Summary
Detta protokoll bedömer Drosophilas rörelseaktivitet genom att spåra och analysera flugornas rörelse i en handgjord arena med hjälp av öppen källkodsprogramvara Fiji, kompatibel med plugins för att segmentera pixlar i varje ram baserat på högupplöst videoinspelning för att beräkna parametrar för hastighet, avstånd etc.
Abstract
Drosophila melanogaster är en idealisk modellorganism för att studera olika sjukdomar på grund av dess överflöd av avancerade genetiska manipulationstekniker och olika beteendefunktioner. Att identifiera beteendebrist i djurmodeller är ett avgörande mått på sjukdomens svårighetsgrad, till exempel vid neurodegenerativa sjukdomar där patienter ofta upplever nedsatt motorisk funktion. Men med tillgången till olika system för att spåra och bedöma motoriska underskott i flugmodeller, såsom läkemedelsbehandlade eller transgena individer, saknas fortfarande ett ekonomiskt och användarvänligt system för exakt utvärdering från flera vinklar. En metod baserad på AnimalTracker applikationsprogrammeringsgränssnitt (API) utvecklas här, vilket är kompatibelt med Fiji bildbehandlingsprogram, för att systematiskt utvärdera rörelseaktiviteterna hos både vuxna och larvala individer från inspelad video, vilket möjliggör analys av deras spårningsbeteende. Denna metod kräver endast en HD-kamera och en hårdvaruintegration för kringutrustning för att spela in och analysera beteende, vilket gör det till ett prisvärt och effektivt tillvägagångssätt för screening av flugmodeller med transgena eller miljömässiga beteendebrister. Exempel på beteendetester med farmakologiskt behandlade flugor ges för att visa hur teknikerna kan upptäcka beteendeförändringar hos både vuxna flugor och larver på ett mycket repeterbart sätt.
Introduction
Drosophila melanogaster ger en utmärkt modellorganism för att undersöka cellulära och molekylära funktioner i neuronala sjukdomsmodeller skapade av genmodifiering1, läkemedelsbehandling2 och åldrande3. Det höga bevarandet av biologiska vägar, fysikaliska egenskaper och sjukdomsassocierade homologgener mellan människor och Drosophila gör att fruktflugan gör att fruktflugan är en idealisk efterlikning från molekylär till beteendenivå4. I många sjukdomsmodeller är beteendebrist ett viktigt index, vilket ger en användbar modell för olika mänskliga neuropatier 5,6. Drosophila används nu för att studera flera mänskliga sjukdomar, neurodevelopment och neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom och amyotrofisk lateralskleros 7,8. Att detektera sjukdomsmodellernas motoriska förmåga är avgörande för att förstå det patogena framsteget och kan ge en fenotypisk korrelation till de molekylära mekanismerna bakom sjukdomsprocessen.
Nyligen har kommersiellt tillgängliga mjukvaruverktyg och kostnadseffektiva program utvecklats för Drosophila lokomotoriska detektionsstrategier, såsom testning med hög genomströmning i grupperade flugor9,10 och mätning av rörelse i realtid11,12. Ett sådant konventionellt tillvägagångssätt är snabb interaktiv negativ geotaxi (RING), även kallad klättringsanalysen, som inkluderar flera kanaler som gör det möjligt att innehålla en stor flugpopulation med samma kön och ålder, vilket minskar variationen medan data samlar in 9,13. En annan förtestmetod för att analysera lokomotoriskt beteende är TriKinetics Drosophila aktivitetsmonitor (DAM), en enhet som använder flera strålar för att detektera flugaktivitetsrörelse i ett tunt glasrör14. Enheten registrerar position kontinuerligt, vilket representerar automatiserad rörelse genom att beräkna strålkorsningarna för att studera flugornas aktivitet och dygnsrytm under en längre tidsperiod15. Även om dessa metoder har använts i stor utsträckning för att analysera beteendefel hos fruktflugor för att bestämma förändringar i beteendemässig rörelse, kräver de alltid speciell testutrustning eller komplexa analysprocesser och begränsar deras tillämpning i vissa modeller med en begränsad, enkel enhet. Djurspårningsgruppbaserade strategier för testning av den vuxna Drosophila, såsom FlyGrAM11 och Drosophila island assay10, implementerar social rekrytering och individuell spårning i ett fördefinierat område. Icke desto mindre kan social individuell begränsning i trotsiga områden ha en negativ inverkan på identifieringen i bilderna, orsakad av kollision eller överlappning av flugor. Även om vissa materialbaserade metoder med öppen källkod, som TRex16, MARGO 12 och FlyPi17, har en nödsituation, kan de snabbt spåra flugorna med flexibel användning i beteendetestning. Dessa testmetoder är förknippade med utarbetade experimentella apparatinstallationer, speciella programvarukrav eller professionella datorspråk. För larver är mätning av det totala avståndet som reste över antalet rutnätgränslinjer per tidsenhet18, eller grovräkning av kroppsväggkontraktionerna för individer manuellt19, de dominerande metoderna för att bedöma deras rörelseförmåga. På grund av bristen på precision i utrustning eller anordningar och analysmetoder kan viss beteendemässig rörelse av larver undgå upptäckt, vilket gör det svårt att exakt bedöma beteenderörelser, särskilt fin rörelse15.
Den nuvarande utvecklade metoden använder AnimalTracker applikationsprogrammeringsgränssnitt (API), kompatibelt med Fiji (ImageJ) bildbehandlingsprogram, för att systematiskt utvärdera rörelseaktiviteten hos både vuxna och larvflugor genom att analysera deras spårningsbeteende från högupplösta (HD) videor. Fiji är en ImageJ-distribution med öppen källkod som kan kombinera robusta programvarubibliotek med många skriptspråk, vilket resulterar i snabb prototypning av bildbehandlingsalgoritmer, vilket gör den populär bland biologer för sina bildanalysfunktioner20. I det nuvarande tillvägagångssättet utnyttjas Fijis integration i AnimalTracker API för att utveckla en unik Drosophila-beteendeanalys med personlig algoritminsättning och ger ett användbart steg för detaljerad dokumentation och handledning för att stödja robusta analytiska funktioner för lokomotoriskt beteende (figur 1). För att kringgå komplikationen av objektiva identifieringar i bilderna som orsakas av kollision eller överlappning av flugor, är varje arena begränsad till att vara värd för endast en fluga. Vid bedömning av metodens spårningsprecision implementerades det för att spåra och kvantifiera rörelserörelserna hos Drosophila som administrerades med det toxiska läkemedlet rotenon, som vanligtvis används för djurmodeller av Parkinsons sjukdom, och slutligen upptäckte rörelsenedsättning i läkemedelsbehandlingen21. Denna metod, som använder öppen källkod och fri programvara, kräver inte högkostnadsinstrumentering och kan exakt och reproducerbart analysera Drosophila beteenderörelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
W1118 vuxna flugor och tredje instar larver användes för den aktuella studien.
1. Experimentell förberedelse
OBS: En öppen fältarena för Drosophila rörelsespårning är gjord medenfärgslös och luktfri kiselgel.
- Blanda reagens A och reagens B i förhållandet 1:10 enligt tillverkarens instruktioner för kiseldioxidsatsen (se Materialförteckning). Se till att natriumbikarbonat tillsätts blandningen under omrörning tills färgen ändras till vit. Överför blandningen till en ren petriskål och ställ in den i en ugn vid 40 °C för torkning i 48 timmar.
- Ställ HD-kameran (se Materialförteckning) på ett stativ och justera den så att kameralinsen är vinkelrät mot ytan på kiselarenan. Justera kamerans brännvidd och öppningar, se till att kameran är fokuserad på kiseldioxidytan och att skärmen är tillräckligt upplyst. Den experimentella uppställningen illustreras i figur 1.
- Överför en fluga till den öppna fältarenan för att spela in en kontinuerlig video på minst 61 s.
OBS: Med tanke på larvernas tröga natur rekommenderas en videoinspelningstid på mer än 10 minuter.- Öppna videon med Fiji, dra förloppsindikatorn till den första bildrutan och godkänn tyst. Välj hela flugans kropp med hjälp av verktyget "frihandsval" (figur 2B, C).
- Klicka på bilden > justera > ljusstyrka och kontrast för att justera vitbalansen tills gråvärdet för det markerade området närmar sig den breda bakgrunden (bild 2D-F).
OBS: Bakgrundshomogenisering av den första ramen gör det möjligt för programvaran att skilja bakgrunden utan några objekt och skapa en kontrast när en fluga är närvarande, vilket gör att programvaran kan spåra den.
- Utför hela experimentet i en testmiljö inställd på 25 °C och 60 % relativ luftfuktighet, i ett område som är tyst och saknar exponering för starkt ljus.
2. Videoinspelning och förbehandling
- Efter en kort period av anestesi med 95% koldioxid (CO2), överför en fluga till den öppna arenan och tryck på inspelningsknappen på kameraprogrammet för att starta videoinspelning.
OBS: För att minimera effekten av bedövningsmedlet på rörelse, låt flugorna återhämta sig i 10 minuter innan videoinspelningen påbörjas. Kylbedövning genom kylning rekommenderas också.- När flugorna återhämtat sig från narkosen, lägg arenaparabolen som innehåller flugan under kameran och skaka plattan snabbt från sida till sida för att säkerställa att flugan är i rörelse när inspelningen börjar.
- När inspelningen är klar trycker du på stoppknappen för att avsluta videoinspelningen.
OBS: Se till att videoinspelningstiden överstiger destinationens spårningstid något med en liten marginal. För att förbättra den experimentella effektiviteten är det dessutom möjligt att spåra flera flugor spontant. Detta beror på kamerans upplösning för att möjliggöra en högkvalitativ videobeskärning. - Konvertera inspelade videor till AVI-format med MJPEG-kodning, så att de kan öppnas och analyseras med Fiji. Ställ under tiden in bildrutorna per sekund (fps) för videon till 15 fps för vuxna flugor och 12 fps för larver.
3. Videoanalys
- Öppna videon som har omvandlats med "använd virtuell stack" och "konvertera till gråskala", två alternativ i popup-fönstret när du öppnar videon med Fiji (figur 2A).
- Gör en tom första bildruta, som nämnts ovan.
- Hämta ett bearbetningsfönster genom att använda verktyget "set active image" i AnimalTracker-plugin och skapa ett spårningsområde som cirklar arenan i det ursprungliga videofönstret med hjälp av verktyget "oval" (figur 3A).
- Ställ in filtren (bild 3A,3) och parametrarna för de två filtren (bild 4A–G) för den första tomma bildrutan i bearbetningsfönstret. Välj sedan nästa bildruta i det ursprungliga videofönstret och välj den filtrerade ytan i bearbetningsfönstret (bild 5A–C).
OBS: Filtreringssteget tjänar till att minska bildbrus och / eller ta bort bakgrunden, vilket gör det enklare att separera förgrunden från bakgrunden i binariseringen av ramarna. - När ett filtrerat bearbetningsfönster har valts vrider du den spårade flugan med en röd profil täckt i bearbetningsfönstret med hjälp av verktyget "set threshold" (figur 3A, 4, figur 5D-E och figur 6A).
- Använd "set blob-detector" för att låta datorn känna igen flugan med en röd profil täckt i bearbetningsfönstret (bild 3A,5 och figur 6B).
- Ställ in bildruta 901 som den sista bildrutan för den vuxna flugan, beräknad utifrån videons inspelningslängd och fps (bild 3A,6, bild 6C).
Följande experiment med larver har spårats i 10 minuter, så ram 7200 är inställd som den sista ramen. - Använd verktyget "visa blobar" för att presentera en spårningsrektangel i det ursprungliga videofönstret (bild 3A,7 och bild 6D,E). Starta sedan spårningen och exportera spårningsfilen när övervakningen är klar (bild 3A,8,9 och bild 7A,B).
4. Spåra filanalys
- Läs in spårnings- och zonfilerna med plugin-programmet Animal tracker > Tracking analyzer (bild 8A).
- Välj önskat index med zoninställningar och ändra parameterinställningarna (bild 8). Beräkna tiden för bildintervallet med bildhastigheten.
I det här fallet är bildrutehastigheten 15 fps och bildruteintervallet är ungefär 0,067 s, vilket är standardinställningen (bild 8D). - Producera de kvantitativa analysdiagrammen med hjälp av kalkylprogrammet och GraphPad Prism efter att ha analyserats i spårningsanalysator (figur 9).
5. Analys per ram
- Utför hastighetsanalys per bildintervall. Analysera spårfilen utan Fiji om mer detaljerad forskning behövs.
- Öppna spårfilen, kopiera alla koordinater till Microsoft Office Excel och dela cellerna med blankstegstangenten.
OBS: När filen till exempel har delats upp i kolumnerna "C" och "D" beräknas hastigheten för Drosophila per bildruteintervall med formeln SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2), som visas i kolumnen "E" (figur 10A). Data i kolumn "E" anger antalet pixlar som flugan flyttade mellan två ramar, med den första ramen inte beaktad. Markera alla beräknade resultat och infoga ett linjediagram för att visa en intuitiv flygrörelsehastighet per bildruteintervall, med en topp i linjediagrammet (bild 10B).
- Öppna spårfilen, kopiera alla koordinater till Microsoft Office Excel och dela cellerna med blankstegstangenten.
- Beräkna immobilitetstiden per bildintervall. När filen har delats upp i kolumnerna "C" och "D" beräknar du orörlighetsstatusen för Drosophila per bildruteintervall med formeln IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), som visas i kolumnen "E". (Figur 10C).
OBS: Till skillnad från hastighetsanalys definierades resultaten av den första ramen. Flugor som rörde sig mindre än 20 pixlar ansågs orörliga och registrerades som "0" i kolumn "E".- Markera alla beräknade resultat och infoga ett stapeldiagram för att visuellt visa orörlighetstiden med marginalen för hela stapeldiagrammet (bild 10D).
- Se till att riktningsvinkeln ändras.
OBS: Vinkeln för riktningsändringsanalys representerar flugornas riktningsval. När filen har delats upp i kolumnerna "C" och "D" beräknas riktningsändringsvinkeln med formeln ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2)^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))*180/PI(), som presenteras i kolumnen "E" (figur 10E). Det beräknade resultatet anger vinkeln mellan tre koordinater.- Välj alla beräknade resultat och infoga ett punktdiagram för att illustrera riktningsändringen för flugornas rörelse (figur 10F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den aktuella studien undersöktes rörelseunderskott hos vuxna flugor och tredje instarlarver behandlade med rotenon och jämfördes i sin motoriska aktivitet med den hos en kontrollfluga som matades med läkemedlet lösningsmedel dimetylsulfoxid (DMSO). Behandling med rotenon i Drosophila har visat sig orsaka dopaminerg neuronförlust i hjärnan22 och leda till betydande rörelsestörningar23. Som visas i figur 11 och figur 12 har vuxna flugor och tredje instarlarver behandlade med rotenon betydande rörelseunderskott jämfört med kontrollflugor som matas med DMSO. Figur 11 och figur 12B-E illustrerar de relativa förändringarna i avstånd, hastighet och immobilitetstid för rörelseparametrar mellan flugor behandlade med eller utan rotenon. Figur 11 och figur 12F-K illustrerar en representativ analys av parametrarna hastighet, immobilitetstid och riktningsval, med eller utan rotenonbehandling hos vuxna och larver. Kvantitativ analys av parametrarna för avstånd, immobilitetstid och hastighet med hjälp av Fiji-programvara hos vuxna flugor (figur 11) och tredje instarlarver (figur 12) i läkemedelsmatningsgrupperna validerar ytterligare att behandling med rotenon kan användas för att undersöka rörelseunderskott i mänskliga sjukdomar, inklusive neurodegenerativa tillstånd, och replikera några av de beteendeegenskaper som observerats hos människor och däggdjur.
Figur 1: Flödesschema som beskriver utrustningens inställning och experimentella procedur för analys av Drosophilas rörelsespårning. Den lokomotoriska spårningsarenan avbildas med en överliggande HD-kamera som är inbyggd i och styrs av en dator. Proceduren för att analysera förflyttningen av Drosophila består av videoinspelning, rörelsespårning, spårningsfilanalys, databehandling och parametrisk analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bakgrundshomogenisering av den första ramen. (A) Markera alternativet "konvertera till gråskala" när du öppnar den transformerade videon för att omvandla videon till gråskala och undvika störningar av färg. (B) Skapa en disposition av Drosophila med hjälp av verktyget "frihandsval", som visas i den röda rutan. (C) Som analysval användes en gul linje för att avgränsa flugornas konturer. Att hålla den gula linjen nära flugans konturer minskar sannolikheten för att välja en region som inte är upptagen av flugan. Skalstapel = 1 cm. (D) Justera ljusstyrkan och kontrasten för den första bildrutan tills området med gult ändras till samma gråskala som bakgrunden. (E) Slutför justeringen av ljusstyrka och kontrast för den första ramen, men inte för alla ramar, genom att klicka på "Nej" i fönstret "stack". (F) I slutändan justeras den första ramen för att skapa en enhetlig och fläckfri bakgrund. Skalstång = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Inställningar för spårningsfönster och spårningszon. (A) Slutför spårningsanalysen genom att klicka på spårningsinsticksprogrammen i den ordning som är markerad i fönstret Djurspårning. (B) När du har ställt in den aktiva bilden i figur A,1 visas ett bearbetningsfönster som bara visar den aktuella ramen. Det primära videofönstret och bearbetningsfönstret är tydligt åtskilda och används i olika situationer. För att ändra den aktuella ramen, se till att ändringen utförs i det primära videofönstret; Ändringen kommer att synas i båda fönstren. Skalstång = 1 cm. (C) Skapa ett spårningsområde som cirklar arenan med hjälp av verktyget "oval" för datorigenkänning. Valet av spårningszon måste finnas i en inringad arena i ett öppet videofönster i stället för i ett bearbetningsfönster. (D) Skissera ett spårningsområde med de gula linjerna för att passa arenan i största möjliga utsträckning för att minimera störningen av yttre ljus. Skalstång = 1 cm. (E) För att ställa in intresseområdet (ROI ) i spårningsområdet, klicka på knapparna efter ordningen markerad med siffrorna som visas i fönstret "zondesigner". I det här steget måste hela operationen slutföras efter att det valda videofönstret öppnas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Filterinställning för den första bildrutan. (A) Genom att slutföra inställningen av ROI för spårningsområdet ändras den gula linjen som omger arenan till grön i både det öppnade videofönstret och bearbetningsfönstret. Skalstapel = 1 cm. (B) Om du lägger till syftet med filter ställs en svart bakgrund in för att göra målobjektet mer uppenbart för den första bildrutan i bearbetningsfönstret. Hela operationen bör utföras inom ett bearbetningsfönster snarare än ett öppet videofönster. (C,D) Om du lägger till filtren "bakgrundssubtraktor" och "Gaussisk oskärpa" i fönstret "filterinställningar" blir den första ramen i bearbetningsfönstret svart. Hela filterinställningsprocessen måste slutföras i den första ramen. (E) Parametrarna ställs in steg för steg genom att klicka på knappar markerade med en siffra och en röd rektangel i fönstret "bakgrundssubtraktor". Steget "set image" måste användas efter att bearbetningsfönstret har valts. (F) Skalstång = 1 cm. Fönstret "medianbild" kommer att presenteras efter att ha klickat på "visa filter" -knappen i "E4" och direkt stängt fönstret utan någon åtgärd. (G) Parametern för Gaussisk oskärpa ställs in med standardvärdet 2,0. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5: Tröskelinställningar för den andra ramen. (A) Genom att klicka på den nedre förloppsindikatorn får du videofönstret att gå vidare till den andra bildrutan. Flugan återkommer i mitten av skärmen och identifieras av Fiji. Skalstång = 1 cm. (B,C) Visa bearbetningsfönstret före och efter filtrering. (B) Visa det filtrerade bearbetningsfönstret genom att välja det läge som är markerat med en röd rektangel. (C) Ett exempel på ett bearbetningsfönster med en röd rektangel efter att det "filtrerade" läget valdes. Skalstapel = 1 cm. (D) Ställ in tröskelvärdet genom att välja standardtröskelmetoden, "gråskaletröskel", som visas i fönstret "tröskelvärden", efter att ha valt verktyget "set threshold" i figur 3A,4. (E) Justera parametrarna genom att skjuta rutan med förloppsindikatorn i mitten tills spårningsflugan syns och täcks av den röda profilen. Vi rekommenderar inte att du ändrar standardinställningarna för parametrarna i den röda rektangeln nedan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 6: Blobidentifiering, inställning för senaste bildruta och val av djurspårning. A) När det tröskelvärde som anges i figur 5E har uppnåtts visar bearbetningsfönstret en stor röd profil efter flugan i den andra bildrutan. Gör den röda profilen som täcker flugan lämplig för att spåra flugan. Skalstapel = 1 cm. (B) Definiera den röda profiltäckta flugan som mål för spårning genom att välja standardblobdetektormetoden, "basblobdetektor". (C) Ställ in ram 901 som den sista ramen med verktyget "ställ in sista bildruta" i figur 3A,6. Det totala ramnumret beräknas med formeln "ramnummer = fps * inspelningstid". (D) Spårningen flyger med en gul rektangel inramad efter showblobbar i det öppnade videofönstret (vänster panelavsnitt). I den förstorade vänstra panelen är fruktflugor fästa i rött (höger panelsektion). Skalstång = 1 cm. (E) Spårningsflugan med en röd rektangel boxad efter att ha klickat för att välja den röda rektangeln i "D" (övre panelsektionen). Vid förstoring av övre panelen fästs fruktflugor i rött (nedre panelsektionen). Se till att valet av en gul rektangel runt en spårningsfluga är klar i det öppnade videofönstret. Slutför valet i det öppnade videofönstret, och flugan kommer att identifieras av Fiji i alla ramar. Skalstång = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 7: Resultat av spårningsspårning. Spårningsspårningen visas separat i det öppnade videofönstret ( A) och bearbetningsfönstret (B). För att få spårningsspårningsprofilen, klicka på förloppsindikatorn i det ursprungliga videofönstret och skjut förloppsindikatorn för att kontrollera spårningens kontinuitet. Spårningsspåret visar flugornas krypavstånd intuitivt. Skalstång = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 8: Spåra filanalys med hjälp av AnimalTracker-plugin-programmen. (A) Spårningsanalysatorn underlättar en detaljerad analys av spårningsfilen; Varje steg markerat med en röd rektangel betecknas med ett nummer. (B) Ställ in parametrarna för "zoninställningar" i A,4. Fyra parametrar, tid, avstånd, immobilitetstid och hastighetsvektor, visas i den röda rektangeln. Parametern väljs baserat på önskat resultat. (C-G) Ställ in konfigurationsparametrarna individuellt i fönstret "set parameters" i A,5. (C) Fyra justerbara parametrar illustreras i fönstret "config parameters settings", (D-G) som visar fönstren "time settings", "immobility time setting", "distance settings" respektive "velocity vector setting". Vi rekommenderar inte att du ändrar standardvärdet för parameterinställningarna. För "ramintervallet" bör parametern beräknas med formeln "ramintervall = 1 / fps" när bildens fps ändras. Dessutom är det möjligt att använda en känd skala för att fastställa det faktiska avståndet och hastigheten genom att korrelera de pixlar som registrerats med spårningen av en fluga till ett konkret värde. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 9: Resultat som visar analys av spårningsfiler. a) Inställningen av figur 8A,6. Två lägen för att visa data är tillgängliga: "grupperade efter zoner" och "grupperade efter parametrar". (B) Resultaten av analysen av spårningsfilen visas som "grupperade efter zoner" i "A,6.1". (C-F) Resultaten av spårningsfilanalys visas som "grupperade efter parametrar" i A, 6.2, som uppvisar "immobilitetstid" (C), "hastighetsvektor" (D), "tid" (E) och "avstånd" (F) separat. Resultaten av immobilitetstiden och avståndet kvantifieras som "s" och "pixlar". Enheten för hastighetsvektorn ska definieras som "pixel/s" och matas ut med anteckningen "längd". Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Resultat av dataanalysen för hastighet per fps. (A, C och E) Exportdata innehåller koordinater för pixlar i horisontella (kolumn "C") och vertikala (kolumn "D") partitioner, samt rörelse av pixlar, immobilitet och riktningsändringsvinkel mellan två bildruteintervall (kolumn "E" i A, C respektive E), som beräknas automatiskt med formeln som beskrivs i sammanhanget. Eftersom resultaten som exporteras från Fiji är textdokument rekommenderar vi att du öppnar filen med Microsoft Office Excel och delar upp data i tre kolumner genom att lägga till mellanslag mellan dem. (B, D och F) Ett linjediagram visar de beräknade resultaten från datauppsättningen för rörelsen av pixlar (B). Det globala toppvärdet representerar hastigheten, vilket indikerar rörelsedetekteringskapaciteten; Stapeldiagrammet visar de beräknade resultaten från datauppsättningen för immobilitet (D). Graden av gleshet i kolumndiagrammet representerar orörligheten, som uppvisar flygans motoriska defekt; ett punktdiagram visar de beräknade resultaten från datauppsättningen för riktningsändringsvinkeln (F). Anrikningen av stänk som visas i spridningsdiagrammet representerar den riktning som flugan väljer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: En jämförande analys av rörelser mellan flugor behandlade med eller utan rotenon. (A) Representativa diagram över spårningsspåren av vuxna W1118-flugor som utfodrats med standardfoder som innehåller 500 μM rotenon, eller DMSO för kontroll, visas. W1118-flugor samlades in och placerades sedan i en kontrollerad miljö bestående av standardmat med 500 μM rotenon eller DMSO, 25 °C och 60% luftfuktighet. Sex flugor användes för analys från varje grupp efter 48 timmar. Resultatet visar att rörelseavståndet för att spåra flugor som matas med rotenon minskar signifikant jämfört med kontrollen. Resultatet visade en defekt motorisk förmåga hos flugor som matades med rotenon. (B–E) Kvantitativ analys av rotenonbehandlingen på det genomsnittliga avståndet, immobilitetstiden, medelhastigheten och maximal hastighet utförs med hjälp av Fiji. Resultaten av rotenonbehandlingen visade en signifikant minskning av det tillryggalagda avståndet och medelhastigheten och en signifikant ökning av immobilitetstiden. (F-K) Analys av pixlar per bildruta (F,G), immobilitetstid per bildruta (H,I) och riktningsvinkelförändringar (J,K) mellan flugor behandlade med rotenon (G,I,K) eller DMSO (F,H,J). Exempeldiagram som illustrerar effekterna av rotenon på rörelsehastigheten visar färre toppar som representerar rörelsehastigheten per bildintervall hos flugor som matas med rotenon (G) jämfört med de i kontrollen (F), vilket indikerar svårighetsgraden av rörelseaktivitetsdefekten (F,G). Den intuitionistiska immobilitetskolumnen med flyttade pixlar per bildruta är lägre och visar betydligt mindre rörelse inom 1 min för rotenonmatade flugor (I) jämfört med kontrollflugorna (H). Exempel på diagram över rörelsevinkeln för riktningsförändringar hos rotenonmatade (K) och kontrolldjur (J) avslöjar förändringar i den riktning som flugor väljer. Data är medelvärdet ± SEM för sex hanflugor som övervakas i 1 min. Asterisker indikerar signifikanta skillnader mellan grupper (***p < 0,001; oparat t-test, p = 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12: En jämförande analys av rörelsen mellan larver behandlade med eller utan rotenon. (A) Representativa resultat av jämförelsen av rörelseaktivitet genom spårning av spåren av W1118 tredje instar larver som matats med rotenon eller DMSO. I korthet samlades W1118 tredje instarlarver in och odlades i 10 % sackaros, eller 10 % sackaros innehållande 500 μM rotenon, i en 25 °C miljö med 60 % luftfuktighet. Sex larver per grupp användes för analys. Med hänsyn till larvernas långsamma rörelse har datainspelningen under en period av 5 minuter kvantifierats och analyserats för att utvärdera effekterna av rotenon på rörelse. (B–E) Det genomsnittliga avståndet, immobilitetstiden, medelhastigheten och maxhastigheten för de två grupperna som analyseras i Fiji analyseras kvantitativt. De kvantitativa resultaten visar att rörelseavståndet, medelhastigheten och maxhastigheten signifikant minskar hos larver som matas med rotenon, och immobilitetstiden ökar signifikant hos larver som matas med rotenon. (F-K) I likhet med vuxna flugor visade analys av pixlar per bildruta, orörlighetstid och riktningsvinkelförändringar mellan flugor behandlade med rotenon (G, I, K) och utan rotenon (F, H, J) att larver behandlade med rotenon hade lägre rörelsehastighet, mer orörlighetstid och växlade sina riktningar. Resultaten visar att beteenderörelsen hos spårningslarver som matas med rotenon är signifikant försämrad jämfört med kontrollen. Resultaten visar en defekt lokomotorisk aktivitet hos flugor som matas med rotenon. Data är medelvärdet ± SEM för sex 3-dagars gamla larver som övervakas i 5 minuter. Asterisker indikerar en signifikant skillnad mellan grupper (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; oparad t-test, p = 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Jämförelse av djurspårningsbaserade metoder för kvantifiering av den rörelseiska aktiviteten hos Drosophila. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utformat en metod, baserad på materialet AnimalTracker API med öppen källkod som är kompatibelt med Fijis bildbehandlingsprogram, som kan göra det möjligt för forskare att systematiskt utvärdera rörelseaktivitet genom att spåra både vuxna och enskilda larvflugor. AnimalTracke är ett verktyg skrivet i Java som enkelt kan integreras i befintliga databaser eller andra verktyg för att underlätta analysen av applikationsdesignat djurspårningsbeteende24. Efter en ram-för-ram-analys med en mjukvaruberäkningsformel som kvantifierar den lokomotoriska aktiviteten hos vuxna och larver kan flera parametrar, inklusive rörelsehastighet, körd sträcka, orörlighet och riktningsvinkelförändringar analyseras flexibelt. Dessa parametrar, som representerar olika aspekter av beteendemässig rörelse, kan plottas för att illustrera rörelseförändringar över tiden. Dessutom, genom att skapa ett grafiskt användargränssnitt, tillhandahålla detaljerad dokumentation om dess användning och ett applikationsprogrammeringsgränssnitt, strävar vi efter att göra denna metod tillgänglig för forskare som saknar programmeringserfarenhet och erfarna användare som skapar anpassade experimentella paradigmer.
För att verifiera att metoden exakt kan övervaka beteendet har lokomotorisk testning av vuxna flugor och larver behandlade med rotenon, samt en jämförelse av deras motoriska aktivitet med kontrollflugor som matas med läkemedlets lösningsmedel, utförts. Fiji-programvaran, med sina plugins, används för att analysera pixelkoordinaterna för varje ram i videoinspelningen av rörelsen, vilket möjliggör beräkning av hastighet, avstånd och andra parametrar för experimentflugorna. Vi observerade en signifikant minskning av tillryggalagd sträcka över tid vid administrering av rotenon (figur 11), vilket överensstämmer med rapporterade resultat23. Under tiden har den stigande rörelsehastigheten och den onormala riktningen observerats i läkemedelsmatade grupper för att illustrera mer detaljer om beteendebristen hos flugor. Med tanke på framgången med att upptäcka vuxna flugors rörelseaktivitet försökte vi sedan utvärdera larvernas rörlighet (figur 12). Jämfört med kontrollen försämrades resultaten av spårningslarverna som matades med rotenon signifikant, parallellt med vuxna flugor som matades med droger. Experiment med vuxna och larver som matas med rotenon tyder på att denna metod exakt kan registrera minskningen av flugor som producerade rörelseunderskott jämfört med kontroller. Denna rapport har framgångsrikt demonstrerat tillämpningar av den nuvarande metoden för att kvantifiera och analysera rörelseförmåga och andra aspekter av beteendefel hos bananflugor i testmodeller eller farmakologisk forskning på djur.
För att säkerställa att video- och spårningsanalysen ger framgångsrika och reproducerbara resultat rekommenderar vi att du följer följande riktlinjer. För det första, för valet av videoramhastighet, rekommenderar vi att du konverterar den inspelade videon till ett format på 15 bilder per sekund (fps). Detta kan inte bara upprätthålla god rörelsespårning, utan också undvika långsamheten i datoranalys orsakad av stora mängder data. Genom att förbättra videobildhastigheten blir rörelsebaneanalysen mer detaljerad. För det andra kan parametrarna i formeln också justeras för att passa motsvarande experimentella schema vid analys av den statiska rörelsen mellan varannan ram. För larvrörelseövervakning är det viktigt att använda kiselgel snarare än agar, eftersom den stelnade kiselgelen är tät och larverna inte kan komma in i den. Dessutom är kiselgel transparent och kan färgas genom att tillsätta färgämne för att producera optimal bakgrund, vilket underlättar önskade optiska effekter som förbättrar bildkvaliteten.
Djurspårningssystem utvecklas för att tillhandahålla omfattande lösningar för etiologi, neurovetenskap och beteendegenetik. Tabell 1 ger en jämförelse av funktionerna i flera spårningsprogram som för närvarande finns tillgängliga 10,11,12,16,17,25,26. Detta tillvägagångssätt är extremt kostnadseffektivt, enkelt att lära sig och exakt vid mätning av lokomotoriskt beteende utan att kräva kostsam programvara och utrustning. Det råder ingen tvekan om att denna metod bekvämt kan utvidgas till andra Drosophila-liknande djurmodeller, och även till större djur som råttor och möss. Strukturen för AnimalTracker API kan enkelt utökas genom oberoende ImageJ-applikationer eller plugins, som erbjuder ett brett utbud av användbara verktygslådor för anpassad beteendeforskning och analys24. Ändå har denna studie vissa begränsningar. Eftersom en enda fluga placeras i en öppen fältarena för bildinspelning och videospårning utförs individuellt är denna metod ineffektiv och tidskrävande. Vi har försökt utöka kapaciteten för inspelning av flera arenor samtidigt, vilket möjliggör upp till sex individuella inspelningar. Det är teoretiskt möjligt att registrera ett större antal Drosophila samtidigt; Detta beror på arenans storlek och kamerans konfiguration. Alternativt, om användare vill utvidga till att registrera grupperad Drosophila, rekommenderas det att överväga det begränsade antalet enskilda poster och en konfiguration av tillräcklig kvalitet för att identifiera kollisioner och överlappningar mellan flugorna. Förbättringar av testeffektiviteten genom maskininlärning beaktades inte i studien, eftersom ett prisvärt och kompatibelt tillvägagångssätt inte har räknats ut som kan integreras med det nuvarande systemet för att visuellt skilja identiteter och spåra modeller exakt.
Sammanfattningsvis utvecklar och validerar metoden som beskrivs här ett effektivt och enkelt tillvägagångssätt baserat på fri programvara med öppen källkod, utformad för att minska tidsåtgången och förfina experimentella tekniker för kvantitativ indikering och analys av Drosophila locomotion i larverna och vuxna stadier. Genom systematisk analys kan denna metod hjälpa oss att förstå hur djurets hastighet förändras över tid under rörelse, liksom egenskaperna hos riktningsval. Således ger införlivandet av programvara med öppen källkod i vanliga digitala enheter ett tillförlitligt sätt att testa lokomotorisk aktivitet i olika flugmodeller. Detta kan vara användbart för att utvärdera fysiologiska och patologiska rörelseutgångar vid testning av neurodegenerativa sjukdomsmodeller härledda från farmakologisk behandling och transgen modifiering hos Drosophila såväl som andra djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en särskild lanseringsfond från Soochow University och National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). Vi tackar professor Chunfeng Lius labbmedlemmar för deras diskussion och kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
