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Biochemistry

कार्यात्मक 3 डी स्फेरॉइड सेल संस्कृतियों का अर्ध-स्वचालित फेनोटाइपिक विश्लेषण

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65086
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 3, 1
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3CelVivo ApS

Summary

हम छवि कैप्चर और प्रोटिओमिक्स का उपयोग करके उच्च-प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्फेरॉइड और उनके फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो 3 डी सेल संस्कृतियों को बढ़ाने, इलाज और निगरानी के लिए एक स्टैंडअलोन क्लिनोस्टेट इनक्यूबेटर का उपयोग करने के गुणों और लाभों का वर्णन करता है। क्लिनोस्टैट एक ऐसे वातावरण की नकल करता है जहां कोशिकाएं कम कतरनी बलों और सक्रिय पोषक तत्व प्रसार के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्फेरॉइड के रूप में इकट्ठा हो सकती हैं। हम प्रदर्शित करते हैं कि कैंसर और गैर-कैंसर हेपेटोसाइट्स (HepG2 / C3A और THLE-3 सेल लाइनों) दोनों को यकृत कोशिकाओं की तुलना में कार्यक्षमता प्राप्त करने से पहले 3 सप्ताह के विकास की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल सेल विकास की निगरानी करने वाले कैमरों के साथ 3 डी कोशिकाओं के लिए इनक्यूबेटरों का उपयोग करने की सुविधा पर प्रकाश डालता है, क्योंकि उपचार पर स्फेरॉइड को गिनने और मापने के लिए स्नैपशॉट लिए जा सकते हैं। हम टीएचएलई -3 और हेपजी 2 / सी 3 ए सेल लाइनों की तुलना का वर्णन करते हैं, यह दिखाते हुए कि गैर-कैंसर सेल लाइनों के साथ-साथ अमर कैंसर कोशिकाओं को कैसे विकसित किया जा सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं और बताते हैं कि प्रोटिओमिक्स प्रयोगों को कुछ स्फेरॉइड से कैसे आयोजित किया जा सकता है, जिसे सेल सिग्नलिंग को परेशान किए बिना एकत्र किया जा सकता है, यानी, कोई ट्रिप्सिनाइजेशन की आवश्यकता नहीं है। हम दिखाते हैं कि प्रोटिओमिक्स विश्लेषण का उपयोग श्वसन श्रृंखला चयापचय के विशिष्ट यकृत फेनोटाइप और धातु विषहरण में शामिल प्रोटीन के उत्पादन की निगरानी के लिए किया जा सकता है और स्फेरॉइड के क्षेत्र को गिनने और मापने के लिए एक अर्ध-स्वचालित प्रणाली का वर्णन करता है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल एक टूलबॉक्स प्रस्तुत करता है जिसमें छवि कैप्चर के माध्यम से एक फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन और 3 डी सेल कल्चर मॉडल पर प्रयोग करने के लिए एक प्रोटिओमिक्स पाइपलाइन शामिल है।

Introduction

इन विट्रो सेल संस्कृतियां जीव विज्ञान में मौलिक ज्ञान स्थापित करने में आवश्यक और अमूल्य साबित हुई हैं। जीव विज्ञान और कैंसर में अधिकांश वैज्ञानिक समझ विशेष रूप से 2 डी संस्कृति प्रणाली से आई है जो एक मोनोलेयर में बढ़ने वाली कोशिकाएं हैं। यद्यपि 2 डी संस्कृति प्रमुख सेल संस्कृति प्रणाली रही है, लेकिन इसके कई नुकसान हैं जो संभावित रूप से आगे जैविक प्रगति को रोक सकते हैं। उदाहरण के लिए, 2 डी संस्कृतियों में सेल सिग्नलिंग और प्रसार1 के लिए महत्वपूर्ण सेल-सेल इंटरैक्शन की कमी है। आज तक, 3 डी संस्कृति प्रणालियों को बेहतर मॉडल भेदभाव, दवा प्रतिक्रिया, ट्यूमर आक्रमण और जीव विज्ञान 2,3,4,5 दिखाया गया है। उम्र बढ़ने की आबादी और कैंसर की मृत्यु दर में वृद्धि के कारण घातक कैंसर का 3 डी मॉडलिंग विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में से एक है और अक्सर इसका निदान बहुत खराब होताहै। एचसीसी को कम इलाज दर, खराब दवा प्रतिक्रिया और पुनरावृत्ति की उच्च दर 6,7,8 के लिए जाना जाता है। सामान्य यकृत और एचसीसी के लिए कई 3 डी मॉडल विकसित किए गए हैं जो विवो सामान्य और घातक यकृत ऊतक 9,10 के शरीर विज्ञान की नकल करते हैं।

वर्तमान 3 डी प्रणालियों में से कुछ में तरल ओवरले, बायोरिएक्टर, हाइड्रोगेल, मचान और 3 डी-मुद्रित संरचनाएं शामिल हैं। बायोरिएक्टर में उत्पन्न स्फेरॉइड विशेष रूप से अद्वितीय लाभ प्रदान करते हैं क्योंकि वे पोषक तत्वों के जोखिम, गैस विनिमय और सेल प्रसार के ट्यूमर वितरण की नकल करतेहैं। बायोरिएक्टर विशेष रूप से उपयोग में आसानी, बड़ी स्केलेबिलिटी, पोषक तत्व प्रसार और पहुंच के कारण कैंसर मॉडलके लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, बायोरिएक्टर उच्च थ्रूपुट प्रयोगों, अधिक प्रजनन क्षमता और मानव त्रुटि में कमी की अनुमति दे सकते हैं। इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला बायोरिएक्टर अद्वितीय है क्योंकि यह कम गुरुत्वाकर्षण की एक प्रणाली का अनुकरण करता है, जो विशिष्ट बायोरिएक्टर में लागू विघटनकारी कतरनी बलों को कम करता है जिससे बेहतर प्रजनन क्षमता12 की अनुमति मिलती है। सर्वव्यापी गुरुत्वाकर्षण और कतरनी बलों में कमी कोशिकाओं को अधिक शारीरिक तरीके से विकसित करने की अनुमति देती है। सबूत के रूप में, इस पद्धति के तहत विकसित हेपजी 2 / सी 3 ए कोशिकाएं गोलाकार ऑर्गेनेल विकसित करती हैं जो एटीपी, एडेनिलेट किनेज, यूरिया और कोलेस्ट्रॉल13,14 के विवो स्तर में उत्पादन करती हैं। इसके अलावा, इस 3 डी प्रणाली में दवा उपचार 2 डी संस्कृतियों की तुलना में अधिक उन्नत और स्वचालित हैं। 2 डी संस्कृतियों में, सेल स्वास्थ्य को ट्रिप्सिनाइज करने और बनाए रखने की आवश्यकता के कारण दवा उपचार में अक्सर कम समय का कोर्स होना चाहिए। फिर भी, हमारे मामले में, हम कोशिकाओं की संरचना और शरीर विज्ञान को बाधित करने की आवश्यकता के बिना स्फेरॉइड के दीर्घकालिक दवा उपचार कर सकते हैं। इसलिए, विवो जैविक घटनाओं और आगे के वैज्ञानिक विकास में बेहतर मॉडल के लिए 2 डी से 3 डी संस्कृतियों में बदलाव आवश्यक है।

यह पेपर उच्च-प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्फेरॉइड (चित्रा 1 और चित्रा 2) को बढ़ाने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करता है और 3 डी संरचनाओं (चित्रा 3) को फेनोटाइपिक रूप से चिह्नित करने के लिए एक अर्ध-स्वचालित प्रणाली दिखाता है। छवि स्तर पर, हम स्फेरॉइड के क्षेत्र की गिनती और मापने के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं (चित्रा 3)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों का उपयोग करके, हम दिखाते हैं कि विशिष्ट जैविक कार्यों का आकलन करने के लिए प्रोटिओमिक्स का उपयोग कैसे किया जा सकता है (चित्रा 4)। इस डेटा को एकत्र और विश्लेषण करके, हम 3 डी सेल कल्चर सिस्टम के पीछे जीव विज्ञान की समझ में सुधार करने की उम्मीद करते हैं।

Protocol

1. बफर और अभिकर्मक

  1. हेपजी 2 / सी 3 ए कोशिकाओं के लिए सेल विकास मीडिया: डलबेकको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम, 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज) तैयार करें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (1% वी / वी), एल-ग्लूटामाइन (1% वी / वी) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.5% वी / वी) शामिल हैं। विकास मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. टीएचएलई -3 कोशिकाओं के लिए सेल विकास मीडिया: ब्रोन्कियल एपिथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम [बीईजीएम] तैयार करें जिसमें इसकी खुराक (गोजातीय पिट्यूटरी अर्क [बीपीई], हाइड्रोकार्टिसोन, मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर [एचईजीएफ], एपिनेफ्रीन, ट्रांसफरिन, इंसुलिन, रेटिनोइक एसिड, ट्राईआयोडोथायरोनिन, जेंटामाइसिन सल्फेट-एम्फोटेरिसिन [जीए]) के साथ-साथ 10% एफबीएस, 5 एनजी / एमएल एचईजीएफ और 70 एनजी / एमएल फॉस्फोएटानोलमाइन शामिल हैं।
  3. 500 mM DL-Dithiothreitol (DTT): 10 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, 10 मिलीलीटर HPLC ग्रेड पानी में 0.771 ग्राम DTT को पुन: निलंबित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 100 μL एलिकोट स्टोर करें।
  4. 200 एमएम आयोडोसेटामाइड: 1 एमएल तैयार करने के लिए, 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट के 1 एमएल में 36 मिलीग्राम आयोडोसिटामाइड को पुन: निलंबित करें। पुन: निलंबित आयोडोएसिटामाइड को स्टोर न करें।
  5. 5% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस): 50 एमएल तैयार करने के लिए, 50 एमएल अमोनियम बाइकार्बोनेट के 50 एमएल में 2.5 ग्राम एसडीएस को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. 12% फॉस्फोरिक एसिड: 100 एमएल तैयार करने के लिए, एचपीएलसी ग्रेड पानी के 85.9 एमएल में 85% फॉस्फोरिक एसिड के 14.1 एमएल को पतला करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर एक कांच की बोतल में स्टोर करें।
  7. बाइंडिंग बफर: 1 एल तैयार करने के लिए, 10 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट या टीईएबी के 100 एमएल में 900 एमएल केंद्रित मेथनॉल जोड़ें।
  8. 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) समाधान: एचपीएलसी ग्रेड पानी के 999 एमएल में 1 मिलीलीटर केंद्रित टीएफए जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. 0.1% टीएफए समाधान: एचपीएलसी ग्रेड एसिटोनिट्राइल (60% वी / वी) के 600 एमएल को एचपीएलसी ग्रेड पानी के 399 एमएल में जोड़ें। इसके बाद, इस समाधान में 1 एमएल केंद्रित टीएफए जोड़ें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  10. मोबाइल चरण ए (एमपीए) - 0.1% फॉर्मिक एसिड: एचपीएलसी-ग्रेड पानी के 999 एमएल में 1 मिलीलीटर केंद्रित फॉर्मिक एसिड जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
  11. मोबाइल चरण बी (एमपीबी) - 80% एचपीएलसी-ग्रेड एसिटोनिट्राइल + 0.1% फॉर्मिक एसिड: एचपीएलसी-ग्रेड एसिटोनिट्राइल के 800 एमएल को 199 एमएल एचपीएलसी-ग्रेड पानी में जोड़ें। इसके बाद, इस घोल में 1 मिलीलीटर केंद्रित फॉर्मिक एसिड जोड़ें और मिलाएं।

2. स्फेरॉइड की तैयारी

नोट: चित्रा 1 ए सेल लाइनों से 3 डी स्फेरॉइड तैयार करने और संवर्धन के लिए प्रारंभिक चरणों का प्रतिनिधित्व करता है।

  1. हेपजी 2 / सी 3 ए और टीएचएलई -3 कोशिकाओं को पिघलाएं और उन्हें ऊतक संवर्धन फ्लास्क या डिश में मानक विकास मीडिया का उपयोग करके एक मोनोलेयर के रूप में विकसित करें जब तक कि वे लगभग 80% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाते।
    नोट: जब कोशिकाएं सामंजस्य तक पहुंचती हैं, तो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सामान्य सेलुलर आकृति विज्ञान और विकास पैटर्न की जांच करें। उच्च मार्ग संख्या पर कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है।
  2. हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस, टी 75 सेमी2 फ्लास्क या 10 सेमी डिश के लिए 5 एमएल का उपयोग करें) के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  3. एचबीएसएस (1: 2 कमजोर पड़ने) में पतला 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए का 5 एमएल जोड़ें और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सेल डिटेचमेंट का आकलन करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया को बेअसर करने के लिए 3 एमएल एफबीएस या ग्रोथ मीडिया (10% एफबीएस युक्त) जोड़ें।
  4. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर 270 x g पर स्पिन करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला और 5 मिलीलीटर पूर्ण विकास मीडिया में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    नोट: यदि बहुत अधिक कोशिकाएं हैं, तो गिनती से पहले सेल निलंबन को पतला करें।
  6. कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और 1.5 एमएल की अधिकतम मात्रा में 1 x 106 प्राप्त करने के लिए पूर्ण विकास मीडिया में सेल निलंबन को पतला करें।
  7. माइक्रोवेल युक्त एक अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 24-वेल गोल बॉटम प्लेट को बराबर करें।
    1. कुओं को 0.5 मिलीलीटर विकास मीडिया के साथ धोएं।
    2. प्लेट को 5 मिनट के लिए 3,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें (यह कुओं की सतह से हवा के बुलबुले को हटा देता है)।
  8. सेल सस्पेंशन (चरण 1.4 में तैयार) को प्लेट में स्थानांतरित करें और 120 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: सेल निलंबन मात्रा सेल गिनती के आधार पर भिन्न हो सकती है, लेकिन इसे 1.5 एमएल तक सीमित करना महत्वपूर्ण है।
  9. स्फेरॉइड गठन शुरू करने के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।

3. बायोरिएक्टर में स्फेरॉइड संस्कृति (चित्रा 2)।

नोट: स्फेरॉइड की संरचना को संरक्षित करने के लिए, 3 डी गोले को संभालते समय व्यापक बोर युक्तियों का उपयोग करें।

  1. स्फेरॉइड को स्थानांतरित करने से पहले 24 घंटे आर्द्रता कक्ष को 25 मिलीलीटर बाँझ पानी और सेल कक्ष को 9 मिलीलीटर विकास मीडिया के साथ भरकर बायोरिएक्टर को समतुल्य करें (चित्रा 2 ए)। आर्द्रता और सेल कक्षों को भरते समय एक लंबी सुई के साथ युग्मित 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  2. बायोरिएक्टर को 3 डी इनक्यूबेटर (चित्रा 2 डी, एफ) में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ घूमने (15 आरपीएम) को इनक्यूबेट करें।
  3. 1 एमएल चौड़े बोर टिप्स का उपयोग करके, अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट से स्फेरॉइड को अलग करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करें और स्फेरॉइड को टिशू कल्चर डिश में स्थानांतरित करें।
  4. बचे हुए स्फेरॉइड को पकड़ने और चरण 3.3 से उन्हें उसी डिश में स्थानांतरित करने के लिए 0.5 एमएल प्री-वार्म्ड ग्रोथ मीडिया के साथ अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट को धो लें।
  5. प्रकाश माइक्रोस्कोप (4x आवर्धन) का उपयोग करके स्फेरॉइड के आकार, कॉम्पैक्टनेस और गोलाई का आकलन करें और उन लोगों का चयन करें जो पर्याप्त रूप से बनते हैं।
    नोट: कोशिकाएं पर्याप्त रूप से बनती हैं जब वे कॉम्पैक्ट होती हैं और हैंडलिंग के दौरान अलग नहीं होती हैं। यह भी महत्वपूर्ण है कि स्फेरॉइड एक एकल इकाई है और एक साथ नहीं झुकी हुई है। बायोरिएक्टर में स्थानांतरित होने पर 100-200 μm के बीच एक गोलाकार आकार पसंद किया जाता है।
  6. 5 एमएल ताजा विकास मीडिया से भरे समतुल्य बायोरिएक्टर में स्फेरॉइड स्थानांतरित करें। स्फेरॉइड को स्थानांतरित करने के बाद, बायोरिएक्टर को पूरी तरह से ताजा विकास मीडिया से भरें, और मीडिया से भरते समय बायोरिएक्टर में बुलबुले जोड़ने से बचना सुनिश्चित करें।
  7. बायोरिएक्टर को 3 डी इनक्यूबेटर में रखें और नियंत्रण इकाई (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके रोटेशन गति को समायोजित करें। हेपजी 2 / सी 3 ए स्फेरॉइड के लिए, रोटेशन गति को 10-11 आरपीएम पर सेट करें; टीएचएलई -3 स्फेरॉइड के लिए, इसे 11-12 आरपीएम पर सेट करें।
    नोट: रोटेशन की गति सही ढंग से सेट की जाती है जब स्फेरॉइड बायोरिएक्टर के केंद्र में समान रूप से वितरित होते हैं और इसकी दीवारों को नहीं छूते हैं। चित्रा 2 ई एक घूर्णन बायोरिएक्टर दिखाता है।
  8. 10 एमएल पुराने मीडिया को हटाकर और इसे 10 एमएल ताजा मीडिया के साथ बदलकर हर 2-3 दिनों में विकास मीडिया का आदान-प्रदान करें; मीडिया का आदान-प्रदान करते समय स्फेरॉइड को हटाना सुनिश्चित न करें (चित्रा 2 बी)।
    नोट: मीडिया विनिमय की एक दिनचर्या (उदाहरण के लिए, 48 घंटे / 48 एच / 72 घंटे) और एक विस्तृत रिकॉर्ड रखने की सिफारिश की जाती है।
  9. हर बार मीडिया बदलने पर रोटेशन गति समायोजित करें। आकार और संख्या में स्फेरॉइड बढ़ने के साथ गति बढ़ाएं।
  10. संस्कृति में 15 दिनों के बाद, स्फेरॉइड को दो नए बायोरिएक्टरों में विभाजित करें।
    नोट: सेल लाइन और विकास दर के आधार पर, समय भिन्न हो सकता है और व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  11. 20 दिनों के बाद, स्फेरॉइड संग्रह के लिए तैयार हैं।

4. छवि कैप्चर और स्फेरॉइड की गिनती

नोट: स्फेरॉइड गिनती के लिए सरलीकृत पाइपलाइन चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। स्फेरॉइड गिनती और क्षेत्र निर्धारण (खंड 5) के लिए, 3 डी संरचनाओं की कॉम्पैक्टनेस का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है। यह एक अधिक उन्नत रंग कंट्रास्ट में योगदान देगा, जो विधि के सटीक होने के लिए आवश्यक है।

  1. टैबलेट पर इंस्टॉल 3 डी ऐप खोलें।
  2. बायोरिएक्टर का चयन करें और एक स्नैपशॉट लें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक तस्वीर ली जा सकती है। निम्नलिखित मापदंडों पर विचार किया जाना चाहिए।
    1. बायोरिएक्टर के पीछे एक काली पृष्ठभूमि रखें (बायोरिएक्टर बॉक्स में काला समर्थन प्रदान किया जाता है)।
    2. सुनिश्चित करें कि सेल कक्ष पर कोई प्रकाश प्रतिबिंब नहीं है।
    3. जितना संभव हो सके बायोरिएक्टर के करीब तस्वीर लें।
  3. फिजी में एक तस्वीर खोलें (ImageJ)।
  4. विश्लेषण के लिए चित्र तैयार करें:
    1. ओवल उपकरण का चयन करें। प्लग के चारों ओर एक सर्कल खींचें।
    2. सर्कल के अंदर सब कुछ काला बनाने के लिए कीबोर्ड पर हटाएं पर क्लिक करें। सेल कक्ष के चारों ओर एक सर्कल खींचें। सुनिश्चित करें कि सभी स्फेरॉइड सर्कल के अंदर हैं।
  5. स्फेरॉइड की गणना करने के लिए मैक्रो चलाएँ:
    1. प्लगइन्स > मैक्रो > रिकॉर्ड क्लिक करें. रिकॉर्डर में पूरक फ़ाइल 1 से मैक्रो पाठ की प्रतिलिपि बनाएँ।
    2. क्रिएट दबाएं, और एक नई विंडो खुल जाएगी। खोले गए चित्र का विश्लेषण करने के लिए चलाएँ दबाएँ.
    3. परिणामों के साथ एक नई विंडो खुल जाएगी (गणना, कुल क्षेत्र, औसत आकार और प्रतिशत क्षेत्र)।
  6. छवि को बंद करें और प्रत्येक छवि के लिए चरण 4.4 और 4.5 दोहराएं जिसके लिए स्फेरॉइड गिनती की आवश्यकता है। आसान और तेज़ प्रसंस्करण के लिए, मैक्रो सहेजें और इसे प्लगइन्स > मैक्रो > चलाएँ क्लिक करके चलाएँ और सहेजे गए मैक्रो का चयन करें.

5. स्फेरॉइड क्षेत्र का प्लानिमेट्रिक निर्धारण

नोट: स्फेरॉइड क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए सरलीकृत पाइपलाइन चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।

  1. चरण 3.5 में वर्णित छवियों को लें।
  2. शुरू करने से पहले, स्फेरॉइड के क्षेत्र को मापने के लिए एक वैश्विक स्तर निर्धारित करें।
    1. फिजी में वांछित आवर्धन के साथ एक स्केल बार के साथ एक तस्वीर खोलें। लाइन उपकरण का चयन करें। स्केल बार पर खींचें (लाइन को स्केल बार जितना लंबा होना चाहिए)।
    2. सेट स्केल > विश्लेषण खोलें. ज्ञात दूरी लिखें (पिक्सेल में दूरी में रेखा की लंबाई स्वचालित रूप से दर्ज की जाती है)। ग्लोबल टिक करना सुनिश्चित करें।
    3. OK दबाएँ. अब उस तस्वीर के लिए पैमाना सेट किया गया है जिसका विश्लेषण किया जाएगा।
  3. प्लानिमेट्रिक निर्धारण प्रारंभ करने के लिए, मैक्रो (पूरक फ़ाइल 2) चलाएँ।
    1. मैक्रो > बैच > प्रक्रिया क्लिक करें. वह फ़ोल्डर चुनें जिसमें विश्लेषण किए जाने वाले चित्र हैं. यह फ़ोल्डर इनपुट होगा.
    2. चरण 5.3.1 में बनाए गए फ़ोल्डर को आउटपुट के रूप में चुनें। प्रेस प्रक्रिया.
  4. गुणवत्ता की जांच के रूप में, मूल्यांकन करें कि मापा गया स्फेरॉइड क्षेत्र मूल छवि से मेल खाता है या नहीं।
    नोट: मैक्रो किनारे पर स्फेरॉइड को शामिल नहीं करता है जहां स्फेरॉइड का केवल एक हिस्सा मापा जा सकता है।

6. स्फेरॉइड का संग्रह

नोट: यह दृढ़ता से सलाह दी जाती है कि स्फेरॉइड को उनकी 3 डी संरचना को संरक्षित करने के लिए व्यापक बोर युक्तियों का उपयोग करके एकत्र किया जाता है। संग्रह बायोरिएक्टर के सामने प्लग का उपयोग करके किया जा सकता है (चित्रा 2 ए)।

संग्रह में स्फेरॉइड का आकार सेल लाइन, कोशिकाओं की शुरुआती संख्या और विभाजन प्रक्रिया (संस्कृति में दिन, प्रति बायोरिएक्टर स्फेरॉइड की संख्या और विभाजन अनुपात) के आधार पर भिन्न हो सकता है।

  1. स्फेरॉइड इकट्ठा करने के लिए, एक लंबी सुई के साथ युग्मित सिरिंज का उपयोग करके शीर्ष पोर्ट के माध्यम से बायोरिएक्टर से 5 एमएल मीडिया निकालें। स्फेरॉइड को बायोरिएक्टर के निचले केंद्र (नीचे बंदरगाह के पास) में डूबने देना सुनिश्चित करें।
  2. फ्रंट पोर्ट खोलें और 1 एमएल चौड़े बोर टिप का उपयोग करके स्फेरॉइड एकत्र करें। स्फेरॉइड को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें। 5 मिनट के लिए 500 x g पर स्फेरॉइड को सेंट्रीफ्यूज करें और मीडिया को छोड़ दें।
  3. एफबीएस को हटाने के लिए 200 μL HBSS के साथ स्फेरॉइड धोएं। 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  4. तरल नाइट्रोजन के साथ स्फेरॉइड गोली को स्नैप-फ्रीज करें और प्रसंस्करण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. स्फेरॉइड की व्यवहार्यता

नोट: स्फेरॉइड व्यवहार्यता क्षतिग्रस्त कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) द्वारा जारी एडेनिलेट किनेज (एके) की गतिविधि को मापकर निर्धारित की गई थी। प्रसार ढाल के कारण, एके माप कुशल होता है जब स्फेरॉइड व्यास12 में 900 μm से छोटे होते हैं। यदि स्फेरॉइड बड़े हो जाते हैं, या यदि व्यवहार्यता माप के बारे में कोई संदेह है, तो एटीपी परख15 किया जा सकता है।

  1. स्फेरॉइड सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और 20 μL को 96-अच्छी तरह से सफेद दीवार वाली प्लेट (सपाट तल स्पष्ट) में स्थानांतरित करें। प्रत्येक कुएं में एडेनिलेट काइनेज डिटेक्शन अभिकर्मक के 100 μL जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे पाइप करके समरूप करें।
  2. आरटी पर 2 मिनट के लिए गति वैक्यूम में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बुलबुले निकालें। आरटी पर 20 मिनट के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  3. प्लेट को ल्यूमिनोमीटर (प्लेट रीडर, ल्यूमिनेसेंस मोड) में रखें और प्रोग्राम शुरू करें। किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार पैरामीटर सेट करें।
    नोट: बायोल्यूमिनेसेंट व्यवहार्यता परख में, सेल प्रतिक्रिया की गणना करने के लिए प्रत्यक्ष ल्यूमिनोमीटर प्रकाश आउटपुट (आमतौर पर आरएलयू) का उपयोग किया जा सकता है। जैसा कि एडेनिलेट काइनेज केवल उन कोशिकाओं से लीक होगा जिनकी कोशिका अखंडता से समझौता किया गया है, लाइसिस अभिकर्मक का उपयोग करके कुल एडेनिलेट किनेज नियंत्रण प्राप्त करना संभव है।

8. प्रोटीन निष्कर्षण

नोट: चित्रा 1 बी स्फेरॉइड प्रसंस्करण और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए वर्कफ़्लो का प्रतिनिधित्व करता है।

  1. 36 वें दिन स्फेरॉइड (धारा 6) एकत्र करें। कोशिकाओं को निष्क्रिय करने के लिए 5% एसडीएस के 25 μL में स्फेरॉइड को पुन: निलंबित करें।
    1. 5% एसडीएस जोड़ने के बाद, गोली को ऊपर और नीचे पाइप करके समरूप करें। कुछ मामलों में जब स्फेरॉइड को लाइज करना मुश्किल होता है, तो एक छोटे मूसल का उपयोग करें।
  2. प्रोटीन को कम करने के लिए 1 घंटे के लिए 20 एमएम डीटीटी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
  3. 30 मिनट के लिए 40 एमएम आयोडोएसिटामाइड के साथ नमूने को प्रकाश से अल्काइलेट प्रोटीन तक संरक्षित किया जाता है। ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
  4. 1.2% की अंतिम एकाग्रता पर नमूने में 12% फॉस्फोरिक एसिड समाधान (10x) जोड़ें।
  5. बाइंडिंग बफर के छह खंडों में नमूने पतला करें और धीरे से मिश्रण करें।
  6. नमूने को एस-ट्रैप फ़िल्टर प्लेट पर लोड करें और 30 सेकंड के लिए 500 x g पर स्पिन करें।
    नोट: यदि चरण 8.4 में नमूने की कुल मात्रा कॉलम वॉल्यूम क्षमता से अधिक है, तो बैच ों में नमूने लोड करें और चरण 8.6 को तब तक दोहराएं जब तक कि सब कुछ कॉलम के माध्यम से पारित न हो जाए।
  7. 150 μL बाइंडिंग बफर के साथ नमूने को दो बार धोएं। प्रत्येक धोने के बाद, 30 सेकंड के लिए 500 x g पर घूमें और प्रवाह को छोड़ दें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट में पतला अनुक्रमण-ग्रेड ट्रिप्सिन के 1 μg के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें।
    नोट: व्यापक प्रोटिओम विश्लेषण के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में कम से कम 20 μg प्रोटीन की सिफारिश की जाती है। इसके लिए, ट्रिप्सिन का 1 μg कुशल पाचन के लिए आदर्श मात्रा है। बफर और कॉलम बेड के बीच किसी भी बुलबुले को हटा दें।
  9. 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट के 40 μL के साथ इल्यूट पेप्टाइड्स और एक ही संग्रह ट्यूब में पूल।
  10. 30 सेकंड के लिए 500 x g पर स्पिन करें। 0.1% टीएफए के 40 μL के साथ इल्यूट पेप्टाइड्स और उन्हें एक ही संग्रह ट्यूब में पूल करें।
  11. 30 सेकंड के लिए 500 x g पर स्पिन करें। पेप्टाइड्स को 60% एसिटोनिट्राइल और 0.1% टीएफए के 40 μL के साथ मिलाएं और उन्हें एक ही संग्रह ट्यूब में पूल करें।
  12. 30 सेकंड के लिए 500 x g पर स्पिन करें। ड्राई पूल ्ड इलुएट्स को स्पीड वैक्यूम में रखें और प्रसंस्करण तक नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

9. नमूना सफाई

नोट: प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने से पहले, नमूनों में मौजूद नमक को हटाना आवश्यक है। लवण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचपीएलसी-एमएस) विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकते हैं क्योंकि वे इलेक्ट्रोस्प्रे के दौरान आयनित होते हैं, पेप्टाइड्स से संकेत को दबाते हैं। इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए डी-साल्टिंग के लिए सेटअप पहले जोसेफ-चौधरी और सहयोगियोंद्वारा प्रदर्शित किया गया था।

  1. शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित चरणों के दौरान प्रवाह को इकट्ठा करने के लिए एक साफ 96-वेल संग्रह प्लेट है। चुंबकीय हलचल प्लेट पर सी 18 राल (100% एसिटोनिट्राइल में 50 मिलीग्राम / एमएल) मिलाएं।
  2. 96-वेल फ़िल्टर प्लेट के प्रति अच्छी तरह से सी 18 राल निलंबन के 70 μL जोड़ें, यह सुनिश्चित करने के लिए तेजी से ऐसा करें कि C18 राल पिपेट के तल पर पूल नहीं करता है।
  3. छींटे को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे से चालू करें। 96-वेल संग्रह प्लेट पर एकत्र किए गए प्रवाह-माध्यम को छोड़ दें।
  4. राल को 0.1% टीएफए के 100 μL के साथ धोएं। नमूनों के छींटे और मिश्रण को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे से चालू करें और प्रवाह को छोड़ दें।
  5. प्रत्येक नमूने को 0.1% टीएफए के 100 μL में पुन: निलंबित करें। जांचें और सुनिश्चित करें कि पीएच 2-3 के बीच है।
  6. प्रत्येक नमूने को फ़िल्टर प्लेट के प्रत्येक कुएं में लोड करें। नमूनों के छींटे और मिश्रण को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे से चालू करें और प्रवाह को छोड़ दें।
  7. 0.1% टीएफए के 100 μL के साथ धोएं। नमूनों के छींटे और मिश्रण को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे से चालू करें। प्रवाह को छोड़ दें।
  8. नमकीन नमूने एकत्र करने के लिए 96-वेल संग्रह प्लेट को एक नई 96-वेल प्लेट से बदलें।
  9. प्रति अच्छी तरह से एसीटोनिट्राइल / 0.1% टीएफए के 60 μL जोड़ें। सी 18 राल से नमूने को अलग करने के लिए, छींटे को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे से चालू करें।
  10. एलसी-एमएस/एमएस के लिए आगे बढ़ें या नमूने को संसाधित करने के लिए तैयार होने तक प्लेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

10. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से प्रोटिओमिक्स विश्लेषण।

नोट: इस पांडुलिपि के लिए डेटा उत्पन्न करने के लिए, 300 μm ID x 0.5 सेमी C18 ट्रैप कॉलम और 75 μm ID x 25 सेमी C18-AQ (3 μm) विश्लेषणात्मक नैनो-कॉलम के साथ दो-कॉलम सिस्टम सेटअप के साथ एक nLC-MS/MS सिस्टम का उपयोग किया गया था।

  1. एचपीएलसी पर चलने के लिए मोबाइल चरण तैयार करें:
    मोबाइल चरण ए (एमपीए): एचपीएलसी-ग्रेड पानी में 0.1% फॉर्मिक एसिड
    मोबाइल चरण बी (एमपीबी): एचपीएलसी-ग्रेड एसिटोनिट्राइल में 0.1% फॉर्मिक एसिड।
  2. एचपीएलसी विधि को निम्नानुसार प्रोग्राम करें: 120 मिनट में 4% -34% एमपीबी, 5 मिनट में 34% -90% एमपीबी, 5 मिनट में 90% एमपीबी; प्रवाह दर: 300 nL /
  3. पता लगाए गए पेप्टाइड संकेतों के एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा उत्पन्न करने के लिए डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआईए) करने के लिए एमएस अधिग्रहण विधि सेट करें।
  4. एनएलसी ऑटोसैंपलर में नमूने रखने से पहले 0.1% टीएफए के 10 μl में 1 μg नमूने को पुन: निलंबित करें।
  5. कैननिकल प्रोटिओमिक्स अधिग्रहण के लिए प्रोग्राम किए गए अनुसार एनएलसी-एमएस विधि चलाएं:
    1. ऑर्बिटरैप में पूर्ण एमएस स्कैन को 300-1100 मीटर / जेड पर सेट करें, जिसमें 120,000 (200 मीटर / जेड पर) का रिज़ॉल्यूशन और 125 का स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य है।
    2. 400 के एजीसी लक्ष्य और 30 की उच्च-ऊर्जा टकराव पृथक्करण (एचसीडी) ऊर्जा के साथ 50 मीटर / जेड की अनुक्रमिक अलगाव खिड़की के साथ ऑर्बिटरैप में एमएस / एमएस सेट करें।

11. डेटा विश्लेषण

  1. एनएलसी-एमएस/एमएस कच्चे डेटा फ़ाइलों को उपयोग किए गए एमएस प्लेटफ़ॉर्म के साथ संगत पीक डिटेक्शन सॉफ़्टवेयर में आयात करें।
  2. उचित डेटाबेस (मानव, माउस, आदि) का चयन करें।
  3. एन-टर्मिनल एसिटिलीकरण को चर संशोधन के रूप में और कार्बामिडोमिथाइल सिस्टीन को निश्चित संशोधन के रूप में सेट करें।
  4. ट्रिप्सिन को पाचन एंजाइम के रूप में निर्दिष्ट करें जिसमें दो मिस्ड क्लीवेज की अनुमति है।
  5. स्पेक्ट्रा अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले मास एनालाइज़र के अनुसार द्रव्यमान सहिष्णुता सेट करें।
  6. विश्लेषण को स्प्रेडशीट के रूप में निर्यात करें और आवश्यकतानुसार डेटा को आगे संसाधित करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हम एक अभिनव तनाव मुक्त 3 डी सेल इनक्यूबेटर के गुणों का वर्णन करते हैं, एक प्रणाली जिसे विशेष रूप से 3 डी स्फेरॉइड (चित्रा 2) के संवर्धन के लिए डिज़ाइन किया गया है। हमने THLE-3 और HepG2/C3A सेल लाइनों के 3D संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना सरल है और प्रति बायोरिएक्टर > 100 स्फेरॉइड की प्रजनन क्षमता और लागत प्रभावी संवर्धन की अनुमति देता है। एक बार बायोरिएक्टर में, स्फेरॉइड को 2 डी संस्कृति में बनाए गए कोशिकाओं के समान माना जाता है। सप्ताह में दो से तीन बार मीडिया का आदान-प्रदान करके इष्टतम विकास की स्थिति प्राप्त की जाती है (चित्रा 2 बी) और स्फेरॉइड के विकास और आकार के अनुसार रोटेशन गति को समायोजित करके (चित्रा 2सी)। यह प्रणाली, जिसमें 3 डी स्फेरॉइड को घूर्णन बायोरिएक्टर (चित्रा 2 ई, एफ) में सुसंस्कृत किया जाता है, स्फेरॉइड को समान और बहुत कम मात्रा में कतरनी बल को उजागर करके 3 डी संरचनाओं के लिए एक इष्टतम विकास वातावरण प्रदान करता है।

हमने पहले दिखाया है कि क्रोमैटिन संशोधन16 के विश्लेषण के लिए स्फेरॉइड का उपयोग कैसे किया जा सकता है। यहां, हम विस्तार से प्रदर्शित करते हैं कि यकृत स्फेरॉइड कैसे प्राप्त करें और पूर्ण प्रोटिओम (चित्रा 1) के विश्लेषण के लिए प्रोटिओमिक्स प्रयोग कैसे किए जा सकते हैं। संक्षेप में, प्रोटोकॉल को THLE-3 या HepG2/ C3A फ्लैट कोशिकाओं का उपयोग करके शुरू किया गया था जब तक कि संस्कृति 80% प्रवाह तक नहीं पहुंच गई। कोशिकाओं को स्फेरॉइड के रूप में कल्चर करने के लिए, लगभग 2,000 कोशिकाओं को माइक्रोवेल युक्त अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में चढ़ाया गया था ताकि उन्हें आत्म-एकत्रित करने की अनुमति मिल सके, और फिर, गठित स्फेरॉइड को बायोरिएक्टर में स्थानांतरित कर दिया गया (चित्रा 1 ए)। यद्यपि वे संस्कृति में 3 सप्ताह के बाद कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं, जैसा कि पहले17 प्रदर्शित किया गया था, हम इस प्रोटोकॉल के लिए संस्कृति में 36 दिनों के बाद एकत्र किए गए स्फेरॉइड से परिणाम दिखाते हैं। संग्रह के बाद, स्फेरॉइड को नीचे घुमाया गया था, और पेलेट और सुपरनैटेंट दोनों को विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया गया था। क्षतिग्रस्त कोशिकाओं द्वारा जारी एडेनिलेट किनेज की मात्रा का ठहराव के लिए सतह पर तैरनेवाला से सेल व्यवहार्यता का आकलन किया गया था, जैसा कि पहलेवर्णित है। सेलुलर प्रोटीन सेल गोली से निकाले गए थे, और पूर्ण प्रोटिओम का विश्लेषण उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (चित्रा 1 बी) द्वारा किया गया था।

यह प्रोटोकॉल सार्वजनिक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम फिजी (फिजी इज़ जस्ट इमेजजे)18 का उपयोग करके स्फेरॉइड गिनती (चित्रा 3 ए) के लिए एक अर्ध-स्वचालित विधि भी प्रदर्शित करता है। विश्लेषण के लिए स्फेरॉइड की एक अच्छी गुणवत्ता वाली तस्वीर ली जानी चाहिए, और कुछ मापदंडों को धारा 5 में उल्लिखित माना जाना चाहिए। फिर, विश्लेषण के लिए चित्र तैयार करने के बाद, स्फेरॉइड की गिनती के लिए एक मैक्रो स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग किया जाता है। मैक्रो पहले फिजी स्फेरॉइड काउंटिंग नामक एक फ़ोल्डर बनाकर काम करता है, उस फ़ोल्डर के अंदर जहां स्फेरॉइड चित्र स्थित हैं। इस फ़ोल्डर में, विश्लेषण से सभी जानकारी सहेजी जाती है; इसमें प्रत्येक स्फेरॉइड पर एक आईडी नंबर के साथ गिने गए स्फेरॉइड की एक तस्वीर शामिल है। इसमें एक एक्सेल फ़ाइल भी शामिल है जिसे स्फेरॉइड काउंटिंग कहा जाता है। इस फ़ाइल में गिने गए प्रत्येक स्फेरॉइड के लिए पिक्सेल क्षेत्र और ID संख्या होती है. एक विश्लेषित चित्र के अनुरूप डेटा फ़ाइल के प्रत्येक टैब में प्रस्तुत किया जाता है। टैब को विश्लेषण किए गए चित्र के नाम के अनुसार लेबल किया गया है। चूंकि स्फेरॉइड आकार कई कारकों से बिगड़ा जा सकता है, जिसमें एक पोत के भीतर संरचनाओं की संख्या और दवा उपचार शामिल हैं, इसलिए उनके सतह क्षेत्र (प्लानिमेट्री) की निगरानी करना भी महत्वपूर्ण है। यहां प्रस्तुत मैक्रो स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 2) काले क्षेत्रों को मापकर काम करती है, जो चित्र में स्फेरॉइड के अनुरूप हैं (चित्रा 3 बी)। आउटपुट को प्लानिमेट्री.xlsx नामक एक फ़ाइल में इकट्ठा किया जाता है, जिसमें प्रत्येक स्फेरॉइड का मापा क्षेत्र, परिधि और व्यास होता है। फेरेट नामक एक माप भी है, जिसका उपयोग व्यास की गणना करने के लिए किया जाता है। फेरेट सबसे लंबा संभव व्यास है, जबकि मिनफेरेट सबसे छोटा है। व्यास इन दोनों का औसत है। आउटपुट फ़ोल्डर के अंदर, प्लानिमेट्री.xlsx फ़ाइल के अलावा, स्फेरॉइड की एक तस्वीर भी है जिसे मापा गया था।

प्रोटिओम विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने से पहले, स्फेरॉइड की व्यवहार्यता का मूल्यांकन संस्कृति समय पर किया गया था। एके का स्तर 17 वें दिन तक बढ़ता है, कोशिका मृत्यु के लगभग 7% तक पहुंच जाता है, और फिर मृत्यु 5% से नीचे के स्तर तक कम हो जाती है (चित्रा 4 ए), जो पहले प्रकाशित कार्य17 के अनुसार है। यह प्रोटोकॉल सेल फेनोटाइप की निगरानी के लिए पूर्ण प्रोटिओम विश्लेषण भी दिखाता है। सबसे पहले, THLE-3 और HepG2/C3A फ्लैट कोशिकाओं और स्फेरॉइड के प्रोटिओम की तुलना की गई थी। पहले प्रमुख घटक (पीसी 1) का विश्लेषण करके, यह स्पष्ट है कि फ्लैट सेल संस्कृतियों से स्फेरॉइड नमूनों का सख्त पृथक्करण है, और ऐसा लगता है कि सेल प्रकार (टीएचएलई -3 और हेपजी 2 / सी 3 ए) का सहसंबंध प्रासंगिक नहीं है (चित्रा 4 बी)। हालांकि THLE-3 और HepG2 / C3A स्फेरॉइड एक साथ क्लस्टर नहीं करते हैं, वे यकृत समारोह के अनुरूप समान प्रोफाइल साझा करते हैं। हम इस प्रोटोकॉल में मेटलोथियोनिन के उदाहरण का प्रदर्शन करते हैं, जिनकी यकृत द्वारा किए गए धातु विषहरण में भूमिका होती है। हमने प्रोटिओमिक्स विश्लेषण में फ्लैट कोशिकाओं (एमटी 1 ई और एमटी 1 एक्स) (चित्रा 4 सी) की तुलना में स्फेरॉइड में अतिरंजित 2 आइसोफॉर्म की पहचान की। हम स्फेरॉइड के रूप में उगाए गए दोनों सेल लाइनों के जीन ऑन्कोलॉजी (जीओ) संवर्धन को भी दिखाते हैं। कार्बोहाइड्रेट चयापचय प्रक्रिया, जिसमें ट्राइकारबॉक्सिलिक एसिड चक्र (टीसीए चक्र), इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (सेलुलर श्वसन), और पाइरूवेट चयापचय शामिल हैं, एक लगातार शब्द है और हेपजी 2 / सी 3 ए और टीएचएलई -3 स्फेरॉइड (चित्रा 4 डी, ई) दोनों में समृद्ध है। सेलुलर डिटॉक्सिफिकेशन, फैटी एसिड और कोलेस्ट्रॉल चयापचय दोनों स्फेरॉइड में समृद्ध अन्य कार्य हैं। साथ में, इन कार्यों को यकृत समारोह के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: स्फेरॉइड संस्कृति और नमूना तैयारी के लिए वर्कफ़्लो । (ए) 3 डी सेल संस्कृति प्रयोगात्मक दृष्टिकोण। वांछित संयोजन पर फ्लैट सेल कल्चर को ट्रिप्सिनाइज्ड किया गया और माइक्रोवेल युक्त अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 24 वेल प्लेट पर बीज दिया गया, जहां कोशिकाएं स्फेरॉइड में स्वयं इकट्ठा होती हैं। 24 घंटे के बाद, स्फेरॉइड को एक बायोरिएक्टर में स्थानांतरित कर दिया गया और जब तक वे विश्लेषण के लिए तैयार नहीं हो जाते, तब तक खेती की गई। (बी) संग्रह के बाद, स्फेरॉइड को पेलेट किया गया था और प्रसंस्करण तक पेलेट और कल्चर सुपरनैटेंट दोनों को संग्रहीत किया गया था। हिस्टोन16और गैर-हिस्टोन प्रोटीन निकाले गए, पेप्टाइड्स में पचाए गए, और उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। मास स्पेक्ट्रोमेट्री से प्राप्त कच्ची फाइलों को मानव डेटाबेस के खिलाफ खोजा गया था, और डेटा को आगे संसाधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली । (ए) बायोरिएक्टर भाग। बायोरिएक्टर एक गैस एक्सचेंज और आर्द्रीकरण कक्ष से बना है जिसमें पानी के मोती होते हैं और मीडिया विनिमय और स्फेरॉइड संग्रह के लिए दो प्लग के साथ एक खुला सेल कक्ष होता है। (बी) बायोरिएक्टर मीडिया एक्सचेंज। बायोरिएक्टर को सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करके 10 एमएल विकास मीडिया से भरा जाता है। (सी) सिस्टम नियंत्रण ऐप। रोटेशन गति, सीओ 2 स्तर, तापमान, अलार्म लॉग और अन्य कार्यक्षमताओं को नियंत्रण इकाई का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है। (डी) बायोरिएक्टर को 3 डी इनक्यूबेटर में रखना। प्रत्येक बायोरिएक्टर में एक संबद्ध मोटर होती है जो बायोरिएक्टर को धीरे-धीरे स्पिन कर सकती है। (ई) एक (सी) टैबलेट द्वारा नियंत्रित गति (आरपीएम) के साथ आंदोलन में बायोरिएक्टर। गति (आरपीएम) को स्फेरॉइड के आकार के अनुसार समायोजित किया जाता है। (एफ) 3 डी इनक्यूबेटर के अंदर बायोरिएक्टर। 3 डी इनक्यूबेटर 6 व्यक्तिगत रूप से नियंत्रित बायोरिएक्टर तक फिट कर सकता है। फोटो जेसन टोरेस फोटोग्राफी के सौजन्य से। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: छवि कैप्चर के माध्यम से स्फेरॉइड के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन । (ए) अर्ध-स्वचालित स्फेरॉइड गिनती। बायोरिएक्टर में स्फेरॉइड के स्नैपशॉट लेने के बाद, छवि फिजी में विश्लेषण के लिए तैयार की जाती है। प्रत्येक स्फेरॉइड की गणना की जाती है, और उनमें से प्रत्येक के लिए एक आईडी नंबर प्रदान किया जाता है। एक मैक्रो का उपयोग किया जाता है, और परिणाम गिने गए स्फेरॉइड के लिए आईडी, लेबल (विश्लेषण किए गए चित्र का नाम), और क्षेत्र (स्फेरॉइड में गिने गए पिक्सेल की संख्या) दिखाते हुए प्रदर्शित होते हैं। (बी) स्फेरॉइड क्षेत्र का प्लानिमेट्रिक निर्धारण। मैक्रो का उपयोग करके, एक विशिष्ट स्फेरॉइड का क्षेत्र, परिधि और व्यास निर्धारित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: यकृत स्फेरॉइड का प्रोटिओम विश्लेषण । (ए) स्फेरॉइड की व्यवहार्यता की गणना कल्चर सुपरनैटेंट पर एडेनिलेट किनेज (एके) की रिहाई के आधार पर की गई थी। ±(बी) प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) टीएचएलई -3 और हेपजी 2 / सी 3 ए फ्लैट कोशिकाओं और स्फेरॉइड के प्रोटिओम की तुलना करने के लिए किया गया था। (सी) मेटलोथियोनिन की सापेक्ष बहुतायत, जो मानव यकृत द्वारा व्यक्त प्रोटीन हैं। ±(D) कार्यात्मक रूप से समूहीकृत नेटवर्क HepG2/C3A स्फेरॉइड और (E) THLE-3 स्फेरॉइड के लिए GO संवर्धन दिखाता है, जहां प्रति समूह केवल सबसे महत्वपूर्ण शब्द का लेबल दिखाया जाता है। नेटवर्क का निर्माण क्लूगो19 का उपयोग करके किया गया था। नोड आकार संवर्धन महत्व शब्द का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: स्फेरॉइड गिनती के लिए मैक्रो स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: स्फेरॉइड प्लानिमेट्रिक निर्धारण के लिए मैक्रो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

त्रि-आयामी (3 डी) सेलुलर संरचनाओं के पीछे जीव विज्ञान को समझना उनकी कार्यक्षमता के अधिक व्यापक ज्ञान के लिए बेहद महत्वपूर्ण है। जटिल जीव विज्ञान का अध्ययन करने और विषाक्तता स्क्रीनिंग करने के लिए 3 डी मॉडल का उपयोग करने में रुचि बढ़ रही है। 3 डी में कोशिकाओं की खेती करते समय कई कारकों पर विचार करने की आवश्यकता होती है, जिसमें मॉडल सिस्टम का फेनोटाइपिक मूल्यांकन भी शामिल है। एक फेनोटाइप को एक विशिष्ट जीव की अवलोकन योग्य विशेषताओं के समूह के रूप में परिभाषित किया गया है, जैसे आकृति विज्ञान, व्यवहार, शारीरिक और जैव रासायनिक गुण20।

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं कि प्रोटिओमिक्स प्रयोगों को कुछ स्फेरॉइड से कैसे आयोजित किया जा सकता है और इसका उपयोग विशिष्ट यकृत फेनोटाइप की निगरानी के लिए किया जा सकता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री 3 डी सेल लक्षण वर्णन के लिए एक बड़े पैमाने पर लागू विधि बन गई है, जिससे विभिन्न जैविक प्रश्नों 12,16,21,22 की जांच की अनुमति मिलती है। एक व्यापक प्रोटिओम विश्लेषण के लिए, कम से कम 20 μg प्रोटीन शुरू करने वाली सामग्री का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें से 1 μg को मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्ट किया जाता है। यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि कम नमूना जोड़ने से संवेदनशीलता का नुकसान हो सकता है, और अधिक जोड़ने से क्रोमैटोग्राफी की गुणवत्ता धीरे-धीरे खराब हो जाएगी और अंततः कॉलम को अवरुद्ध कर दिया जाएगा। इस अध्ययन में, हमने दिखाया कि हेपजी 2 / सी 3 ए और टीएचएलई -3 स्फेरॉइड ग्लाइकोलाइसिस और टीसीए चक्र से महत्वपूर्ण प्रोटीन से समृद्ध हैं, जो विशिष्ट यकृत मार्ग हैं और रक्त शर्करा के स्तर को बनाए रखने और ऊर्जा उत्पादनके लिए महत्वपूर्ण हैं। दरअसल, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण न केवल प्रोटीन स्तर पर जानकारी प्रदान करता है, बल्कि प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की जांच की भी अनुमति देता है, जैसा कि हमारे समूह16 द्वारा पहले दिखाया गया है।

3 डी फेनोटाइपिक अध्ययनों में विचार किया जाने वाला एक और पहलू स्फेरॉइड की संख्या और आकार है। प्रयोगों को अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने के अलावा, स्फेरॉइड की संख्या की गणना करना और उनके आकार का निर्धारण करना यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि संस्कृति को कई बायोरिएक्टरों में कब विभाजित किया जाए, क्योंकि एक पोत के भीतर 3 डी संरचनाओं की संख्या स्फेरॉइड के आकार और चयापचय गतिविधि के स्तर को प्रभावित कर सकती है। हालांकि, यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि स्फेरॉइड की संख्या और आकार सेल लाइन, कोशिकाओं की शुरुआती संख्या, विभाजन प्रक्रिया और संग्रह के समय पर निर्भर करता है। हेपजी 2 / सी 3 ए स्फेरॉइड संस्कृति का विवरण, जैसे कि प्रति स्फेरॉइड कोशिकाओं की संख्या, प्रोटीन सामग्री, और उम्र के कार्य के रूप में आकार, फे, कोर्जेनियोव्स्का और व्रेज़िन्स्की25 द्वारा प्रदान किए गए थे। यहां वर्णित अर्ध-स्वचालित विधि का उपयोग करके सटीक और सफल विश्लेषण के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम एक अच्छा स्फेरॉइड की तस्वीर है। सादगी के लिए, तस्वीर को फोन या टैबलेट के साथ लिया जा सकता है, लेकिन इसका रिज़ॉल्यूशन जितना संभव हो उतना ऊंचा रखा जाना चाहिए। जैसा कि छवियां जल्दी प्राप्त होती हैं, वे विशिष्ट फेनोटाइपिक विशेषताओं की कल्पना करने या दवा उपचार की प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग प्रयोगों की अनुमति देते हैं। इसलिए, सेल-आधारित परख ों की बढ़ती संख्या के कारण,छवि विश्लेषण के लिए पिछले 10 वर्षों में कई ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर विकसित किए गए हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम स्फेरॉइड के आकार को गिनने और मापने के लिए सॉफ्टवेयर फिजी18 का उपयोग करके एक अर्ध-स्वचालित प्रणाली का वर्णन करते हैं। हमने एल्गोरिथम संचालन के अनुक्रम को परिभाषित करने के लिए स्क्रिप्ट (सरल प्रोग्रामिंग कमांड) प्रस्तुत की जिसे छवि संग्रह पर लागू किया जा सकता है, जिससे विश्लेषण एक आसान और त्वरित प्रक्रिया बन जाती है। हालांकि, स्फेरॉइड की विशेषता के आधार पर, एक मैनुअल माप नियोजित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि स्फेरॉइड बहुत पारदर्शी हैं, तो फिजी लिपि गलत होगी। वैसे, इस विधि के काम करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण मानदंडों में से एक स्फेरॉइड की कॉम्पैक्टनेस है। यह विशेषता स्फेरॉइड और पृष्ठभूमि के बीच अधिक उन्नत रंग कंट्रास्ट में योगदान देगी, जो विधि के सटीक होने के लिए आवश्यक है।

सारांश में, उच्च-प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्फेरॉइड बढ़ाने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करने के अलावा, छवि कैप्चर और प्रोटिओमिक्स के माध्यम से फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन के साथ युग्मित एक अर्ध-स्वचालित प्रणाली का भी वर्णन किया गया था। हम उम्मीद करते हैं कि 3 डी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए यह टूलबॉक्स पूर्ण-स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर और अगली पीढ़ी के मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ अधिक मजबूत हो जाएगा।

Disclosures

हेले सेदिघी फ्रैंडसेन क्लिनोस्टार सिस्टम के निर्माता सेलविवो एपीएस में एक शोध वैज्ञानिक के रूप में कार्यरत हैं। कैरोलिन मिकेलसेन एक औद्योगिक पीएचडी छात्र है जो सेलविवो एपीएस में कार्यरत है और एसडीयू, ओडेंस, डेनमार्क में पीएचडी अध्ययन कर रही है। अन्य सभी लेखकों के कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

सिडोली लैब ल्यूकेमिया रिसर्च फाउंडेशन (हॉलिस ब्राउनस्टीन न्यू इन्वेस्टिगेटर रिसर्च ग्रांट), एएफएआर (सागोल नेटवर्क गेरोमिक्स अवार्ड), डियरफील्ड (एक्ससीड अवार्ड), रिले थेरेप्यूटिक्स, मर्क और एनआईएच ऑफिस ऑफ द डायरेक्टर (1एस10ओडी030286-01) को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Bio-Rad 2239480
10 mL syringe Fisher Scientific 1481754 Luer lock tip, graduated to 12 mL
1000 µL wide bore pipet tips Fisher Scientific 14222703
200 µL wide bore pipet tips Fisher Scientific 14222730
96-well Orochem filter plate Orochem  OF1100
96-well skirted plate Axygen PCR-96-FS-C
96-well vacuum manifold Millipore MAVM0960R
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-25G
Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) Lonza CC-3170
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
ClinoReactor CelVivo N/A Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar incubator CelVivo N/A CO2 incubator for 3D cell culture
DTT Sigma D0632-5G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Fisher Scientific MT17205CV
Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells Corning 4441
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35010CV
Formic acid Thermo 28905
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific MT21022CV
hEGF Corning 354052
HERAcell vios 160i Thermo 51033557 CO2 incubator for 2D cell culture
HPLC grade acetonitrile Fisher Scientific A955-4
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452-1
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Iodoacetamide Sigma I1149-5G
L-glutamine Fisher Scientific MT25015CI
Non-essential amino acids Fisher Scientific MT25025CI
Oasis HLB Resin 30 µm Waters 186007549
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer Thermo IQLAAEGAAPFADBMBHQ High resolution mass spectrometer
PAULA microscope Leica
Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific MT3002CI
PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader PerkinElmer
pH paper Hydrion 93
Phosphoetanolamine Sigma P0503
Phosphoric acid Fisher Scientific A260-500
Pipette gun Eppendorf Z666467 (Milipore Sigma)
Refrigerated centrifuge Thermo 75-217-420
Reprosil-Pur resin MSWIL R13.AQ.003 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size
SDS Bio-Rad 1610301
Sequencing grade modified trypsin Promega V511A
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) Thermo 15308325 Savant SPD1010
Sterile hood Thermo 1375
Sterile serological pipettes Fisher Scientific 1367549
S-trap Protifi C02-micro-80
Syringe needle (18 G) Fisher Scientific 14817100 3" length, 0.05" diameter
Trifluoroacetic acid (TFA) Thermo 28904
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Vortex Sigma Z258415
Water bath Fisher Scientific FSGPD10

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References

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