Summary
הפרוטוקול הנוכחי מעריך את הפעילות המוטורית של דרוזופילה על ידי מעקב וניתוח תנועת הזבובים בזירה בעבודת יד באמצעות תוכנת קוד פתוח פיג'י, התואמת לתוספים לפלח פיקסלים של כל פריים בהתבסס על הקלטת וידאו בחדות גבוהה כדי לחשב פרמטרים של מהירות, מרחק וכו '.
Abstract
Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל אידיאלי לחקר מחלות שונות בשל שפע של טכניקות מניפולציה גנטית מתקדמות ותכונות התנהגותיות מגוונות. זיהוי ליקוי התנהגותי במודלים של בעלי חיים הוא מדד מכריע לחומרת המחלה, למשל, במחלות נוירודגנרטיביות שבהן חולים חווים לעתים קרובות ליקויים בתפקוד המוטורי. עם זאת, עם זמינותן של מערכות שונות למעקב והערכה של ליקויים מוטוריים במודלים של זבובים, כגון אנשים שטופלו בתרופות או אנשים טרנסגניים, עדיין חסרה מערכת חסכונית וידידותית למשתמש להערכה מדויקת מזוויות מרובות. שיטה המבוססת על ממשק תכנות היישומים AnimalTracker (API) פותחה כאן, התואמת לתוכנית עיבוד התמונה של פיג'י, כדי להעריך באופן שיטתי את פעילויות התנועה של פרטים בוגרים וזחלים מווידאו מוקלט, ובכך לאפשר ניתוח של התנהגות המעקב שלהם. שיטה זו דורשת רק מצלמה בחדות גבוהה ושילוב חומרה היקפית למחשב כדי להקליט ולנתח התנהגות, מה שהופך אותה לגישה זולה ויעילה לסינון מודלים של זבובים עם ליקויים התנהגותיים טרנסגניים או סביבתיים. דוגמאות לבדיקות התנהגותיות באמצעות זבובים שטופלו בפרמקולוגית ניתנות כדי להראות כיצד הטכניקות יכולות לזהות שינויים התנהגותיים הן בזבובים בוגרים והן בזחלים באופן שניתן לחזור עליו.
Introduction
Drosophila melanogaster מספק אורגניזם מודל מצוין לחקר תפקודים תאיים ומולקולריים במודלים של מחלות עצביות שנוצרו על ידי שינוי גנים1, טיפול תרופתי2 והזדקנות3. השימור הגבוה של מסלולים ביולוגיים, תכונות פיזיקליות וגנים הומולוגיים הקשורים למחלות בין בני אדם לדרוזופילה הופך את זבוב הפירות לחיקוי אידיאלי מהרמה המולקולרית לרמה ההתנהגותית4. במודלים רבים של מחלות, ליקוי התנהגותי הוא מדד חשוב, המספק מודל מועיל לנוירופתיות אנושיות שונות 5,6. דרוזופילה משמשת כיום לחקר מחלות אנושיות מרובות, התפתחות עצבית ומחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון וטרשת אמיוטרופית צידית 7,8. גילוי היכולת המוטורית של מודלי המחלה חיוני להבנת ההתקדמות הפתוגנית ועשוי לספק מתאם פנוטיפי למנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך המחלה.
לאחרונה, כלי תוכנה זמינים מסחרית ותוכניות חסכוניות פותחו עבור אסטרטגיות זיהוי לוקומוטור Drosophila, כגון בדיקות תפוקה גבוהה בזבובים מקובצים9,10 ומדידת תנועה בזמן אמת11,12. גישה קונבנציונלית אחת כזו היא גיאוטקסיס שלילי אינטראקטיבי מהיר (RING), המכונה גם מבחן הטיפוס, הכולל ערוצים מרובים המאפשרים להכיל אוכלוסיית זבובים גדולה עם אותו מין וגיל, מה שמקטין את השונות תוך איסוף נתונים 9,13. שיטת בדיקה מקדימה נוספת לניתוח התנהגות לוקומוטורית היא TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), מכשיר המשתמש במספר אלומות כדי לזהות תנועת פעילות זבובים בתוך צינור זכוכית דק14. המכשיר מתעד מיקום רציף, המייצג תנועה אוטומטית על ידי חישוב מעברי הקרן כדי ללמוד את הפעילות והשעון הביולוגי של הזבובים לאורך פרק זמן ארוך יותר15. למרות ששיטות אלה שימשו באופן נרחב בניתוח פגמים התנהגותיים בזבובי פירות כדי לקבוע שינויים בתנועה התנהגותית, הן תמיד דורשות ציוד בדיקה מיוחד או תהליכי ניתוח מורכבים, ומגבילות את יישומן בדגמים מסוימים עם מכשיר מוגבל ופשוט. אסטרטגיות קבוצתיות למעקב אחר בעלי חיים לבדיקת הדרוזופילה הבוגרת, כגון FlyGrAM11 ובדיקת האי דרוזופילה 10, מיישמות גיוס חברתי ומעקב אישי באזור מוגדר מראש. אף על פי כן, להגבלה חברתית של הפרט באזורים מנוגדים עלולה להיות השפעה שלילית על הזיהוי בתמונות, הנגרמת כתוצאה מהתנגשות או חפיפה של זבובים. למרות שכמה שיטות מבוססות חומרים בקוד פתוח, כגון TRex16, MARGO 12 ו- FlyPi17, יש מצב חירום, הן יכולות לעקוב אחר הזבובים במהירות עם שימוש גמיש בבדיקות התנהגותיות. גישות בדיקה אלה קשורות להתקנות משוכללות של מכשירים ניסיוניים, דרישות תוכנה מיוחדות או שפות מחשב מקצועיות. עבור הזחלים, מדידת המרחק הכולל שעבר על פני מספר קווי הגבול של הרשת ליחידת זמן18, או ספירה גסה של התכווצויות דופן הגוף עבור פרטיםבאופן ידני 19, הן השיטות הדומיננטיות להערכת היכולת המוטורית שלהם. בשל חוסר דיוק בציוד או במכשירים ובשיטות ניתוח, תנועה התנהגותית מסוימת של הזחלים עלולה לחמוק מגילוי, מה שמקשה על הערכה מדויקת של תנועה התנהגותית, במיוחד תנועה עדינה15.
השיטה הנוכחית שפותחה משתמשת בממשק תכנות היישומים AnimalTracker (API), התואם לתוכנית עיבוד התמונה פיג'י (ImageJ), כדי להעריך באופן שיטתי את הפעילות המוטורית של זבובים בוגרים וזחלים כאחד על ידי ניתוח התנהגות המעקב שלהם מסרטוני וידאו בחדות גבוהה (HD). פיג'י היא תוכנת קוד פתוח להפצת ImageJ שיכולה לשלב ספריות תוכנה חזקות עם שפות סקריפטים רבות, וכתוצאה מכך אב טיפוס מהיר של אלגוריתמים לעיבוד תמונה, מה שהופך אותה לפופולרית בקרב ביולוגים בזכות יכולות ניתוח התמונה שלה20. בגישה הנוכחית, השילוב של פיג'י ב-API של AnimalTracker מנוצל לפיתוח בדיקה התנהגותית ייחודית של דרוזופילה עם החדרת אלגוריתם מותאמת אישית, ומספק צעד שימושי לתיעוד מפורט והדרכות לתמיכה ביכולות אנליטיות חזקות של התנהגות לוקומוטורית (איור 1). כדי לעקוף את הסיבוך של זיהויים אובייקטיביים בתמונות הנגרמות כתוצאה מהתנגשות או חפיפה של זבובים, כל זירה מוגבלת לאירוח זבוב אחד בלבד. לאחר הערכת דיוק המעקב של הגישה, היא יושמה כדי לעקוב ולכמת את תנועות הלוקומוטור של דרוזופילה שניתנו עם התרופה הרעילה רוטנון, המשמשת בדרך כלל למודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון, ובסופו של דבר גילתה פגיעה בתנועה בטיפול התרופתי21. מתודולוגיה זו, המשתמשת בקוד פתוח ובתוכנה חופשית, אינה מחייבת מכשור בעלות גבוהה, ויכולה לנתח באופן מדויק ומשכפל תנועה התנהגותית של דרוזופילה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
W1118 זבובים בוגרים וזחלי כוכב שלישי שימשו במחקר הנוכחי.
1. הכנה ניסיונית
הערה: זירת שדה פתוח למעקב אחר תנועה של דרוזופילה עשויה מג'ל סיליקה חסר צבע וריח.
- מערבבים מגיב A וריאגנט B ביחס של 1:10, בהתאם להוראות היצרן לערכת הסיליקה (ראה טבלת חומרים). ודא כי סודיום ביקרבונט הוסיף לתערובת על ידי ערבוב עד צבע משתנה לבן. מעבירים את התערובת לתבנית פטרי נקייה ומכניסים לתנור ב-40°C לייבוש למשך 48 שעות.
- מקם את מצלמת ה- HD (ראה טבלת חומרים) על חצובה, וכוונן אותה כך שעדשת המצלמה תהיה ניצבת לפני השטח של זירת הסיליקה. התאמת אורך המוקד ופתחי המצלמה, ודא שהמצלמה ממוקדת בפני השטח של הסיליקה ושהתצוגה מוארת כראוי. מערך הניסוי מומחש באיור 1.
- העבר זבוב לזירת השדה הפתוח כדי להקליט וידאו רציף של לפחות 61 שניות.
הערה: בהתחשב באופי האיטי של הזחלים, מומלץ זמן הקלטת וידאו של יותר מ -10 דקות.- פתח את הסרטון עם פיג'י, גרור את מד ההתקדמות למסגרת הראשונית ואשר בשתיקה. בחרו את כל גוף הזבוב באמצעות הכלי "בחירה חופשית" (איור 2B,C).
- לחצו על התמונה > להתאים את הבהירות והניגודיות > כדי להתאים את איזון הלבן עד שערך האפור של האזור שנבחר יתקרב לרקע הרחב (איור 2D-F).
הערה: הומוגניזציה של הרקע של הפריים הראשון מאפשרת לתוכנה להבחין ברקע ללא אובייקטים כלשהם וליצור ניגודיות כאשר זבוב נוכח, ובכך לאפשר לתוכנה לעקוב אחריו.
- בצעו את הניסוי כולו בסביבת בדיקה של 25°C ו-60% לחות יחסית, באזור שקט וללא חשיפה לאור בהיר.
2. הקלטת וידאו ועיבוד מקדים
- לאחר תקופה קצרה של הרדמה תוך שימוש ב-95% פחמן דו-חמצני (CO2), העבירו זבוב לזירה הפתוחה ולחצו על כפתור ההקלטה ביישום המצלמה כדי להתחיל להקליט וידאו.
הערה: כדי למזער את השפעת חומר ההרדמה על תנועה, אפשר לזבובים להתאושש במשך 10 דקות לפני תחילת הקלטת וידאו. מומלץ גם להרדים באמצעות קירור.- לאחר שהזבובים מתאוששים מההרדמה, הניחו את צלחת הזירה המכילה את הזבוב מתחת למצלמה ונערו את הצלחת במהירות מצד לצד כדי לוודא שהזבוב נמצא בתנועה כאשר ההקלטה מתחילה.
- עם סיום ההקלטה, לחץ על כפתור העצירה כדי לסיים את הקלטת הווידאו.
הערה: ודא שזמן הקלטת הווידאו חורג במעט מזמן מעקב היעד בהפרש קטן. בנוסף, כדי לשפר את יעילות הניסוי, ניתן לעקוב אחר זבובים מרובים באופן ספונטני. הדבר תלוי ברזולוציה של המצלמה כדי לאפשר חיתוך וידאו באיכות גבוהה. - המר את הסרטונים שהוקלטו לפורמט AVI עם קידוד MJPEG, כך שניתן יהיה לפתוח ולנתח אותם באמצעות פיג'י. בינתיים, הגדר את קצב הפריימים לשנייה (fps) של הווידאו ל- 15 fps עבור זבובים בוגרים ו- 12 fps עבור זחלים.
3. ניתוח וידאו
- פתחו את הסרטון שעבר טרנספורמציה עם "השתמש בערימה וירטואלית" ו"המר לגווני אפור", שתי אפשרויות בחלון הקופץ בעת פתיחת הווידאו עם פיג'י (איור 2A).
- צור מסגרת ראשונה ריקה, כאמור לעיל.
- השיגו חלון עיבוד באמצעות הכלי "הגדר תמונה פעילה" של תוסף AnimalTracker וצרו אזור מעקב שמקיף את הזירה בחלון הווידאו המקורי באמצעות הכלי "סגלגל" (איור 3A).
- הגדר את המסננים (איור 3A,3) ואת הפרמטרים של שני המסננים (איור 4A-G) עבור המסגרת הריקה הראשונה בחלון העיבוד. לאחר מכן, בחרו את הפריים הבא בחלון הווידאו המקורי, ובחרו את המשטח המסונן של חלון העיבוד (איור 5A-C).
הערה: שלב הסינון משמש להפחתת רעשי התמונה ו/או להסרת הרקע, ובכך מפשט את הפרדת החזית מהרקע בבינאריות של המסגרות. - לאחר שנבחר חלון עיבוד מסונן, סובב את הזבוב המסומן עם פרופיל אדום מכוסה בחלון העיבוד באמצעות הכלי "הגדר סף" (איור 3A,4, איור 5D-E ואיור 6A).
- השתמשו ב"גלאי הכתמים המוגדר" כדי לאפשר למחשב לזהות את הזבוב באמצעות פרופיל אדום המכוסה בחלון העיבוד (איור 3A,5 ואיור 6B).
- הגדר את פריים 901 כמסגרת האחרונה עבור הזבוב הבוגר, המחושב לפי משך ההקלטה של הווידאו ו-fps (איור 3A,6, איור 6C).
הערה: הניסוי הבא עם זחלים היה במעקב במשך 10 דקות, כך שמסגרת 7200 מוגדרת כפריים האחרונים. - השתמשו בכלי "הצג כתמים" כדי להציג מלבן מעקב בחלון הווידאו המקורי (איור 3A,7 ואיור 6D,E). לאחר מכן, התחל את המעקב וייצא את קובץ המעקב לאחר השלמת הניטור (איור 3A,8,9 ואיור 7A,B).
4. מעקב אחר ניתוח קבצים
- טען את קובצי המעקב והאזור באמצעות התוסף Animal tracker > Tracking analyzer (איור 8A).
- בחר באינדקס הרצוי באמצעות הגדרות אזור ושנה את הגדרות הפרמטרים (איור 8). חשב את זמן מרווח המסגרות באמצעות קצב המסגרות.
הערה: במצב זה, קצב המסגרות הוא 15 fps, ומרווח המסגרת הוא בערך 0.067 שניות, שהיא הגדרת ברירת המחדל (איור 8D). - הפק את תרשימי הניתוח הכמותי באמצעות תוכנת הגיליונות האלקטרוניים ו- GraphPad Prism לאחר ניתוח במנתח מעקב (איור 9).
5. ניתוח לכל מסגרת
- בצע ניתוח מהירות לכל מרווח פריימים. נתח את קובץ המסלול ללא פיג'י אם יש צורך במחקר מפורט יותר.
- פתח את קובץ המעקב, העתק את כל הקואורדינטות ל- Microsoft Office Excel ופצל את התאים באמצעות מקש הרווח.
הערה: לדוגמה, לאחר שהקובץ חולק לעמודות "C" ו- "D", מהירות הדרוזופילה לכל מרווח מסגרת מחושבת לפי הנוסחה SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2), המוצגת בעמודה "E" (איור 10A). הנתונים בעמודה "E" מציינים את מספר הפיקסלים שהזבוב העביר בין שתי מסגרות, כאשר המסגרת הראשונה אינה נחשבת. בחר את כל התוצאות המחושבות והוסף תרשים קו כדי להציג מהירות אינטואיטיבית של תנועת זבוב לכל מרווח פריימים, עם שיא בתרשים הקו (איור 10B).
- פתח את קובץ המעקב, העתק את כל הקואורדינטות ל- Microsoft Office Excel ופצל את התאים באמצעות מקש הרווח.
- חשב את זמן חוסר התנועה לכל מרווח פריימים. לאחר פיצול הקובץ לעמודות "C" ו- "D", חשב את מצב חוסר התנועה של דרוזופילה לכל מרווח מסגרת באמצעות הנוסחה IF(SQRT((C6-C5)^ 2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), המוצגת בעמודה "E". (איור 10C).
הערה: בניגוד לניתוח מהירות, הוגדרו תוצאות הפריים הראשון. זבובים שנעו פחות מ-20 פיקסלים נחשבו חסרי תנועה ונרשמו כ-"0" בעמודה "E".- בחר את כל התוצאות המחושבות והוסף תרשים טורים כדי להציג באופן חזותי את זמן חוסר התנועה בשולי תרשים הטורים כולו (איור 10D).
- ודא שזווית הכיוון משתנה.
הערה: ניתוח זווית שינוי הכיוון מייצג את בחירת הכיוון של הזבובים. לאחר פיצול הקובץ לעמודות "C" ו- "D", זווית שינוי הכיוון מחושבת לפי הנוסחה ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), המוצגת בעמודה "E" (איור 10E). התוצאות המחושבות מציינות את הזווית בין שלוש קואורדינטות.- בחר את כל התוצאות המחושבות והוסף דיאגרמת פיזור כדי להמחיש את זווית שינוי הכיוון של תנועת הזבובים (איור 10F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר הנוכחי נבדקו ליקויים מוטוריים בזבובים בוגרים ובזחלי כוכב שלישי שטופלו ברוטנון והושוו בפעילותם המוטורית לזו של זבוב ביקורת הניזון מהתרופה הממסה דימתיל סולפוקסיד (DMSO). טיפול ברוטנון בדרוזופילה הוכח כגורם לאובדן נוירונים דופמינרגיים במוח22 ומוביל לליקויים מוטוריים משמעותיים23. כפי שניתן לראות באיור 11 ובאיור 12, לזבובים בוגרים ולזחלי אינסטאר שלישי שטופלו ברוטנון יש ליקויים מוטוריים משמעותיים בהשוואה לזבובי ביקורת שניזונו מ-DMSO. איור 11 ואיור 12B-E מדגימים את השינויים היחסיים במרחק, במהירות ובזמן חוסר התנועה של פרמטרי תנועה בין זבובים שטופלו עם או בלי רוטנון. איור 11 ואיור 12F-K מדגימים ניתוח מייצג של פרמטרים של מהירות, חוסר תנועה ובחירת כיוון, עם או בלי טיפול ברוטנון במבוגרים ובזחלים. ניתוח כמותי של פרמטרים של מרחק, חוסר תנועה, זמן ומהירות באמצעות תוכנת פיג'י בזבובים בוגרים (איור 11) ובזחלי כוכב שלישי (איור 12) של קבוצות ההזנה בתרופות מאמת עוד יותר את העובדה שניתן להשתמש בטיפול ברוטנון כדי לחקור ליקויים מוטוריים במחלות אנושיות, כולל מחלות נוירודגנרטיביות, ולשכפל חלק מהמאפיינים ההתנהגותיים שנצפו אצל בני אדם ויונקים.
איור 1: תרשים זרימה המתאר את הגדרת הציוד ואת ההליך הניסיוני לניתוח מעקב אחר תנועה של דרוזופילה . זירת המעקב אחר מנועי לוקומוטור מצולמת באמצעות מצלמת HD עילית המשולבת ונשלטת על ידי מחשב. ההליך לניתוח התנועה של דרוזופילה מורכב מהקלטת וידאו, מעקב אחר תנועה, ניתוח קבצי מעקב, עיבוד נתונים וניתוח פרמטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הומוגניזציה ברקע של הפריים הראשון. (A) בדוק את האפשרות "המר לגווני אפור" בעת פתיחת הווידאו שעבר טרנספורמציה, כדי להמיר את הווידאו לגווני אפור ולמנוע הפרעה של צבע. (B) שרטט דרוזופילה באמצעות הכלי "בחירה חופשית", המוצג בתיבה האדומה. (C) כבחירת הניתוח נעשה שימוש בקו צהוב כדי לשרטט את קווי המתאר של הזבובים. שמירה על הקו הצהוב קרוב לקווי המתאר של הזבוב מפחיתה את הסבירות לבחירת אזור שאינו תפוס על ידי הזבוב. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (D) התאם את הבהירות והניגודיות למסגרת הראשונה עד שהאזור המסומן בצהוב ישתנה לגווני אפור זהים לגווני הרקע. (E) השלם את התאמת הבהירות והניגודיות עבור המסגרת הראשונה, אך לא עבור כל המסגרות, על ידי לחיצה על "לא" בחלון "ערימה". (F) בסופו של דבר, המסגרת הראשונה מותאמת ליצירת רקע אחיד וללא פגמים. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגדרות חלון מעקב ואזור מעקב. (A) השלם את ניתוח המעקב על ידי לחיצה על תוספי המעקב בסדר המסומן בחלון מעקב אחר בעלי חיים. (B) לאחר הגדרת התמונה הפעילה באיור A,1, מוצג חלון עיבוד שמציג רק את המסגרת הנוכחית. חלון הווידאו הראשי וחלון העיבוד מובחנים בבירור ומשמשים במצבים שונים. לשינוי המסגרת הנוכחית, ודא שהשינוי מבוצע בחלון הווידאו הראשי; השינוי יהיה גלוי בשני החלונות. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (C) צור אזור מעקב המקיף את הזירה, באמצעות הכלי "סגלגל" לזיהוי מחשב. בחירת אזור המעקב חייבת להיות בזירה מעוגלת בחלון וידאו פתוח, ולא בחלון עיבוד. (ד) לשרטט אזור מעקב עם הקווים הצהובים כך שיתאים ככל האפשר לזירה, כדי למזער את ההפרעה של האור החיצוני. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (E) להגדרת אזור העניין (ROI) באזור המעקב, לחץ על הלחצנים שאחרי הסדר המסומן במספרים המוצגים בחלון "מעצב אזורים". בשלב זה, יש להשלים את הפעולה כולה לאחר פתיחת חלון הווידאו שנבחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הגדרת מסנן עבור המסגרת הראשונה. (A) על ידי השלמת הגדרת החזר ההשקעה עבור אזור המעקב, הקו הצהוב המקיף את הזירה משתנה לירוק הן בחלון הווידאו הפתוח והן בחלון העיבוד. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (B) הוספת מטרת המסננים קובעת רקע שחור כדי להפוך את אובייקט היעד לברור יותר למסגרת הראשונה בחלון העיבוד. הפעולה כולה צריכה להתבצע בתוך חלון עיבוד, ולא חלון וידאו פתוח. (ג,ד) הוספת מסנני "מחסר רקע" ו"טשטוש גאוסיאני" לחלון "הגדרות סינון" הופכת את המסגרת הראשונה בחלון העיבוד לשחורה. יש להשלים את כל תהליך הגדרת המסנן במסגרת הראשונה. (E) הפרמטרים נקבעים שלב אחר שלב על ידי לחיצה על לחצנים המסומנים במספר ומלבן אדום בחלון "מחסר רקע". יש להפעיל את שלב "הגדרת תמונה" לאחר בחירת חלון העיבוד. (F) סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. חלון "התמונה החציונית" יוצג לאחר לחיצה על כפתור "הצג מסנן" ב- "E4" וסגירה ישירה של החלון ללא כל פעולה. (G) הפרמטר של טשטוש גאוס נקבע עם ערך סיגמא ברירת מחדל של 2.0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הגדרות סף של המסגרת השנייה. (A) על ידי לחיצה על מד ההתקדמות התחתון, קדם את חלון הווידאו לפריים השני. הזבוב חוזר באמצע המסך ומזוהה על ידי פיג'י. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (B,C) הצג את חלון העיבוד לפני ואחרי הסינון. (B) הצג את חלון העיבוד המסונן באמצעות בחירת המצב המסומן במלבן אדום. (C) דוגמה לחלון עיבוד עם מלבן אדום לאחר שנבחר המצב "מסונן". סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (D) הגדר את הסף על-ידי בחירת שיטת הסף המוגדרת כברירת מחדל, "מחזיק סף בגווני אפור", המוצגת בחלון "מחזיקי סף", לאחר בחירת הכלי "הגדר סף" באיור 3A,4. (E) התאם את הפרמטרים על-ידי החלקת תיבת מד ההתקדמות באמצע עד שזבוב המעקב ייראה ויכוסה בפרופיל האדום. לא מומלץ לשנות את הגדרות ברירת המחדל עבור הפרמטרים המסומנים במלבן האדום להלן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: גלאי כתמים, הגדרת מסגרת אחרונה ובחירת מעקב אחר בעלי חיים. (A) עם ההגעה לסף המצוין באיור 5E, חלון העיבוד מגלה פרופיל אדום ניכר בעקבות הזבוב בפריים השני. התאימו את הפרופיל האדום המכסה את הזבוב למעקב אחר הזבוב. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (B) הגדר את הזבוב מכוסה הפרופיל האדום כיעד למעקב על-ידי בחירת שיטת ברירת המחדל של גלאי כתמים, "גלאי כתמי בסיס". (C) הגדר את מסגרת 901 כמסגרת האחרונה באמצעות הכלי "הגדר מסגרת אחרונה" באיור 3A,6. מספר המסגרת הכולל מחושב על ידי הנוסחה "מספר מסגרת = fps * זמן הקלטה". (D) המעקב טס עם מלבן צהוב ארוז לאחר הצגת כתמים בחלון הווידאו הפתוח (אזור הפאנל השמאלי). בלוח השמאלי המוגדל, זבובי פירות מחוברים באדום (חלק מהפאנל הימני). סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (E) זבוב המעקב עם מלבן אדום באריזה לאחר לחיצה לבחירת המלבן האדום ב- "D" (קטע הלוח העליון). בהגדלת הלוח העליון, זבובי פירות מחוברים באדום (חלק מהפאנל התחתון). ודא שבחירת המלבן הצהוב סביב זבוב מעקב הושלמה בחלון הווידאו הפתוח. השלם את הבחירה בחלון הווידאו שנפתח, והזבוב יזוהה על ידי פיג'י בכל המסגרות. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תוצאות מעקב מעקב. מעקב המעקב מוצג בנפרד בחלון הווידאו הפתוח ( A) ובחלון העיבוד (B). כדי לקבל את פרופיל מעקב המעקב, לחץ על מד ההתקדמות בחלון הווידאו המקורי והחלק את מד ההתקדמות כדי לבדוק את המשכיות המעקב. מעקב המעקב מציג את מרחק הזחילה של הזבובים באופן אינטואיטיבי. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מעקב אחר ניתוח קבצים באמצעות תוספי AnimalTracker. (א) מנתח המעקב מאפשר ניתוח מפורט של קובץ המעקב; כל צעד המסומן במלבן אדום מסומן במספר. (B) הגדר את הפרמטרים "הגדרות אזור" ב- A,4. ארבעה פרמטרים, זמן, מרחק, זמן חוסר תנועה ווקטור מהירות, מוצגים במלבן האדום. הפרמטר נבחר על סמך התוצאה הרצויה. (ג-ג) הגדר את פרמטרי התצורה בנפרד בחלון "הגדר פרמטרים" של A,5. (C) ארבעה פרמטרים מתכווננים מתוארים בחלון "הגדרות פרמטרים של קונפיגורציה" (D-G) המציג את החלונות "הגדרות זמן", "הגדרת זמן חוסר תנועה", "הגדרות מרחק" ו"הגדרת וקטור מהירות", בהתאמה. שינוי ערך ברירת המחדל עבור הגדרות הפרמטרים אינו מומלץ. עם זאת, עבור "מרווח מסגרת", הפרמטר צריך להיות מחושב באמצעות הנוסחה "מרווח מסגרת = 1/fps" כאשר fps של הווידאו משתנה. בנוסף, ניתן להשתמש בקנה מידה ידוע כדי לוודא את המרחק והמהירות בפועל על ידי התאמת הפיקסלים שנרשמו עם מעקב של זבוב לערך מוחשי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: תוצאה המציגה ניתוח קבצי מעקב. (א) הגדרת איור 8א,6. שני מצבים להצגת הנתונים זמינים: "מקובצים לפי אזורים" ו"מקובצים לפי פרמטרים". (B) תוצאות ניתוח קבצי המעקב מוצגות כ"מקובצות לפי אזורים" ב- "A,6.1". (ג-ו) התוצאות של ניתוח קבצי מעקב מוצגות כ"מקובצות לפי פרמטרים" ב- A,6.2, ומציגות "זמן חוסר תנועה" (C), "וקטור מהירות" (D), "זמן" (E) ו"מרחק" (F) בנפרד. התוצאות של חוסר התנועה, הזמן והמרחק מכומתים כ-"s" ו-"pixels". יש להגדיר את יחידת וקטור המהירות כ-"pixel/s", ולהפיק פלט עם הביאור "length". אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: תוצאות ניתוח הנתונים עבור מהירות לשנייה. (A, C ו- E) נתוני הייצוא מכילים קואורדינטות של פיקסלים במחיצות אופקיות (עמודה "C") ואנכיות (עמודה "D"), וכן תנועה של פיקסלים, חוסר תנועה וזווית שינוי כיוון בין מרווחי זמן של שתי מסגרות (עמודה "E" ב- A, C ו- E בהתאמה), המחושבת באופן אוטומטי על-ידי הנוסחה המתוארת בהקשר. מכיוון שהתוצאות המיוצאות מפיג'י הן מסמכי טקסט, מומלץ לפתוח את הקובץ באמצעות Microsoft Office Excel ולפצל את הנתונים לשלוש עמודות על-ידי הוספת רווחים ביניהן. (ב', ד' ו-ו') תרשים קו מציג את התוצאות המחושבות מערכת הנתונים של תנועת הפיקסלים (B). ערך השיא העולמי מייצג את המהירות, המעיד על יכולות זיהוי התנועה; תרשים הטורים מציג את התוצאות המחושבות מתוך ערכת הנתונים של חוסר תנועה (D). מידת הדלילות בתרשים הטורים מייצגת את חוסר התנועה, המציגה את פגם היכולת המוטורית של זבובים; דיאגרמת פיזור מציגה את התוצאות המחושבות מערכת הנתונים של זווית שינוי הכיוון (F). העשרת הנתזים המוצגת בדיאגרמת הפיזור מייצגת את הכיוון שנבחר על ידי הזבוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: ניתוח השוואתי של תנועה בין זבובים שטופלו עם או בלי רוטנון. (A) מוצגים גרפים מייצגים של עקבות המעקב אחר W1118 זבובים בוגרים המוזנים במזון סטנדרטי המכיל 500 מיקרומטר רוטנון, או DMSO לביקורת. זבובי W1118 נאספו ולאחר מכן הונחו בסביבה מבוקרת המורכבת ממזון סטנדרטי עם 500 מיקרומטר רוטנון או DMSO, 25 מעלות צלזיוס ו-60% לחות. שישה זבובים שימשו לניתוח מכל קבוצה לאחר 48 שעות. התוצאה מגלה כי מרחק התנועה של זבובי המעקב המוזנים ברוטנון קטן משמעותית בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת. התוצאה הראתה יכולת מוטורית פגומה בזבובים שניזונו מרוטנון. (ב-ה) ניתוח כמותי של הטיפול ברוטנון על מרחק הנסיעה הממוצע, זמן חוסר התנועה, המהירות הממוצעת והמהירות המרבית מתבצע באמצעות פיג'י. תוצאות הטיפול ברוטנון הראו ירידה משמעותית במרחק הנסיעה ובמהירות הממוצעת, ועלייה משמעותית בזמן חוסר התנועה. (פ-ק) ניתוח פיקסלים למסגרת (F,G), זמן חוסר תנועה לפריים (H,I) ושינויי כיוון בזווית (J,K) בין זבובים שטופלו ברוטנון (G,I,K) או DMSO (F,H,J). גרפים לדוגמה הממחישים את ההשפעות של רוטנון על מהירות התנועה מראים פחות שיאים המייצגים את מהירות התנועה למרווח מסגרת בזבובים הניזונים מרוטנון (G) בהשוואה לאלה שבקבוצת הביקורת (F), מה שמצביע על חומרת הפגם בפעילות המוטורית (F,G). עמודת חוסר התנועה האינטואיציוניסטית של פיקסלים נעים לכל מסגרת נמוכה יותר, ומציגה פחות תנועה משמעותית תוך דקה אחת עבור זבובים הניזונים מרוטנון (I) בהשוואה לזבובי הביקורת (H). תרשימים לדוגמה של זווית התנועה של שינויי כיוון בבעלי חיים הניזונים מרוטנון (K) ובבעלי חיים (J) חושפים שינויים בכיוון שנבחר על ידי זבובים. הנתונים הם ממוצע ± SEM של שישה זבובים זכרים המנוטרים במשך דקה אחת. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין הקבוצות (***p < 0.001; מבחן t לא מזווג, p = 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: ניתוח השוואתי של התנועה בין זחלים שטופלו עם או בלי רוטנון. (A) תוצאות מייצגות של השוואת הפעילות המוטורית על ידי מעקב אחר עקבותיהם של זחלי כוכב שלישי W1118 הניזונים מרוטנון או DMSO. בקצרה, W1118 זחלי כוכב שלישי נאספו וגודלו בתרבית של 10% סוכרוז, או 10% סוכרוז המכיל 500 מיקרומטר רוטנון, בסביבה של 25 מעלות צלזיוס עם 60% לחות. שישה זחלים לכל קבוצה שימשו לניתוח. אם ניקח בחשבון את התנועה האיטית של הזחלים, הנתונים הקלטה על פני טווח של 5 דקות כומתו ונותחו כדי להעריך את ההשפעות של רוטנון על תנועה. (ב-ה) המרחק הממוצע, זמן חוסר התנועה, המהירות הממוצעת והמהירות המרבית של שתי הקבוצות שנותחו בפיג'י מנותחים כמותית. התוצאות הכמותיות מראות כי מרחק התנועה, המהירות הממוצעת והמהירות המרבית פוחתים משמעותית בזחלים הניזונים מרוטנון, וזמן חוסר התנועה גדל משמעותית בזחלים הניזונים מרוטנון. (פ-ק) בדומה לזבובים בוגרים, ניתוח של פיקסלים לפריים, זמן חוסר תנועה ושינויי כיוון בין זבובים שטופלו ברוטנון (G,I,K) וללא רוטנון (F,H,J) הראה כי לזחלים שטופלו ברוטנון הייתה מהירות תנועה נמוכה יותר, זמן תנועה רב יותר והם שינו את כיוונם לסירוגין. התוצאות מראות כי התנועה ההתנהגותית של זחלי מעקב הניזונים מרוטנון נפגעת משמעותית בהשוואה לקבוצת הביקורת. התוצאות מראות פעילות לוקומוטורית פגומה של זבובים הניזונים מרוטנון. הנתונים הם ממוצע ± SEM של שישה זחלים בני 3 ימים המנוטרים במשך 5 דקות. כוכביות מצביעות על הבדל משמעותי בין הקבוצות (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; מבחן t לא מזווג, p = 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: השוואה בין מתודולוגיות מבוססות מעקב אחר בעלי חיים לכימות הפעילות המוטורית בדרוזופילה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תכננו שיטה, המבוססת על חומר הקוד הפתוח AnimalTracker API התואם לתוכנית עיבוד התמונה של פיג'י, שיכולה לאפשר לחוקרים להעריך באופן שיטתי את הפעילות המוטורית על ידי מעקב אחר זבובי זחלים בוגרים ובודדים. AnimalTracke הוא כלי שנכתב ב- Java שניתן לשלב בקלות במסדי נתונים קיימים או כלים אחרים כדי להקל על ניתוח התנהגות מעקב אחר בעלי חיים שתוכננה על ידי יישום24. בניתוח פריים אחר פריים על ידי נוסחת חישוב תוכנה המכמתת את הפעילות המוטורית של הבוגרים והזחלים, ניתן לנתח באופן גמיש מספר פרמטרים, כולל מהירות תנועה, מרחק נסיעה, חוסר תנועה ושינויי זווית כיוון. פרמטרים אלה, המייצגים היבטים שונים של תנועה התנהגותית, ניתנים לשרטוט כדי להמחיש שינויים מוטוריים לאורך זמן. בנוסף, על ידי יצירת ממשק משתמש גרפי, מתן תיעוד מפורט על השימוש בו וממשק תכנות יישומים, אנו שואפים להנגיש שיטה זו לחוקרים חסרי ניסיון בתכנות ולמשתמשים מנוסים היוצרים פרדיגמות ניסוי מותאמות אישית.
כדי לוודא שהשיטה יכולה לנטר התנהגות במדויק, בוצעה בדיקה מוטורית של זבובים בוגרים וזחלים שטופלו ברוטנון, כמו גם השוואה של הפעילות המוטורית שלהם לזו של זבובי ביקורת המוזנים בממס של התרופה. תוכנת פיג'י, עם התוספים שלה, משמשת לניתוח קואורדינטות הפיקסלים של כל פריים בהקלטת הווידאו של התנועה, ומאפשרת חישוב המהירות, המרחק ופרמטרים אחרים של זבובי הניסוי. הבחנו בירידה משמעותית במרחק הנסיעה לאורך זמן במתן רוטנון (איור 11), אשר עקבית עם התוצאות המדווחות23. בינתיים, מהירות התנועה העולה והכיוון החריג שנבחר נצפו בקבוצות שניזונו מסמים, כדי לעזור להמחיש פרטים נוספים על הליקוי ההתנהגותי בזבובים. לאור ההצלחה בזיהוי הפעילות המוטורית של זבובים בוגרים, ביקשנו להעריך את הניידות של הזחלים (איור 12). בהשוואה לקבוצת הביקורת, תוצאות זחלי המעקב שניזונו מרוטנון נפגעו באופן משמעותי, בדומה לתוצאות של זבובים בוגרים שניזונו מסמים. ניסויים עם מבוגרים וזחלים שניזונו מרוטנון מצביעים על כך ששיטה זו יכולה לתעד במדויק את הפחתת הזבובים שיצרו ליקויים מוטוריים בהשוואה לקבוצת הביקורת. דו"ח זה הדגים בהצלחה יישומים של השיטה הנוכחית בכימות וניתוח יכולת לוקומוטורית והיבטים אחרים של פגמים התנהגותיים של זבובי פירות במודלים של ניסויים או במחקר פרמקולוגי בבעלי חיים.
כדי להבטיח שניתוח הווידאו והמעקב יניב תוצאות מוצלחות וניתנות לשחזור, מומלץ לדבוק בהנחיות הבאות. ראשית, לבחירת קצב מסגרות הווידאו, אנו ממליצים להמיר את הווידאו המוקלט לפורמט של 15 מסגרות לשנייה (fps). זה יכול לא רק לשמור על מעקב תנועה טוב, אלא גם למנוע את האיטיות של ניתוח המחשב הנגרמת על ידי כמויות עצומות של נתונים. על ידי שיפור קצב פריימים של וידאו, ניתוח מסלול התנועה נעשה מפורט יותר. שנית, ניתן להתאים את הפרמטרים בנוסחה כך שיתאימו לתוכנית הניסוי המתאימה בעת ניתוח התנועה הסטטית בין כל שתי מסגרות. לניטור מנוע הזחלים, חיוני להשתמש בג'ל סיליקה ולא באגר, מכיוון שג'ל הסיליקה המוצק הדוק והזחלים אינם יכולים להיכנס אליו. יתר על כן, ג'ל סיליקה הוא שקוף וניתן לצבוע אותו על ידי הוספת חומר צבע כדי לייצר רקע אופטימלי, מה שמקל על אפקטים אופטיים רצויים המשפרים את איכות התמונה.
מערכות מעקב אחר בעלי חיים מתקדמות כדי לספק פתרונות מקיפים לקהילות האטיולוגיה, מדעי המוח והגנטיקה ההתנהגותית. טבלה 1 מספקת השוואה בין התכונות של תוכניות מעקב מרובות הזמינות כעת 10,11,12,16,17,25,26. גישה זו היא חסכונית ביותר, פשוטה ללמידה ומדויקת במדידת התנהגות מוטורית, ללא צורך בתוכנה וציוד יקרים. אין ספק שניתן להרחיב שיטה זו בנוחות למודלים אחרים של בעלי חיים דמויי דרוזופילה, ואפילו לבעלי חיים גדולים יותר כמו חולדות ועכברים. ניתן להרחיב את מבנה ה-API של AnimalTracker בקלות באמצעות יישומים או תוספים עצמאיים של ImageJ, המציעים מגוון רחב של ערכות כלים שימושיות למחקר וניתוח התנהגות מותאמים אישית24. עם זאת, למחקר זה יש מגבלות מסוימות. מכיוון שזבוב בודד מוצב בזירה בשדה פתוח להקלטת תמונות ומעקב וידאו מתבצע בנפרד, שיטה זו אינה יעילה וגוזלת זמן. ניסינו להרחיב את היכולת להקליט מספר זירות בו זמנית, ולאפשר עד שש הקלטות בודדות. תיאורטית ניתן להקליט מספר גדול יותר של דרוזופילה בו זמנית; זה תלוי בגודל הזירה ובתצורת המצלמה. לחלופין, אם משתמשים רוצים להרחיב להקלטת דרוזופילה מקובצת, מומלץ לשקול את המספר המוגבל של רשומות בודדות ותצורה באיכות מספקת כדי לזהות התנגשויות וחפיפות בין הזבובים. שיפורים ביעילות הבדיקה על ידי למידת מכונה לא נלקחו בחשבון במחקר, שכן לא נמצאה גישה זולה ותואמת שניתן לשלב עם המערכת הנוכחית כדי להבחין חזותית בין זהויות ולעקוב אחר מודלים במדויק.
לסיכום, השיטה המתוארת כאן מפתחת ומאמתת גישה יעילה ופשוטה המבוססת על תוכנת קוד פתוח חופשית, שנועדה להפחית את צריכת הזמן ולשכלל טכניקות ניסוי לציון וניתוח כמותי של תנועת דרוזופילה בזחלים ובשלבים בוגרים. באמצעות ניתוח שיטתי, שיטה זו יכולה לעזור לנו להבין כיצד מהירות החיה משתנה עם הזמן במהלך התנועה, כמו גם את המאפיינים של בחירת כיוון. לפיכך, שילוב של תוכנות קוד פתוח במכשירים דיגיטליים נפוצים מספק דרך אמינה לבחון את פעילות הלוקומוטור בדגמי זבובים שונים. זה עשוי להיות שימושי להערכת תפוקות לוקומוטוריות פיזיולוגיות ופתולוגיות בבדיקת מודלים של מחלות נוירודגנרטיביות הנגזרים מטיפול תרופתי ומשינוי מהונדס בדרוזופילה כמו גם בבעלי חיים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן שיגור מיוחדת מאוניברסיטת סוצ'ו והקרן הלאומית למדע של סין (NSFC) (82171414). אנו מודים לחברי המעבדה של פרופ' צ'ון-פנג ליו על הדיון וההערות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
