Vi presenterar ett protokoll för odling av högreproducerbara sfäroider och deras fenotypiska karakterisering med hjälp av bildfångst och proteomik.
Vi presenterar ett protokoll som beskriver egenskaperna och fördelarna med att använda en fristående klinostatinkubator för odling, behandling och övervakning av 3D-cellkulturer. Klinostaten efterliknar en miljö där celler kan samlas som mycket reproducerbara sfäroider med låga skjuvkrafter och aktiv näringsdiffusion. Vi visar att både cancer och icke-cancerhepatocyter (HepG2/C3A och THLE-3 cellinjer) kräver 3 veckors tillväxt innan de uppnår funktioner jämförbara med leverceller. Detta protokoll belyser bekvämligheten med att använda inkubatorer för 3D-celler med kameror som övervakar celltillväxten, eftersom ögonblicksbilder kan tas för att räkna och mäta sfäroider vid behandling. Vi beskriver jämförelsen av THLE-3 och HepG2/C3A cellinjer och visar hur icke-cancerösa cellinjer kan odlas såväl som odödliga cancerceller. Vi demonstrerar och illustrerar hur proteomikexperiment kan utföras från ett fåtal sfäroider, som kan samlas in utan störande cellsignalering, dvs ingen trypsinisering krävs. Vi visar att proteomikanalys kan användas för att övervaka den typiska leverfenotypen för metabolism i andningskedjan och produktionen av proteiner som är involverade i metallavgiftning och beskriver ett halvautomatiskt system för att räkna och mäta sfäroidens area. Sammantaget presenterar protokollet en verktygslåda som består av en fenotypisk karakterisering via bildtagning och en proteomikpipeline för att experimentera på 3D-cellodlingsmodeller.
In vitro-cellkulturer har visat sig vara nödvändiga och ovärderliga för att etablera grundläggande kunskap inom biologi. Mycket av den vetenskapliga förståelsen inom biologi och cancer specifikt har kommit från 2D-odlingssystemet, det vill säga celler som växer i ett monolager. Även om 2D-odling har varit det dominerande cellodlingssystemet har det många nackdelar som potentiellt kan kväva ytterligare biologiska framsteg. Till exempel saknar 2D-kulturer cell-cellinteraktioner som är viktiga för cellsignalering och proliferation1. Hittills har 3D-odlingssystem visat sig bättre modellera differentiering, läkemedelsrespons, tumörinvasion och biologi 2,3,4,5. 3D-modellering av maligna cancerformer är särskilt viktigt på grund av ökningen av den åldrande befolkningen och cancerdödligheten. Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en av de främsta orsakerna till cancerrelaterad dödlighet i världen och har ofta en urusel prognos. HCC är känt för att ha en låg läkningsfrekvens, dåligt läkemedelssvar och hög återfallsfrekvens 6,7,8. Flera 3D-modeller för normal lever och HCC har utvecklats som efterliknar fysiologin hos in vivo normal och malign levervävnad 9,10.
Några av de nuvarande 3D-systemen inkluderar vätskeöverlägg, bioreaktorer, hydrogel, ställningar och 3D-printade strukturer. Sfäroider som genereras i bioreaktorer ger specifikt unika fördelar eftersom de efterliknar tumörfördelning av näringsexponering, gasutbyte och cellproliferation/vila11. Bioreaktorer är särskilt lämpliga för cancermodeller på grund av deras användarvänlighet, stora skalbarhet, näringsdiffusion och tillgänglighet11. Dessutom kan bioreaktorer möjliggöra experiment med hög genomströmning, större reproducerbarhet och minskade mänskliga fel. Bioreaktorn som används i denna studie är unik eftersom den simulerar ett system med reducerad gravitation, vilket minimerar störande skjuvkrafter som appliceras i typiska bioreaktorer vilket möjliggör bättre reproducerbarhet12. Den rundstrålande gravitationen och minskningen av skjuvkrafterna gör det möjligt för cellerna att utvecklas på ett mer fysiologiskt sätt. Som bevis utvecklar HepG2/C3A-celler som odlas enligt denna metod sfäriska organeller som producerar in vivo-nivåer av ATP, adenylatkinas, urea och kolesterol13,14. Dessutom är läkemedelsbehandlingar i detta 3D-system mer avancerade och automatiserade i jämförelse med 2D-kulturer. I 2D-kulturer måste läkemedelsbehandlingar ofta ha ett kort tidsförlopp på grund av behovet av att trypsinisera och upprätthålla cellhälsan. Men i vårt fall kan vi utföra långsiktiga läkemedelsbehandlingar av sfäroider utan att behöva störa cellernas struktur och fysiologi. Därför är ett skifte från 2D- till 3D-kulturer nödvändigt för att bättre modellera biologiska fenomen in vivo och främja vetenskaplig utveckling.
Denna artikel presenterar en metod för odling av högreproducerbara sfäroider (Figur 1 och Figur 2) och visar ett halvautomatiskt system för att fenotypiskt karakterisera 3D-strukturer (Figur 3). På bildnivå ger vi information om hur man räknar och mäter sfäroidernas area (figur 3). Genom att använda masspektrometrimetoder visar vi hur proteomik kan användas för att bedöma specifika biologiska funktioner (Figur 4). Genom att samla in och analysera dessa data hoppas vi kunna förbättra förståelsen för biologin bakom 3D-cellodlingssystem.
Att förstå biologin bakom tredimensionella (3D) cellulära strukturer är oerhört viktigt för en mer omfattande kunskap om deras funktioner. Det finns ett växande intresse för att använda 3D-modeller för att studera komplex biologi och utföra toxicitetsscreening. När man odlar celler i 3D måste många faktorer beaktas, inklusive den fenotypiska bedömningen av modellsystemet. En fenotyp definieras som en grupp observerbara egenskaper hos en specifik organism, såsom morfologi, beteende, fysiologiska och biokemiska egenskaper20.
I detta protokoll visar vi hur proteomikexperiment kan utföras från ett fåtal sfäroider och kan användas för att övervaka den typiska leverfenotypen. Masspektrometri har blivit en i stor utsträckning tillämpad metod för 3D-cellkarakterisering, vilket gör det möjligt att undersöka en mängd olika biologiska frågor 12,16,21,22. För en omfattande proteomanalys rekommenderas att använda minst 20 μg proteinutgångsmaterial, från vilket 1 μg injiceras i masspektrometern. Det är viktigt att nämna att om man lägger till mindre prov kan det leda till förlust av känslighet, och att lägga till mer skulle gradvis försämra kromatografens kvalitet och så småningom leda till att kolonnen blockeras. I denna studie visade vi att sfäroiderna HepG2/C3A och THLE-3 är berikade med viktiga proteiner från glykolys och TCA-cykeln, som är specifika levervägar och är avgörande för att upprätthålla blodsockernivåerna och för energiproduktion23,24. Faktum är att masspektrometrianalys inte bara ger information på proteinnivå utan också möjliggör undersökning av proteiners posttranslationella modifieringar, som tidigare visats av vår grupp16.
En annan aspekt som ska beaktas i 3D-fenotypiska studier är antalet och storleken på sfäroider. Förutom att göra experimenten mer reproducerbara är det viktigt att räkna antalet sfäroider och bestämma deras storlek för att avgöra när kulturen ska delas upp i flera bioreaktorer, eftersom antalet 3D-strukturer i ett kärl kan påverka sfäroidernas storlek och metaboliska aktivitetsnivåer. Det är dock viktigt att betona att antalet och storleken på sfäroider beror på cellinjen, startantalet celler, delningsprocessen och insamlingstiden. Detaljer om HepG2/C3A-sfäroidkulturen, såsom antal celler per sfäroid, proteininnehåll och storlek som en funktion av ålder, tillhandahölls av Fey, Korzeniowska och Wrzesinski25. För noggrann och framgångsrik analys med den halvautomatiska metoden som beskrivs här är det mest kritiska steget en bra sfäroidbild. För enkelhetens skull kan bilden tas med en telefon eller surfplatta, men upplösningen bör hållas så hög som möjligt. Eftersom bilder är snabba att få fram möjliggör de storskaliga screeningexperiment för att visualisera specifika fenotypiska egenskaper eller undersöka svar på läkemedelsbehandling. Därför, på grund av det ökande antalet cellbaserade analyser, har ett antal programvaror med öppen källkod utvecklats under de senaste 10 åren för bildanalys26. I detta protokoll beskriver vi ett halvautomatiskt system som använder programvaran FIJI18 för att räkna och mäta sfäroidernas storlek. Vi presenterade skript (enkla programmeringskommandon) för att definiera en sekvens av algoritmiska operationer som kan tillämpas på en bildsamling, vilket gör analysen till en enkel och snabb process. Beroende på sfäroidens egenskaper bör dock en manuell mätning användas. Till exempel, om sfäroiderna är för genomskinliga, kommer FIJI-skriptet att vara oprecist. Förresten, ett av de viktigaste kriterierna för att denna metod ska fungera är sfäroidernas kompakthet. Denna egenskap kommer att bidra till en mer förbättrad färgkontrast mellan sfäroiderna och bakgrunden, vilket är nödvändigt för att metoden ska vara korrekt.
Sammanfattningsvis, förutom att presentera en metodik för att odla högreproducerbara sfäroider, beskrevs också ett halvautomatiserat system i kombination med fenotypisk karakterisering via bildtagning och proteomik. Vi förväntar oss att denna verktygslåda för analys av 3D-celler kommer att bli mer robust med helautomatisk programvara för bildanalys och nästa generations masspektrometrar.
The authors have nothing to disclose.
Sedoli-labbet är tacksamma för Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck och NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
DTT | Sigma | D0632-5G | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
Formic acid | Thermo | 28905 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
hEGF | Corning | 354052 | |
HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
PAULA microscope | Leica | ||
Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
pH paper | Hydrion | 93 | |
Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
Sterile hood | Thermo | 1375 | |
Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
Vortex | Sigma | Z258415 | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |