Summary
Den nåværende protokollen vurderer den lokomotoriske aktiviteten til Drosophila ved å spore og analysere bevegelsen av fluer i en håndlaget arena ved hjelp av åpen kildekode-programvare Fiji, kompatibel med plugins for å segmentere piksler i hver ramme basert på HD-videoopptak for å beregne parametere for hastighet, avstand, etc.
Abstract
Drosophila melanogaster er en ideell modellorganisme for å studere ulike sykdommer på grunn av sin overflod av avanserte genetiske manipulasjonsteknikker og ulike atferdsegenskaper. Identifisering av atferdsmangel i dyremodeller er et avgjørende mål på sykdommens alvorlighetsgrad, for eksempel i nevrodegenerative sykdommer der pasienter ofte opplever nedsatt motorisk funksjon. Men med tilgjengeligheten av ulike systemer for å spore og vurdere motoriske underskudd i fluemodeller, for eksempel narkotikabehandlede eller transgene individer, mangler det fortsatt et økonomisk og brukervennlig system for presis evaluering fra flere vinkler. En metode basert på AnimalTracker applikasjonsprogrammeringsgrensesnitt (API) er utviklet her, som er kompatibel med Fiji bildebehandlingsprogram, for systematisk å evaluere bevegelsesaktivitetene til både voksne og larveindivider fra innspilt video, og dermed muliggjøre analyse av deres sporingsadferd. Denne metoden krever bare et HD-kamera og en perifer maskinvareintegrasjon for å registrere og analysere atferd, noe som gjør det til en rimelig og effektiv tilnærming for screening av fluemodeller med transgene eller miljømessige atferdsmangler. Eksempler på atferdstester ved bruk av farmakologisk behandlede fluer er gitt for å vise hvordan teknikkene kan oppdage atferdsendringer hos både voksne fluer og larver på en svært repeterbar måte.
Introduction
Drosophila melanogaster gir en utmerket modellorganisme for å undersøke cellulære og molekylære funksjoner i nevronale sykdomsmodeller opprettet av genmodifisering1, medikamentell behandling2 og senescens3. Den høye bevaringen av biologiske veier, fysiske egenskaper og sykdomsassosierte homologgener mellom mennesker og Drosophila gjør fruktfluen til en ideell etterligning fra molekylært til atferdsnivå4. I mange sykdomsmodeller er atferdsmangel en viktig indeks, og gir en nyttig modell for ulike menneskelige nevropatier 5,6. Drosophila brukes nå til å studere flere menneskelige sykdommer, nevroutvikling og nevrodegenerative sykdommer som Parkinsons sykdom og amyotrofisk lateralsklerose 7,8. Påvisning av sykdomsmodellenes motoriske evne er avgjørende for å forstå den patogene utviklingen og kan gi en fenotypisk korrelasjon til de molekylære mekanismene som ligger til grunn for sykdomsprosessen.
Nylig har kommersielt tilgjengelige programvareverktøy og kostnadseffektive programmer blitt utviklet for Drosophila lokomotoriske deteksjonsstrategier, for eksempel testing med høy gjennomstrømning i grupperte fluer9,10 og måling av bevegelse i sanntid11,12. En slik konvensjonell tilnærming er rapid interactive negative geotaxis (RING), også kalt klatreanalysen, som inkluderer flere kanaler som gjør det mulig å inneholde en stor fluepopulasjon med samme kjønn og alder, noe som reduserer variasjonen mens data samlerinn 9,13. En annen pre-testing metode for å analysere lokomotorisk oppførsel er TriKinetics Drosophila aktivitet monitor (DAM), en enhet som bruker flere stråler for å oppdage fly aktivitet bevegelse i et tynt glassrør 14. Enheten registrerer posisjon kontinuerlig, noe som representerer automatisert bevegelse ved å beregne stråleovergangene for å studere aktiviteten og døgnrytmen til fluer over en lengre periode15. Selv om disse metodene har blitt mye brukt i å analysere atferdsdefekter i fruktfluer for å bestemme endringer i atferdsbevegelse, krever de alltid spesielt testutstyr eller komplekse analyseprosesser, og begrenser deres anvendelse i noen modeller med en begrenset, enkel enhet. Gruppebaserte strategier for testing av den voksne Drosophila, som FlyGrAM11 og Drosophila-øyanalysen 10, implementerer sosial rekruttering og individuell sporing i et forhåndsdefinert område. Likevel kan sosial individuell begrensning i trossede områder ha en negativ effekt på identifikasjoner i bildene, forårsaket av kollisjon eller overlapping av fluer. Selv om noen åpen kildekode-materialbaserte metoder, som TRex16, MARGO 12 og FlyPi17, har en nødsituasjon, kan de spore fluene raskt med fleksibel bruk i atferdstesting. Disse testmetodene er knyttet til forseggjorte eksperimentelle apparatinstallasjoner, spesielle programvarekrav eller profesjonelle dataspråk. For larver er måling av total tilbakelagt avstand over antall gittergrenselinjer per tidsenhet18, eller grovtelling av kroppsveggkontraksjonene for individer manuelt19, de dominerende metodene for å vurdere deres lokomotoriske evne. På grunn av mangel på presisjon i utstyr eller enheter og analysemetoder, kan noen atferdsbevegelse av larver unnslippe deteksjon, noe som gjør det vanskelig å nøyaktig vurdere atferdsbevegelse, spesielt fin bevegelse15.
Den nåværende utviklede metoden benytter AnimalTracker applikasjonsprogrammeringsgrensesnitt (API), kompatibelt med Fiji (ImageJ) bildebehandlingsprogram, for systematisk å evaluere den lokomotoriske aktiviteten til både voksne og larvefluer ved å analysere deres sporingsadferd fra HD-videoer (HD). Fiji er en åpen kildekode-programvare ImageJ-distribusjon som kan kombinere robuste programvarebiblioteker med mange skriptspråk, noe som resulterer i rask prototyping av bildebehandlingsalgoritmer, noe som gjør den populær blant biologer for sine bildeanalysemuligheter20. I den nåværende tilnærmingen utnyttes Fijis integrering i AnimalTracker API til å utvikle en unik Drosophila-atferdsanalyse med personlig algoritmeinnsetting, og gir et nyttig trinn for detaljert dokumentasjon og opplæringsprogrammer for å støtte robuste analytiske evner for lokomotorisk oppførsel (figur 1). For å omgå komplikasjonen av objektive identifikasjoner i bildene forårsaket av kollisjon eller overlapping av fluer, er hver arena begrenset til å være vert for bare en flue. Ved vurdering av sporingspresisjonen til tilnærmingen ble det implementert for å spore og kvantifisere de lokomotoriske bevegelsene til Drosophila som ble administrert med det giftige stoffet rotenon, som vanligvis brukes til dyremodeller av Parkinsons sykdom, og til slutt oppdaget bevegelsessvikt i narkotikabehandlingen21. Denne metoden, som benytter åpen kildekode og fri programvare, krever ikke høykostinstrumentering, og kan nøyaktig og reproduserbart analysere Drosophila atferdsbevegelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
W1118 voksne fluer og tredje instar larver ble brukt til denne studien.
1. Eksperimentell forberedelse
MERK: En åpen arena for Drosophila bevegelsessporing er laget medacolorless og luktfri silikagel.
- Bland reagens A og reagens B i forholdet 1:10, i henhold til produsentens instruksjoner for silikasettet (se materialfortegnelse). Sørg for at natriumbikarbonat tilsettes til blandingen ved omrøring til fargen endres til hvit. Overfør blandingen til en ren petriskål og sett den i en ovn ved 40 °C for tørking i 48 timer.
- Sett HD-kameraet (se Materialfortegnelse) på et stativ, juster det slik at kameralinsen er vinkelrett på overflaten av silikaarenaen. Juster brennvidden og blenderåpningene på kameraet, sørg for at kameraet er fokusert på overflaten av silika og at skjermen er tilstrekkelig opplyst. Det eksperimentelle oppsettet er illustrert i figur 1.
- Overfør en flue til arenaen for å spille inn en kontinuerlig video på minst 61 s.
MERK: Med tanke på larvenes trege natur, anbefales en videoopptakstid på mer enn 10 minutter.- Åpne videoen med Fiji, dra fremdriftslinjen til startbildet, og stilltiende godkjenne. Velg hele fluekroppen ved hjelp av verktøyet "frihåndsvalg" (figur 2B,C).
- Klikk på bildet > juster > lysstyrke og kontrast for å justere hvitbalansen til gråverdien i det merkede området nærmer seg den brede bakgrunnen (figur 2D-F).
MERK: Bakgrunnshomogenisering av den første rammen gjør det mulig for programvaren å skille bakgrunnen uten objekter og skape en kontrast når en flue er til stede, slik at programvaren kan spore den.
- Utfør hele eksperimentet i et testmiljø satt til 25 °C og 60 % relativ fuktighet, i et område som er stille og uten eksponering for sterkt lys.
2. Videoopptak og forhåndsbehandling
- Etter en kort periode med anestesi ved bruk av 95% karbondioksid (CO2), overfør en flue til den åpne arenaen og trykk på opptaksknappen på kameraapplikasjonen for å starte videoopptak.
MERK: For å minimere effekten av bedøvelsen på bevegelse, la fluene komme seg i 10 minutter før du starter videoopptak. Cool-bedøvelse ved kjøling anbefales også.- Når fluene kommer seg etter narkosen, legger du arenafatet som inneholder flua under kameraet og rister platen raskt fra side til side for å sikre at flua er i bevegelse når opptaket begynner.
- Når opptaket er fullført, trykker du på stoppknappen for å avslutte videoopptaket.
MERK: Forsikre deg om at videoopptakstiden litt overstiger destinasjonssporingstiden med en liten margin. I tillegg, for å forbedre eksperimentell effektivitet, er det mulig å spore flere fluer spontant. Dette avhenger av kameraets oppløsning for å muliggjøre en videoavling av høy kvalitet. - Konverter de innspilte videoene til AVI-format med MJPEG-koding, slik at de kan åpnes og analyseres ved hjelp av Fiji. I mellomtiden setter du rammene per sekund (fps) på videoen til 15 fps for voksne fluer og 12 fps for larver.
3. Videoanalyse
- Åpne videoen som har blitt transformert med "bruk virtuell stabel" og "konverter til gråtoner", to alternativer i popup-vinduet når du åpner videoen med Fiji (figur 2A).
- Lag en tom første ramme, som nevnt ovenfor.
- Få et behandlingsvindu ved å bruke "set active image"-verktøyet i AnimalTracker-pluginen og opprett et sporingsområde som sirkler arenaen i det originale videovinduet ved hjelp av det "ovale" verktøyet (figur 3A).
- Still inn filtrene (figur 3A,3) og parametrene for de to filtrene (figur 4A-G) for den første tomme rammen i behandlingsvinduet. Velg deretter neste ramme i det opprinnelige videovinduet, og velg den filtrerte overflaten til behandlingsvinduet (figur 5A-C).
MERK: Filtreringstrinnet tjener til å redusere bildestøy og / eller fjerne bakgrunnen, noe som gjør det enklere å skille forgrunnen fra bakgrunnen i binariseringen av rammene. - Når et filtrert behandlingsvindu er valgt, snur du den sporede fluen med en rød profil dekket i behandlingsvinduet ved å bruke verktøyet "angi terskel" (figur 3A, 4, figur 5D-E og figur 6A).
- Bruk "set blob-detector" for å la datamaskinen gjenkjenne fluen med en rød profil dekket i behandlingsvinduet (figur 3A, 5 og figur 6B).
- Sett ramme 901 som det siste bildet for den voksne fluen, beregnet ut fra videoens opptaksvarighet og fps (figur 3A,6, figur 6C).
MERK: Følgende forsøk med larver har blitt sporet i 10 min, så ramme 7200 er satt som siste bilde. - Bruk «vis blober»-verktøyet til å presentere et sporingsrektangel i det opprinnelige videovinduet (figur 3A,7 og figur 6D,E). Start deretter sporingen og eksporter sporingsfilen etter at overvåkingen er fullført (figur 3A,8,9 og figur 7A,B).
4. Analyse av sporingsfiler
- Last inn sporings- og sonefilene ved hjelp av programtillegget Animal tracker > Tracking analyzer (figur 8A).
- Velg ønsket indeks ved hjelp av soneinnstillinger og endre parameterinnstillingene (figur 8). Beregn tiden for rammeintervallet ved hjelp av bildefrekvensen.
MERK: I denne tilstanden er bildefrekvensen 15 fps, og rammeintervallet er omtrent 0.067 s, som er standardinnstillingen (figur 8D). - Produser de kvantitative analysediagrammene ved hjelp av regnearkprogramvaren og GraphPad Prism etter å ha blitt analysert i sporingsanalysator (figur 9).
5. Analyse per ramme
- Utfør hastighetsanalyse per rammeintervall. Analyser sporfilen uten Fiji hvis mer detaljert forskning er nødvendig.
- Åpne sporfilen, kopier alle koordinatene til Microsoft Office Excel, og del cellene ved hjelp av mellomromstasten.
MERK: For eksempel, når filen er delt inn i "C" og "D" kolonner, beregnes hastigheten til Drosophila per rammeintervall med formelen SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), som vises i "E" -kolonnen (figur 10A). Dataene i kolonne "E" indikerer antall piksler som fluen flyttet mellom to rammer, med den første rammen ikke vurdert. Velg alle beregnede resultater og sett inn et linjediagram for å vise en intuitiv glibevegelseshastighet per rammeintervall, med en topp på linjediagrammet (figur 10B).
- Åpne sporfilen, kopier alle koordinatene til Microsoft Office Excel, og del cellene ved hjelp av mellomromstasten.
- Beregn immobilitetstiden per rammeintervall. Etter at filen er delt inn i "C" og "D" kolonner, beregner du immobilitetsstatusen til Drosophila per rammeintervall ved hjelp av formelen HVIS(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), som vises i "E" -kolonnen. (Figur 10C).
MERK: I motsetning til hastighetsanalyse ble resultatene av det første bildet definert. Fluer som beveget seg færre enn 20 piksler ble ansett som immobile og registrert som "0" i kolonne "E".- Velg alle beregnede resultater og sett inn et stolpediagram for visuelt å vise immobilitetstiden med margen på hele kolonnediagrammet (figur 10D).
- Kontroller at retningsvinkelen endres.
MERK: Vinkelen på retningsendringsanalysen representerer fluenes retningsvalg. Når filen er delt inn i "C" og "D" kolonner, beregnes retningsendringsvinkelen med formelen ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), som presenteres i kolonnen "E" (figur 10E). De beregnede resultatene angir vinkelen mellom tre koordinater.- Velg alle beregnede resultater og sett inn et punktdiagram for å illustrere vinkelen for retningsendring av fluenes bevegelse (figur 10F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien ble lokomotoriske underskudd hos voksne fluer og tredje instar larver behandlet med rotenon undersøkt og sammenlignet i motorisk aktivitet med en kontrollflue matet med medikamentet løsningsmidlet dimetylsulfoksid (DMSO). Behandling med rotenon i Drosophila har vist seg å forårsake dopaminergt nevrontap i hjernen22 og føre til betydelige lokomotoriske utfall23. Som vist i figur 11 og figur 12 har voksne fluer og tredje instar larver behandlet med rotenon signifikante lokomotoriske utfall sammenlignet med kontrollfluer fôret med DMSO. Figur 11 og figur 12B-E illustrerer de relative endringene i avstand, hastighet og immobilitetstid for bevegelsesparametere mellom fluer behandlet med eller uten rotenon. Figur 11 og figur 12F-K illustrerer en representativ analyse av parametrene hastighet, immobilitetstid og retningsvalg, med eller uten rotenonbehandling hos voksne og larver. Kvantitativ analyse av parametrene for avstand, immobilitetstid og hastighet ved hjelp av Fiji-programvare hos voksne fluer (figur 11) og tredje stjernelarver (figur 12) i legemiddelfôringsgruppene validerer videre at behandling med rotenon kan brukes til å undersøke lokomotoriske underskudd i menneskelige sykdommer, inkludert nevrodegenerative tilstander, og replikere noen av atferdsegenskapene observert hos mennesker og pattedyr.
Figur 1: Flytskjema som beskriver utstyrsoppsettet og eksperimentell prosedyre for Drosophila-bevegelsessporingsanalyse . Den lokomotoriske sporingsarenaen er avbildet med et overhead HD-kamera som er innlemmet i og kontrollert av en datamaskin. Prosedyren for å analysere bevegelsen til Drosophila består av videoopptak, bevegelsessporing, sporingsfilanalyse, databehandling og parametrisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bakgrunnshomogenisering av det første bildet. (A) Merk av for "konverter til gråtoner" mens du åpner den transformerte videoen, for å transformere videoen til gråtoner og unngå forstyrrelser av farger. (B) Disposisjon Drosophila ved hjelp av "frihåndsvalg" verktøyet, vist i den røde boksen. (C) Som analysevalg ble en gul linje benyttet for å avgrense fluenes konturer. Å holde den gule linjen nær konturene til flua reduserer sannsynligheten for å velge et område som ikke er okkupert av flua. Skalalinje = 1 cm. (D) Juster lysstyrken og kontrasten for det første bildet til området som er pakket inn i gult, endres til samme gråtoner som bakgrunnen. (E) Fullfør lysstyrke- og kontrastjusteringen for den første rammen, men ikke for alle rammer, ved å klikke på "Nei" i "stabel" -vinduet. (F) Til slutt justeres det første bildet for å skape en jevn og plettfri bakgrunn. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Innstillinger for sporingsvindu og sporingssone. (A) Fullfør sporingsanalysen ved å klikke på sporingspluginene i rekkefølgen merket i dyresporingsvinduet. (B) Etter å ha satt det aktive bildet i figur A, 1, presenteres et behandlingsvindu som bare viser gjeldende ramme. Det primære videovinduet og behandlingsvinduet er tydelig skilt ut og brukes i forskjellige situasjoner. For å endre gjeldende ramme, sørg for at endringen utføres i det primære videovinduet; Endringen vil være synlig i begge vinduene. Skala bar = 1 cm. (C) Opprett et sporingsområde som sirkler arenaen, ved hjelp av det "ovale" verktøyet for datamaskingjenkjenning. Valget av sporingssone må være i en sirkelarena i et åpent videovindu, og ikke i et behandlingsvindu. (D) Skissere et sporingsområde med de gule linjene for å passe arenaen i størst mulig grad, for å minimere forstyrrelsen av eksternt lys. Skalalinje = 1 cm. (E ) For å angi interesseområdet (ROI) i sporingsområdet, klikk på knappene etter rekkefølgen merket med tallene som vises i "soneutforming"-vinduet. I dette trinnet må hele operasjonen fullføres etter at det valgte videovinduet åpnes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Filterinnstilling for det første delbildet. (A) Ved å fullføre innstillingen av avkastningen for sporingsområdet, endres den gule linjen som omkranser arenaen til grønn i både det åpne videovinduet og behandlingsvinduet. Skalalinje = 1 cm. (B) Hvis du legger til formålet med filtre, angis en svart bakgrunn for å gjøre målobjektet tydeligere for det første bildet i behandlingsvinduet. Hele operasjonen bør utføres i et behandlingsvindu, i stedet for et åpent videovindu. (C,D) Hvis du legger til filtrene "bakgrunnssubtraktor" og "Gaussisk uskarphet" i vinduet "filterinnstillinger", blir den første rammen i behandlingsvinduet svart. Hele filterinnstillingsprosessen må fullføres i den første rammen. (E) Parametrene settes trinn for trinn ved å klikke på knapper merket med et tall og et rødt rektangel i vinduet "bakgrunnssubtraktor". Trinnet "sett bilde" må betjenes etter at behandlingsvinduet er valgt. (F) Skalastang = 1 cm. Vinduet "medianbilde" vises etter å ha klikket på "vis filter" -knappen i "E4" og lukket vinduet direkte uten operasjon. (G) Parameteren for Gaussisk uskarphet er satt med en standard sigmaverdi på 2,0. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Terskelinnstillinger for det andre bildet. (A) Ved å klikke på den nedre fremdriftslinjen, gjør videovinduet videre til den andre rammen. Flua går igjen midt på skjermen og identifiseres av Fiji. Skalastang = 1 cm. (B,C) Vis behandlingsvinduet før og etter filtrering. (B) Vis det filtrerte behandlingsvinduet ved å velge modusen som er merket med et rødt rektangel. (C) Et eksempel på et behandlingsvindu med et rødt rektangel etter at "filtrert" -modus ble valgt. Skalalinje = 1 cm. (D) Angi terskelen ved å velge standard terskelmetode, "gråtoneterskeler", vist i vinduet "terskler", etter å ha valgt verktøyet "angi terskel" i figur 3A,4. (E) Juster parametrene ved å skyve fremdriftslinjeboksen i midten til sporingsflyet er sett og dekket av den røde profilen. Det anbefales ikke å endre standardinnstillingene for parametrene som er bokset i det røde rektangelet nedenfor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Blob-detektor, siste rammeinnstilling og valg av dyresporing. (A) Når terskelen som er angitt i figur 5E, viser behandlingsvinduet en betydelig rød profil etter fluen i den andre rammen. Få den røde profilen som dekker flua til å passe for å spore flua. Skalastang = 1 cm. (B) Definer den røde profildekkede fluen som mål for sporing ved å velge standard blob-detektormetode, "base blob detector". (C) Sett ramme 901 som den siste rammen ved hjelp av verktøyet "sett siste ramme" i figur 3A, 6. Det totale rammenummeret beregnes med formelen "rammenummer = fps * opptakstid". (D) Sporingen flyr med et gult rektangel i boks etter visningsblobber i det åpne videovinduet (venstre paneldel). I det forstørrede venstre panelet er bananfluer festet i rødt (høyre panelseksjon). Skala bar = 1 cm. ( E) Sporingsfluen med et rødt rektangel bokset etter å ha klikket for å velge det røde rektangelet i "D" (øvre panelseksjon). I den øvre panelforstørrelsen er bananfluer festet i rødt (nederste panelseksjon). Forsikre deg om at valget av et gult rektangel rundt en sporingsfly er fullført i det åpne videovinduet. Fullfør valget i det åpne videovinduet, og flyet vil bli identifisert av Fiji i alle rammer. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Resultater av sporingsspor. Sporingssporingen vises separat i det åpne videovinduet ( A) og behandlingsvinduet (B). For å få sporingssporingsprofilen, klikk på fremdriftslinjen i det opprinnelige videovinduet og skyv fremdriftslinjen for å kontrollere kontinuiteten til sporingen. Sporingssporet presenterer krypeavstanden til fluene intuitivt. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Sporing av filanalyse ved hjelp av AnimalTracker-plugins. (A) Sporingsanalysatoren muliggjør en detaljert analyse av sporingsfilen; Hvert trinn merket med et rødt rektangel er betegnet med et tall. (B) Angi parametrene for "soneinnstillinger" i A,4. Fire parametere, tid, avstand, immobilitetstid og hastighetsvektor, vises i det røde rektangelet. Parameteren velges basert på ønsket resultat. (VG Nett) Angi konfigurasjonsparametrene individuelt i vinduet "angi parametere" på A,5. (C) Fire justerbare parametere er illustrert i vinduet "config parameters settings", (D-G) som viser henholdsvis vinduene "time settings", "immobility time setting", "distance settings" og "velocity vector setting". Det anbefales ikke å endre standardverdien for parameterinnstillingene. For "rammeintervallet" skal parameteren imidlertid beregnes ved hjelp av formelen "rammeintervall = 1 / fps" når fps på videoen endres. I tillegg er det mulig å bruke en kjent skala for å fastslå den faktiske avstanden og hastigheten ved å korrelere pikslene som er registrert med sporing av en flue til en konkret verdi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Resultat som viser sporingsfilanalyse. (A) Innstillingen av figur 8A,6. To moduser for å vise dataene er tilgjengelige: "gruppert etter soner" og "gruppert etter parametere". (B) Resultatene av sporingsfilanalysen vises som "gruppert etter soner" i "A,6.1". (VG Nett) Resultatene av sporingsfilanalyse vises som "gruppert etter parametere" i A, 6.2, som viser "immobilitetstid" (C), "hastighetsvektor" (D), "tid" (E) og "avstand" (F) separat. Resultatene av immobilitetstid og avstand kvantifiseres som "s" og "piksler". Enheten for hastighetsvektoren skal defineres som "piksel / s", og utgang med merknaden "lengde". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Resultater av dataanalysen for hastighet per fps. (A, C og E) Eksportdataene inneholder koordinater for piksler i horisontale (kolonne "C") og vertikale (kolonne "D") partisjoner, samt bevegelse av piksler, ubevegelighet og retningsendringsvinkel mellom tobildeintervaller (kolonne "E" i henholdsvis A, C og E), som automatisk beregnes av formelen som er beskrevet i konteksten. Siden resultatene som eksporteres fra Fiji er tekstdokumenter, anbefales det å åpne filen med Microsoft Office Excel og dele dataene inn i tre kolonner ved å legge til mellomrom mellom dem. (B, D og F) Et linjediagram viser de beregnede resultatene fra datasettet for bevegelsen av piksler (B). Den globale toppverdien representerer hastigheten, noe som indikerer bevegelsesdeteksjonsfunksjonene; det stående stolpediagrammet viser de beregnede resultatene fra datasettet for immobilitet (D). Graden av sparsitet i kolonnediagrammet representerer immobiliteten, som viser den motoriske evnefeilen til fluer; et punktdiagram viser de beregnede resultatene fra datasettet for retningsendringsvinkelen (F). Anrikningen av sprut vist i punktdiagrammet representerer retningen valgt av fluen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: En komparativ analyse av bevegelse mellom fluer behandlet med eller uten rotenon. (A) Representative grafer over sporingssporet av W1118 voksne fluer fôret med standard mat inneholdende 500 μM rotenon, eller DMSO for kontroll, er vist. W1118 fluer ble samlet inn og deretter plassert i et kontrollert miljø bestående av standard mat med 500 μM rotenon eller DMSO, 25 °C og 60 % luftfuktighet. Seks fluer ble brukt til analyse fra hver gruppe etter 48 timer. Resultatet viser at bevegelsesavstanden til sporingsfluer matet med rotenon er betydelig redusert sammenlignet med kontrollen. Resultatet viste en defekt motorisk evne hos fluer matet med rotenon. (VG Nett) Kvantitativ analyse av rotenonbehandlingen på gjennomsnittlig tilbakelagt avstand, immobilitetstid, gjennomsnittshastighet og maksimal hastighet utføres ved bruk av Fiji. Resultatene av rotenonbehandlingen viste en signifikant reduksjon i tilbakelagt avstand og gjennomsnittlig hastighet, og en signifikant økning i immobilitetstiden. (VG Nett) Analyse av piksler per bilde (F,G), immobilitetstid per bildebilde (H,I) og retningsvinkelendringer (J,K) mellom fluer behandlet med rotenon (G,I,K) eller DMSO (F,H,J). Eksempelgrafer som illustrerer effekten av rotenon på bevegelseshastigheten, viser færre topper som representerer bevegelseshastigheten per rammeintervall i fluer matet med rotenon (G) sammenlignet med de i kontrollen (F), noe som indikerer alvorlighetsgraden av den lokomotoriske aktivitetsdefekten (F,G). Den intuisjonistiske immobilitetskolonnen med bevegelige piksler per ramme er lavere, og viser betydelig mindre bevegelse innen 1 minutt for rotenonfôrede fluer (I) sammenlignet med kontrollfluene (H). Eksempelgrafer over bevegelsesvinkelen for retningsendringer i rotenonmatede (K) og kontrolldyr (J) avslører endringer i retningen valgt av fluer. Data er gjennomsnittlig SEM ± seks hannfluer overvåket i 1 min. Stjerner indikerer signifikante forskjeller mellom gruppene (***p < 0,001; uparet t-test, p = 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: En komparativ analyse av bevegelsen mellom larver behandlet med og uten rotenon. (A) Representative resultater av sammenligningen av lokomotorisk aktivitet ved å spore sporet av W1118 tredje stjernelarver matet med rotenon eller DMSO. Kort fortalt ble W1118 tredje stjernelarver samlet inn og dyrket i 10 % sukrose, eller 10 % sukrose inneholdende 500 μM rotenon, i et miljø på 25 °C med 60 % fuktighet. Seks larver per gruppe ble brukt til analyse. Med tanke på larvenes langsomme bevegelse har dataregistreringen over et tidsrom på 5 minutter blitt kvantifisert og analysert for å evaluere effekten av rotenon på bevegelse. (VG Nett) Den gjennomsnittlige avstanden, immobilitetstiden, gjennomsnittshastigheten og maksimal hastighet for de to gruppene analysert i Fiji analyseres kvantitativt. De kvantitative resultatene viser at bevegelsesavstanden, gjennomsnittshastigheten og maksimal hastighet reduseres signifikant hos larver som er matet med rotenon, og immobilitetstiden øker betydelig hos larver som er matet med rotenon. (VG Nett) I likhet med voksne fluer viste analyse av piksler per ramme, immobilitetstid og retningsvinkelendringer mellom fluer behandlet med rotenon (G, I, K) og uten rotenon (F, H, J) at larver behandlet med rotenon hadde lavere bevegelseshastighet, mer immobilitetstid og vekslet retning. Resultatene viser at atferdsbevegelsen til sporingslarver matet med rotenon er betydelig svekket sammenlignet med kontrollen. Resultatene viser en defekt lokomotorisk aktivitet av fluer matet med rotenon. Data er gjennomsnittlig SEM ± seks 3 dager gamle larver overvåket i 5 min. Stjerner indikerer en signifikant forskjell mellom gruppene (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; uparet t-test, p = 0,05). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammenligning av dyresporingsbaserte metoder for kvantifisering av bevegelsesaktiviteten i Drosophila. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utviklet en metode, basert på open source-materialet AnimalTracker API som er kompatibelt med Fijis bildebehandlingsprogram, som kan gjøre det mulig for forskere å systematisk evaluere bevegelsesaktivitet ved å spore både voksne og individuelle larvefluer. AnimalTracke er et verktøy skrevet i Java som enkelt kan integreres i eksisterende databaser eller andre verktøy for å lette analysen av applikasjonsdesignet dyresporingsadferd24. Ved en ramme-for-ramme-analyse ved hjelp av en programvareberegningsformel som kvantifiserer den lokomotoriske aktiviteten til voksne og larver, kan flere parametere, inkludert bevegelseshastighet, tilbakelagt avstand, immobilitet og retningsvinkelendringer analyseres fleksibelt. Disse parametrene, som representerer ulike aspekter av atferdsbevegelse, kan plottes for å illustrere lokomotoriske endringer over tid. I tillegg, ved å lage et grafisk brukergrensesnitt, gi detaljert dokumentasjon om bruken og et applikasjonsprogrammeringsgrensesnitt, tar vi sikte på å gjøre denne metoden tilgjengelig for forskere som mangler programmeringserfaring og erfarne brukere som skaper tilpassede eksperimentelle paradigmer.
For å verifisere at metoden nøyaktig kan overvåke atferd, er det utført lokomotorisk testing av voksne fluer og larver behandlet med rotenon, samt en sammenligning av deres motoriske aktivitet med kontrollfluer matet med stoffets løsningsmiddel. Fiji-programvaren, med sine plugins, brukes til å analysere pikselkoordinatene til hver ramme i videoopptaket av bevegelsen, noe som gjør det mulig å beregne hastigheten, avstanden og andre parametere til eksperimentelle fluer. Vi observerte en signifikant reduksjon i tilbakelagt distanse over tid ved rotenonadministrasjon (figur 11), noe som stemmer overens med rapporterte resultater23. I mellomtiden har den stigende bevegelseshastigheten og den unormale retningen som er valgt, blitt observert i narkotikamatede grupper, for å illustrere flere detaljer om atferdsmangel hos fluer. Gitt suksessen med å oppdage voksne fluers bevegelsesaktivitet, søkte vi deretter å evaluere larvenes mobilitet (figur 12). Sammenlignet med kontrollen var resultatene av sporingslarver matet med rotenon signifikant svekket, parallelt med voksne fluer matet med rusmidler. Eksperimenter med voksne og larver matet med rotenon tyder på at denne metoden nøyaktig kan registrere reduksjonen av fluer som produserte lokomotoriske underskudd sammenlignet med kontroller. Denne rapporten har med hell demonstrert anvendelser av den nåværende metoden for å kvantifisere og analysere lokomotoriske evner og andre fasetter av atferdsdefekter hos fruktfluer i testmodeller eller farmakologisk forskning hos dyr.
For å sikre at video- og sporingsanalysen gir vellykkede og reproduserbare resultater, anbefales det å følge følgende retningslinjer. For det første, for valg av bildefrekvens, anbefaler vi å konvertere den innspilte videoen til et format på 15 bilder per sekund (fps). Dette kan ikke bare opprettholde god bevegelsessporing, men også unngå tregheten i dataanalyse forårsaket av store mengder data. Ved å forbedre videobildefrekvensen blir bevegelsesbaneanalysen mer detaljert. For det andre kan parametrene i formelen også justeres for å passe til det tilsvarende eksperimentelle skjemaet når man analyserer den statiske bevegelsen mellom hver to rammer. For larver lokomotorisk overvåking er det viktig å bruke silikagel i stedet for agar, da den størknede silikagelen er tett og larvene ikke kan komme inn i den. Dessuten er silikagel gjennomsiktig og kan farges ved å tilsette fargestoff for å produsere optimal bakgrunn, noe som letter ønskede optiske effekter som forbedrer bildekvaliteten.
Dyresporingssystemer blir avansert for å gi omfattende løsninger for etiologi, nevrovitenskap og atferdsgenetikk. Tabell 1 gir en sammenligning av funksjonene i flere sporingsprogrammer som for øyeblikket er tilgjengelige: 10,11,12,16,17,25,26. Denne tilnærmingen er ekstremt kostnadseffektiv, enkel å lære og presis når det gjelder å måle lokomotorisk oppførsel, uten å kreve kostbar programvare og utstyr. Det er ingen tvil om at denne metoden enkelt kan utvides til andre Drosophila-lignende dyremodeller, og til og med til større dyr som rotter og mus. Strukturen til AnimalTracker API kan enkelt utvides gjennom uavhengige ImageJ-applikasjoner eller plugins, og tilbyr et bredt utvalg av nyttige verktøysett for tilpasset atferdsforskning og analyse24. Likevel har denne studien visse begrensninger. Siden en enkelt fly er plassert i en åpen arena for bildeopptak og videosporing utføres individuelt, er denne metoden ineffektiv og tidkrevende. Vi har forsøkt å utvide kapasiteten for opptak av flere arenaer samtidig, slik at det åpnes for inntil seks enkeltopptak. Det er teoretisk mulig å registrere et større antall Drosophila samtidig; Dette avhenger av størrelsen på arenaen og konfigurasjonen av kameraet. Alternativt, hvis brukere ønsker å utvide til å registrere gruppert Drosophila, anbefales det å vurdere det begrensede antallet enkeltregistreringer og en konfigurasjon av tilstrekkelig kvalitet til å identifisere kollisjoner og overlappinger mellom fluene. Forbedringer i testeffektiviteten ved maskinlæring ble ikke vurdert i studien, siden en rimelig og kompatibel tilnærming ikke er funnet ut som kan integreres med det nåværende systemet for å visuelt skille identiteter og spore modeller nøyaktig.
Oppsummert utvikler og validerer metoden beskrevet her en effektiv og grei tilnærming basert på gratis programvare med åpen kildekode, designet for å redusere tidsforbruket og forbedre eksperimentelle teknikker for kvantitativt å indikere og analysere Drosophila-bevegelse i larver og voksne stadier. Gjennom systematisk analyse kan denne metoden hjelpe oss å forstå hvordan dyrets hastighet endres over tid under bevegelse, samt egenskapene til retningsvalg. Dermed gir inkorporering av åpen kildekode-programvare i vanlige digitale enheter en pålitelig måte å teste lokomotorisk aktivitet i forskjellige fluemodeller. Dette kan være nyttig for å evaluere fysiologiske og patologiske lokomotoriske utganger ved testing av nevrodegenerative sykdomsmodeller avledet fra farmakologisk behandling og transgen modifikasjon i Drosophila så vel som andre dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et spesielt lanseringsfond fra Soochow University og National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). Vi takker professor Chunfeng Lius laboratoriemedlemmer for deres diskusjon og kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
