Summary
该协议通过使用开源软件斐济跟踪和分析手工竞技场中苍蝇的运动来评估 果蝇 的运动活动，该软件与插件兼容，以基于高清视频录制分割每帧的像素以计算速度、距离等参数。
Abstract
黑腹果蝇 因其丰富的先进遗传操作技术和多样化的行为特征而成为研究各种疾病的理想模式生物。在动物模型中识别行为缺陷是衡量疾病严重程度的关键指标，例如，在神经退行性疾病中，患者经常经历运动功能障碍。然而，随着各种系统可用于跟踪和评估苍蝇模型中的运动缺陷，例如药物治疗或转基因个体，仍然缺乏从多个角度进行精确评估的经济且用户友好的系统。本文开发了一种基于 AnimalTracker 应用程序编程接口（API）的方法，该方法与斐济图像处理程序兼容，以系统地评估记录的视频中成年和幼虫个体的运动活动，从而可以分析其跟踪行为。该方法只需要一个高清摄像头和一个计算机外围硬件集成来记录和分析行为，使其成为筛选具有转基因或环境行为缺陷的苍蝇模型的一种经济有效的方法。给出了使用药理处理的苍蝇的行为测试示例，以展示该技术如何以高度可重复的方式检测成年苍蝇和幼虫的行为变化。
Introduction
黑腹果蝇 为研究由基因修饰1、药物治疗2 和衰老3 创建的神经元疾病模型中的细胞和分子功能提供了一种极好的模式生物。人类和果蝇之间生物途径、物理特性和疾病相关同系物基因的高度保守性使果 蝇 成为从分子到行为水平的理想模仿物4.在许多疾病模型中，行为缺陷是一个重要的指标，为各种人类神经病提供了有用的模型5，6。 果蝇 现在用于研究多种人类疾病、神经发育和神经退行性疾病，如帕金森病和肌萎缩侧索硬化症7，8。检测疾病模型的运动能力对于了解致病进展至关重要，并且可以提供与疾病过程背后的分子机制的表型相关性。
最近，已经为果蝇运动检测策略开发了商用软件工具和具有成本效益的程序，例如在分组果蝇中进行高通量测试9，10和实时测量运动11，12。一种这样的传统方法是快速交互式负地理分类（RING），也称为攀爬测定，它包括多个通道，允许包含具有相同性别和年龄的大量苍蝇种群，从而在收集数据的同时减少变异9，13。另一种用于分析运动行为的预测试方法是TriKinetics果蝇活动监测器（DAM），这是一种使用多个光束来检测细玻璃管内苍蝇活动运动的设备14。该设备连续记录位置，通过计算光束交叉来表示自动运动，以研究苍蝇在较长时间内的活动和昼夜节律15。尽管这些方法已广泛用于分析果蝇的行为缺陷以确定行为运动的变化，但它们总是需要特殊的测试设备或复杂的分析过程，并且限制了它们在某些模型中的应用，设备有限，简单。用于测试成年果蝇的基于动物追踪组的策略，例如 FlyGrAM11 和果蝇岛测定10，在预定义的区域实施社会招募和个体跟踪。然而，由于苍蝇的碰撞或重叠，在被蹂躏的区域，社会个体限制可能会对图像中的识别产生负面影响。尽管一些基于开源材料的方法，如TRex16、MARGO 12和FlyPi17，有紧急情况，但它们可以在行为测试中灵活使用，快速追踪苍蝇。这些测试方法与复杂的实验设备安装、特殊软件要求或专业计算机语言有关。对于幼虫，测量每单位时间穿过网格边界线数量的总距离18，或粗略计算个体的体壁收缩19，是评估其运动能力的主要方法。由于设备或装置和分析方法缺乏精确性，幼虫的一些行为运动可能逃脱检测，难以准确评估行为运动，尤其是精细运动15。
本开发的方法利用与斐济（ImageJ）图像处理程序兼容的 AnimalTracker 应用程序编程接口（API），通过分析成蝇和幼蝇的高清（HD）视频中的跟踪行为，系统地评估其运动活动。斐济是一个开源软件ImageJ发行版，可以将强大的软件库与多种脚本语言相结合，从而快速制作图像处理算法的原型，使其图像分析功能在生物学家中很受欢迎20。在当前的方法中，斐济与 AnimalTracker API 的集成被用来开发具有个性化算法插入的独特果 蝇 行为测定，并为详细文档和教程提供了一个有用的步骤，以支持运动行为的强大分析能力（图 1）。为了避免因苍蝇碰撞或重叠而导致图像中客观识别的复杂性，每个竞技场仅限于容纳一只苍蝇。在评估该方法的跟踪精度后，实施它来追踪和量化与有毒药物鱼藤酮一起给药的果 蝇 运动，该药物通常用于帕金森病的动物模型，最终发现药物治疗中的运动障碍21。这种方法采用开源和免费软件，不需要高成本的仪器，并且可以精确和可重复地分析 果蝇 的行为运动。
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Protocol
本研究使用W1118成年苍蝇和第三龄幼虫。
1. 实验准备
注意：用于 果蝇 运动跟踪的露天竞技场由无色无味硅胶制成。
- 根据制造商对硅胶试剂盒的说明，以 1：10 的比例混合试剂 A 和试剂 B（参见 材料表）。确保通过搅拌将碳酸氢钠添加到混合物中，直到颜色变为白色。将混合物转移到干净的培养皿中，并将其置于40°C的烤箱中干燥48小时。
- 将高清摄像机（参见 材料表）放在三脚架上，对其进行调整，使摄像机镜头垂直于二氧化硅竞技场的表面。调整相机的焦距和光圈，确保相机聚焦在二氧化硅表面，并且显示器被充分照亮。实验设置如图 1所示。
- 将一只苍蝇转移到空旷的竞技场中，录制至少 61 秒的连续视频。
注意：考虑到幼虫的缓慢性质，建议视频录制时间超过10分钟。- 使用斐济打开视频，将进度条拖动到初始帧，然后默许。使用“手绘选择”工具选择苍蝇的整个身体（图2B，C）。
- 单击图像>调整>亮度和对比度以调整白平衡，直到所选区域的灰度值接近宽背景（图2D-F）。
注意：第一帧的背景均匀化使软件能够在没有任何物体的情况下区分背景，并在苍蝇存在时创建对比度，从而允许软件跟踪它。
- 在25°C和60%相对湿度的测试环境中进行整个实验，在安静且没有暴露在强光下的区域。
2. 视频录制和预处理
- 使用95%二氧化碳（CO2）进行短时间麻醉后，将苍蝇转移到露天竞技场，然后按相机应用程序上的录制按钮开始视频录制。
注意：为了尽量减少麻醉剂对运动的影响，请在开始视频录制之前让苍蝇恢复 10 分钟。还建议通过冷却进行冷麻醉。- 一旦苍蝇从麻醉中恢复过来，将装有苍蝇的竞技场盘放在相机下方，并快速左右摇晃板，以确保记录开始时苍蝇在运动。
- 录制完成后，按 停止 按钮终止视频录制。
注意：确保视频录制时间略微超过目标跟踪时间。此外，为了提高实验效率，可以自发地跟踪多只苍蝇。这取决于相机的分辨率，以实现高质量的视频裁剪。 - 使用MJPEG编码将录制的视频转换为AVI格式，以便可以使用斐济打开和分析它们。同时，将视频的每秒帧数 （fps） 速率设置为成年苍蝇的 15 fps 和幼虫的 12 fps。
3. 视频分析
- 打开已使用“使用虚拟堆栈”和“转换为灰度”转换的视频，这是使用斐济打开视频时弹出窗口中的两个选项（图2A）。
- 如上所述，制作空白的第一帧。
- 使用 AnimalTracker 插件的“设置活动图像”工具获取处理窗口，并使用“椭圆形”工具在原始视频窗口中创建一个环绕竞技场的跟踪区域（图 3A）。
- 为处理窗口中的第一个空白帧设置过滤器（图3A，3）和两个过滤器的参数（图4A-G）。然后，选择原始视频窗口中的下一帧，并选择处理窗口的过滤表面（图 5A-C）。
注意：滤波步骤用于减少图像噪声和/或去除背景，从而在帧的二值化中更轻松地将前景与背景分开。 - 选择过滤后的处理窗口后，使用“设置阈值”工具转动具有处理窗口中覆盖的红色轮廓的跟踪苍蝇（图 3A、4、图 5D-E 和图 6A）。
- 使用“设置斑点检测器”让计算机识别处理窗口中覆盖的红色轮廓的苍蝇（图 3A、5 和图 6B）。
- 将第 901 帧设置为成年苍蝇的最后一帧，由视频的录制持续时间和 fps 计算（图 3A、6、图 6C）。
注意：以下幼虫实验已被跟踪 10 分钟，因此将帧 7200 设置为最后一帧。 - 使用“显示斑点”工具在原始视频窗口中显示跟踪矩形（图 3A、7 和图 6D，E）。然后，开始跟踪并在监控完成后导出跟踪文件（图 3A、8、9 和图 7A，B）。
4. 跟踪文件分析
- 使用 动物跟踪器>跟踪分析器插件加载跟踪和 区域文件（图 8A）。
- 使用区域设置选择所需的索引并更改参数设置（图 8）。使用帧速率计算帧间隔的时间。
注意：在这种情况下，帧速率为 15 fps，帧间隔约为 0.067 s，这是默认设置（图 8D）。 - 在跟踪分析仪中进行分析后，使用电子表格软件和GraphPad Prism生成定量分析图表（图9）。
5. 每帧分析
- 按帧间隔执行速度分析。如果需要更详细的研究，请在没有斐济的情况下分析轨迹文件。
- 打开跟踪文件，将所有坐标复制到 Office Excel Microsoft并使用空格键拆分单元格。
注意：例如，一旦文件被划分为“C”和“D”列，果 蝇 每帧间隔的速度由公式 SQRT（（C5-C4）^2+（D5-D4）^2）计算，如“E”列所示（图10A）。“E”列中的数据表示苍蝇在两帧之间移动的像素数，不考虑第一帧。选择所有计算结果并插入折线图以显示每帧间隔的直观飞行移动速度，并在折线图上显示峰值（图 10B）。
- 打开跟踪文件，将所有坐标复制到 Office Excel Microsoft并使用空格键拆分单元格。
- 计算每帧间隔的静止时间。将文件拆分为“C”和“D”列后，使用公式IF（SQRT（（C6-C5）^2+（D6-D5）^2）<20，0，1）计算果蝇每帧间隔的不动状态，该公式显示在“E”列中。（图10C）。
注意： 与速度分析不同，定义了第一帧的结果。移动小于20像素的苍蝇被认为是不动的，并在“E”列中记录为“0”。- 选择所有计算结果并插入柱形图，以通过整个柱形图的边距直观地显示静止时间（图10D）。
- 确保方向角度发生变化。
注意：方向变化角度分析代表苍蝇的方向选择。将文件拆分为“C”和“D”列后，方向变化的角度由公式 ACOS（（（SQRT（（（C7-C6）^2+（D7-D6）^2））^2+（SQRT（（C6-C5）^2+（D6-D5）^2））^2-（SQRT（（C7-C5）^2+（D7-D5）^2））^2）/（2*SQRT（（C6-C5）^2+（D6-D5）^2））*（ SQRT（（C7-C6）^2+（D7-D6）^2）））*180/PI（），显示在“E”列中（图 10E）。计算结果表示三个坐标之间的角度。- 选择所有计算结果并插入散点图以说明苍蝇运动的方向变化角度（图10F）。
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Representative Results
在本研究中，检查了用鱼藤酮处理的成蝇和第三龄幼虫的运动缺陷，并将其运动活性与用药物溶剂二甲基亚砜（DMSO）喂养的对照苍蝇的运动活性进行了比较。在果蝇中使用鱼藤酮治疗已被证明会导致大脑中的多巴胺能神经元丢失22并导致显着的运动缺陷23。如图11和图12所示，与喂食DMSO的对照苍蝇相比，用鱼藤酮处理的成蝇和第三龄幼虫具有显着的运动缺陷。图11和图12B-E说明了用或没有鱼藤酮处理的苍蝇之间运动参数的距离，速度和不动时间的相对变化。图11和图12F-K说明了对成虫和幼虫的速度、不动时间和方向选择参数的代表性分析，有或没有鱼藤酮处理。使用斐济软件对成蝇（图11）和第三龄幼虫（图12）中的距离，静止时间和速度参数进行定量分析进一步验证了鱼藤酮治疗可用于研究人类疾病（包括神经退行性疾病）中的运动缺陷，并复制在人类和哺乳动物中观察到的一些行为特征。
图 1：流程图概述了果蝇运动跟踪分析的设备设置和实验程序。 运动跟踪竞技场由头顶高清摄像机成像，该摄像机合并到计算机中并由计算机控制。分析果蝇运动的程序包括视频记录、运动跟踪、跟踪文件分析、数据处理和参数分析。请点击此处查看此图的大图。
图 2：第一帧的背景均匀化。（A） 打开转换后的视频时勾选“转换为灰度”选项，将视频转换为灰度并避免颜色的干扰。 （B） 使用红色框中显示的“徒手选择”工具勾勒出 果蝇 的轮廓。 （C） 作为分析选择，使用黄线描绘苍蝇的轮廓。保持黄线靠近苍蝇的轮廓可以降低选择未被苍蝇占据的区域的可能性。比例尺 = 1 厘米。 （D） 调整第一帧的亮度和对比度，直到黄色框住的区域变为与背景相同的灰度。 （E） 通过单击“堆栈”窗口中的“否”，完成第一帧的亮度和对比度调整，但不是所有帧的亮度和对比度调整。 （F） 最终，调整第一帧以创建均匀且无瑕疵的背景。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：跟踪窗口和跟踪区域设置。（A） 按照动物追踪窗口中标记的顺序单击追踪器插件，完成追踪分析。 （B） 在 图A，1中设置活动图像后，将显示仅显示当前帧的处理窗口。主视频窗口和处理窗口明显区分，用于不同情况。要更改当前帧，请确保在主视频窗口中执行更改;更改将在两个窗口中可见。比例尺 = 1 厘米。 （C） 使用计算机识别的“椭圆形”工具创建一个环绕竞技场的跟踪区域。跟踪区域选择必须位于打开的视频窗口中的圈出竞技场中，而不是在处理窗口中。 （D） 用黄线勾勒出一个跟踪区域，以最大限度地适应竞技场，以尽量减少外界光线的干扰。比例尺 = 1 厘米。 （ E） 要在跟踪区域中设置感兴趣区域 （ROI），请单击“区域设计器”窗口中标有数字的顺序后面的按钮。在此步骤中，必须在所选视频窗口打开后完成整个操作。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：第一帧的滤镜设置。（A） 通过完成跟踪区域的ROI设置，在打开的视频窗口和处理窗口中，环绕竞技场的黄线都将变为绿色。比例尺 = 1 厘米。 （B） 添加滤镜的用途会设置黑色背景，以使处理窗口中第一帧的目标对象更加明显。整个操作应在处理窗口内进行，而不是在打开的视频窗口中进行。 （中，四） 将“背景减法器”和“高斯模糊”滤镜添加到“滤镜设置”窗口会使处理窗口中的第一帧变黑。整个滤镜设置过程必须在第一帧中完成。 （E） 通过在“背景减法器”窗口中单击标有数字和红色矩形的按钮逐步设置参数。选择处理窗口后，必须操作“设置图像”步骤。 （F） 比例尺 = 1 厘米。单击“E4”中的“显示过滤器”按钮并直接关闭窗口后，将显示“中值图像”窗口，无需任何操作。 （G） 高斯模糊的参数设置为默认西格玛值 2.0。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：第二帧的阈值设置。（A） 通过单击下方进度条，使视频窗口前进到第二帧。苍蝇在屏幕中间重复出现，由斐济识别。比例尺 = 1 厘米。 （B，C） 显示过滤前后的处理窗口。（B） 通过选择标有红色矩形的模式来显示筛选的处理窗口。（C） 选择“过滤”模式后带有红色矩形的处理窗口示例。比例尺 = 1 cm. （D） 在选择图 3A，4 中的“设置阈值”工具后，通过选择默认阈值方法“阈值器”（如“阈值器”窗口所示）来设置阈值。（E）通过滑动中间的进度条框来调整参数，直到看到跟踪苍蝇并被红色配置文件覆盖。不建议更改下面红色矩形中框内的参数的默认设置。请点击此处查看此图的大图。
图 6：斑点检测器、最后一帧设置和动物跟踪选择。（A） 在达到 图5E中所述的阈值时，处理窗口在第二帧中显示一个相当大的红色轮廓。使覆盖苍蝇的红色轮廓适合跟踪苍蝇。比例尺 = 1 厘米。 （B） 通过选择默认的斑点检测器方法“基础斑点检测器”，将红色轮廓覆盖的苍蝇定义为跟踪目标。 （C） 使用 图 3A，6 中的“设置最后一帧”工具将帧 901 设置为最后一帧。总帧数由公式“帧数 = fps * 录制时间”计算。 （D ） 跟踪在打开的视频窗口（左侧面板部分）中显示斑点后带有黄色矩形框。在放大的左面板中，果蝇以红色附着（右侧面板部分）。比例尺 = 1 厘米。 （ E ） 跟踪飞行，点击选择“D”（上面板部分）中的红色矩形后，带有红色矩形框。在上面板放大中，果蝇以红色附着（底部面板部分）。确保在打开的视频窗口中完成跟踪苍蝇周围黄色矩形的选择。在打开的视频窗口中完成选择，斐济将在所有帧中识别苍蝇。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：跟踪跟踪的结果。 跟踪跟踪分别显示在打开的视频窗口 （A ） 和处理窗口 （B） 中。要获取跟踪跟踪配置文件，请单击原始视频窗口中的进度条，然后滑动进度条以检查跟踪的连续性。跟踪跟踪直观地显示了苍蝇的爬行距离。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：使用 AnimalTracker 插件进行跟踪文件分析。（A）跟踪分析器便于对跟踪文件进行详细分析;每个标有红色矩形的步骤都用一个数字表示。（B） 在 A、4 中设置“区域设置”参数。四个参数（时间、距离、静止时间和速度矢量）显示在红色矩形中。根据所需的结果选择参数。（C-G）在 A，5 的“设置参数”窗口中单独设置配置参数。（C）四个可调参数在“配置参数设置”窗口中显示，（D-G）分别显示“时间设置”，“静止时间设置”，“距离设置”和“速度矢量设置”窗口。不建议修改参数设置的默认值。但是，对于“帧间隔”，当视频的 fps 发生变化时，应使用公式“帧间隔 = 1/fps”计算参数。此外，可以通过将记录的像素与苍蝇跟踪相关联，使用已知比例来确定实际距离和速度。请点击此处查看此图的大图。
图 9：显示跟踪文件分析的结果。（A）图8A，6的设置。有两种数据显示模式：“按区域分组”和“按参数分组”。（B）跟踪文件分析的结果在“A，6.1”中显示为“按区域分组”。（C-F）跟踪文件分析的结果在A，6.2中显示为“按参数分组”，分别显示“静止时间”（C），“速度矢量”（D），“时间”（E）和“距离”（F）。静止时间和距离的结果被量化为“s”和“像素”。速度矢量的单位应定义为“像素/秒”，输出时应带有注释“长度”。请点击此处查看此图的大图。
图 10：每 fps 速度的数据分析结果。（A、C 和 E） 导出数据包含水平（列“C”）和垂直（列“D”）分区中的像素坐标，以及像素的移动、不动和两帧间隔之间的方向变化角度（分别为 A、C 和 E 中的列“E”），这些坐标由上下文中描述的公式自动计算。由于从斐济导出的结果是文本文档，因此建议使用Microsoft Office Excel打开文件，并通过在它们之间添加空格将数据拆分为三列。（B、D 和 F）折线图显示像素移动数据集的计算结果 （B）。全局峰值表示速度，表示运动检测能力;柱形图显示来自不动 （D） 数据集的计算结果。柱形图中的稀疏程度代表不动，表现出苍蝇的运动能力缺陷;散点图显示方向变化角度 （F） 数据集的计算结果。散点图中显示的飞溅富集表示苍蝇选择的方向。请点击此处查看此图的大图。
图11：用或不用鱼藤酮处理的苍蝇之间运动的比较分析。（A）显示了用含有500μM鱼藤酮或用于对照的DMSO的标准食物喂养的W1118成年苍蝇的跟踪跟踪的代表性图。收集W1118苍蝇，然后置于由500μM鱼藤酮或DMSO，25°C和60%湿度的标准食物组成的受控环境中。48小时后，每组使用6只苍蝇进行分析。结果表明，饲喂鱼藤酮的跟踪苍蝇的运动距离比对照显著减小。结果显示用鱼藤酮喂养的苍蝇的运动能力有缺陷。（乙-E）使用斐济对鱼藤酮处理对平均行进距离、不动时间、平均速度和最大速度进行定量分析。鱼藤酮处理的结果显示行进距离和平均速度显着降低，并且不动时间显着增加。（F-K）分析每帧像素（F，G），每帧不动时间（H，I）和用鱼藤酮（G，I，K）或DMSO（F，H，J）处理的苍蝇之间的方向变化角度（J，K）。说明鱼藤酮对运动速度影响的示例图表显示，与对照组（F）相比，喂食鱼藤酮（G）的苍蝇中代表每帧间隔运动速度的峰值较少，表明运动活动缺陷（F，G）的严重程度。每帧移动像素的直觉不动列较低，与对照苍蝇（H）相比，鱼藤酮喂养的苍蝇（I）在1分钟内的运动明显减少。鱼藤酮喂养（K）和对照（J）动物的方向变化移动角度的示例图揭示了苍蝇选择的方向的变化。数据是监测1分钟的6只雄性苍蝇的平均±SEM。星号表示组间差异显著（***p < 0.001;未配对 t 检验，p = 0.05）。 请点击此处查看此图的大图。
图12：用或不使用鱼藤酮处理的幼虫之间运动的比较分析。（A）通过跟踪喂食鱼藤酮或DMSO的W1118第三龄幼虫的痕迹来比较运动活动的代表性结果。简而言之，收集W1118第三龄幼虫并在25°C环境，湿度为60%的25°C环境中，在含有500μM鱼藤酮的10%蔗糖中培养。每组使用6只幼虫进行分析。考虑到幼虫的缓慢运动，对5分钟内的数据记录进行了量化和分析，以评估鱼藤酮对运动的影响。（乙-E）定量分析了斐济分析的两组的平均距离、不动时间、平均速度和最大速度。定量结果表明，喂鱼藤酮幼虫运动距离、平均速度和最大速度显著降低，鱼藤酮喂养幼虫不动时间显著增加。（F-K）与成蝇相似，对每帧像素数、不动时间以及用鱼藤酮（G，I，K）和不用鱼藤酮（F，H，J）处理的苍蝇之间的方向变化角度分析表明，用鱼藤酮处理的幼虫运动速度较低，静止时间较长，并且方向交替。结果表明，与对照组相比，喂食鱼藤酮的追踪幼虫的行为运动明显受损。结果显示喂食鱼藤酮的苍蝇的运动活动缺陷。数据是监测5分钟的6只3日龄幼虫的平均±SEM。星号表示组间差异显著（*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001;未配对 t 检验，p = 0.05 ）。请点击此处查看此图的大图。
表1：基于动物追踪的定量果蝇运动活动的方法的比较。请按此下载此表格。
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Discussion
我们设计了一种基于与斐济图像处理程序兼容的开源材料 AnimalTracker API的方法，该方法可以使研究人员通过跟踪成年和个体幼蝇来系统地评估运动活动。 AnimalTracke 是用Java编写的工具，可以很容易地集成到现有的数据库或其他工具中，以促进对应用程序设计的动物跟踪行为的分析24。通过量化成虫和幼虫运动活动的软件计算公式逐帧分析，可以灵活分析几个参数，包括移动速度、行进距离、不动和方向变化角度。这些参数代表行为运动的不同方面，可以绘制成图表来说明运动随时间的变化。此外，通过创建图形用户界面，提供有关其用法的详细文档以及应用程序编程接口，我们的目标是使缺乏编程经验的研究人员和经验丰富的用户创建自定义实验范式可以使用此方法。
为了验证该方法可以准确监测行为，已经对用鱼藤酮处理的成年苍蝇和幼虫进行了运动测试，并将其运动活性与喂食药物溶剂的对照苍蝇的运动活性进行了比较。斐济软件及其插件用于分析运动视频记录中每一帧的像素坐标，从而可以计算实验苍蝇的速度、距离和其他参数。我们观察到鱼藤酮给药时间的行进距离显着减少（图11），这与报告的结果一致23。同时，在药物喂养组中观察到上升的运动速度和选择的异常方向，以帮助说明苍蝇行为缺陷的更多细节。鉴于成功检测成果蝇的运动活动，我们随后试图评估幼虫的活动性（图12）。与对照组相比，喂食鱼藤酮的跟踪幼虫结果显着受损，与喂食药物的成年苍蝇的结果相似。对喂食鱼藤酮的成虫和幼虫的实验表明，与对照组相比，这种方法可以准确记录产生运动缺陷的苍蝇的减少。本报告成功地证明了当前方法在动物测试模型或药理研究中量化和分析果蝇运动能力和其他行为缺陷方面的应用。
为确保视频和跟踪分析产生成功且可重现的结果，建议遵循以下准则。首先，对于视频帧速率的选择，我们建议将录制的视频转换为每秒 15 帧 （fps） 的格式。这样既能保持良好的运动跟踪，又能避免海量数据造成的计算机分析缓慢。通过提高视频帧速率，运动轨迹分析变得更加详细。其次，在分析每两帧之间的静态运动时，也可以调整公式中的参数以适应相应的实验方案;对于幼虫运动监测，必须使用硅胶而不是琼脂，因为固化的硅胶很紧密，幼虫无法进入其中。此外，硅胶是透明的，可以通过添加彩色物质来染色以产生最佳背景，从而促进所需的光学效果，从而提高图像质量。
动物追踪系统正在得到推进，为病因学、神经科学和行为遗传学界提供全面的解决方案。表1提供了当前可用的多个跟踪程序10、11、12、16、17、25、26的特征的比较。这种方法非常经济高效，易于学习，并且可以精确地测量运动行为，而无需昂贵的软件和设备。毫无疑问，这种方法可以方便地扩展到其他类似果蝇的动物模型，甚至扩展到较大的动物，如大鼠和小鼠。AnimalTracker API 的结构可以通过独立的 ImageJ 应用程序或插件轻松扩展，为自定义行为研究和分析提供了广泛的有用工具包24.然而，这项研究有一定的局限性。由于将一只苍蝇放置在空旷的竞技场中进行图像记录，并且单独进行视频跟踪，因此这种方法效率低下且耗时。我们试图扩大同时录制多个舞台的能力，允许最多六个单独的录制。理论上可以同时记录更多数量的果蝇;这取决于竞技场的大小和摄像机的配置。或者，如果用户希望扩展到记录分组果蝇，建议考虑有限数量的单个记录和足够质量的配置，以识别苍蝇之间的碰撞和重叠。研究中没有考虑通过机器学习提高测试效率，因为尚未找到一种经济实惠且兼容的方法，可以与当前系统集成以直观地区分身份并准确跟踪模型。
总之，这里描述的方法开发并验证了一种基于免费开源软件的高效而直接的方法，旨在减少时间消耗并改进实验技术，以定量指示和分析幼虫和成虫阶段的果 蝇 运动。通过系统分析，这种方法可以帮助我们了解动物在运动过程中的速度如何随时间变化，以及方向选择的特点。因此，将开源软件整合到常用的数字设备中，为测试各种苍蝇模型中的运动活动提供了一种可靠的方法。这可能有助于评估生理和病理运动输出，以测试来自 果蝇 和其他动物的药物治疗和转基因修饰的神经退行性疾病模型。
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Disclosures
提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了苏州大学和中国国家自然科学基金（82171414）的特别启动基金的支持。我们感谢刘春风教授的实验室成员的讨论和评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
