Summary
Vi presenterar ett protokoll för odling av högreproducerbara sfäroider och deras fenotypiska karakterisering med hjälp av bildfångst och proteomik.
Abstract
Vi presenterar ett protokoll som beskriver egenskaperna och fördelarna med att använda en fristående klinostatinkubator för odling, behandling och övervakning av 3D-cellkulturer. Klinostaten efterliknar en miljö där celler kan samlas som mycket reproducerbara sfäroider med låga skjuvkrafter och aktiv näringsdiffusion. Vi visar att både cancer och icke-cancerhepatocyter (HepG2/C3A och THLE-3 cellinjer) kräver 3 veckors tillväxt innan de uppnår funktioner jämförbara med leverceller. Detta protokoll belyser bekvämligheten med att använda inkubatorer för 3D-celler med kameror som övervakar celltillväxten, eftersom ögonblicksbilder kan tas för att räkna och mäta sfäroider vid behandling. Vi beskriver jämförelsen av THLE-3 och HepG2/C3A cellinjer och visar hur icke-cancerösa cellinjer kan odlas såväl som odödliga cancerceller. Vi demonstrerar och illustrerar hur proteomikexperiment kan utföras från ett fåtal sfäroider, som kan samlas in utan störande cellsignalering, dvs ingen trypsinisering krävs. Vi visar att proteomikanalys kan användas för att övervaka den typiska leverfenotypen för metabolism i andningskedjan och produktionen av proteiner som är involverade i metallavgiftning och beskriver ett halvautomatiskt system för att räkna och mäta sfäroidens area. Sammantaget presenterar protokollet en verktygslåda som består av en fenotypisk karakterisering via bildtagning och en proteomikpipeline för att experimentera på 3D-cellodlingsmodeller.
Introduction
In vitro-cellkulturer har visat sig vara nödvändiga och ovärderliga för att etablera grundläggande kunskap inom biologi. Mycket av den vetenskapliga förståelsen inom biologi och cancer specifikt har kommit från 2D-odlingssystemet, det vill säga celler som växer i ett monolager. Även om 2D-odling har varit det dominerande cellodlingssystemet har det många nackdelar som potentiellt kan kväva ytterligare biologiska framsteg. Till exempel saknar 2D-kulturer cell-cellinteraktioner som är viktiga för cellsignalering och proliferation1. Hittills har 3D-odlingssystem visat sig bättre modellera differentiering, läkemedelsrespons, tumörinvasion och biologi 2,3,4,5. 3D-modellering av maligna cancerformer är särskilt viktigt på grund av ökningen av den åldrande befolkningen och cancerdödligheten. Hepatocellulärt karcinom (HCC) är en av de främsta orsakerna till cancerrelaterad dödlighet i världen och har ofta en urusel prognos. HCC är känt för att ha en låg läkningsfrekvens, dåligt läkemedelssvar och hög återfallsfrekvens 6,7,8. Flera 3D-modeller för normal lever och HCC har utvecklats som efterliknar fysiologin hos in vivo normal och malign levervävnad 9,10.
Några av de nuvarande 3D-systemen inkluderar vätskeöverlägg, bioreaktorer, hydrogel, ställningar och 3D-printade strukturer. Sfäroider som genereras i bioreaktorer ger specifikt unika fördelar eftersom de efterliknar tumörfördelning av näringsexponering, gasutbyte och cellproliferation/vila11. Bioreaktorer är särskilt lämpliga för cancermodeller på grund av deras användarvänlighet, stora skalbarhet, näringsdiffusion och tillgänglighet11. Dessutom kan bioreaktorer möjliggöra experiment med hög genomströmning, större reproducerbarhet och minskade mänskliga fel. Bioreaktorn som används i denna studie är unik eftersom den simulerar ett system med reducerad gravitation, vilket minimerar störande skjuvkrafter som appliceras i typiska bioreaktorer vilket möjliggör bättre reproducerbarhet12. Den rundstrålande gravitationen och minskningen av skjuvkrafterna gör det möjligt för cellerna att utvecklas på ett mer fysiologiskt sätt. Som bevis utvecklar HepG2/C3A-celler som odlas enligt denna metod sfäriska organeller som producerar in vivo-nivåer av ATP, adenylatkinas, urea och kolesterol13,14. Dessutom är läkemedelsbehandlingar i detta 3D-system mer avancerade och automatiserade i jämförelse med 2D-kulturer. I 2D-kulturer måste läkemedelsbehandlingar ofta ha ett kort tidsförlopp på grund av behovet av att trypsinisera och upprätthålla cellhälsan. Men i vårt fall kan vi utföra långsiktiga läkemedelsbehandlingar av sfäroider utan att behöva störa cellernas struktur och fysiologi. Därför är ett skifte från 2D- till 3D-kulturer nödvändigt för att bättre modellera biologiska fenomen in vivo och främja vetenskaplig utveckling.
Denna artikel presenterar en metod för odling av högreproducerbara sfäroider (Figur 1 och Figur 2) och visar ett halvautomatiskt system för att fenotypiskt karakterisera 3D-strukturer (Figur 3). På bildnivå ger vi information om hur man räknar och mäter sfäroidernas area (figur 3). Genom att använda masspektrometrimetoder visar vi hur proteomik kan användas för att bedöma specifika biologiska funktioner (Figur 4). Genom att samla in och analysera dessa data hoppas vi kunna förbättra förståelsen för biologin bakom 3D-cellodlingssystem.
Protocol
1. Buffertar och reagenser
- Celltillväxtmedium för HepG2/C3A-celler: Förbered Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM, 4,5 g/L glukos) som innehåller 10 % fetalt bovint serum (FBS), icke-essentiella aminosyror (1 % v/v), L-glutamin (1 % v/v) och penicillin/streptomycin (0,5 % v/v). Förvara odlingssubstratet vid 4 °C.
- Celltillväxtmedium för THLE-3-celler: Förbered bronkialepitelcelltillväxtmedium [BEGM] som innehåller dess tillskott (bovint hypofysextrakt [BPE], hydrokortison, human epidermal tillväxtfaktor [hEGF], adrenalin, transferrin, insulin, retinsyra, trijodtyronin, gentamicinsulfat-amfotericin [GA]) samt 10 % FBS, 5 ng/ml hEGF och 70 ng/ml fosfoetanolamin.
- 500 mM DL-ditiotreitol (DTT): För att bereda 10 ml, återsuspendera 0,771 g DTT i 10 ml vatten av HPLC-kvalitet. Förvara 100 μL alikvoter vid -20 °C.
- 200 mM jodacetamid: För att bereda 1 ml, återsuspendera 36 mg jodacetamid i 1 ml 50 mM ammoniumbikarbonat. Förvara inte återsuspenderad jodacetamid.
- 5 % natriumdodecylsulfat (SDS): För att bereda 50 ml, återsuspendera 2,5 g SDS i 50 ml 50 mM ammoniumbikarbonat. Förvaras vid 4 °C.
- 12 % fosforsyra: För att bereda 100 ml, späd 14,1 ml 85 % fosforsyra i 85,9 ml vatten av HPLC-kvalitet. Förvaras i glasflaska i rumstemperatur (RT).
- Bindningsbuffert: För att bereda 1 l, tillsätt 900 ml koncentrerad metanol till 100 ml 10 mM ammoniumbikarbonat eller TEAB.
- 0,1 % trifluorättiksyralösning (TFA): Tillsätt 1 ml koncentrerad TFA till 999 ml vatten av HPLC-kvalitet. Förvaras vid 4 °C.
- 60 % acetonitril/0,1 % TFA-lösning: Tillsätt 600 ml acetonitril av HPLC-kvalitet (60 % v/v) till 399 ml vatten av HPLC-kvalitet. Tillsätt sedan 1 ml koncentrerad TFA till denna lösning och förvara sedan vid 4 °C.
- Mobil fas A (MPA) - 0,1 % myrsyra: Tillsätt 1 ml koncentrerad myrsyra till 999 ml vatten av HPLC-kvalitet och blanda väl.
- Mobil fas B (MPB) - 80 % acetonitril av HPLC-kvalitet + 0,1 % myrsyra: Tillsätt 800 ml actonitril av HPLC-kvalitet till 199 ml vatten av HPLC-kvalitet. Tillsätt sedan 1 ml koncentrerad myrsyra till denna lösning och blanda.
2. Beredning av sfäroider
OBS: Figur 1A visar de första stegen för att förbereda och odla 3D-sfäroider från cellinjer.
- Tina frysta HepG2/C3A- och THLE-3-celler och odla dem som ett monolager med hjälp av vanliga odlingsmedier i en vävnadsodlingskolv eller skål tills de når cirka 80 % sammanflöde.
OBS: När celler når sammanflöde, kontrollera den allmänna cellulära morfologin och tillväxtmönstren med hjälp av ett mikroskop. Det rekommenderas inte att använda celler med höga passagenummer. - Tvätta cellerna två gånger med Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, använd 5 ml för en T75 cm2 kolv eller 10 cm skål).
- Tillsätt 5 ml 0,05 % trypsin-EDTA utspätt i HBSS (1:2 spädning) och inkubera 5 % CO2 i 5 minuter vid 37 °C. Använd ett mikroskop för att bedöma cellavlossning och tillsätt 3 ml FBS eller tillväxtmedia (innehållande 10 % FBS) för att neutralisera trypsinreaktionen.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör. Snurra ner med 270 x g vid RT i 5 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 ml komplett odlingssubstrat.
OBS: Om det finns för många celler, späd cellsuspensionen innan du räknar. - Räkna antalet celler och späd cellsuspensionen i komplett odlingssubstrat för att erhålla 1 x 106 i en maximal volym av 1,5 ml.
- Jämvikt med en ultralåg infästning 24-håls rund bottenplatta som innehåller mikrobrunnar.
- Tvätta brunnarna med 0,5 ml odlingsmedium.
- Centrifugera plattan med 3 000 x g i 5 minuter (detta tar bort luftbubblor från brunnarnas yta).
- Överför cellsuspensionen (beredd i steg 1.4) till plattan och centrifugera i 3 minuter vid 120 x g.
OBS: Cellsuspensionsvolymen kan variera beroende på cellantalet, men det är viktigt att begränsa den till 1.5 ml. - Inkubera plattan i 24 timmar vid 37 °C med 5 % CO2 för att påbörja sfäroidbildningen.
3. Odling av sfäroider i bioreaktorer (figur 2)
OBS: För att bevara sfäroidernas struktur, använd spetsar med bred borrning vid hantering av 3D-sfärer.
- Jämvikt mellan bioreaktorn och fyll fuktkammaren med 25 ml sterilt vatten och cellkammaren med 9 ml odlingssubstrat under 24 timmar innan sfäroiderna överförs till den (figur 2A). Var noga med att använda en 10 ml spruta kopplad till en lång nål när du fyller fukt och cellkammare.
- Inkubera bioreaktorn genom att rotera (15 varv/min) i 3D-inkubatorn (figur 2D,F) i 24 timmar vid 37 °C med 5 % CO2 -.
- Använd 1 ml breda borrspetsar, pipettera försiktigt upp och ner för att lossa sfäroider från den ultralåga fästplattan och överför sfäroiderna till en vävnadsodlingsskål.
- Tvätta den ultralåga fästplattan med 0.5 ml förvärmt odlingsmedium för att fånga upp överblivna sfäroider och överföra dem till samma skål från steg 3.3.
- Bedöm sfäroidernas storlek, kompakthet och rundhet med hjälp av ett ljusmikroskop (4x förstoring) och välj de som är tillräckligt formade.
OBS: Cellerna är tillräckligt formade när de är kompakta och inte faller isär under hanteringen. Det är också viktigt att sfäroider är en enda enhet och inte klumpas ihop. En sfäroidstorlek mellan 100-200 μm är att föredra när den överförs till bioreaktorn. - Överför sfäroider till den jämviktade bioreaktorn fylld med 5 ml färskt odlingsmedium. Efter att ha överfört sfäroiderna, fyll bioreaktorn helt med färska tillväxtmedier och se till att undvika att lägga till bubblor i bioreaktorn när du fyller den med media.
- Placera bioreaktorn i 3D-inkubatorn och justera rotationshastigheten med hjälp av styrenheten (Figur 2C). För HepG2/C3A-sfäroider, ställ in rotationshastigheten till 10-11 rpm; för THLE-3-sfäroider, ställ in den på 11-12 rpm.
OBS: Rotationshastigheten är korrekt inställd när sfäroiderna är jämnt fördelade i mitten av bioreaktorn och inte vidrör dess väggar. Figur 2E visar en roterande bioreaktor. - Byt odlingsmedia var 2-3:e dag genom att ta bort 10 ml gammalt medium och ersätta det med 10 ml nytt media; Var noga med att inte ta bort sfäroider när du byter media (Figur 2B).
OBS: Det rekommenderas att ha en rutin för medieutbyte (t.ex.ample, 48 h/48 h/72 h) och föra ett detaljerat register. - Justera rotationshastigheten varje gång du byter material. Öka hastigheten i takt med att sfäroiderna växer i storlek och antal.
- Efter 15 dagar i odling, dela sfäroider i två nya bioreaktorer.
OBS: Beroende på cellinje och tillväxthastighet kan tiden variera och bör optimeras individuellt. - Efter 20 dagar är sfäroiderna redo för insamling.
4. Bildtagning och räkning av sfäroider
OBS: Den förenklade pipelinen för antalet sfäroider visas i figur 3A. För antal sfäroider och areabestämning (avsnitt 5) är det viktigt att utvärdera kompaktheten hos 3D-strukturerna. Detta kommer att bidra till en mer förbättrad färgkontrast, vilket är nödvändigt för att metoden ska vara korrekt.
- Öppna 3D-appen som är installerad på surfplattan.
- Välj bioreaktorn och ta en ögonblicksbild.
OBS: Alternativt kan en bild tas. Följande parametrar bör beaktas.- Placera en svart bakgrund bakom bioreaktorn (svart stöd finns i bioreaktorlådan).
- Se till att det inte finns någon ljusreflektion på cellkammaren.
- Ta bilden så nära bioreaktorn som möjligt.
- Öppna en bild i FIJI (ImageJ).
- Förbered bilden för analys:
- Välj verktyget Oval . Rita en cirkel runt kontakten.
- Klicka på Ta bort på tangentbordet för att göra allt i cirkeln svart. Rita en cirkel runt cellkammaren. Se till att alla sfäroider är inuti cirkeln.
- Kör makro för att räkna sfäroider:
- Klicka på Plugin-program > makro > spela in. Kopiera makrotext från tilläggsfil 1 till inspelaren.
- Tryck på Skapa så öppnas ett nytt fönster. Tryck på Kör för att analysera den öppnade bilden.
- Ett nytt fönster öppnas med resultaten (antal, total yta, genomsnittlig storlek och procentyta).
- Stäng bilden och upprepa steg 4.4 och 4.5 för varje bild som sfäroidräkningen behövs för. För enklare och snabbare bearbetning, spara makrot och kör det genom att klicka på Plugins > Macro > Kör och välj det sparade makrot.
5. Planimetrisk bestämning av sfäroidområdet
OBS: Den förenklade rörledningen för bestämning av sfäroidområdet visas i figur 3B.
- Ta bilder enligt beskrivningen i steg 3.5.
- Innan du börjar, ställ in en global skala för att mäta sfäroidernas area.
- Öppna en bild i FIJI med en skalstapel med önskad förstoring. Välj linjeverktyget. Rita över skalstapeln (linjen måste vara lika lång som skalstapeln är).
- Öppna Analysera > Ange skala. Skriv det kända avståndet (linjens längd anges automatiskt i Avstånd i pixlar. Se till att kryssa i Global.
- Tryck på OK. Nu är skalan inställd för den bild som ska analyseras.
- För att starta den planimetrisk bestämningen, kör makrot (tilläggsfil 2).
- Klicka på Bearbeta > Gruppera > makro. Välj den mapp som innehåller de bilder som ska analyseras. Den här mappen kommer att vara indata.
- Välj mappen som skapades i steg 5.3.1 som Utdata. Tryck på Process.
- Som en kvalitetskontroll, utvärdera om det uppmätta sfäroidområdet motsvarar originalbilden.
OBS: Makro utesluter sfäroider på kanten där endast en del av sfäroiden kan mätas.
6. Insamling av sfäroider
OBS: Det rekommenderas starkt att sfäroider samlas in med hjälp av spetsar med breda hål för att bevara sin 3D-struktur. Insamlingen kan göras med hjälp av pluggen på framsidan av bioreaktorn (Figur 2A).
Storleken på sfäroider vid insamling kan variera beroende på cellinje, startantal celler och delningsprocess (dagar i odling, antal sfäroider per bioreaktor och delningsförhållande).
- För att samla upp sfäroider, ta bort 5 ml media från bioreaktorn genom den övre porten med hjälp av en spruta kopplad till en lång nål. Var noga med att låta sfäroider sjunka till botten av bioreaktorn (nära den nedre porten).
- Öppna den främre porten och samla upp sfäroider med en 1 ml bred borrspets. Placera sfäroiderna i mikrocentrifugrör. Centrifugera sfäroiderna vid 500 x g i 5 minuter och kassera materialet.
- Tvätta sfäroiderna med 200 μL HBSS för att ta bort FBS. Centrifugera vid 500 x g i 5 minuter och kassera supernatanten.
- Snap-frys sfäroidpelleten med flytande kväve och förvara vid -80 °C fram till bearbetning.
7. Sfäroidernas livskraft
OBS: Sfäroidernas viabilitet bestämdes genom att mäta aktiviteten hos adenylatkinas (AK) som frigörs av skadade celler (Figur 4A). På grund av diffusionsgradienten är AK-mätning effektiv när sfäroider är mindre än 900 μm i diameter12. Om sfäroiderna blir större, eller om det finns några tvivel angående viabilitetsmätningen, kan en ATP-analys utföras15.
- Samla upp sfäroidsupernatanten och överför 20 μL till en 96-håls vitväggig platta (klar med platt botten). Tillsätt 100 μl adenylatkinasdetektionsreagens till varje brunn och homogenisera genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- Avlägsna bubblorna genom centrifugering i hastighetsvakuum i 2 minuter vid RT. Inkubera plattorna i 20 minuter vid RT.
- Placera plattan i luminometern (plattläsare, luminiscensläge) och starta programmet. Ställ in parametrarna enligt satstillverkarens instruktioner.
OBS: I bioluminescerande viabilitetsanalyser kan den direkta luminometerns ljuseffekt (vanligtvis RLU) användas för att beräkna cellsvaret. Eftersom adenylatkinas endast läcker från celler vars cellintegritet har äventyrats, är det möjligt att uppnå en total kontroll av adenylatkinas genom att använda ett lysreagens.
8. Extraktion av protein
OBS: Figur 1B visar arbetsflödet för bearbetning av sfäroider och proteinextraktion.
- Samla sfäroider (avsnitt 6) på dag 36. Återsuspendera sfäroider i 25 μL 5 % SDS för att lysera cellerna.
- Efter tillsats av 5 % SDS, homogenisera pelleten genom att pipettera upp och ner. I vissa fall när det är svårt att lysera sfäroiderna, använd en liten mortelstöt.
- Inkubera proverna med 20 mM DTT i 1 timme för att reducera proteiner. Blanda genom att pipettera upp och ner.
- Inkubera prover med 40 mM jodacetamid i 30 minuter skyddade från ljus till alkylatproteiner. Blanda genom att pipettera upp och ner.
- Tillsätt 12 % fosforsyralösning (10 gånger) till proverna vid en slutlig koncentration på 1,2 %.
- Späd proverna i sex volymer bindningsbuffert och blanda försiktigt.
- Ladda provet på en S-Trap-filterplatta och centrifugera ner med 500 x g i 30 s.
OBS: Om den totala volymen av sample i steg 8.4 överstiger kolonnvolymkapaciteten, ladda samples i omgångar och upprepa steg 8.6 tills allt har passerat genom kolonnen. - Tvätta proverna två gånger med 150 μl bindningsbuffert. Efter varje tvätt, centrifugera ner med 500 x g i 30 s och kassera flödet.
- Inkubera proverna med 1 μg sekvenseringsklassat trypsin utspätt i 50 mM ammoniumbikarbonat över natten vid 37 °C.
OBS: Minst 20 μg protein rekommenderas som utgångsmaterial för omfattande proteomanalys. För detta är 1 μg trypsin den idealiska mängden för effektiv matsmältning. Ta bort eventuella bubblor mellan bufferten och pelarbädden. - Eluera peptider med 40 μL 50 mM ammoniumbikarbonat och samlas i samma uppsamlingsrör.
- Centrifugera med 500 x g i 30 s. Eluera peptider med 40 μL 0,1 % TFA och slå samman dem i samma uppsamlingsrör.
- Centrifugera med 500 x g i 30 s. Eluera peptiderna med 40 μL 60 % acetonitril och 0,1 % TFA och slå samman dem i samma uppsamlingsrör.
- Centrifugera med 500 x g i 30 s. Torka poolen av eluat i hastighetsvakuum och förvara proverna vid -80 °C fram till bearbetningen.
9. Rengöring av prover
OBS: Innan du går vidare till proteomikanalysen är det nödvändigt att ta bort saltet som finns i proverna. Salter kan störa högpresterande vätskekromatografi-masspektrometri (HPLC-MS) analys eftersom de joniseras under elektrospray, vilket undertrycker signalen från peptider. Upplägget för avsaltning som användes i denna studie har tidigare demonstrerats av Joseph-Chowdhury och kollegor16.
- Innan du börjar, se till att det finns en ren uppsamlingsplatta med 96 brunnar för att samla upp flödet under följande steg. Blanda C18-hartset (50 mg/ml i 100 % acetonitril) på en magnetisk omrörningsplatta.
- Tillsätt 70 μL av C18-hartssuspensionen per brunn på 96-hålsfilterplattan, gör detta snabbt för att säkerställa att C18-hartset inte samlas i botten av pipetten.
- Slå på dammsugaren försiktigt för att förhindra stänk. Kassera genomströmningen som samlats på uppsamlingsplattan med 96 brunnar.
- Tvätta hartset med 100 μL 0,1 % TFA. Slå på vakuumet försiktigt för att förhindra stänk och blandning av samples och kassera flödet igenom.
- Återsuspendera varje prov i 100 μl 0,1 % TFA. Kontrollera och se till att pH-värdet är mellan 2-3.
- Ladda varje sample i varje brunn på filterplattan. Slå på vakuumet försiktigt för att förhindra stänk och blandning av samples och kassera flödet igenom.
- Tvätta med 100 μL 0,1 % TFA. Slå på dammsugaren försiktigt för att förhindra stänk och blandning av samples. Kassera genomflödet.
- Byt ut uppsamlingsplattan med 96 brunnar mot en ny platta med 96 brunnar för att samla upp de avsaltade proverna.
- Tillsätt 60 μl acetonitril/0,1 % TFA per brunn. För att eluera proverna från C18-hartset, slå på vakuumet försiktigt för att förhindra stänk.
- Samla upp genomströmningen och torka i ett hastighetsvakuum vid RT. Fortsätt till LC-MS/MS eller förvara plattan vid -80 °C tills den är redo att bearbeta proverna.
10. Proteomikanalys med vätskekromatografi i kombination med masspektrometri
OBS: För att generera data för detta manuskript användes ett nLC-MS/MS-system med en tvåkolonnsystemuppsättning med en 300 μm ID x 0,5 cm C18 fällkolonn och en 75 μm ID x 25 cm C18-AQ (3 μm) analytisk nanokolonn förpackad internt.
- Förbered de mobila faserna för att köras på HPLC:
Mobil fas A (MPA): 0,1 % myrsyra i vatten av HPLC-kvalitet
Mobil fas B (MPB): 0,1 % myrsyra i acetonitril av HPLC-kvalitet - Programmera HPLC-metoden enligt följande: 4%-34% MPB under 120 min, 34%-90% MPB under 5 min, isokratisk 90% MPB under 5 min; flöde: 300 nL/min.
- Ställ in MS-insamlingsmetoden för att utföra dataoberoende insamling (DIA) för att generera MS/MS-spektra av de detekterade peptidsignalerna.
- Återsuspendera 1 μg prover i 10 μl 0,1 % TFA innan proverna placeras i nLC-autosamplern.
- Kör nLC-MS-metoden som programmerad för kanonisk proteomikinsamling:
- Ställ in full MS-skanning till 300-1100 m/z i orbitrap, med en upplösning på 120 000 (vid 200 m/z) och ett mål för automatisk förstärkningskontroll (AGC) på 125.
- Ställ in MS/MS i orbitrap med sekventiellt isoleringsfönster på 50 m/z med ett AGC-mål på 400 och en högre energikollisionsdissociationsenergi (HCD) på 30.
11. Analys av data
- Importera nLC-MS/MS-rådatafilerna till en programvara för toppdetektering som är kompatibel med den MS-plattform som används.
- Välj rätt databas (människa, mus, etc.).
- Ställ in N-terminal acetylering som variabel modifiering och karbamidometylcystein som fast modifiering.
- Ange trypsin som matsmältningsenzym med två missade klyvningar tillåtna.
- Ställ in masstoleransen i enlighet med massanalysatorn som används för spektrainsamlingen.
- Exportera analysen som ett kalkylblad och bearbeta data ytterligare efter behov.
Representative Results
I detta protokoll beskriver vi egenskaperna hos en innovativ stressfri 3D-cellinkubator, ett system designat speciellt för odling av 3D-sfäroider (Figur 2). Vi optimerade protokollet för 3D-odling av THLE-3 och HepG2/C3A-cellinjer. Protokollet som beskrivs här är enkelt att använda och möjliggör reproducerbarhet och kostnadseffektiv odling av > 100 sfäroider per bioreaktor. Väl i bioreaktorn behandlas sfäroider på samma sätt som celler som upprätthålls i 2D-odling. Optimala tillväxtförhållanden uppnås genom att byta ut mediet två till tre gånger i veckan (figur 2B) och justera rotationshastigheten efter sfäroidernas tillväxt och storlek (figur 2C). Detta system, där 3D-sfäroider odlas i roterande bioreaktorer (figur 2E,F), ger en optimal tillväxtmiljö för 3D-strukturer genom att exponera sfäroider för en lika stor och mycket låg skjuvkraft.
Vi har tidigare visat hur sfäroider kan användas för analys av kromatinmodifiering16. Här visar vi i detalj hur man får leversfäroider och hur proteomikexperiment kan utföras för analys av hela proteomet (Figur 1). I korthet initierades protokollet genom att använda THLE-3 eller HepG2/C3A platta celler tills odlingen nådde 80% sammanflöde. För att odla celler som sfäroider pläterades cirka 2 000 celler i en ultralåg fästplatta som innehöll mikrobrunnar för att de skulle kunna självaggregera, och sedan överfördes bildade sfäroider till en bioreaktor (Figur 1A). Även om de är funktionellt aktiva efter 3 veckor i odling, som tidigare visats17, visar vi resultat från sfäroider som samlats in efter 36 dagar i odling för detta protokoll. Efter insamlingen spanns sfäroider ner och både pellets och supernatant lagrades för analys. Cellviabiliteten bedömdes från supernatanten för kvantifiering av adenylatkinas som frisatts av skadade celler, som beskrivits tidigare17. Cellulära proteiner extraherades från cellpelleten och hela proteomet analyserades med högupplösande masspektrometri (Figur 1B).
Detta protokoll demonstrerar också en halvautomatisk metod för att räkna sfäroider (figur 3A) med hjälp av det offentliga bildbehandlingsprogrammet FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. En bild av god kvalitet på sfäroiden bör tas för analysen, och vissa parametrar bör beaktas som nämns i avsnitt 5. Sedan, efter att ha förberett bilden för analys, används ett makroskript (tilläggsfil 1) för att räkna sfäroiderna. Makrot fungerar genom att först göra en mapp som heter FIJI Spheroids counting, inuti mappen där sfäroidbilderna finns. I den här mappen sparas all information från analysen. Detta inkluderar en bild av de sfäroider som räknades, med ett ID-nummer på varje sfäroid. Den innehåller också en Excel-fil som heter sfäroidräkning. Den här filen innehåller pixelarean och ID-numret för varje sfäroid som räknades. Data som motsvarar en analyserad bild presenteras på varje flik i filen. Fliken är märkt enligt namnet på den analyserade bilden. Eftersom sfäroidernas storlek kan försämras av många faktorer, inklusive antalet strukturer i ett kärl och läkemedelsbehandling, är det också viktigt att övervaka deras yta (planimetri). Makroskriptet som presenteras här (tilläggsfil 2) fungerar genom att mäta de svarta områdena, som motsvarar sfäroider i bilden (figur 3B). Utdata samlas i en fil som heter planimetry.xlsx, som innehåller den uppmätta arean, omkretsen och diametern för varje sfäroid. Det finns också ett mått som kallas Feret, som används för att beräkna diametern. Feret är den längsta möjliga diametern, medan minFeret är den kortaste. Diametern är genomsnittet av dessa två. Inuti utdatamappen, förutom planimetry.xlsx -filen, finns det också en bild av sfäroiderna som mättes.
Innan man gick vidare till proteomanalysen utvärderades sfäroidernas livskraft över odlingstiden. Nivåerna av AK ökar fram till dag 17 och når cirka 7 % av celldöden, och sedan minskar döden till nivåer under 5 % (Figur 4A), vilket är i enlighet med tidigare publicerat arbete17. Detta protokoll visar också den fullständiga proteomanalysen för övervakning av cellfenotypen. För det första jämfördes proteomen hos THLE-3 och HepG2/C3A flatceller och sfäroider. Genom att analysera den första huvudkomponenten (PC1) är det uppenbart att det finns en strikt separation av sfäroidprover från platta cellkulturer, och det verkar som om korrelationen mellan celltyp (THLE-3 och HepG2/C3A) inte är relevant (Figur 4B). Även om THLE-3 och HepG2/C3A sfäroider inte klustrar ihop, delar de liknande profiler som överensstämmer med leverfunktionen. Vi visar i detta protokoll exemplet med metallothioneiner, som har en roll i metallavgiftning som utförs av levern. Vi identifierade i proteomikanalysen 2 isoformer överuttryckta i sfäroider i jämförelse med platta celler (MT1E och MT1X) (Figur 4C). Vi visar också Gene Ontology (GO) anrikning av båda cellinjerna som odlas som sfäroider. Kolhydratmetabolismen, som omfattar trikarboxylsyracykeln (TCA-cykeln), elektrontransportkedjan (cellandning) och pyruvatmetabolism, är en frekvent term och är berikad med både HepG2/C3A- och THLE-3-sfäroider (Figur 4D,E). Cellulär avgiftning, fettsyra- och kolesterolmetabolism är andra funktioner som är berikade i båda sfäroiderna. Tillsammans är dessa funktioner kända för att vara avgörande för leverfunktionen.
Figur 1: Arbetsflöde för sfäroidodling och provberedning . (A) Experimentell metod för 3D-cellodling. Platta cellkulturer vid önskat sammanflöde trypsiniserades och såddes på en ultralåg 24-brunnsplatta innehållande mikrobrunnar, där celler självorganiserar sig till sfäroider. Efter 24 timmar överfördes sfäroiderna till en bioreaktor och odlades tills de är redo för analys. (B) Efter insamlingen pelleterades sfäroider och både pellet- och kultursupernatanten lagrades fram till bearbetningen. Histon-16och icke-histonproteiner extraherades, smältes till peptider och analyserades med högupplösande masspektrometri. Råfiler erhållna från masspektrometrin genomsöktes mot den mänskliga databasen och data bearbetades vidare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: 3D-cellodlingssystem . (A) Bioreaktordelar. Bioreaktorn består av en gasutbytes- och befuktningskammare som innehåller vattenpärlor och en öppningsbar cellkammare med två pluggar för medieutbyte och uppsamling av sfäroider. (B) Utbyte av bioreaktormedier. Bioreaktorn fylls med 10 ml odlingssubstrat med hjälp av en spruta med nål. (C) Appen för systemkontroll. Rotationshastigheten, CO2-nivån, temperaturen, larmloggen och andra funktioner kan styras med hjälp av styrenheten. D) Bioreaktorn placeras i 3D-inkubatorn. Varje bioreaktor har en tillhörande motor som kan snurra bioreaktorn långsamt. (E) Bioreaktor i rörelse med varvtalet (rpm) styrt av en (C) tablett. Hastigheten (rpm) justeras efter sfäroidernas storlek. (F) Bioreaktorer inuti de 3D-inkubatorn. 3D-inkubatorn rymmer upp till 6 individuellt styrda bioreaktorer. Foto med tillstånd av Jason Torres Photography. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fenotypisk karakterisering av sfäroider via bildtagning . (A) Halvautomatisk sfäroidräkning. Efter att ha tagit ögonblicksbilder av sfäroiderna i bioreaktorn förbereds bilden för analys i FIJI. Varje sfäroid räknas och ett ID-nummer anges för var och en av dem. Ett makro används och resultatet visas med ID för den räknade sfäroiden, etiketten (namnet på bilden som analyserades) och arean (antalet pixlar som räknas i sfäroiden). (B) Planimetrisk bestämning av sfäroidarean. Med hjälp av ett makro bestäms arean, omkretsen och diametern för en specifik sfäroid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Proteomanalys av leversfäroider. (A) Sfäroidernas viabilitet beräknades baserat på frisättningen av adenylatkinas (AK) på odlingssupernatant. Resultaten är medelvärdet av duplicerade datapunkter ± SD. (B) Principalkomponentanalys (PCA) utfördes för att jämföra proteomet hos THLE-3 och HepG2/C3A flata celler och sfäroider. C) Relativ förekomst av metallothioneiner, som är proteiner som uttrycks av levern hos människa. Data representeras som medel ± SEM. (D) Funktionellt grupperade nätverk visar GO-anrikning för HepG2/C3A-sfäroider och (E) THLE-3-sfäroider, där endast etiketten för den mest signifikanta termen per grupp visas. Nätverket konstruerades med hjälp av ClueGo19. Nodstorleken representerar termen berikningsbetydelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Makroskript för sfäroidräkning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Makro för sfäroid planimetrisk bestämning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Att förstå biologin bakom tredimensionella (3D) cellulära strukturer är oerhört viktigt för en mer omfattande kunskap om deras funktioner. Det finns ett växande intresse för att använda 3D-modeller för att studera komplex biologi och utföra toxicitetsscreening. När man odlar celler i 3D måste många faktorer beaktas, inklusive den fenotypiska bedömningen av modellsystemet. En fenotyp definieras som en grupp observerbara egenskaper hos en specifik organism, såsom morfologi, beteende, fysiologiska och biokemiska egenskaper20.
I detta protokoll visar vi hur proteomikexperiment kan utföras från ett fåtal sfäroider och kan användas för att övervaka den typiska leverfenotypen. Masspektrometri har blivit en i stor utsträckning tillämpad metod för 3D-cellkarakterisering, vilket gör det möjligt att undersöka en mängd olika biologiska frågor 12,16,21,22. För en omfattande proteomanalys rekommenderas att använda minst 20 μg proteinutgångsmaterial, från vilket 1 μg injiceras i masspektrometern. Det är viktigt att nämna att om man lägger till mindre prov kan det leda till förlust av känslighet, och att lägga till mer skulle gradvis försämra kromatografens kvalitet och så småningom leda till att kolonnen blockeras. I denna studie visade vi att sfäroiderna HepG2/C3A och THLE-3 är berikade med viktiga proteiner från glykolys och TCA-cykeln, som är specifika levervägar och är avgörande för att upprätthålla blodsockernivåerna och för energiproduktion23,24. Faktum är att masspektrometrianalys inte bara ger information på proteinnivå utan också möjliggör undersökning av proteiners posttranslationella modifieringar, som tidigare visats av vår grupp16.
En annan aspekt som ska beaktas i 3D-fenotypiska studier är antalet och storleken på sfäroider. Förutom att göra experimenten mer reproducerbara är det viktigt att räkna antalet sfäroider och bestämma deras storlek för att avgöra när kulturen ska delas upp i flera bioreaktorer, eftersom antalet 3D-strukturer i ett kärl kan påverka sfäroidernas storlek och metaboliska aktivitetsnivåer. Det är dock viktigt att betona att antalet och storleken på sfäroider beror på cellinjen, startantalet celler, delningsprocessen och insamlingstiden. Detaljer om HepG2/C3A-sfäroidkulturen, såsom antal celler per sfäroid, proteininnehåll och storlek som en funktion av ålder, tillhandahölls av Fey, Korzeniowska och Wrzesinski25. För noggrann och framgångsrik analys med den halvautomatiska metoden som beskrivs här är det mest kritiska steget en bra sfäroidbild. För enkelhetens skull kan bilden tas med en telefon eller surfplatta, men upplösningen bör hållas så hög som möjligt. Eftersom bilder är snabba att få fram möjliggör de storskaliga screeningexperiment för att visualisera specifika fenotypiska egenskaper eller undersöka svar på läkemedelsbehandling. Därför, på grund av det ökande antalet cellbaserade analyser, har ett antal programvaror med öppen källkod utvecklats under de senaste 10 åren för bildanalys26. I detta protokoll beskriver vi ett halvautomatiskt system som använder programvaran FIJI18 för att räkna och mäta sfäroidernas storlek. Vi presenterade skript (enkla programmeringskommandon) för att definiera en sekvens av algoritmiska operationer som kan tillämpas på en bildsamling, vilket gör analysen till en enkel och snabb process. Beroende på sfäroidens egenskaper bör dock en manuell mätning användas. Till exempel, om sfäroiderna är för genomskinliga, kommer FIJI-skriptet att vara oprecist. Förresten, ett av de viktigaste kriterierna för att denna metod ska fungera är sfäroidernas kompakthet. Denna egenskap kommer att bidra till en mer förbättrad färgkontrast mellan sfäroiderna och bakgrunden, vilket är nödvändigt för att metoden ska vara korrekt.
Sammanfattningsvis, förutom att presentera en metodik för att odla högreproducerbara sfäroider, beskrevs också ett halvautomatiserat system i kombination med fenotypisk karakterisering via bildtagning och proteomik. Vi förväntar oss att denna verktygslåda för analys av 3D-celler kommer att bli mer robust med helautomatisk programvara för bildanalys och nästa generations masspektrometrar.
Disclosures
Helle Sedighi Frandsen är anställd som forskare på CelVivo ApS, tillverkaren av ClinoStar-systemet. Karoline Mikkelsen är industridoktorand anställd på CelVivo ApS och utför sin doktorandstudie vid SDU, Odense, Danmark. Alla andra författare har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Sedoli-labbet är tacksamma för Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck och NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
| 200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
| 96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
| 96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
| DTT | Sigma | D0632-5G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
| Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| Formic acid | Thermo | 28905 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
| hEGF | Corning | 354052 | |
| HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
| Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| PAULA microscope | Leica | ||
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
| PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
| pH paper | Hydrion | 93 | |
| Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
| Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
| SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo | 1375 | |
| Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
| S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
| Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Vortex | Sigma | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model. Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).
- Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels. Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10 (29), (2012).
- Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures. Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).
- Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma. Cancer Cell International. 22 (1), 243 (2022).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J.
- Sia, D., Llovet, J. M. Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).
- Tang, J., et al. A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro. Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).
- van Zijl, F., Mikulits, W. Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver. World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
- Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids. Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).
- Joseph-Chowdhury, J. N., et al. Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606 (2022).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver. Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S.
- Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. Phenotypic analysis of organoids by proteomics. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Avelino, T. M., et al. Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids. SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).
- Chiang, J. Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease. McManus, L. M., MitchellIn, R. N. , Academic Press, Elsevier, San Diego. 1770-1782 (2014).
- Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver. Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).
- Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity. Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).
- Smith, K., et al. Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays. Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).
