomsnittet av hver USL (figur 10), samt cervikale og sakrale ender (tilleggsfigur 1 og tilleggsfigur 2) er vist.
Figur 10: Påvirkning av enzymbehandling på USL-sammensetning. Raman-spektroskopi av USLs mellomseksjon antyder at enzymbehandlinger endret den biokjemiske sammensetningen av murine USL. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Toppene var korrelert med forskjellige biologiske komponenter basert på in vivo Raman-spektroskopi av den menneskelige livmorhalsen utført av O'Brien et al.15. Våre data ble normalisert ved hjelp av toppen av fosfatidyletanolamin (1,769 nm), et fosfolipid funnet i cellemembraner, som bør forbli uendret etter enzymatiske behandlinger. Sammenligning på tvers av representative spektra viste at vanninnhold, kollagen, hyaluronsyre, proteoglykaner og GAGs var redusert i både kollagenasebehandlede og kondroitinasebehandlede USL (figur 10, tilleggsfigur 1 og tilleggsfigur 2).
Tilleggsfigur 1: Påvirkning av enzymbehandling på USL-sammensetning. Raman-spektroskopi av USLs livmorhalssnitt antyder at enzymbehandlingene endret den biokjemiske sammensetningen av murine USL. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Påvirkning av enzymbehandling på USL-sammensetning. Raman-spektroskopi av USLs sakralsnitt antyder at enzymbehandlingene endret den biokjemiske sammensetningen av murine USL. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 1: Vekt-, alders- og USL-analysen av musene som ble brukt i studien. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 2: Påvirkning av enzymbehandling på USL-kraftmålinger. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 3: Tverrsnittsarealberegninger av de mekanisk testede USL-ene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 1: CAD-fil for farging av brønnen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 2: CAD-fil for farging av brønnlokket. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 3: CAD-fil i lastekammeret. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 4: CAD-fil av bøyesystemet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effekten av strukturell skade på kvinnelige reproduktive vev er understudert, og en lett tilgjengelig dyremodell for POP-forskning er nødvendig. Musen er en kostnadseffektiv modell som kan etterligne menneskelige reproduksjonsstudier16. På grunn av den økende interessen for studiet av det kvinnelige reproduktive systemet, er det behov for metoder som hjelper studiet av disse vevene. For å møte dette behovet er det i dette arbeidet etablert en metode for å dissekere og forberede murine bekkenbunnsvev for strukturelle og funksjonelle analyser.
For å lykkes med disseksjonen er det nødvendig med tilstrekkelig tid og omsorg. Murine reproduktive vev er små og skjøre. Oppmerksomhet på detaljer er nødvendig, spesielt mens du fjerner fettet rundt USL og bekkenorganene, for å unngå å skade USL eller annet vev når fettet fjernes. Det er viktig å bruke dissekeringsmikroskopet for å hjelpe til med å identifisere forskjeller mellom USL og fett, som det utrente øyet lett kan forveksle. Fjerning av urinlederne kan være nyttig for å unngå forvirring med USL, da innsettingspunktene til blæren og livmorhalsen er nær hverandre. Når du knytter suturen rundt USL, må du passe på å unngå å punktere vev ved å bruke tang for å løfte USL-ene forsiktig for å gi plass til nålen. For å trekke ut USL-ene kan identifisering av riktig vevstruktur og viktige anatomiske landemerker være vanskelig, men med denne metoden og praksisen vil disseksjonsresultatene være repeterbare.
Den foreslåtte metoden skisserer en detaljert prosedyre for dissekering av bekkenbunnsvev fra en enkelt prøve. En begrensning er at det ikke er mulig å holde alle vevene helt intakte siden et stykke av livmorhalsen forblir festet til dissekert USL for å fungere som et anker under den mekaniske testingen og bidra til å identifisere orienteringen. En annen begrensning er at musens anatomi og menneskets anatomi har forskjeller i vevsform, størrelse og orientering9. POP har blitt undersøkt ved hjelp av flere dyremodeller, som gnagere 17,18, kaniner19,20 sauer 20,21, svin5,22,23,24 og ikke-menneskelige primater 25,26, samt i menneskelige 24,26,27, og noen av disse modellene har fokusert på USLs rolle. Mens hver av disse modellene er gunstig for studiet av POP, er en ekstra fordel med musen den enkle genetiske manipulasjonen for å skape nye sykdomsmodeller, noe som ikke er mulig hos større dyr27.
For å dra nytte av musen som modell, er denne metoden utviklet for å hjelpe til med vellykket disseksjon av USL og fremstilling av vev for ulike analyser, inkludert mekanisk testing, Raman-mikroskopi, immunhistokjemi og biokjemiske analyser. Med denne metoden er det mulig å trekke ut USL med sin anatomiske forbindelse for å identifisere orienteringen, for å binde USL og mekanisk teste USL under forhold som ligner de som finnes in vivo.
Den mekaniske integriteten til USL er avledet fra ECM-komponentene, inkludert kollagen, proteoglykaner og GAG. Type I kollagen er et stort strekkbærende protein, og skade på denne ECM-komponenten antas å bidra til USL-svikt og POP. I denne prosedyren ble to forskjellige enzymbehandlinger sammenlignet for å teste hvordan varierende ECM-sammensetningen påvirker den mekaniske responsen og sammensetningen av USL. Den mekaniske analysen antydet at kollagen og GAGs bidro til den aksiale stivheten til USL, og senket den gjennomsnittlige aksiale topp- og likevektsspenningen (figur 7). De enzymbehandlede USL-ene opplevde en lignende eller større gjennomsnittlig aksial stamme (tabell 2). Raman-spektroskopi viste at kollagenasebehandlet USL hadde redusert kollageninnhold, samt redusert vann og hyaluronsyre, mens kondroitinasebehandlede USL hadde mindre hyaluronsyre, samt lavere vann- og kollageninnhold. For disse resultatene validerte Raman-spektroskopien at komponentene ble fjernet på grunn av fordøyelsen. Denne metoden forventes å gjøre bekkenbunnsbaserte studier mer tilgjengelige og øke antall forskere som fokuserer på dette understuderte området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) stipend (CB), NSF Graduate Research Fellowship (LS), Schmidt Science Fellowship (CL), University of Colorado Research & Innovation Seed Grant Program (2020-prisen til VF, SC og KC), og Anschutz Boulder Nexus Seed Grant ved University of Colorado (til VF og KC). Spesiell anerkjennelse går til Dr. Tyler Tuttle for hjelp med lastekammerdesignet, samt Calve-laboratoriemedlemmene for nyttige diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y.
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D.
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O'Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
