Summary
Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.
Abstract
Apresentamos um protocolo que descreve as propriedades e vantagens do uso de uma incubadora independente de clinostatos para cultivo, tratamento e monitoramento de culturas de células 3D. O clinostat imita um ambiente onde as células podem se reunir como esferoides altamente reprodutíveis com baixas forças de cisalhamento e difusão ativa de nutrientes. Demonstramos que hepatócitos cancerígenos e não cancerígenos (linhagens celulares HepG2/C3A e THLE-3) requerem 3 semanas de crescimento antes de atingir funcionalidades comparáveis às células hepáticas. Este protocolo destaca a conveniência de utilizar incubadoras para células 3D com câmeras monitorando o crescimento celular, pois instantâneos podem ser tirados para contar e medir esferoides após o tratamento. Descrevemos a comparação de linhagens celulares THLE-3 e HepG2/C3A, mostrando como linhagens celulares não cancerosas podem ser cultivadas, bem como células cancerosas imortalizadas. Demonstramos e ilustramos como experimentos proteômicos podem ser conduzidos a partir de alguns esferoides, que podem ser coletados sem perturbar a sinalização celular, ou seja, sem necessidade de tripsinização. Mostramos que a análise proteômica pode ser usada para monitorar o fenótipo hepático típico do metabolismo da cadeia respiratória e a produção de proteínas envolvidas na desintoxicação de metais e descrevemos um sistema semi-automatizado para contar e medir a área do esferoide. Em conjunto, o protocolo apresenta uma caixa de ferramentas que compreende uma caracterização fenotípica via captura de imagens e um pipeline proteômico para experimentação em modelos de cultura de células 3D.
Introduction
Culturas celulares in vitro têm se mostrado necessárias e inestimáveis no estabelecimento de conhecimentos fundamentais em biologia. Grande parte do entendimento científico em biologia e câncer especificamente veio do sistema de cultura 2D que são células crescendo em uma monocamada. Embora a cultura 2D tenha sido o sistema de cultura celular dominante, ela tem muitas desvantagens que podem potencialmente sufocar o progresso biológico. Por exemplo, culturas 2D carecem de interações célula-célula importantes para a sinalização e proliferação celular1. Até o momento, sistemas de cultura 3D têm demonstrado modelar melhor a diferenciação, a resposta a drogas, a invasão tumoral e a biologia 2,3,4,5. A modelagem 3D de cânceres malignos é especialmente vital devido ao aumento da população idosa e à mortalidade por câncer. O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma das principais causas de mortalidade por câncer no mundo e frequentemente tem um prognóstico abismal6. Sabe-se que o CHC apresenta baixa taxa de cura, baixa resposta medicamentosa e alta taxa de recorrência 6,7,8. Vários modelos 3D para fígado normal e CHC foram desenvolvidos que mimetizam a fisiologia do tecido hepático normal e maligno in vivo9,10.
Alguns dos sistemas 3D atuais incluem sobreposições de líquidos, biorreatores, hidrogel, andaimes e estruturas impressas em 3D. Os esferoides gerados em biorreatores especificamente oferecem vantagens únicas, pois mimetizam a distribuição tumoral de exposição a nutrientes, trocas gasosas e proliferação/quiescência celular11. Os biorreatores são especialmente adequados para modelos de câncer devido à sua facilidade de uso, grande escalabilidade, difusão de nutrientes e acessibilidade11. Além disso, os biorreatores podem permitir experimentos de alto rendimento, maior reprodutibilidade e diminuição do erro humano. O biorreator utilizado neste estudo é único, pois simula um sistema de gravidade reduzida, o que minimiza as forças de cisalhamento disruptivas aplicadas em biorreatores típicos, permitindo melhor reprodutibilidade12. A gravidade omnidirecional e a redução das forças de cisalhamento permitem que as células se desenvolvam de forma mais fisiológica. Como evidência, células HepG2/C3A cultivadas sob essa metodologia desenvolvem organelas esféricas que produzem níveis in vivo de ATP, adenilato quinase, ureia e colesterol13,14. Além disso, os tratamentos medicamentosos neste sistema 3D são mais avançados e automatizados em comparação com as culturas 2D. Em culturas 2D, os tratamentos medicamentosos geralmente devem ter um curso de tempo curto devido à necessidade de tripsinizar e manter a saúde celular. No entanto, no nosso caso, podemos realizar tratamentos medicamentosos de longo prazo de esferoides sem a necessidade de interromper a estrutura e a fisiologia das células. Portanto, uma mudança de culturas 2D para 3D é necessária para melhor modelar fenômenos biológicos in vivo e maior desenvolvimento científico.
Este trabalho apresenta uma metodologia para o crescimento de esferoides de alta reprodutibilidade (Figura 1 e Figura 2) e mostra um sistema semi-automatizado para caracterizar fenotipicamente estruturas 3D (Figura 3). No nível da imagem, fornecemos informações sobre contagem e medição da área dos esferoides (Figura 3). Usando métodos de espectrometria de massas, mostramos como a proteômica pode ser usada para avaliar funções biológicas específicas (Figura 4). Ao coletar e analisar esses dados, esperamos melhorar a compreensão da biologia por trás dos sistemas de cultura de células 3D.
Protocol
1. Buffers e reagentes
- Meios de crescimento celular para células HepG2/C3A: Preparar meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, 4,5g/L de glicose) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), aminoácidos não essenciais (1% v/v), L-glutamina (1% v/v) e penicilina/estreptomicina (0,5% v/v). Conservar o meio de crescimento a 4 °C.
- Meio de crescimento celular para células THLE-3: Preparar meio de crescimento de células epiteliais brônquicas [BEGM] contendo seus suplementos (extrato de hipófise bovina [BPE], hidrocortisona, fator de crescimento epidérmico humano [hEGF], epinefrina, transferrina, insulina, ácido retinóico, triiodotironina, sulfato de gentamicina-anfotericina [GA]), bem como FBS a 10%, hEGF 5 ng/mL e fosfoetalamina 70 ng/mL.
- 500 mM DL-Ditiotreitol (TDT): Para preparar 10 mL, ressuspenda 0,771 g de TDT em 10 mL de água grau HPLC. Loja alíquotas de 100 μL a -20 °C.
- Iodoacetamida 200 mM: Para preparar 1 mL, ressuspenda 36 mg de iodoacetamida em 1 mL de bicarbonato de amônio 50 mM. Não conservar iodoacetamida ressuspensa.
- Dodecil sulfato de sódio (SDS) a 5%: Para preparar 50 mL, ressuspenda 2,5 g de SDS em 50 mL de bicarbonato de amônio 50 mM. Conservar a 4 °C.
- Ácido fosfórico a 12%: Para preparar 100 mL, diluir 14,1 mL de ácido fosfórico a 85% em 85,9 mL de água grau HPLC. Conservar num frasco de vidro à temperatura ambiente (RT).
- Tampão de ligação: Para preparar 1 L, adicione 900 mL de metanol concentrado a 100 mL de bicarbonato de amônio 10 mM ou TEAB.
- Solução de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%: Adicionar 1 ml de TFA concentrado a 999 ml de água de grau HPLC. Conservar a 4 °C.
- Solução de acetonitrila a 60%/TFA a 0,1%: Adicionar 600 mL de acetonitrila grau HPLC (60% v/v) a 399 mL de água grau HPLC. Em seguida, adicione 1 ml de TFA concentrado a esta solução e, em seguida, conservar a 4 °C.
- Fase A móvel (MPA) - ácido fórmico a 0,1%: Adicionar 1 mL de ácido fórmico concentrado a 999 mL de água grau HPLC e misturar bem.
- Fase B móvel (MPB) - 80% acetonitrila grau HPLC + 0,1% ácido fórmico: Adicionar 800 mL de acetonitrila grau HPLC a 199 mL de água grau HPLC. Em seguida, adicione 1 ml de ácido fórmico concentrado a esta solução e misture.
2. Preparação de esferoides
NOTA: A Figura 1A representa os passos iniciais para preparar e cultivar esferoides 3D a partir de linhas celulares.
- Descongelar células HepG2/C3A e THLE-3 congeladas e cultivá-las como monocamada usando meio de crescimento padrão em um frasco ou placa de cultura de tecidos até que atinjam aproximadamente 80% de confluência.
NOTA: Quando as células atingem a confluência, verifique a morfologia celular geral e os padrões de crescimento usando um microscópio. Não é recomendado o uso de células em números de passagem altos. - Lavar as células duas vezes com Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, utilizar 5 ml para um balão T75 cm2 ou prato de 10 cm).
- Adicionar 5 mL de tripsina-EDTA a 0,05% diluído em HBSS (diluição 1:2) e incubar por 5 min a 37 °C com 5% de CO2. Use um microscópio para avaliar o desprendimento celular e adicione 3 mL de FBS ou meio de crescimento (contendo 10% de FBS) para neutralizar a reação de tripsina.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL. Gire para baixo a 270 x g em RT por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de meio de crescimento completo.
NOTA: Se houver muitas células, dilua a suspensão de células antes de contar. - Contar o número de células e diluir a suspensão celular em meio de crescimento completo para obter 1 x 106 em um volume máximo de 1,5 mL.
- Equilibre uma placa de fundo redondo de 24 poços de fixação ultrabaixa contendo micropoços.
- Lavar os poços com 0,5 mL de meio de cultura.
- Centrifugar a placa a 3.000 x g por 5 min (isso remove bolhas de ar da superfície dos poços).
- Transferir a suspensão celular (preparada na etapa 1.4) para a placa e centrifugar durante 3 minutos a 120 x g.
NOTA: O volume de suspensão celular pode variar dependendo da contagem celular, mas é importante limitá-lo a 1,5 mL. - Incubar a placa durante 24 h a 37 °C com 5% de CO2 para iniciar a formação de esferoides.
3. Cultura de esferoides em biorreatores (Figura 2)
NOTA: Para preservar a estrutura dos esferoides, use pontas largas ao manusear esferas 3D.
- Equilibrar o biorreator preenchendo a câmara de umidade com 25 mL de água estéril e a câmara celular com 9 mL de meio de crescimento 24 h antes de transferir os esferoides para ela (Figura 2A). Certifique-se de usar uma seringa de 10 mL acoplada a uma agulha longa ao encher a umidade e as câmaras celulares.
- Incubar o biorreator, girando (15 rpm) na incubadora 3D (Figura 2D,F), por 24 h a 37 °C com 5% de CO2.
- Usando pontas de furo largo de 1 mL, pipetar suavemente para cima e para baixo para separar os esferoides da placa de fixação ultrabaixa e transferir os esferoides para uma placa de cultura de tecidos.
- Lavar a placa de fixação ultrabaixa com 0,5 ml de meio de crescimento pré-aquecido para capturar os esferoides remanescentes e transferi-los para o mesmo prato a partir do passo 3.3.
- Avalie o tamanho, a compacidade e a arredondamento dos esferoides usando um microscópio de luz (aumento de 4x) e selecione os que estão suficientemente formados.
NOTA: As células são suficientemente formadas quando são compactas e não se desfazem durante o manuseamento. Também é importante que os esferoides sejam uma única unidade e não agrupados. Um tamanho esferoide entre 100-200 μm é preferido quando transferido para o biorreator. - Transfira esferoides para o biorreator equilibrado preenchido com 5 mL de meio de crescimento fresco. Depois de transferir os esferoides, encha completamente o biorreator com meios de crescimento frescos e certifique-se de evitar adicionar bolhas ao biorreator ao preenchê-lo com meio.
- Coloque o biorreator na incubadora 3D e ajuste a velocidade de rotação usando a unidade de controle (Figura 2C). Para esferoides HepG2/C3A, ajuste a velocidade de rotação para 10-11 rpm; para esferoides THLE-3, configure-o para 11-12 rpm.
NOTA: A velocidade de rotação é corretamente ajustada quando os esferoides estão distribuídos uniformemente no centro do biorreator e não tocam suas paredes. A Figura 2E mostra um biorreator rotativo. - Troque o meio de crescimento a cada 2-3 dias, removendo 10 mL de meio antigo e substituindo-o por 10 mL de meio fresco; certifique-se de não remover esferoides ao trocar mídia (Figura 2B).
NOTA: Recomenda-se ter uma rotina de troca de mídia (por exemplo, 48 h/48 h/72 h) e manter um registro detalhado. - Ajuste a velocidade de rotação sempre que a mídia for alterada. Aumente a velocidade à medida que os esferoides crescem em tamanho e número.
- Após 15 dias em cultura, dividir os esferoides em dois novos biorreatores.
NOTA: Dependendo da linha celular e da taxa de crescimento, o tempo pode variar e deve ser otimizado individualmente. - Após 20 dias, os esferoides estão prontos para coleta.
4. Captura de imagens e contagem de esferoides
NOTA: O pipeline simplificado para contagem de esferoides é mostrado na Figura 3A. Para contagem de esferoides e determinação de área (seção 5), é fundamental avaliar a compacidade das estruturas 3D. Isso contribuirá para um contraste de cores mais aprimorado, o que é necessário para que o método seja preciso.
- Abra o aplicativo 3D instalado no tablet.
- Selecione o biorreator e tire uma foto.
NOTA: Alternativamente, uma foto pode ser tirada. Os seguintes parâmetros devem ser considerados.- Coloque um fundo preto atrás do biorreator (suporte preto é fornecido na caixa do biorreator).
- Certifique-se de que não há reflexão de luz na câmara celular.
- Tire a foto o mais próximo possível do biorreator.
- Abra uma imagem no FIJI (ImageJ).
- Prepare o quadro para análise:
- Selecione a ferramenta Oval . Desenhe um círculo ao redor do plugue.
- Clique em Excluir no teclado para deixar tudo dentro do círculo preto. Desenhe um círculo ao redor da câmara celular. Certifique-se de que todos os esferoides estão dentro do círculo.
- Execute a macro para contar esferoides:
- Clique em Plug-ins > Macro > Record. Copie o texto da macro do Arquivo Suplementar 1 para o gravador.
- Pressione Criar e uma nova janela será aberta. Pressione Executar para analisar a imagem aberta.
- Uma nova janela será aberta com os resultados (contagem, área total, tamanho médio e área percentual).
- Feche a imagem e repita as etapas 4.4 e 4.5 para cada imagem para a qual a contagem esferoide é necessária. Para um processamento mais fácil e rápido, salve a macro e execute-a clicando em Plug-ins > Macro > Executar e selecione a macro salva.
5. Determinação planimétrica da área esferoide
NOTA: O pipeline simplificado para determinar a área esferoide é mostrado na Figura 3B.
- Tire as imagens conforme descrito na etapa 3.5.
- Antes de começar, defina uma escala global para medir a área dos esferoides.
- Abra em FIJI uma imagem com uma barra de escala com a ampliação desejada. Selecione a ferramenta de linha. Desenhe sobre a barra de escala (a linha precisa ser tão longa quanto a barra de escala).
- Abra Analisar > definir escala. Escreva a distância conhecida (o comprimento da linha é inserido automaticamente na Distância em Pixels. Certifique-se de marcar Global.
- Pressione OK. Agora, a escala está definida para o quadro que será analisado.
- Para iniciar a determinação planimétrica, execute a macro (Arquivo Suplementar 2).
- Clique em Processar > Macro de > em lote. Escolha a pasta que contém as imagens a serem analisadas. Esta pasta será a Entrada.
- Escolha a pasta criada na etapa 5.3.1 como Saída. Processo de Imprensa.
- Como verificação de qualidade, avalie se a área esferoide medida corresponde à imagem original.
NOTA: Macro exclui esferoides na borda onde apenas uma parte do esferoide pode ser medida.
6. Coleção de esferoides
NOTA: É altamente recomendável que os esferoides sejam coletados usando pontas largas para preservar sua estrutura 3D. A coleta pode ser feita utilizando-se o plugue na parte frontal do biorreator (Figura 2A).
O tamanho dos esferoides na coleta pode variar dependendo da linhagem celular, do número inicial de células e do processo de divisão (dias em cultura, número de esferoides por biorreator e razão de divisão).
- Para coletar esferoides, remova 5 mL de meio do biorreator através da porta superior usando uma seringa acoplada a uma agulha longa. Certifique-se de deixar os esferoides afundarem no centro inferior do biorreator (perto da porta inferior).
- Abra a porta frontal e colete esferoides usando uma ponta de furo de 1 mL de largura. Coloque os esferoides em tubos de microcentrífuga. Centrifugar os esferoides a 500 x g por 5 min e descartar o meio.
- Lave os esferoides com 200 μL de HBSS para remover o SFB. Centrifugar a 500 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
- Congelar rapidamente o pellet esferoide com azoto líquido e armazenar a -80 °C até ao processamento.
7. Viabilidade dos esferoides
NOTA: A viabilidade esferoide foi determinada medindo-se a atividade da adenilato quinase (CA) liberada pelas células lesadas (Figura 4A). Devido ao gradiente de difusão, a medida da CA é eficiente quando os esferoides são menores que 900 μm de diâmetro12. Se os esferoides se tornarem maiores, ou se houver alguma dúvida quanto à medida da viabilidade, um ensaio de ATP pode ser realizado15.
- Recolher o sobrenadante esferoide e transferir 20 μL para uma placa de paredes brancas de 96 poços (fundo plano transparente). Adicionar 100 μL de reagente de detecção de adenilato quinase a cada poço e homogeneizar pipetando suavemente para cima e para baixo.
- Remova as bolhas por centrifugação no vácuo de velocidade por 2 min no RT. Incube as placas por 20 min no RT.
- Coloque a placa no luminômetro (leitor de placas, modo luminescência) e inicie o programa. Defina os parâmetros de acordo com as instruções do fabricante do kit.
NOTA: Em ensaios de viabilidade bioluminescente, a saída de luz direta do luminômetro (comumente RLUs) pode ser usada para calcular a resposta celular. Como a adenilato quinase só vaza de células cuja integridade celular foi comprometida, é possível obter um controle total da adenilato quinase usando um reagente de lise.
8. Extração de proteínas
NOTA: A Figura 1B representa o fluxo de trabalho para processamento de esferoides e extração de proteínas.
- Recolher esferoides (secção 6) no dia 36. Ressuspender esferoides em 25 μL de SDS a 5% para lisar as células.
- Após adicionar 5% de SDS, homogeneizar o pellet pipetando para cima e para baixo. Em alguns casos, quando é difícil lisar os esferoides, use um pequeno pilão.
- Incubar as amostras com 20 mM de TDT durante 1 h para reduzir as proteínas. Misture pipetando para cima e para baixo.
- Incubar amostras com iodoacetamida 40 mM durante 30 min protegidas da luz a proteínas alquiladas. Misture pipetando para cima e para baixo.
- Adicionar às amostras uma solução de ácido fosfórico a 12% (10x) numa concentração final de 1,2%.
- Diluir as amostras em seis volumes de tampão de ligação e misturar suavemente.
- Coloque a amostra numa placa de filtro S-Trap e gire para baixo a 500 x g durante 30 s.
NOTA: Se o volume total da amostra na etapa 8.4 exceder a capacidade de volume da coluna, carregue as amostras em lotes e repita a etapa 8.6 até que tudo seja passado pela coluna. - Lavar as amostras duas vezes com 150 μL de tampão de ligação. Após cada lavagem, gire para baixo a 500 x g por 30 s e descarte o fluxo.
- Incubar as amostras com 1 μg de tripsina de grau sequencial diluída em 50 mM de bicarbonato de amónio durante a noite a 37 °C.
NOTA: Recomenda-se pelo menos 20 μg de proteína como material de partida para uma análise abrangente do proteoma. Para isso, 1 μg de tripsina é a quantidade ideal para uma digestão eficiente. Remova quaisquer bolhas entre o buffer e o leito de coluna. - Elute peptídeos com 40 μL de bicarbonato de amônio 50 mM e agrupe-se no mesmo tubo de coleta.
- Gire para baixo a 500 x g por 30 s. Elute peptídeos com 40 μL de TFA 0,1% e agrupe-os no mesmo tubo de coleta.
- Gire para baixo a 500 x g por 30 s. Eluir os peptídeos com 40 μL de acetonitrila a 60% e TFA a 0,1% e agrupá-los no mesmo tubo de coleta.
- Gire para baixo a 500 x g por 30 s. Eluato seco em pool no vácuo de velocidade e armazenar as amostras a -80 °C até o processamento.
9. Limpeza da amostra
OBS: Antes de proceder à análise proteômica, é necessário retirar o sal presente nas amostras. Os sais podem interferir na análise por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (HPLC-MS) à medida que se ionizam durante o eletrospray, suprimindo o sinal dos peptídeos. A configuração para dessalgar utilizada neste estudo foi previamente demonstrada por Joseph-Chowdhury e colaboradores16.
- Antes de começar, certifique-se de que há uma placa de coleta limpa de 96 poços para coletar o fluxo durante as etapas a seguir. Misturar a resina C18 (50 mg/mL em acetonitrila a 100%) em uma placa de agitação magnética.
- Adicione 70 μL da suspensão de resina C18 por poço da placa de filtro de 96 poços, faça isso rapidamente para garantir que a resina C18 não se acumule no fundo da pipeta.
- Ligue o aspirador suavemente para evitar respingos. Descarte o fluxo coletado na placa coletora de 96 poços.
- Lavar a resina com 100 μL de TFA 0,1%. Ligue o vácuo suavemente para evitar respingos e mistura de amostras e descarte o fluxo através.
- Ressuspender cada amostra em 100 μL de TFA 0,1%. Verifique e certifique-se de que o pH está entre 2-3.
- Coloque cada amostra em cada poço da placa filtrante. Ligue o vácuo suavemente para evitar respingos e mistura de amostras e descarte o fluxo através.
- Lavar com 100 μL de TFA 0,1%. Ligue o vácuo suavemente para evitar respingos e mistura de amostras. Descarte o fluxo.
- Substitua a placa de coleta de 96 poços por uma nova placa de 96 poços para coletar as amostras dessalgadas.
- Adicionar 60 μL de acetonitrila/0,1% TFA por poço. Para eluir as amostras da resina C18, ligue o vácuo suavemente para evitar respingos.
- Recolher o fluxo e secar a vácuo a uma velocidade de vácuo em RT. Prossiga para LC-MS/MS ou armazene a placa a -80 °C até estar pronta para processar as amostras.
10. Análise proteômica via cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
NOTA: Para gerar os dados para este manuscrito, foi utilizado um sistema nLC-MS/MS com configuração de sistema de duas colunas com coluna armadilha C18 de 300 μm ID x 0,5 cm e nanocoluna analítica C18-AQ (3 μm) de 75 μm ID x 25 cm embalada internamente.
- Prepare as fases móveis para serem executadas na HPLC:
Fase A móvel (MPA): 0,1% de ácido fórmico em água de grau HPLC
Fase B móvel (MPB): 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila grau HPLC - Programar o método HPLC da seguinte forma: 4%-34% MPB acima de 120 min, 34%-90% MPB acima de 5 min, isocrático 90% MPB acima de 5 min; vazão: 300 nL/min.
- Configure o método de aquisição de MS para realizar aquisição independente de dados (DIA) para gerar espectros MS/MS dos sinais peptídicos detectados.
- Ressuspender 1 μg de amostras em 10 μL de TFA 0,1% antes de colocar as amostras no amostrador automático nLC.
- Execute o método nLC-MS conforme programado para aquisição de proteômica canônica:
- Defina a varredura completa de MS para 300-1100 m/z no orbitrap, com uma resolução de 120.000 (a 200 m/z) e um alvo de controle de ganho automático (AGC) de 125.
- Defina MS/MS no orbitrap com janela de isolamento sequencial de 50 m/z com um alvo AGC de 400 e uma energia de dissociação colisional de alta energia (HCD) de 30.
11. Análise dos dados
- Importe os arquivos de dados brutos nLC-MS/MS para um software de detecção de pico compatível com a plataforma MS usada.
- Selecione o banco de dados adequado (humano, mouse, etc).
- Definir acetilação N-terminal como modificação variável e carbamidometilcisteína como modificação fixa.
- Especifique tripsina como a enzima digestiva com duas clivagens perdidas permitidas.
- Ajuste a tolerância de massa de acordo com o analisador de massa utilizado para a aquisição dos espectros.
- Exporte a análise como uma planilha e processe os dados conforme necessário.
Representative Results
Neste protocolo, descrevemos as propriedades de uma inovadora incubadora de células 3D livre de estresse, um sistema projetado especificamente para o cultivo de esferoides 3D (Figura 2). Otimizamos o protocolo para cultivo 3D de linhagens celulares THLE-3 e HepG2/C3A. O protocolo aqui descrito é simples de usar e permite a reprodutibilidade e o custo-efetivo de > de 100 esferoides por biorreator. Uma vez no biorreator, os esferoides são tratados de forma semelhante às células mantidas em cultura 2D. As condições ótimas de crescimento são alcançadas trocando-se o meio duas a três vezes por semana (Figura 2B) e ajustando-se a velocidade de rotação de acordo com o crescimento e tamanho dos esferoides (Figura 2C). Este sistema, no qual esferoides 3D são cultivados em biorreatores rotativos (Figura 2E,F), fornece um ambiente de crescimento ótimo para estruturas 3D, expondo o esferoide a uma quantidade igual e muito baixa de força de cisalhamento.
Nós mostramos anteriormente como os esferoides podem ser usados para a análise da modificação da cromatina16. Aqui, demonstramos em detalhes como obter esferoides hepáticos e como experimentos proteômicos podem ser conduzidos para a análise do proteoma completo (Figura 1). Resumidamente, o protocolo foi iniciado com o uso de células planas THLE-3 ou HepG2/C3A até que a cultura atingisse 80% de confluência. Para a cultura de células como esferoides, aproximadamente 2.000 células foram plaqueadas em uma placa de ultrabaixa fixação contendo micropoços para permitir sua auto-agregação e, em seguida, os esferoides formados foram transferidos para um biorreator (Figura 1A). Apesar de estarem funcionalmente ativos após 3 semanas de cultura, como demonstrado anteriormente17, mostramos resultados de esferoides coletados após 36 dias em cultura para este protocolo. Após a coleta, os esferoides foram fiados e tanto o pellet quanto o sobrenadante foram armazenados para análise. A viabilidade celular foi avaliada a partir do sobrenadante para a quantificação da adenilato quinase liberada pelas células lesadas, conforme descrito anteriormente17. As proteínas celulares foram extraídas do pellet celular, e o proteoma total foi analisado por espectrometria de massas de alta resolução (Figura 1B).
Este protocolo também demonstra um método semi-automatizado para contagem de esferoides (Figura 3A) utilizando o programa de processamento de imagens públicas FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Uma imagem de boa qualidade do esferoide deve ser tirada para a análise, e alguns parâmetros devem ser considerados, conforme mencionado na seção 5. Em seguida, após a preparação da imagem para análise, um script de macro (Arquivo Suplementar 1) é usado para contar os esferoides. A macro funciona primeiro fazendo uma pasta chamada contagem de esferoides FIJI, dentro da pasta onde as imagens esferoides estão localizadas. Nesta pasta, todas as informações da análise são salvas; isso inclui uma imagem dos esferoides que foram contados, com um número de identificação em cada esferoide. Ele também inclui um arquivo do Excel chamado contagem esferoide. Esse arquivo contém a área de pixel e o número de ID para cada esferoide que foi contado. Os dados correspondentes a uma figura analisada são apresentados em cada aba do arquivo. A guia é rotulada de acordo com o nome da imagem analisada. Como o tamanho do esferoide pode ser prejudicado por muitos fatores, incluindo o número de estruturas dentro de um vaso e o tratamento medicamentoso, também é importante monitorar sua área de superfície (planimetria). O roteiro macro aqui apresentado (Arquivo Suplementar 2) funciona medindo as áreas pretas, que correspondem aos esferoides da figura (Figura 3B). A saída é reunida em um arquivo chamado planimetria.xlsx, que contém a área medida, o perímetro e o diâmetro de cada esferoide. Há também uma medida chamada Feret, usada para calcular o diâmetro. Feret é o maior diâmetro possível, enquanto minFeret é o mais curto. O diâmetro é a média desses dois. Dentro da pasta de saída, além do arquivo .xlsx planimetria, há também uma imagem dos esferoides que foram medidos.
Antes de proceder à análise do proteoma, a viabilidade dos esferoides foi avaliada ao longo do tempo de cultivo. Os níveis de CA aumentam até o 17º dia, atingindo aproximadamente 7% de morte celular, e então a morte diminui para níveis abaixo de 5% (Figura 4A), o que está de acordo com trabalhos publicadosanteriormente17. Este protocolo também mostra a análise completa do proteoma para monitorar o fenótipo celular. Primeiramente, os proteomas das células planas e esferoides THLE-3 e HepG2/C3A foram comparados. Analisando o primeiro componente principal (CP1), fica evidente que há uma separação rigorosa das amostras esferoides das culturas de células planas, e parece que a correlação do tipo celular (THLE-3 e HepG2/C3A) não é relevante (Figura 4B). Embora os esferoides THLE-3 e HepG2/C3A não se agrupem, eles compartilham perfis semelhantes consistentes com a função hepática. Demonstramos neste protocolo o exemplo das metalotioneínas, que têm um papel na desintoxicação de metais realizada pelo fígado. Identificamos na análise proteômica 2 isoformas superexpressas em esferoides em comparação com células planas (MT1E e MT1X) (Figura 4C). Mostramos também o enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) de ambas as linhagens celulares cultivadas como esferoides. O processo metabólico dos carboidratos, que compreende o ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo do TCA), a cadeia de transporte de elétrons (respiração celular) e o metabolismo do piruvato, é um termo frequente e enriquecido tanto em esferoides HepG2/C3A quanto THLE-3 (Figura 4D,E). Desintoxicação celular, ácido graxo, e metabolismo do colesterol são outras funções enriquecidas em ambos os esferoides. Juntas, essas funções são conhecidas por serem cruciais para a função hepática.
Figura 1: Fluxo de trabalho para cultura de esferoides e preparação de amostras . (A) Abordagem experimental de cultura de células 3D. Culturas de células planas na confluência desejada foram tripsinizadas e semeadas em uma placa de 24 poços de fixação ultrabaixa contendo micropoços, onde as células se auto-agrupam em esferoides. Após 24 h, os esferoides foram transferidos para um biorreator e cultivados até que estejam prontos para análise. (B) Após a coleta, os esferoides foram peletizados e o sobrenadante do pellet e da cultura foram armazenados até o processamento. As proteínas histonas16e não-histonas foram extraídas, digeridas em peptídeos e analisadas por espectrometria de massas de alta resolução. Arquivos brutos obtidos a partir da espectrometria de massas foram pesquisados no banco de dados humano, e os dados foram posteriormente processados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sistema de cultura de células 3D. (A) Peças de biorreator. O biorreator é composto por uma câmara de troca gasosa e umidificação contendo esferas de água e uma câmara celular aberta com dois plugs para troca de meios e coleta de esferoides. (B) Intercâmbio de meios de biorreatores. O biorreator é preenchido com 10 mL de meio de crescimento usando uma seringa com uma agulha. (C) O aplicativo de controle do sistema. A velocidade de rotação, o nível de CO2, a temperatura, o registro de alarme e outras funcionalidades podem ser controladas usando a unidade de controle. (D) Colocação do biorreator na incubadora 3D. Cada biorreator tem um motor associado que pode girar o biorreator lentamente. (E) Biorreator em movimento com a velocidade (rpm) controlada por um comprimido (C). A velocidade (rpm) é ajustada de acordo com o tamanho dos esferoides. (F) Biorreatores dentro de incubadora 3D. A incubadora 3D pode acomodar até 6 biorreatores controlados individualmente. Foto gentilmente cedida por Jason Torres Photography. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização fenotípica dos esferoides via captura de imagens . (A) Contagem esferoide semi-automatizada. Depois de tirar instantâneos dos esferoides no biorreator, a imagem é preparada para análise em FIJI. Cada esferoide é contado, e um número de identificação é fornecido para cada um deles. Uma macro é usada e os resultados são exibidos mostrando o ID do esferoide contado, o rótulo (nome da imagem que foi analisada) e a área (o número de pixels contados no esferoide). (B) Determinação planimétrica da área esferoide. Usando um macro, a área, o perímetro e o diâmetro de um esferoide específico são determinados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise proteômica de esferoides hepáticos. (A) A viabilidade dos esferoides foi calculada com base na liberação de adenilato quinase (AK) no sobrenadante da cultura. Os resultados são as médias dos pontos de dados duplicados ± SD. (B) A análise de componentes principais (ACP) foi realizada para comparar o proteoma de células planas e esferoides THLE-3 e HepG2/C3A. (C) Abundância relativa de metalotioneínas, que são proteínas expressas pelo fígado humano. ±(D) Rede funcionalmente agrupada mostra enriquecimento de GO para esferoides HepG2/C3A e (E) esferoides THLE-3, onde apenas o rótulo do termo mais significativo por grupo é mostrado. A rede foi construída utilizando o ClueGo19. O tamanho do nó representa o significado do termo enriquecimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Script de macro para contagem de esferoides. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: Macro para determinação planimétrica de esferoides. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
A compreensão da biologia por trás das estruturas celulares tridimensionais (3D) é extremamente importante para um conhecimento mais abrangente de suas funcionalidades. Há um interesse crescente no uso de modelos 3D para estudar biologia complexa e realizar triagem de toxicidade. Ao cultivar células em 3D, muitos fatores precisam ser considerados, incluindo a avaliação fenotípica do sistema modelo. Um fenótipo é definido como um conjunto de características observáveis de um organismo específico, tais como morfologia, comportamento, propriedades fisiológicas e bioquímicas20.
Neste protocolo, demonstramos como experimentos proteômicos podem ser conduzidos a partir de alguns esferoides e podem ser usados para monitorar o fenótipo hepático típico. A espectrometria de massas tornou-se um método extensivamente aplicado para a caracterização de células 3D, permitindo a investigação de uma variedade de questões biológicas 12,16,21,22. Para uma análise abrangente do proteoma, recomenda-se o uso de pelo menos 20 μg de material de partida proteico, a partir do qual 1 μg é injetado no espectrômetro de massa. É importante mencionar que adicionar menos amostra pode levar à perda de sensibilidade, e adicionar mais pioraria gradualmente a qualidade da cromatografia e, eventualmente, levaria ao bloqueio da coluna. Neste estudo, demonstramos que os esferoides HepG2/C3A e THLE-3 são enriquecidos com proteínas importantes da glicólise e do ciclo do TCA, que são vias hepáticas específicas e são fundamentais para a manutenção dos níveis glicêmicos e para a produção de energia23,24. De fato, a análise por espectrometria de massas fornece não apenas informações em nível de proteína, mas também permite a investigação de modificações pós-traducionais de proteínas, como demonstrado anteriormente por nosso grupo16.
Outro aspecto a ser considerado em estudos fenotípicos 3D é o número e o tamanho dos esferoides. Além de tornar os experimentos mais reprodutíveis, contar o número de esferoides e determinar seu tamanho é essencial para determinar quando dividir a cultura em múltiplos biorreatores, pois o número de estruturas 3D dentro de um vaso pode afetar o tamanho dos esferoides e os níveis de atividade metabólica. No entanto, é importante ressaltar que o número e o tamanho dos esferoides dependem da linhagem celular, do número inicial de células, do processo de divisão e do tempo de coleta. Detalhes da cultura de esferoides HepG2/C3A, como número de células por esferoide, conteúdo proteico e tamanho em função da idade, foram fornecidos por Fey, Korzeniowska e Wrzesinski25. Para uma análise precisa e bem-sucedida usando o método semi-automatizado descrito aqui, o passo mais crítico é uma boa imagem dos esferoides. Para simplificar, a foto pode ser tirada com um telefone ou tablet, mas sua resolução deve ser mantida a mais alta possível. Como as imagens são de aquisição rápida, elas permitem experimentos de triagem em larga escala para visualizar características fenotípicas específicas ou investigar respostas ao tratamento medicamentoso. Portanto, devido ao crescente número de ensaios baseados em células, vários softwares de código aberto foram desenvolvidos nos últimos 10 anos para análise de imagens26. Neste protocolo, descrevemos um sistema semi-automatizado utilizando o software FIJI18 para contagem e mensuração do tamanho dos esferoides. Apresentamos scripts (comandos de programação simples) para definir uma sequência de operações algorítmicas que podem ser aplicadas a uma coleção de imagens, tornando a análise um processo fácil e rápido. No entanto, dependendo da característica do esferoide, uma medida manual deve ser empregada. Por exemplo, se os esferoides são muito translúcidos, o script FIJI será impreciso. Aliás, um dos critérios mais importantes para que esse método funcione é a compacidade dos esferoides. Essa característica contribuirá para um contraste de cores mais acentuado entre os esferoides e o fundo, o que é necessário para que o método seja preciso.
Em resumo, além de apresentar uma metodologia para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade também foi descrito um sistema semi-automatizado acoplado à caracterização fenotípica via captura de imagens e proteômica. Esperamos que esta caixa de ferramentas para analisar células 3D se torne mais robusta com software de análise de imagem totalmente automatizado e espectrômetros de massa de última geração.
Disclosures
Helle Sedighi Frandsen trabalha como cientista pesquisadora na CelVivo ApS, produtora do sistema ClinoStar. Karoline Mikkelsen é uma estudante de doutorado industrial empregada na CelVivo ApS e realizando seu estudo de doutorado na SDU, Odense, Dinamarca. Todos os outros autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O laboratório Sidoli agradece à Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (prêmio Sagol Network GerOmics), Deerfield (prêmio Xseed), Relay Therapeutics, Merck e ao NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
| 200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
| 96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
| 96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
| DTT | Sigma | D0632-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
| Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Formic acid | Thermo | 28905 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
| hEGF | Corning | 354052 | |
| HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
| Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| PAULA microscope | Leica | ||
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
| PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
| pH paper | Hydrion | 93 | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
| SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo | 1375 | |
| Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
| S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
| Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Vortex | Sigma | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |
References
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