Summary
Vi præsenterer en protokol til dyrkning af højreproducerbare sfæroider og deres fænotypiske karakterisering ved hjælp af billedoptagelse og proteomics.
Abstract
Vi præsenterer en protokol, der beskriver egenskaberne og fordelene ved at bruge en selvstændig clinostat-inkubator til dyrkning, behandling og overvågning af 3D-cellekulturer. Clinostaten efterligner et miljø, hvor celler kan samles som meget reproducerbare sfæroider med lave forskydningskræfter og aktiv næringsdiffusion. Vi demonstrerer, at både kræft og ikke-kræft hepatocytter (HepG2 / C3A og THLE-3 cellelinjer) kræver 3 ugers vækst før opnåelse af funktionaliteter, der kan sammenlignes med leverceller. Denne protokol fremhæver bekvemmeligheden ved at bruge inkubatorer til 3D-celler med kameraer, der overvåger cellevæksten, da snapshots kan tages for at tælle og måle sfæroider ved behandling. Vi beskriver sammenligningen af THLE-3 og HepG2/C3A cellelinjer, der viser, hvordan ikke-kræftcellelinjer kan dyrkes såvel som udødeliggjorte kræftceller. Vi demonstrerer og illustrerer, hvordan proteomiske eksperimenter kan udføres fra nogle få sfæroider, som kan indsamles uden forstyrrende cellesignalering, dvs. ingen trypsinisering kræves. Vi viser, at proteomics-analyse kan bruges til at overvåge den typiske leverfænotype af respirationskædemetabolisme og produktionen af proteiner, der er involveret i metalafgiftning og beskrive et semi-automatiseret system til at tælle og måle sfæroidens område. Alt i alt præsenterer protokollen en værktøjskasse, der omfatter en fænotypisk karakterisering via billedoptagelse og en proteomics-pipeline til at eksperimentere med 3D-cellekulturmodeller.
Introduction
In vitro cellekulturer har vist sig at være nødvendige og uvurderlige for at etablere grundlæggende viden inden for biologi. Meget af den videnskabelige forståelse inden for biologi og kræft er specifikt kommet fra 2D-kultursystemet, det vil sige celler, der vokser i et monolag. Selvom 2D-kultur har været det dominerende cellekultursystem, har det mange ulemper, der potentielt kan kvæle yderligere biologiske fremskridt. For eksempel mangler 2D-kulturer celle-celle-interaktioner, der er vigtige for cellesignalering og spredning1. Til dato har 3D-kultursystemer vist sig at forbedre modeldifferentiering, lægemiddelrespons, tumorinvasion og biologi 2,3,4,5. 3D-modellering af ondartede kræftformer er især afgørende på grund af stigningen i den aldrende befolkning og kræftdødeligheden. Hepatocellulært karcinom (HCC) er en af de førende årsager til kræftrelateret dødelighed på verdensplan og har ofte en afgrundsdyb prognose6. HCC er kendt for at have en lav hærdningshastighed, dårlig lægemiddelrespons og høj gentagelseshastighed 6,7,8. Der er udviklet flere 3D-modeller for normal lever og HCC, der efterligner fysiologien af in vivo normalt og ondartet levervæv 9,10.
Nogle af de nuværende 3D-systemer inkluderer væskeoverlejringer, bioreaktorer, hydrogel, stilladser og 3D-printede strukturer. Sfæroider genereret i bioreaktorer giver specifikt unikke fordele, fordi de efterligner tumorfordeling af næringseksponering, gasudveksling og celleproliferation / hviletilstand11. Bioreaktorer er især velegnede til kræftmodeller på grund af deres brugervenlighed, store skalerbarhed, næringsstofdiffusion og tilgængelighed11. Derudover kan bioreaktorer give mulighed for eksperimenter med høj kapacitet, større reproducerbarhed og nedsat menneskelig fejl. Bioreaktoren, der anvendes i denne undersøgelse, er unik, fordi den simulerer et system med reduceret tyngdekraft, hvilket minimerer forstyrrende forskydningskræfter, der anvendes i typiske bioreaktorer, hvilket giver mulighed for bedre reproducerbarhed12. Den omnidirektionelle tyngdekraft og reduktion i forskydningskræfter gør det muligt for cellerne at udvikle sig på en mere fysiologisk måde. Som bevis udvikler HepG2 / C3A-celler dyrket under denne metode sfæriske organeller, der producerer in vivo-niveauer af ATP, adenylatkinase, urinstof og kolesterol13,14. Derudover er lægemiddelbehandlinger i dette 3D-system mere avancerede og automatiserede sammenlignet med 2D-kulturer. I 2D-kulturer skal lægemiddelbehandlinger ofte have et kort tidsforløb på grund af behovet for at trypsinisere og opretholde cellesundhed. Men i vores tilfælde kan vi udføre langsigtede lægemiddelbehandlinger af sfæroider uden behov for at forstyrre cellernes struktur og fysiologi. Derfor er et skift fra 2D- til 3D-kulturer nødvendigt for bedre at kunne modellere in vivo-biologiske fænomener og yderligere videnskabelig udvikling.
Dette papir præsenterer en metode til dyrkning af højreproducerbare sfæroider (figur 1 og figur 2) og viser et halvautomatiseret system til fænotypisk karakterisering af 3D-strukturer (figur 3). På billedniveau giver vi information om tælling og måling af sfæroiders areal (figur 3). Ved hjælp af massespektrometrimetoder viser vi, hvordan proteomics kan bruges til at vurdere specifikke biologiske funktioner (figur 4). Ved at indsamle og analysere disse data håber vi at forbedre forståelsen af biologien bag 3D-cellekultursystemer.
Protocol
1. Buffere og reagenser
- Cellevækstmedier til HepG2 / C3A-celler: Forbered Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM, 4,5 g / L glucose) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), ikke-essentielle aminosyrer (1% v / v), L-glutamin (1% v / v) og penicillin / streptomycin (0,5% v / v). Opbevar vækstmediet ved 4 °C.
- Cellevækstmedier til THLE-3-celler: Forbered bronchial epitelcellevækstmedium [BEGM], der indeholder dets kosttilskud (bovin hypofyseekstrakt [BPE], hydrocortison, human epidermal vækstfaktor [hEGF], adrenalin, transferrin, insulin, retinsyre, triiodothyronin, gentamicinsulfat-amphotericin [GA]) samt 10% FBS, 5 ng / ml hEGF og 70 ng / ml phosphoetanolamin.
- 500 mM DL-Dithiothreitol (DTT): For at forberede 10 ml skal 0,771 g DTT resuspenderes i 10 ml vand af HPLC-kvalitet. Der opbevares 100 μL delprøver ved -20 °C.
- 200 mM iodoacetamid: For at forberede 1 ml resuspenderes 36 mg iodoacetamid i 1 ml 50 mM ammoniumbicarbonat. Opbevar ikke resuspenderet iodoacetamid.
- 5% natriumdodecylsulfat (SDS): For at forberede 50 ml resuspenderes 2,5 g SDS i 50 ml 50 mM ammoniumbicarbonat. Opbevares ved 4 °C.
- 12% fosforsyre: For at forberede 100 ml fortyndes 14,1 ml 85% fosforsyre i 85,9 ml vand af HPLC-kvalitet. Opbevares i en glasflaske ved stuetemperatur (RT).
- Bindingsbuffer: For at forberede 1 liter tilsættes 900 ml koncentreret methanol til 100 ml 10 mM ammoniumbicarbonat eller TEAB.
- 0,1% Trifluoreddikesyre (TFA) opløsning: Tilsæt 1 ml koncentreret TFA til 999 ml vand af HPLC-kvalitet. Opbevares ved 4 °C.
- 60 % acetonitril/0,1 % TFA-opløsning: Tilsæt 600 ml acetonitril af HPLC-kvalitet (60 % v/v) til 399 ml vand af HPLC-kvalitet. Derefter tilsættes 1 ml koncentreret TFA til denne opløsning, og opbevares derefter ved 4 °C.
- Mobil fase A (MPA) - 0,1% myresyre: Tilsæt 1 ml koncentreret myresyre til 999 ml vand af HPLC-kvalitet og bland godt.
- Mobil fase B (MPB) - 80% HPLC-grade acetonitril + 0,1% myresyre: Tilsæt 800 ml HPLC-grade acetonitril til 199 ml HPLC-grade vand. Derefter tilsættes 1 ml koncentreret myresyre til denne opløsning og blandes.
2. Fremstilling af sfæroider
BEMÆRK: Figur 1A repræsenterer de indledende trin til forberedelse og dyrkning af 3D-sfæroider fra cellelinjer.
- Optø frosne HepG2/C3A- og THLE-3-celler, og dyrk dem som et monolag ved hjælp af standardvækstmedier i en vævskulturkolbe eller skål, indtil de når ca. 80% sammenløb.
BEMÆRK: Når celler når sammenløb, skal du kontrollere den generelle cellulære morfologi og vækstmønstre ved hjælp af et mikroskop. Det anbefales ikke at bruge celler ved høje passagetal. - Cellerne vaskes to gange med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, brug 5 ml til en T75 cm2 kolbe eller 10 cm skål).
- Tilsæt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA fortyndet i HBSS (1:2 fortynding) og inkuber i 5 minutter ved 37 °C med 5% CO2. Brug et mikroskop til at vurdere cellefrigørelse og tilsæt 3 ml FBS eller vækstmedier (indeholdende 10% FBS) for at neutralisere trypsinreaktion.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør. Spin ned ved 270 x g ved RT i 5 min.
- Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i 5 ml hele vækstmedier.
BEMÆRK: Hvis der er for mange celler, skal du fortynde cellesuspensionen, før du tæller. - Antallet af celler tælles, og cellesuspensionen fortyndes i komplette vækstmedier for at opnå 1 x 106 i et maksimalt volumen på 1,5 ml.
- Ligevægt i en rund bundplade med ultralav fastgørelse på 24 brønde, der indeholder mikrobrønde.
- Vask brøndene med 0,5 ml vækstmedier.
- Pladen centrifugeres ved 3.000 x g i 5 minutter (dette fjerner luftbobler fra brøndens overflade).
- Cellesuspensionen (fremstillet i trin 1.4) overføres til pladen og centrifugeres i 3 minutter ved 120 x g.
BEMÆRK: Cellesuspensionsvolumenet kan variere afhængigt af celleantallet, men det er vigtigt at begrænse det til 1,5 ml. - Pladen inkuberes i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2 for at påbegynde sfærisk dannelse.
3. Sfæroidkultur i bioreaktorer (figur 2)
BEMÆRK: For at bevare strukturen af sfæroider skal du bruge brede borespidser, når du håndterer 3D-kugler.
- Bioreaktoren afbalanceres ved at fylde fugtighedskammeret med 25 ml sterilt vand og cellekammeret med 9 ml vækstmedier 24 timer, før sfæroiderne overføres til det (figur 2A). Sørg for at bruge en 10 ml sprøjte koblet til en lang nål, når du fylder fugtighed og cellekamre.
- Bioreaktoren, der roterer (15 omdr./min.) i 3D-inkubatoren (figur 2D,F), inkuberes i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
- Brug 1 ml brede borespidser til forsigtigt at pipette op og ned for at løsne sfæroider fra den ultralave fastgørelsesplade og overføre sfæroiderne til en vævskulturskål.
- Vask den ultralave fastgørelsesplade med 0,5 ml forvarmede vækstmedier for at fange rester af sfæroider og overfør dem til den samme skål fra trin 3.3.
- Vurder sfæroidernes størrelse, kompakthed og rundhed ved hjælp af et lysmikroskop (4x forstørrelse), og vælg dem, der er tilstrækkeligt dannet.
BEMÆRK: Celler er tilstrækkeligt dannet, når de er kompakte og ikke falder fra hinanden under håndtering. Det er også vigtigt, at sfæroider er en enkelt enhed og ikke klumpet sammen. En sfærisk størrelse mellem 100-200 μm foretrækkes, når den overføres til bioreaktoren. - Overfør sfæroider til den ekvilibrerede bioreaktor fyldt med 5 ml friske vækstmedier. Efter overførsel af sfæroider skal du fylde bioreaktoren helt med friske vækstmedier, og sørg for at undgå at tilføje bobler til bioreaktoren, når du fylder den med medier.
- Placer bioreaktoren i 3D-inkubatoren, og juster rotationshastigheden ved hjælp af styreenheden (figur 2C). For HepG2/C3A-sfæroider skal du indstille rotationshastigheden til 10-11 o / min; for THLE-3 sfæroider skal du indstille den til 11-12 o / min.
BEMÆRK: Rotationshastigheden indstilles korrekt, når sfæroiderne fordeles jævnt i midten af bioreaktoren og ikke berører dens vægge. Figur 2E viser en roterende bioreaktor. - Udskift vækstmedier hver 2-3 dage ved at fjerne 10 ml gamle medier og erstatte dem med 10 ml friske medier; Sørg for ikke at fjerne sfæroider, når du udveksler medier (figur 2B).
BEMÆRK: Det anbefales at have en rutine med medieudveksling (for eksempel 48 h / 48 h / 72 h) og holde en detaljeret registrering. - Juster rotationshastigheden, hver gang medier ændres. Forøg hastigheden, da sfæroider vokser i størrelse og antal.
- Efter 15 dage i kultur opdeles sfæroider i to nye bioreaktorer.
BEMÆRK: Afhængigt af cellelinjen og væksthastigheden kan tiden variere og bør optimeres individuelt. - Efter 20 dage er sfæroider klar til indsamling.
4. Billedoptagelse og tælling af sfæroider
BEMÆRK: Den forenklede pipeline for antallet af sfæroider er vist i figur 3A. For sfæroidtælling og arealbestemmelse (afsnit 5) er det afgørende at evaluere kompaktiteten af 3D-strukturerne. Dette vil bidrage til en mere forbedret farvekontrast, hvilket er nødvendigt for, at metoden skal være nøjagtig.
- Åbn den 3D-app, der er installeret på tabletten.
- Vælg bioreaktoren, og tag et øjebliksbillede.
BEMÆRK: Alternativt kan der tages et billede. Følgende parametre bør overvejes.- Placer en sort baggrund bag bioreaktoren (der er sort støtte i bioreaktorboksen).
- Sørg for, at der ikke er nogen lysrefleksion på cellekammeret.
- Tag billedet så tæt på bioreaktoren som muligt.
- Åbn et billede i FIJI (ImageJ).
- Forbered billedet til analyse:
- Vælg det ovale værktøj. Tegn en cirkel rundt om stikket.
- Klik på Slet på tastaturet for at gøre alt inden for cirklen sort. Tegn en cirkel rundt om cellekammeret. Sørg for, at alle sfæroider er inde i cirklen.
- Kør makro for at tælle sfæroider:
- Klik på Plugins > makro > post. Kopier makrotekst fra supplerende fil 1 til optageren.
- Tryk på Opret, og et nyt vindue åbnes. Tryk på Kør for at analysere det åbnede billede.
- Et nyt vindue åbnes med resultaterne (antal, samlet areal, gennemsnitlig størrelse og procentvis areal).
- Luk billedet, og gentag trin 4.4 og 4.5 for hvert billede, hvor sfæroidtællingen er nødvendig. For nemmere og hurtigere behandling skal du gemme makroen og køre den ved at klikke på Plugins > Makro > Kør og vælge den gemte makro.
5. Planimetrisk bestemmelse af det kugleformede område
BEMÆRK: Den forenklede rørledning til bestemmelse af sfæroidområdet er vist i figur 3B.
- Tag billeder som beskrevet i trin 3.5.
- Før du starter, skal du indstille en global skala for at måle sfæroidernes areal.
- Åbn i FIJI et billede med en skalalinje med den ønskede forstørrelse. Vælg linjeværktøjet. Tegn over skalabjælken (linjen skal være lige så lang som skalabjælken).
- Åbn Analysér > Indstil skala. Skriv den kendte afstand (længden af linjen indtastes automatisk i afstanden i pixels. Sørg for at markere Global.
- Tryk på OK. Nu er skalaen indstillet til det billede, der skal analyseres.
- For at starte den planimetriske bestemmelse skal du køre makroen (Supplementary File 2).
- Klik på Behandl > batch->makro. Vælg den mappe, der indeholder de billeder, der skal analyseres. Denne mappe vil være input.
- Vælg mappen oprettet i trin 5.3.1 som Output. Tryk på Proces.
- Som en kvalitetskontrol skal du vurdere, om det målte sfæroidområde svarer til det originale billede.
BEMÆRK: Makro udelukker sfæroider på kanten, hvor kun en del af sfæroiden kan måles.
6. Indsamling af sfæroider
BEMÆRK: Det anbefales kraftigt, at sfæroider indsamles ved hjælp af brede borespidser for at bevare deres 3D-struktur. Indsamlingen kan ske ved hjælp af stikket foran bioreaktoren (figur 2A).
Størrelsen af sfæroider ved indsamling kan variere afhængigt af cellelinjen, startantallet af celler og opdelingsprocessen (dage i kultur, antal sfæroider pr. Bioreaktor og opdelingsforhold).
- For at opsamle sfæroider skal du fjerne 5 ml medier fra bioreaktoren gennem den øverste port ved hjælp af en sprøjte koblet til en lang nål. Sørg for at lade sfæroider synke til bunden af bioreaktoren (nær bundporten).
- Åbn den forreste port, og saml sfæroider ved hjælp af en 1 ml bred borespids. Anbring sfæroiderne i mikrocentrifugerør. Centrifuger sfæroiderne ved 500 x g i 5 minutter og kassér mediet.
- Sfæroider vaskes med 200 μL HBSS for at fjerne FBS. Der centrifugeres ved 500 x g i 5 min. og supernatanten kasseres.
- Snapfryses kuglestødet med flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C indtil forarbejdning.
7. Levedygtighed af sfæroider
BEMÆRK: Sfærisk levedygtighed blev bestemt ved at måle aktiviteten af adenylatkinase (AK) frigivet af beskadigede celler (figur 4A). På grund af diffusionsgradienten er AK-måling effektiv, når sfæroider er mindre end 900 μm i diameter12. Hvis sfæroiderne bliver større, eller hvis der er tvivl om levedygtighedsmålingen, kan der udføres et ATP-assay15.
- Den kugleformede supernatant opsamles, og 20 μL overføres til en hvidvægget plade med 96 brønde (flad bund klar). Der tilsættes 100 μL adenylatkinasedetektionsreagens til hvert hul og homogeniseres ved forsigtigt pipettering op og ned.
- Boblerne fjernes ved centrifugering i hastighedsvakuummet i 2 minutter ved RT. Pladerne inkuberes i 20 minutter ved RT.
- Placer pladen i luminometeret (pladelæser, luminescenstilstand), og start programmet. Indstil parametrene i henhold til kitproducentens instruktioner.
BEMÆRK: I bioluminescerende levedygtighedsanalyser kan den direkte luminometerlysudgang (almindeligvis RLU'er) bruges til at beregne celleresponsen. Da adenylatkinase kun lækker fra celler, hvis celleintegritet er blevet kompromitteret, er det muligt at opnå en total adenylatkinasekontrol ved hjælp af et lysereagens.
8. Proteinekstraktion
BEMÆRK: Figur 1B viser arbejdsgangen for forarbejdning af sfæroider og proteinekstraktion.
- Saml sfæroider (afsnit 6) på dag 36. Resuspender sfæroider i 25 μL 5% SDS for at lyse cellerne.
- Efter tilsætning af 5% SDS homogeniseres pelleten ved pipettering op og ned. I nogle tilfælde, når det er svært at lyse sfæroiderne, skal du bruge en lille støder.
- Inkuber prøverne med 20 mM DTT i 1 time for at reducere proteiner. Bland ved pipettering op og ned.
- Inkuber prøver med 40 mM iodoacetamid i 30 minutter beskyttet mod lys- til alkylatproteiner. Bland ved pipettering op og ned.
- Tilsæt 12% fosforsyreopløsning (10x) til prøverne i en endelig koncentration på 1,2%.
- Fortynd prøverne i seks volumener bindingsbuffer og bland forsigtigt.
- Fyld prøven på en S-Trap filterplade og drej ned ved 500 x g i 30 s.
BEMÆRK: Hvis den samlede mængde af prøven i trin 8.4 overstiger kolonnevolumenkapaciteten, skal du indlæse prøver i batches og gentage trin 8.6, indtil alt er passeret gennem kolonnen. - Prøverne vaskes to gange med 150 μL bindingsbuffer. Efter hver vask drejes ned ved 500 x g i 30 sek. og strømmen kasseres.
- Prøverne inkuberes med 1 μg trypsin af sekventeringskvalitet fortyndet i 50 mM ammoniumbicarbonat natten over ved 37 °C.
BEMÆRK: Mindst 20 μg protein anbefales som udgangsmateriale til omfattende proteomanalyse. Til dette er 1 μg trypsin den ideelle mængde til effektiv fordøjelse. Fjern eventuelle bobler mellem bufferen og søjlelejet. - Eluer peptider med 40 μL 50 mM ammoniumbicarbonat og pooles i samme opsamlingsrør.
- Spin ned ved 500 x g i 30 s. Eluer peptider med 40 μL 0,1% TFA og saml dem i det samme opsamlingsrør.
- Spin ned ved 500 x g i 30 s. Eluer peptiderne med 40 μL 60% acetonitril og 0,1% TFA og saml dem i det samme opsamlingsrør.
- Spin ned ved 500 x g i 30 s. Tørpoolede eluater i hastighedsvakuum og prøverne opbevares ved -80 °C indtil forarbejdning.
9. Prøve oprydning
BEMÆRK: Før du går videre til proteomics-analysen, er det nødvendigt at fjerne saltet, der er til stede i prøverne. Salte kan forstyrre højtydende væskekromatografi-massespektrometri (HPLC-MS) analyse, da de ioniserer under elektrospray og undertrykker signalet fra peptider. Opsætningen til afsaltning, der blev brugt i denne undersøgelse, blev tidligere demonstreret af Joseph-Chowdhury og kolleger16.
- Før du starter, skal du sikre dig, at der er en ren 96-brønds opsamlingsplade til at opsamle strømmen igennem i de følgende trin. Bland C18-harpiksen (50 mg/ml i 100% acetonitril) på en magnetisk omrøringsplade.
- Tilsæt 70 μL af C18-harpikssuspensionen pr. hul på filterpladen med 96 brønde, og gør dette hurtigt for at sikre, at C18-harpiksen ikke samler sig i bunden af pipetten.
- Tænd vakuumet forsigtigt for at forhindre stænk. Kassér gennemstrømningen, der er opsamlet på opsamlingspladen med 96 brønde.
- Vask harpiksen med 100 μL 0,1% TFA. Tænd vakuumet forsigtigt for at forhindre stænk og blanding af prøver, og kassér strømmen igennem.
- Hver prøve resuspenderes i 100 μL 0,1 % TFA. Kontroller og sørg for, at pH-værdien er mellem 2-3.
- Hver prøve fyldes i hvert hul på filterpladen. Tænd vakuumet forsigtigt for at forhindre stænk og blanding af prøver, og kassér strømmen igennem.
- Vask med 100 μL 0,1% TFA. Tænd vakuumet forsigtigt for at forhindre stænk og blanding af prøver. Kassér gennemløbet.
- Udskift opsamlingspladen med 96 brønde med en ny 96-brøndsplade for at opsamle de afsaltede prøver.
- Der tilsættes 60 μL acetonitril/0,1% TFA pr. hul. For at eluere prøverne fra C18-harpiksen skal du tænde vakuumet forsigtigt for at forhindre stænk.
- Flowet opsamles og tørres i et hastighedsvakuum ved RT. Der fortsættes til LC-MS/MS, eller pladen opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til behandling af prøverne.
10. Proteomics-analyse via væskekromatografi kombineret med massespektrometri
BEMÆRK: For at generere dataene til dette manuskript blev der anvendt et nLC-MS/MS-system med en to-kolonne systemopsætning med en 300 μm ID x 0,5 cm C18-fældesøjle og en 75 μm ID x 25 cm C18-AQ (3 μm) analytisk nanokolonne pakket internt.
- Forbered de mobile faser til at køre på HPLC:
Mobil fase A (MPA): 0,1% myresyre i vand af HPLC-kvalitet
Mobil fase B (MPB): 0,1 % myresyre i HPLC-grade acetonitril - Programmer HPLC-metoden som følger: 4% -34% MPB over 120 min, 34% -90% MPB over 5 min, isokratisk 90% MPB over 5 min; flowhastighed: 300 nL/min.
- Konfigurer MS-anskaffelsesmetoden til at udføre datauafhængig erhvervelse (DIA) for at generere MS/MS-spektre af de detekterede peptidsignaler.
- Resuspender 1 μg prøver i 10 μL 0,1 % TFA, inden prøverne anbringes i nLC-autosampleren.
- Kør nLC-MS-metoden som programmeret til kanonisk proteomics-erhvervelse:
- Indstil fuld MS-scanning til 300-1100 m/z i orbitrap med en opløsning på 120.000 (ved 200 m/z) og et automatisk forstærkningskontrolmål (AGC) på 125.
- Indstil MS/MS i orbitrap med sekventielt isolationsvindue på 50 m/z med et AGC-mål på 400 og en HCD-energi (Higher-energy collisional dissociation) på 30.
11. Analyse af data
- Importer nLC-MS/MS-rådatafilerne til en peak-detektionssoftware, der er kompatibel med den anvendte MS-platform.
- Vælg den rigtige database (menneske, mus osv.).
- Indstil N-terminal acetylering som variabel modifikation og carbamidomethylcystein som fast modifikation.
- Angiv trypsin som fordøjelsesenzymet med to ubesvarede spaltninger tilladt.
- Indstil massetolerance i overensstemmelse hermed til den masseanalysator, der anvendes til spektreoptagelsen.
- Eksportér analysen som et regneark, og behandl dataene yderligere efter behov.
Representative Results
I denne protokol beskriver vi egenskaberne ved en innovativ stressfri 3D-celleinkubator, et system designet specielt til dyrkning af 3D-sfæroider (figur 2). Vi optimerede protokollen til 3D-dyrkning af THLE-3 og HepG2/C3A cellelinjer. Den her beskrevne protokol er enkel at bruge og giver mulighed for reproducerbarhed og omkostningseffektiv dyrkning af > 100 sfæroider pr. Bioreaktor. En gang i bioreaktoren behandles sfæroider på samme måde som celler, der opretholdes i 2D-kultur. Optimale vækstbetingelser opnås ved at udskifte mediet to til tre gange om ugen (figur 2B) og justere rotationshastigheden i henhold til sfæroidernes vækst og størrelse (figur 2C). Dette system, hvor 3D-sfæroider dyrkes i roterende bioreaktorer (figur 2E, F), giver et optimalt vækstmiljø for 3D-strukturer ved at udsætte sfæroid for en lige og meget lav mængde forskydningskraft.
Vi har tidligere vist, hvordan sfæroider kan bruges til analyse af kromatinmodifikation16. Her demonstrerer vi detaljeret, hvordan man opnår leversfæroider, og hvordan proteomiske eksperimenter kan udføres til analyse af det fulde proteom (figur 1). Kort fortalt blev protokollen initieret ved hjælp af THLE-3 eller HepG2 / C3A flade celler, indtil kulturen nåede 80% sammenløb. Til dyrkning af celler som sfæroider blev ca. 2.000 celler belagt i en ultralav fastgørelsesplade indeholdende mikrobrønde for at give dem mulighed for selvaggregere, og derefter blev dannede sfæroider overført til en bioreaktor (figur 1A). Selvom de er funktionelt aktive efter 3 uger i kultur, som tidligere demonstreret17, viser vi resultater fra sfæroider indsamlet efter 36 dage i kultur for denne protokol. Efter indsamling blev sfæroider spundet ned, og både pellet og supernatant blev opbevaret til analyse. Cellelevedygtigheden blev vurderet ud fra supernatanten til kvantificering af adenylatkinase frigivet af beskadigede celler, som beskrevet tidligere17. Cellulære proteiner blev ekstraheret fra cellepelleten, og det fulde proteom blev analyseret ved massespektrometri med høj opløsning (figur 1B).
Denne protokol demonstrerer også en halvautomatisk metode til optælling af sfæroider (figur 3A) ved hjælp af det offentlige billedbehandlingsprogram FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Der bør tages et billede af sfæroiden af god kvalitet til analysen, og nogle parametre bør overvejes som nævnt i afsnit 5. Derefter, efter at billedet er forberedt til analyse, bruges et makroscript (supplerende fil 1) til at tælle sfæroiderne. Makroen fungerer ved først at lave en mappe kaldet FIJI Spheroids counting, inde i den mappe, hvor sfæroidbillederne er placeret. I denne mappe gemmes alle oplysninger fra analysen; dette inkluderer et billede af de sfæroider, der blev talt, med et ID-nummer på hver sfæroide. Det indeholder også en Excel-fil kaldet sfærisk tælling. Denne fil indeholder pixelområdet og id-nummeret for hver kugleform, der blev talt. De data, der svarer til et analyseret billede, præsenteres i hver fane i filen. Fanen er mærket i henhold til navnet på det analyserede billede. Da sfærisk størrelse kan forringes af mange faktorer, herunder antallet af strukturer i et fartøj og lægemiddelbehandling, er det også vigtigt at overvåge deres overfladeareal (planimetry). Makroscriptet, der præsenteres her (supplerende fil 2), fungerer ved at måle de sorte områder, der svarer til sfæroider i billedet (figur 3B). Outputtet samles i en fil kaldet planimetry.xlsx, som indeholder det målte areal, omkreds og diameter af hver sfæroide. Der er også en måling kaldet Feret, der bruges til at beregne diameteren. Feret er den længst mulige diameter, mens minFeret er den korteste. Diameteren er gennemsnittet af disse to. Inde i outputmappen er der udover planimetry.xlsx filen også et billede af de sfæroider, der blev målt.
Før vi gik videre til proteomanalysen, blev sfæroidernes levedygtighed evalueret over dyrkningstid. Niveauer af AK stiger op til dag 17 og når ca. 7% af celledød, og derefter falder døden til niveauer under 5% (figur 4A), hvilket er i overensstemmelse med tidligere offentliggjort arbejde17. Denne protokol viser også den fulde proteomanalyse til overvågning af cellefænotypen. For det første blev proteomerne af THLE-3 og HepG2 / C3A flade celler og sfæroider sammenlignet. Ved at analysere den første hovedkomponent (PC1) er det tydeligt, at der er en streng adskillelse af sfæroidprøver fra flade cellekulturer, og det ser ud til, at korrelationen mellem celletype (THLE-3 og HepG2 / C3A) ikke er relevant (figur 4B). Selvom THLE-3 og HepG2 / C3A sfæroider ikke klynger sammen, deler de lignende profiler i overensstemmelse med leverfunktionen. Vi demonstrerer i denne protokol eksemplet på metallothioneiner, som har en rolle i metalafgiftning udført af leveren. Vi identificerede i proteomics-analysen 2 isoformer, der var overudtrykt i sfæroider sammenlignet med flade celler (MT1E og MT1X) (figur 4C). Vi viser også genontologi (GO) berigelse af begge cellelinjer dyrket som sfæroider. Den kulhydratmetaboliske proces, som omfatter tricarboxylsyrecyklussen (TCA-cyklus), elektrontransportkæden (cellulær respiration) og pyruvatmetabolisme, er et hyppigt udtryk og er beriget i både HepG2 / C3A og THLE-3 sfæroider (figur 4D, E). Cellulær afgiftning, fedtsyre og kolesterolmetabolisme er andre funktioner beriget i begge sfæroider. Sammen er disse funktioner kendt for at være afgørende for leverfunktionen.
Figur 1: Arbejdsproces for sfæroidkultur og prøveforberedelse . (A) 3D-cellekultur eksperimentel tilgang. Fladcellekulturer ved ønsket sammenløb blev trypsiniseret og podet på en ultra-lav vedhæftning 24 brøndplade indeholdende mikrobrønde, hvor celler selv samles i sfæroider. Efter 24 timer blev sfæroider overført til en bioreaktor og dyrket, indtil de er klar til analyse. B) Efter indsamling pelleteres sfæroider, og både pellet og kultursupernatant opbevares indtil forarbejdning. Histoner16og ikke-histoner proteiner blev ekstraheret, fordøjet til peptider og analyseret ved massespektrometri med høj opløsning. Råfiler opnået fra massespektrometrien blev søgt mod den menneskelige database, og dataene blev yderligere behandlet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: 3D-cellekultursystem . (A) Bioreaktordele. Bioreaktoren består af et gasudvekslings- og befugtningskammer indeholdende vandperler og et oplukkeligt cellekammer med to stik til medieudveksling og indsamling af sfæroider. B) Udveksling af bioreaktormedier. Bioreaktoren fyldes med 10 ml vækstmedier ved hjælp af en sprøjte med en nål. (C) Systemkontrolappen. Rotationshastighed, CO2-niveau, temperatur, alarmlog og andre funktioner kan styres ved hjælp af styreenheden. (D) Placering af bioreaktoren i 3D-inkubatoren. Hver bioreaktor har en tilhørende motor, som kan dreje bioreaktoren langsomt. E) Bioreaktor i bevægelse med den hastighed (rpm), der styres af en (C) tablet. Hastigheden (o / min) justeres i henhold til sfæroidernes størrelse. F) Bioreaktorer inde i de 3D-inkubator. 3D-inkubatoren kan rumme op til 6 individuelt styrede bioreaktorer. Foto udlånt af Jason Torres Photography. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fænotypisk karakterisering af sfæroider via billedoptagelse . (A) Halvautomatisk sfærisk tælling. Efter at have taget snapshots af sfæroiderne i bioreaktoren, forberedes billedet til analyse i FIJI. Hver sfærisk tælles, og der gives et ID-nummer for hver af dem. Der bruges en makro, og resultaterne vises, der viser id'et for den tællede sfæroide, etiketten (navnet på det billede, der blev analyseret) og området (antallet af pixel, der tælles i sfæroiden). B) Planimetrisk bestemmelse af kugleformet areal. Ved hjælp af en makro bestemmes arealet, omkredsen og diameteren af en bestemt sfæroide. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Proteomanalyse af leversfæroider . (A) Sfæroider levedygtighed blev beregnet på grundlag af frigivelsen af adenylatkinase (AK) på kultursupernatant. Resultaterne er grundlaget for duplikerede datapunkter ± SD. (B) Hovedkomponentanalyse (PCA) blev udført for at sammenligne proteomet af THLE-3 og HepG2 / C3A flade celler og sfæroider. (C) Relativ forekomst af metallothioneiner, som er proteiner udtrykt af den menneskelige lever. Data er repræsenteret som midler ± SEM. (D) Funktionelt grupperet netværk viser GO-berigelse for HepG2/C3A-sfæroider og (E) THLE-3-sfæroider, hvor kun etiketten for det mest betydningsfulde udtryk pr. gruppe vises. Netværket blev konstrueret ved hjælp af ClueGo19. Nodestørrelsen repræsenterer udtrykket berigelsesbetydning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Makroscript til sfærisk tælling. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Makro til planimetrisk bestemmelse af sfæroider. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Forståelse af biologien bag tredimensionelle (3D) cellulære strukturer er ekstremt vigtig for en mere omfattende viden om deres funktionaliteter. Der er en stigende interesse for at bruge 3D-modeller til at studere kompleks biologi og udføre toksicitetsscreening. Ved dyrkning af celler i 3D er der mange faktorer, der skal overvejes, herunder den fænotypiske vurdering af modelsystemet. En fænotype defineres som en gruppe observerbare egenskaber ved en bestemt organisme, såsom morfologi, adfærd, fysiologiske og biokemiske egenskaber20.
I denne protokol demonstrerer vi, hvordan proteomiske eksperimenter kan udføres fra nogle få sfæroider og kan bruges til at overvåge den typiske leverfænotype. Massespektrometri er blevet en omfattende anvendt metode til 3D-cellekarakterisering, hvilket muliggør undersøgelse af en række biologiske spørgsmål 12,16,21,22. Til en omfattende proteomanalyse anbefales det at anvende mindst 20 μg proteinudgangsmateriale, hvorfra 1 μg injiceres i massespektrometeret. Det er vigtigt at nævne, at tilføjelse af mindre prøve kan føre til tab af følsomhed, og tilføjelse af mere vil gradvist forværre kvaliteten af kromatografien og i sidste ende føre til blokering af kolonnen. I denne undersøgelse viste vi, at HepG2/C3A- og THLE-3-sfæroider er beriget med vigtige proteiner fra glykolyse og TCA-cyklus, som er specifikke leverveje og er kritiske for at opretholde blodsukkerniveauet og for energiproduktion23,24. Faktisk giver massespektrometrianalyse ikke kun information på proteinniveau, men tillader også undersøgelse af protein posttranslationelle modifikationer, som tidligere vist af vores gruppe16.
Et andet aspekt, der skal overvejes i 3D-fænotypiske undersøgelser, er antallet og størrelsen af sfæroider. Udover at gøre eksperimenter mere reproducerbare, er det vigtigt at tælle antallet af sfæroider og bestemme deres størrelse for at bestemme, hvornår kulturen skal opdeles i flere bioreaktorer, da antallet af 3D-strukturer i et fartøj kan påvirke sfæroidernes størrelse og metaboliske aktivitetsniveauer. Det er dog vigtigt at fremhæve, at antallet og størrelsen af sfæroider afhænger af cellelinjen, startantallet af celler, opdelingsprocessen og tidspunktet for indsamling. Detaljer om HepG2 / C3A sfærisk kultur, såsom antal celler pr. Sfæroider, proteinindhold og størrelse som funktion af alder, blev leveret af Fey, Korzeniowska og Wrzesinski25. For nøjagtig og vellykket analyse ved hjælp af den halvautomatiske metode, der er beskrevet her, er det mest kritiske trin et godt sfæroidbillede. For nemheds skyld kan billedet tages med en telefon eller tablet, men opløsningen skal holdes så høj som muligt. Da billeder er hurtige at erhverve, tillader de store screeningseksperimenter at visualisere specifikke fænotypiske træk eller undersøge reaktioner på lægemiddelbehandling. På grund af det stigende antal cellebaserede analyser er der derfor udviklet en række open source-software i løbet af de sidste 10 år til billedanalyse26. I denne protokol beskriver vi et halvautomatisk system, der bruger softwaren FIJI18 til at tælle og måle sfæroidernes størrelse. Vi præsenterede scripts (simple programmeringskommandoer) for at definere en sekvens af algoritmiske operationer, der kan anvendes på en billedsamling, hvilket gør analysen til en nem og hurtig proces. Afhængigt af sfæroidens karakteristika bør der imidlertid anvendes en manuel måling. For eksempel, hvis sfæroiderne er for gennemskinnelige, vil FIJI-scriptet være upræcist. Forresten er et af de vigtigste kriterier for, at denne metode fungerer, sfæroidernes kompakthed. Denne egenskab vil bidrage til en mere forbedret farvekontrast mellem sfæroiderne og baggrunden, hvilket er nødvendigt for, at metoden skal være nøjagtig.
Sammenfattende blev der udover at præsentere en metode til dyrkning af højreproducerbare sfæroider også beskrevet et semiautomatiseret system kombineret med fænotypisk karakterisering via billedoptagelse og proteomics. Vi forventer, at denne værktøjskasse til analyse af 3D-celler bliver mere robust med fuldautomatisk billedanalysesoftware og næste generations massespektrometre.
Disclosures
Helle Sedighi Frandsen er ansat som forsker hos CelVivo ApS, producenten af ClinoStar systemet. Karoline Mikkelsen er erhvervs-ph.d.-studerende ansat hos CelVivo ApS og udfører sit ph.d.-studie på SDU, Odense, Danmark. Alle andre forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Sidoli-laboratoriet anerkender taknemmeligt Leukæmi Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck og NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
| 200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
| 96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
| 96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
| DTT | Sigma | D0632-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
| Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Formic acid | Thermo | 28905 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
| hEGF | Corning | 354052 | |
| HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
| Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| PAULA microscope | Leica | ||
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
| PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
| pH paper | Hydrion | 93 | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
| SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo | 1375 | |
| Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
| S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
| Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Vortex | Sigma | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model. Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).
- Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels. Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10 (29), (2012).
- Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures. Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).
- Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J.
- Sia, D., Llovet, J. M. Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).
- Tang, J., et al. A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro. Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).
- van Zijl, F., Mikulits, W. Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver. World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
- Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).
- Joseph-Chowdhury, J. N., et al. Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S.
- Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. Phenotypic analysis of organoids by proteomics. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Avelino, T. M., et al. Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids. SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).
- Chiang, J. Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. McManus, L. M., MitchellIn, R. N. , Academic Press, Elsevier, San Diego. 1770-1782 (2014).
- Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).
- Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).
- Smith, K., et al. Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays. Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).
