Summary
再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。
Abstract
3D細胞培養の増殖、処理、モニタリングにスタンドアロンのクリノスタットインキュベーターを使用することの特性と利点を説明するプロトコルを紹介します。クリノスタットは、細胞が低せん断力と活発な栄養素拡散で再現性の高いスフェロイドとして組み立てることができる環境を模倣しています。がん肝細胞と非がん肝細胞(HepG2/C3AおよびTHLE-3細胞株)の両方が、肝細胞に匹敵する機能性を獲得するまでに3週間の増殖が必要であることを実証しました。このプロトコルは、処理時にスフェロイドをカウントおよび測定するためにスナップショットを撮ることができるため、細胞増殖を監視するカメラを備えた3D細胞用のインキュベーターを利用することの利便性を強調しています。THLE-3細胞株とHepG2/C3A細胞株の比較について説明し、非がん細胞株と不死化がん細胞の増殖方法を示します。プロテオミクス実験が、細胞シグナル伝達を乱すことなく、つまりトリプシン処理を必要とせずに収集できる少数のスフェロイドからどのように実施できるかを実証し、説明します。プロテオミクス解析は、呼吸鎖代謝の典型的な肝臓表現型と金属解毒に関与するタンパク質の産生をモニターするために使用できることを示し、スフェロイドの面積をカウントおよび測定する半自動システムについて説明します。全体として、プロトコルは3D細胞培養モデルで実験するためにイメージの捕獲およびプロテオミクスのパイプラインによって表現型の性格描写を構成する道具箱を示す。
Introduction
in vitroでの細胞培養は、生物学の基礎知識を確立する上で必要かつ非常に貴重であることが証明されています。特に生物学とがんの科学的理解の多くは、単層で増殖する細胞である2D培養システムからもたらされています。2D培養は主要な細胞培養システムですが、生物学的な進歩を妨げる可能性のある多くの欠点があります。例えば、2D培養では、細胞のシグナル伝達と増殖に重要な細胞間相互作用が欠如しています1。現在までに、3D培養システムは、分化、薬物反応、腫瘍浸潤、および生物学をより適切にモデル化することが示されています2,3,4,5。悪性がんの3Dモデリングは、高齢化とがん死亡率の増加により、特に重要です。肝細胞がん(HCC)は、世界中のがん関連死亡率の主要な原因の1つであり、しばしば予後が悪い6。肝細胞がんは、治癒率が低く、薬物反応が悪く、再発率が高いことが知られています6,7,8。in vivoの正常および悪性肝組織の生理機能を模倣する、正常な肝臓およびHCCのいくつかの3Dモデルが開発されています9,10。
現在の3Dシステムには、液体オーバーレイ、バイオリアクター、ハイドロゲル、足場、3Dプリント構造などがあります。バイオリアクターで生成されたスフェロイドは、栄養曝露、ガス交換、および細胞増殖/静止の腫瘍分布を模倣するため、特に独自の利点を提供します11。バイオリアクターは、その使いやすさ、大きな拡張性、栄養素の拡散、およびアクセス性により、がんモデルに特に適しています11。さらに、バイオリアクターは、ハイスループット実験、再現性の向上、人為的ミスの減少を可能にします。この研究で使用されたバイオリアクターは、重力の低減システムをシミュレートし、典型的なバイオリアクターに加えられる破壊的なせん断力を最小限に抑え、再現性を向上させるという点でユニークです12。全方向の重力とせん断力の減少により、細胞はより生理学的に発達します。その証拠に、この方法で増殖したHepG2/C3A細胞は、in vivoレベルのATP、アデニル酸キナーゼ、尿素、およびコレステロールを産生する球状の細胞小器官を発達させます13,14。さらに、この3Dシステムでの薬物治療は、2D培養と比較してより高度で自動化されています。2D培養では、トリプシン処理と細胞の健康維持が必要なため、薬物処理は多くの場合、短期間で行わなければなりません。しかし、私たちの場合、細胞の構造や生理機能を破壊することなく、スフェロイドの長期的な薬物治療を行うことができます。したがって、生体内の生命現象をより適切にモデル化し、さらなる科学的発展を遂げるためには、2次元培養から3次元培養への移行が必要です。
この論文では、再現性の高いスフェロイドを増殖させるための方法論(図1および図2)を提示し、3D構造を表現型的に特徴付けるための半自動システムを示します(図3)。画像レベルでは、回転楕円体の面積のカウントと測定に関する情報を提供します(図3)。質量分析法を用いて、プロテオミクスを用いて特定の生物学的機能を評価する方法を示します(図4)。このデータを収集して解析することで、3D細胞培養システムの背後にある生物学の理解を深めたいと考えています。
Protocol
1. バッファーおよび試薬
- HepG2/C3A細胞用細胞増殖培地:10%ウシ胎児血清(FBS)、非必須アミノ酸(1%v/v)、L-グルタミン(1%v/v)およびペニシリン/ストレプトマイシン(0.5%v/v)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、4.5g/Lグルコース)を調製します。増殖培地を4°Cで保存します。
- THLE-3細胞用細胞増殖培地:そのサプリメント(ウシ下垂体抽出物[BPE]、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮成長因子[hEGF]、エピネフリン、トランスフェリン、インスリン、レチノイン酸、トリヨードチロニン、硫酸ゲンタマイシン-アムホテリシン[GA])、および10%FBS、5 ng/mL hEGF、70 ng/mLホスホエタノールアミンを含む気管支上皮細胞増殖培地[BEGM]を調製します。
- 500 mM DL-ジチオスレイトール(DTT):10 mL を調製するには、0.771 g の DTT を 10 mL の HPLC グレードの水に再懸濁します。100 μLのアリコートを-20°Cで保存します。
- 200 mM ヨードアセトアミド:1 mL を調製するには、36 mg のヨードアセトアミドを 50 mM 重炭酸アンモニウム 1 mL に再懸濁します。再懸濁したヨードアセトアミドは保管しないでください。
- 5% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS):50 mL を調製するには、2.5 g の SDS を 50 mL の 50 mM 重炭酸アンモニウムに再懸濁します。4°Cで保存してください。
- 12%リン酸:100 mLを調製するには、14.1 mLの85%リン酸を85.9 mLのHPLCグレードの水で希釈します。ガラス瓶に入れて室温(RT)で保管してください。
- 結合バッファー:1 L を調製するには、900 mL の濃メタノールを 100 mL の 10 mM 重炭酸アンモニウムまたは TEAB に加えます。
- 0.1% トリフルオロ酢酸(TFA)溶液:999 mL の HPLC グレードの水に濃縮 TFA 1 mL を加えます。4°Cで保存してください。
- 60% アセトニトリル/0.1% TFA 溶液:HPLC グレードの水 399 mL に HPLC グレードのアセトニトリル(60% v/v)600 mL を加えます。次に、この溶液に1 mLの濃縮TFAを加え、4°Cで保存します。
- 移動相 A(MPA) - 0.1% ギ酸:999 mL の HPLC グレードの水に濃ギ酸 1 mL を加え、よく混合します。
- 移動相 B(MPB) - 80% HPLC グレードアセトニトリル + 0.1% ギ酸:HPLC グレード水 199 mL に HPLC グレードのアセトニトリル 800 mL を加えます。次に、この溶液に1mLの濃ギ酸を加えて混合します。
2. スフェロイドの調製
注: 図1A は、細胞株から3Dスフェロイドを調製および培養するための最初のステップを示しています。
- 凍結したHepG2/C3AおよびTHLE-3細胞を融解し、組織培養フラスコまたはディッシュ内で標準的な増殖培地を使用して、約80%のコンフルエントに達するまで単層として増殖させます。
注:細胞がコンフルエントに達したら、顕微鏡を使用して一般的な細胞形態と増殖パターンを確認します。継代数の多い細胞を使用することは推奨されません。 - Hank's Balanced Salt Solution(HBSS、T75 cm 2フラスコまたは10 cmディッシュに5 mLを使用)で細胞を2 回洗浄します。
- HBSSで希釈した0.05%トリプシン-EDTAを5 mL添加し(1:2希釈)、5% CO2で37°Cで5分間インキュベートします。顕微鏡を使用して細胞剥離を評価し、3 mLのFBSまたは増殖培地(10%FBSを含む)を添加してトリプシン反応を中和します。
- 細胞懸濁液を15 mLチューブに移します。室温で270 x g で5分間スピンダウンします。
- 上清を吸引し、細胞を5 mLの完全増殖培地に再懸濁します。
注:細胞が多すぎる場合は、細胞懸濁液を希釈してからカウントしてください。 - 細胞数を数え、細胞懸濁液を完全増殖培地で希釈して、最大容量1.5mLで1 x 106 を得ます。
- マイクロウェルを含む超低アタッチメントの24ウェル丸底板を平衡化します。
- ウェルを0.5 mLの成長培地で洗浄します。
- プレートを3,000 x g で5分間遠心分離します(これにより、ウェルの表面から気泡が除去されます)。
- 細胞懸濁液(ステップ1.4で調製)をプレートに移し、120 x gで3分間遠心分離します。
注:細胞懸濁液の量は細胞数によって異なる場合がありますが、1.5 mLに制限することが重要です。 - プレートを 37 °C で 5% CO2 で 24 時間インキュベートし、スフェロイドの形成を開始します。
3. バイオリアクターへのスフェロイド培養 (図2)
注:回転楕円体の構造を保持するには、3D球を取り扱うときに幅の広いボアチップを使用してください。
- スフェロイドをバイオリアクターに移す前に、湿度チャンバーに25 mLの滅菌水を、細胞チャンバーに9 mLの増殖培地を24時間充填して、バイオリアクターを平衡化します(図2A)。湿度チャンバーや細胞チャンバーを充填するときは、必ず10 mLのシリンジを長い針につないで使用してください。
- バイオリアクターを3Dインキュベーター(図2D、F)で回転(15rpm)し、37°Cで5%CO2で24時間インキュベートします。
- 1 mL幅のボアチップを使用して、ピペットを静かに上下に動かし、超低接着プレートからスフェロイドを剥離し、スフェロイドを組織培養皿に移します。
- 超低温付着プレートを0.5 mLの予熱した増殖培地で洗浄し、残ったスフェロイドを捕捉し、ステップ3.3の同じディッシュに移します。
- スフェロイドのサイズ、コンパクトさ、真円度を光学顕微鏡(倍率4倍)で評価し、十分に形成されているものを選択します。
注意: セルはコンパクトで、取り扱い中にバラバラにならないと十分に形成されます。また、回転楕円体が単一のユニットであり、凝集していないことも重要です。100〜200μmのスフェロイドサイズは、バイオリアクターに移す場合に好ましい。 - スフェロイドを、5 mLの新鮮増殖培地で満たされた平衡バイオリアクターに移します。スフェロイドを移し替えた後、バイオリアクターを新鮮な増殖培地で完全に満たし、バイオリアクターに培地を充填するときは、バイオリアクターに気泡を加えないようにしてください。
- バイオリアクターを3Dインキュベーターに置き、コントロールユニットを使用して回転速度を調整します(図2C)。HepG2 / C3Aスフェロイドの場合、回転速度を10〜11rpmに設定します。THLE-3スフェロイドの場合は、11〜12rpmに設定します。
注:回転速度は、スフェロイドがバイオリアクターの中心に均等に分布し、その壁に触れていない場合に正しく設定されます。 図2Eは、回転するバイオリアクターを示す。 - 2〜3日ごとに、10 mLの古い培地を取り除き、10 mLの新しい培地と交換して、増殖培地を交換します。培地を交換するときは、スフェロイドを取り除かないように注意してください(図2B)。
メモ: メディア交換のルーチン(たとえば、48 時間/48 時間/72 時間)を用意し、詳細な記録を保持することをお勧めします。 - 用紙を交換するたびに回転速度を調整します。回転楕円体のサイズと数が大きくなるにつれて速度を上げます。
- 培養で 15 日後、スフェロイドを 2 つの新しいバイオリアクターに分割します。
注:細胞株と増殖速度によって、時間は異なる場合があり、個別に最適化する必要があります。 - 20日後、回転楕円体は採取の準備が整います。
4. スフェロイドの画像取得と計数
注:スフェロイド数の簡略化されたパイプラインを 図 3A に示します。回転楕円体の数と面積の決定(セクション5)では、3D構造のコンパクトさを評価することが重要です。これにより、分析法が正確であるために必要な色のコントラストがより強調されます。
- タブレットにインストールされている3Dアプリを開きます。
- バイオリアクターを選択し、スナップショットを撮ります。
注意: または、写真を撮ることもできます。次のパラメータを考慮する必要があります。- バイオリアクターの後ろに黒い背景を配置します(バイオリアクターボックスには黒いサポートがあります)。
- 細胞室に光の反射がないことを確認してください。
- できるだけバイオリアクターの近くで写真を撮ります。
- FIJI (ImageJ) で 1 つの画像を開きます。
- 分析用の画像を準備します。
- 楕円ツールを選択します。プラグの周囲に円を描きます。
- キーボードの [削除 ] をクリックして、円の内側のすべてを黒くします。セルチャンバーの周囲に円を描きます。すべての回転楕円体が円の内側にあることを確認します。
- マクロを実行して回転楕円体をカウントします。
- [ Plugins > Macro > Record] をクリックします。マクロ・テキストを 補足ファイル 1 からレコーダーにコピーします。
- [作成]を押すと、新しいウィンドウが開きます。[実行]を押して、開いた画像を分析します。
- 新しいウィンドウが開き、結果(カウント、総面積、平均サイズ、およびパーセンテージ面積)が表示されます。
- 画像を閉じ、回転楕円体数が必要な画像ごとに手順 4.4 と 4.5 を繰り返します。より簡単かつ迅速に処理するには、マクロを保存し、[ Plugins > Macro] > [Run ] をクリックして実行し、保存したマクロを選択します。
5. 回転楕円体領域の平面測定
注:回転楕円体面積を決定するための簡略化されたパイプラインを 図3Bに示します。
- 手順3.5の説明に従って画像を撮影します。
- 開始する前に、回転楕円体の面積を測定するためのグローバルスケールを設定します。
- フィジーで、希望の倍率の縮尺記号付きの画像を開きます。線ツールを選択します。縮尺記号の上に描画します (線は縮尺記号と同じ長さにする必要があります)。
- [分析] > [スケールの設定] を開きます。 既知の距離を書き込みます(線の長さは、距離(ピクセル単位)に自動的に入力されます。必ず [グローバル] にチェックを入れてください。
- OKを押します。これで、分析する画像の縮尺が設定されました。
- 平面測定を開始するには、マクロ(補足ファイル2)を実行します。
- 「バッチ>マクロ>処理」をクリックします。 分析する画像を含むフォルダーを選択します。このフォルダが入力になります。
- 手順5.3.1で作成したフォルダを出力として選択します。[プロセス]を押します。
- 品質チェックとして、測定された回転楕円体領域が元の画像に対応しているかどうかを評価します。
注: マクロは、回転楕円体の一部しか測定できないエッジ上の回転楕円体を除外します。
6. スフェロイドの採取
注:スフェロイドは、3D構造を維持するために、ワイドボアチップを使用して収集することを強くお勧めします。回収は、バイオリアクターの前面にあるプラグを使用して行うことができます(図2A)。
回収時のスフェロイドのサイズは、細胞株、開始細胞数、および分裂プロセス(培養日数、バイオリアクターあたりのスフェロイド数、および分裂率)によって異なります。
- スフェロイドを回収するには、長い針に結合されたシリンジを使用して、上部ポートからバイオリアクターから 5 mL の培地を除去します。スフェロイドは、必ずバイオリアクターの下部中央(下部ポート付近)に沈ませてください。
- フロントポートを開き、1 mL幅のボアチップを使用してスフェロイドを回収します。スフェロイドを微量遠心チューブに入れます。スフェロイドを 500 x g で 5 分間遠心分離し、培地を廃棄します。
- スフェロイドを200 μLのHBSSで洗浄し、FBSを除去します。500 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 回転楕円体ペレットを液体窒素で急速凍結し、処理するまで-80°Cで保存します。
7. スフェロイドの生存率
注:スフェロイドの生存率は、損傷した細胞から放出されるアデニル酸キナーゼ(AK)の活性を測定することによって決定されました(図4A)。拡散勾配により、AK測定はスフェロイドの直径が900 μm未満の場合に効率的です12。スフェロイドが大きくなる場合、または生存率の測定に疑問がある場合は、ATPアッセイを実行できます15。
- スフェロイド上清を回収し、20 μL を 96 ウェル白壁プレート(平底透明)に移します。100 μLのアデニル酸キナーゼ検出試薬を各ウェルに添加し、ピペッティングで静かに上下させてホモジナイズします。
- 室温で速度真空中で2分間遠心分離して気泡を除去し、室温でプレートを20分間インキュベートします。
- プレートをルミノメーター(プレートリーダー、ルミネッセンスモード)に置き、プログラムを開始します。キットの製造元の指示に従ってパラメータを設定してください。
注:生物発光生存率アッセイでは、直接ルミノメーターの光出力(通常はRLU)を使用して細胞応答を計算できます。アデニル酸キナーゼは、細胞の完全性が損なわれた細胞からのみ漏出するため、溶解試薬を用いることで、アデニル酸キナーゼの完全制御を達成することが可能です。
8. 蛋白質の抽出
注: 図 1B は、スフェロイドの処理とタンパク質抽出のワークフローを示しています。
- 36日目に回転楕円体(セクション6)を収集します。スフェロイドを 25 μL の 5% SDS に再懸濁し、細胞を溶解します。
- 5% SDSを添加した後、ピペッティングで上下させてペレットを均質化します。スフェロイドの溶解が困難な場合は、小さな乳棒を使用してください。
- サンプルを 20 mM DTT で 1 時間インキュベートし、タンパク質を還元します。ピペッティングで上下に混ぜます。
- サンプルを 40 mM ヨードアセトアミドで 30 分間インキュベートし、タンパク質をアルキル酸から光から保護します。ピペッティングで上下に混ぜます。
- 最終濃度1.2%で12%リン酸溶液(10x)をサンプルに添加します。
- サンプルを 6 容量の結合バッファーで希釈し、穏やかに混合します。
- サンプルをS-Trapフィルタープレートにロードし、500 x g で30秒間スピンダウンします。
注:ステップ 8.4 のサンプルの総容量がカラム容量容量を超える場合は、サンプルをバッチでロードし、すべてがカラムを通過するまでステップ 8.6 を繰り返します。 - 150 μLの結合バッファーでサンプルを2回洗浄します。各洗浄後、500 x g で30秒間スピンダウンし、フロースルーを廃棄します。
- 50 mM 重炭酸アンモニウムで希釈した 1 μg のシーケンシンググレードトリプシンとサンプルを 37 °C で一晩インキュベートします。
注:包括的なプロテオーム解析の出発物質として、少なくとも 20 μg のタンパク質が推奨されます。このため、1μgのトリプシンが効率的な消化に理想的な量です。バッファーとカラムベッドの間の気泡を取り除きます。 - ペプチドを 40 μL の 50 mM 重炭酸アンモニウムで溶出し、同じ回収チューブにプールします。
- 500 x g で30秒間スピンダウンします。40 μL の 0.1% TFA でペプチドを溶出し、同じコレクションチューブにプールします。
- 500 x g で30秒間スピンダウンします。40 μL の 60% アセトニトリルと 0.1 % TFA でペプチドを溶出し、同じコレクションチューブにプールします。
- 500 x g で30秒間スピンダウンします。ドライプールされた溶出液は速度真空中で、処理されるまでサンプルを-80°Cで保存します。
9. サンプルのクリーンアップ
注:プロテオミクス分析に進む前に、サンプル中に存在する塩分を除去する必要があります。塩はエレクトロスプレー中にイオン化し、ペプチドからのシグナルを抑制するため、高速液体クロマトグラフィー質量分析(HPLC-MS)分析を妨げる可能性があります。この研究で使用された脱塩のセットアップは、Joseph-Chowdhuryらによって以前に実証されました16。
- 開始する前に、以下のステップでフロースルーを回収するための清潔な96ウェル回収プレートがあることを確認してください。C18樹脂(50 mg/mL、100%アセトニトリル溶液)をマグネチックスタープレート上で混合します。
- 96ウェルフィルタープレートのウェルあたり70 μLのC18レジン懸濁液を添加し、C18レジンがピペットの底に溜まらないように素早く添加します。
- 水しぶきを防ぐために、掃除機を静かにオンにします。96ウェルコレクションプレートに回収されたフロースルーを廃棄します。
- レジンを100 μLの0.1% TFAで洗浄します。サンプルの飛沫や混合を防ぐために、バキュームを静かにオンにし、フロースルーを廃棄します。
- 各サンプルを 100 μL の 0.1% TFA に再懸濁します。pHが2〜3の間であることを確認してください。
- 各サンプルをフィルタープレートの各ウェルにロードします。サンプルの飛沫や混合を防ぐために、バキュームを静かにオンにし、フロースルーを廃棄します。
- 100 μL の 0.1% TFA で洗浄します。サンプルの飛沫や混合を防ぐために、バキュームを静かにオンにします。フロースルーを破棄します。
- 96ウェルの採取プレートを新しい96のウェルプレートに交換して、脱塩したサンプルを回収します。
- ウェルあたり60 μLのアセトニトリル/0.1% TFAを添加します。C18樹脂からサンプルを溶出させるには、バキュームを静かにオンにして、飛散を防ぎます。
- フロースルーを回収し、室温で速度真空中で乾燥させます。 LC-MS/MS に進むか、サンプルを処理する準備ができるまでプレートを -80 °C で保管します。
10. 液体クロマトグラフィーと質量分析によるプロテオミクス分析
注:本稿のデータ作成には、内径 300 μm x C18 トラップカラムと内径 75 μm x 25 cm C18-AQ(3 μm)分析用ナノカラムを社内充填した 2 カラムシステムセットアップの nLC-MS/MS システムを使用しました。
- HPLC で分析する移動相を調製します。
移動相 A(MPA):0.1% ギ酸 HPLC グレードの水溶液
移動相 B(MPB):0.1% ギ酸含有 HPLC グレードアセトニトリル溶液 - HPLCメソッドを次のようにプログラムします:120分間で4%〜34%MPB、5分間で34%〜90%MPB、5分間でアイソクラティック90%MPB。流量:300nL/min。
- 検出されたペプチドシグナルのMS/MSスペクトルを生成するために、データに依存しない取り込み(DIA)を実行するようにMS取り込みメソッドを設定します。
- サンプルを nLC オートサンプラーに入れる前に、1 μg のサンプルを 10 μL の 0.1% TFA に再懸濁します。
- 標準プロテオミクス取得用にプログラムされたとおりに nLC-MS 分析法を実行します。
- Orbitrap でフル MS スキャンを 300-1100 m/z に設定し、分解能を 120,000(200 m/z 時)、自動ゲイン制御(AGC)ターゲットを 125 に設定します。
- Orbitrap で MS/MS を 50 m/z のシーケンシャル分離ウィンドウ、AGC ターゲット 400、高エネルギー衝突解離(HCD)エネルギー 30 に設定します。
11. データ解析
- nLC-MS/MS 生データファイルを、使用する MS プラットホームと互換性のあるピーク検出ソフトウェアにインポートします。
- 適切なデータベース(ヒト、マウスなど)を選択します。
- N末端アセチル化を可変修飾とし、カルバミドメチルシステインを固定修飾とする。
- トリプシンを消化酵素として指定し、2回の切断ミスを許容します。
- スペクトル取得に使用する質量分析計に応じて質量許容値を設定します。
- 分析をスプレッドシートとしてエクスポートし、必要に応じてデータをさらに処理します。
Representative Results
このプロトコルでは、3Dスフェロイドの培養用に特別に設計された革新的なストレスフリー3D細胞インキュベーターの特性について説明します(図2)。THLE-3およびHepG2/C3A細胞株の3D培養のプロトコルを最適化しました。ここで説明するプロトコールは使い方が簡単で、バイオリアクターあたり>100個のスフェロイドの再現性と費用対効果の高い培養が可能です。バイオリアクターに入ると、スフェロイドは2D培養で維持された細胞と同様に扱われます。週に2〜3回培地を交換し(図2B)、スフェロイドの成長とサイズに応じて回転速度を調整することで、最適な増殖条件が得られます(図2C)。回転するバイオリアクターで3Dスフェロイドを培養するこのシステム(図2E、F)は、回転楕円体を等しい非常に低いせん断力にさらすことで、3D構造に最適な増殖環境を提供します。
我々は以前、スフェロイドがクロマチン修飾の分析にどのように使用できるかを示した16。ここでは、肝臓スフェロイドの入手方法と、フルプロテオーム解析のためのプロテオミクス実験の実施方法について詳しく説明します(図1)。簡単に言うと、培養液が80%のコンフルエントに達するまで、THLE-3またはHepG2/C3Aフラットセルを使用してプロトコルを開始しました。細胞をスフェロイドとして培養するには、約2,000個の細胞をマイクロウェルを含む超低接着プレートに播種して自己凝集させ、形成したスフェロイドをバイオリアクターに移しました(図1A)。以前に実証したように、培養後3週間で機能的に活性を示しますが17、このプロトコルでは培養36日後に収集されたスフェロイドの結果を示します。回収後、スフェロイドをスピンダウンし、ペレットと上清の両方を分析用に保管しました。細胞生存率は、前述のように、損傷した細胞によって放出されるアデニル酸キナーゼの定量のために上清から評価された17。細胞ペレットから細胞タンパク質を抽出し、フルプロテオームを高分解能質量分析で分析しました(図1B)。
このプロトコルは、公開画像処理プログラムFIJI(Fiji Is Just ImageJ)18を使用して、スフェロイドカウント(図3A)の半自動方法も実証しています。分析のために回転楕円体の高品質の画像を撮影し、セクション5で述べたようにいくつかのパラメータを考慮する必要があります。次に、分析用の画像を準備した後、マクロスクリプト(補足ファイル1)を使用して回転楕円体をカウントします。このマクロは、最初に回転楕円体の画像が配置されているフォルダー内に FIJI Spheroids counting というフォルダーを作成することで機能します。このフォルダーには、分析のすべての情報が保存されます。これには、カウントされた回転楕円体の写真と、各回転楕円体にID番号が含まれます。また、回転楕円体計数と呼ばれるExcelファイルも含まれています。このファイルには、カウントされた各回転楕円体のピクセル領域と ID 番号が含まれています。分析された 1 つの画像に対応するデータは、ファイルの各タブに表示されます。タブには、分析された画像の名前に従ってラベルが付けられます。スフェロイドのサイズは、血管内の構造の数や薬物処理など、多くの要因によって損なわれる可能性があるため、その表面積を監視することも重要です(プラニメトリー)。ここで紹介するマクロスクリプト(補足ファイル2)は、写真の回転楕円体に対応する黒い領域を測定することで機能します(図3B)。出力は、各回転楕円体の計測面積、周長、および直径を含む planimetry.xlsx というファイルに収集されます。直径を計算するために使用されるフェレと呼ばれる測定値もあります。Feret は可能な限り長い直径で、minFeret は最短です。直径はこれら2つの平均です。出力フォルダー内には、プラニメトリー.xlsxファイルの他に、測定された回転楕円体の画像もあります。
プロテオーム解析に進む前に、スフェロイドの生存率を培養時間にわたって評価しました。AKのレベルは17日目まで増加し、細胞死の約7%に達し、その後死滅は5%未満のレベルまで減少します(図4A)。このプロトコルはまたセル表現型を監視するための完全なプロテオームの分析を示す。まず、THLE-3とHepG2/C3Aの扁平細胞とスフェロイドのプロテオームを比較しました。第1主成分(PC1)を分析すると、平坦な細胞培養からスフェロイドサンプルが厳密に分離されており、細胞タイプ(THLE-3とHepG2/C3A)の相関関係は関係ないことが明らかになりました(図4B)。THLE-3スフェロイドとHepG2/C3Aスフェロイドはクラスター化しませんが、肝機能と一致する類似したプロファイルを共有しています。このプロトコルでは、肝臓で行われる金属解毒に関与するメタロチオネインの例を示します。プロテオミクス解析では、平坦細胞(MT1EおよびMT1X)と比較して、スフェロイドで過剰発現している2つのアイソフォームを同定しました(図4C)。また、スフェロイドとして増殖した両細胞株の遺伝子オントロジー(GO)濃縮も示します。糖鎖代謝プロセスは、トリカルボン酸回路(TCA回路)、電子伝達鎖(細胞呼吸)、ピルビン酸代謝から構成され、HepG2/C3AスフェロイドとTHLE-3スフェロイドの両方に多く含まれています(図4D、E)。細胞の解毒、脂肪酸、コレステロールの代謝は、両方のスフェロイドに豊富に含まれる他の機能です。これらの機能は、肝機能にとって重要であることが知られています。
図1:スフェロイドの培養とサンプル調製のワークフロー 。 (A)3D細胞培養実験的アプローチ。所望のコンフルエントで平坦な細胞培養をトリプシン処理し、細胞が自己組織化してスフェロイドになるマイクロウェルを含む超低付着性24ウェルプレートに播種した。24時間後、スフェロイドをバイオリアクターに移し、分析の準備が整うまで培養しました。(B)回収後、スフェロイドをペレット化し、ペレットと培養上清の両方を加工まで保存しました。ヒストン16および非ヒストンタンパク質を抽出し、ペプチドに消化し、高分解能質量分析で分析しました。質量分析から得られた生ファイルをヒトデータベースと照合し、データをさらに処理しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:3D細胞培養システム 。 (A)バイオリアクター部品。バイオリアクターは、水ビーズを含むガス交換および加湿チャンバーと、培地交換とスフェロイド収集用の2つのプラグを備えた開閉可能なセルチャンバーで構成されています。(B)バイオリアクター培地の交換。バイオリアクターは、針付きのシリンジを使用して10mLの成長培地で満たされます。(C)システム制御アプリ。回転数、CO2レベル、温度、アラームログなどの機能をコントロールユニットで制御できます。(D)バイオリアクターを3Dインキュベーターに入れる。各バイオリアクターには、バイオリアクターをゆっくりと回転させることができるモーターが関連付けられています。(E)(C)錠剤によって制御される速度(rpm)で移動中のバイオリアクター。速度(rpm)は、回転楕円体のサイズに応じて調整されます。(F)de 3Dインキュベーター内のバイオリアクター。3Dインキュベーターは、個別に制御されたバイオリアクターを最大6台まで設置できます。写真提供:Jason Torres Photography この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:画像キャプチャによるスフェロイドの表現型特性評価 。 (A)半自動スフェロイドカウント。バイオリアクターでスフェロイドのスナップショットを撮った後、画像はフィジーでの分析用に準備されます。各回転楕円体がカウントされ、それぞれに ID 番号が付けられます。マクロを使用し、カウントされた回転楕円体のID、ラベル(分析された画像の名前)、および領域(回転楕円体でカウントされたピクセル数)を示す結果が表示されます。(B)回転楕円体面積の平面測定。マクロを使用して、特定の回転楕円体の面積、周囲長、および直径が決定されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:肝スフェロイドのプロテオーム解析 。 (A)スフェロイドの生存率は、培養上清に対するアデニル酸キナーゼ(AK)の放出に基づいて計算されました。±(B)主成分分析(PCA)を行い、THLE-3とHepG2/C3Aの扁平細胞およびスフェロイドのプロテオームを比較した。(C)ヒトの肝臓で発現されるタンパク質であるメタロチオネインの相対的な存在量。データはSEM±平均として表されます。 (D)機能的にグループ化されたネットワークは、HepG2/C3Aスフェロイドおよび(E)THLE-3スフェロイドのGO濃縮を示し、グループごとに最も重要な項のラベルのみを示しています。ネットワークは ClueGo19 を使用して構築されました。ノード サイズは、エンリッチメントの有意性という用語を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:回転楕円体計数用のマクロスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:回転楕円体の平面測定のためのマクロ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
3次元(3D)細胞構造の背後にある生物学を理解することは、その機能をより包括的に理解するために非常に重要です。複雑な生物学の研究や毒性スクリーニングの実施に3Dモデルを使用することへの関心が高まっています。細胞を3Dで培養する際には、モデルシステムの表現型評価など、多くの要素を考慮する必要があります。表現型は、形態、行動、生理学的および生化学的特性など、特定の生物の観察可能な特性のグループとして定義されます20。
このプロトコルでは、プロテオミクス実験が少数のスフェロイドからどのように実施され、典型的な肝臓表現型を監視するために使用できるかを示します。質量分析は、3D細胞の特性評価に広く適用されている方法となっており、さまざまな生物学的疑問の調査を可能にしています12,16,21,22。包括的なプロテオーム分析には、少なくとも20 μgのタンパク質出発物質を使用し、そこから1 μgを質量分析計に注入することが推奨されます。添加するサンプル数が少ないと感度が低下する可能性があり、添加量を増やすとクロマトグラフィーの品質が徐々に低下し、最終的にはカラムが詰まることにつながることに注意してください。この研究では、HepG2/C3AおよびTHLE-3スフェロイドには、特定の肝臓経路であり、血糖値の維持とエネルギー生産に重要な解糖系およびTCA回路からの重要なタンパク質が豊富に含まれていることを示しました23,24。実際、質量分析はタンパク質レベルでの情報を提供するだけでなく、私たちのグループ16で以前に示したように、タンパク質の翻訳後修飾を調べることもできます。
3D表現型研究で考慮すべきもう一つの側面は、回転楕円体の数とサイズです。実験の再現性を高めるだけでなく、容器内の3D構造の数がスフェロイドのサイズと代謝活性レベルに影響を与える可能性があるため、培養を複数のバイオリアクターに分割するタイミングを決定するには、スフェロイドの数を数え、そのサイズを決定することが不可欠です。ただし、スフェロイドの数とサイズは、細胞株、開始細胞数、分裂プロセス、および収集時間に依存することを強調することが重要です。HepG2/C3Aスフェロイド培養の詳細(スフェロイドあたりの細胞数、タンパク質含有量、年齢の関数としてのサイズなど)は、Fey、Korzeniowska、およびWrzesinski25によって提供されました。ここで説明する半自動分析法を使用して正確かつ正常に分析するには、最も重要なステップが適切なスフェロイドの画像です。簡単にするために、写真は携帯電話やタブレットで撮影できますが、その解像度はできるだけ高く保つ必要があります。画像は迅速に取得できるため、大規模なスクリーニング実験で特定の表現型の特徴を視覚化したり、薬物治療に対する反応を調べたりすることができます。したがって、細胞ベースのアッセイの数の増加により、過去10年間に画像解析のために多くのオープンソースソフトウェアが開発されてきました26。このプロトコルでは、ソフトウェア FIJI18 を使用してスフェロイドのサイズをカウントおよび測定する半自動システムについて説明します。画像コレクションに適用できる一連のアルゴリズム操作を定義するスクリプト(簡単なプログラミングコマンド)を提示し、解析を簡単かつ迅速に行えるようにしました。ただし、回転楕円体の特性によっては、手動測定を採用する必要があります。たとえば、回転楕円体が半透明すぎると、FIJI スクリプトが不正確になります。ちなみに、この方法が機能するための最も重要な基準の1つは、回転楕円体のコンパクトさです。この特性は、回転楕円体と背景の間の色のコントラストをより強化することに寄与し、分析法が正確であるために必要なものです。
要約すると、再現性の高いスフェロイドを増殖させるための方法論を提示するだけでなく、画像キャプチャとプロテオミクスによる表現型特性評価と組み合わせた半自動システムについても説明しました。この3D細胞解析ツールボックスは、全自動画像解析ソフトウェアと次世代質量分析計により、より堅牢になることが期待されます。
Disclosures
Helle Sedighi Frandsenは、ClinoStarシステムのプロデューサーであるCelVivo ApSでリサーチサイエンティストとして雇用されています。Karoline Mikkelsenは、CelVivo ApSに勤務し、デンマークのオーデンセにあるSDUで博士号を取得しています。他のすべての著者は、競合する金銭的利害関係を持っていません。
Acknowledgments
シドリ研究室は、白血病研究財団(Hollis Brownstein New Investigator Research Grant)、AFAR(Sagol Network GerOmics賞)、Deerfield(Xseed賞)、Relay Therapeutics、Merck、およびNIH所長室(1S10OD030286-01)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
| 200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
| 96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
| 96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
| DTT | Sigma | D0632-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
| Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Formic acid | Thermo | 28905 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
| hEGF | Corning | 354052 | |
| HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
| Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| PAULA microscope | Leica | ||
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
| PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
| pH paper | Hydrion | 93 | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
| SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo | 1375 | |
| Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
| S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
| Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Vortex | Sigma | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |
References
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