Summary
Denne protokol vurderer Drosophilas lokomotoriske aktivitet ved at spore og analysere fluernes bevægelse i en håndlavet arena ved hjælp af open source-software Fiji, kompatibel med plugins til at segmentere pixels i hver ramme baseret på high-definition videooptagelse for at beregne parametre for hastighed, afstand osv.
Abstract
Drosophila melanogaster er en ideel modelorganisme til at studere forskellige sygdomme på grund af dens overflod af avancerede genetiske manipulationsteknikker og forskellige adfærdsmæssige træk. Identifikation af adfærdsmangel i dyremodeller er et afgørende mål for sygdommens sværhedsgrad, for eksempel i neurodegenerative sygdomme, hvor patienter ofte oplever forringelser i motorisk funktion. Men med tilgængeligheden af forskellige systemer til at spore og vurdere motoriske underskud i fluemodeller, såsom lægemiddelbehandlede eller transgene individer, mangler der stadig et økonomisk og brugervenligt system til præcis evaluering fra flere vinkler. En metode baseret på AnimalTracker applikationsprogrammeringsgrænsefladen (API) udvikles her, som er kompatibel med Fiji-billedbehandlingsprogrammet, til systematisk at evaluere bevægelsesaktiviteterne hos både voksne og larveindivider fra optaget video, hvilket muliggør analyse af deres sporingsadfærd. Denne metode kræver kun et high-definition kamera og en computer perifer hardware integration til at registrere og analysere adfærd, hvilket gør det til en overkommelig og effektiv tilgang til screening af fluemodeller med transgene eller miljømæssige adfærdsmæssige mangler. Eksempler på adfærdstest med farmakologisk behandlede fluer gives for at vise, hvordan teknikkerne kan detektere adfærdsændringer hos både voksne fluer og larver på en meget gentagelig måde.
Introduction
Drosophila melanogaster giver en fremragende modelorganisme til undersøgelse af cellulære og molekylære funktioner i neuronale sygdomsmodeller skabt af genmodifikation1, lægemiddelbehandling2 og ældning3. Den høje bevarelse af biologiske veje, fysiske egenskaber og sygdomsassocierede homologgener mellem mennesker og Drosophila gør frugtfluen til en ideel efterligning fra molekylært til adfærdsmæssigt niveau4. I mange sygdomsmodeller er adfærdsmæssig mangel et vigtigt indeks, der giver en nyttig model for forskellige humane neuropatier 5,6. Drosophila bruges nu til at studere flere menneskelige sygdomme, neuroudvikling og neurodegenerative sygdomme såsom Parkinsons sygdom og amyotrofisk lateral sklerose 7,8. Påvisning af sygdomsmodellernes motoriske evne er afgørende for at forstå de patogene fremskridt og kan give en fænotypisk korrelation til de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomsprocessen.
For nylig er kommercielt tilgængelige softwareværktøjer og omkostningseffektive programmer blevet udviklet til Drosophila lokomotoriske detektionsstrategier, såsom high-throughput test i grupperede fluer9,10 og måling af bevægelse i realtid11,12. En sådan konventionel tilgang er hurtig interaktiv negativ geotaxis (RING), også kaldet klatreassayet, som inkluderer flere kanaler, der gør det muligt at indeholde en stor fluepopulation med samme køn og alder, hvilket reducerer variationen, mens dataindsamling 9,13. En anden præ-testmetode til analyse af lokomotorisk adfærd er TriKinetics Drosophila aktivitetsmonitor (DAM), en enhed, der bruger flere stråler til at detektere flueaktivitetsbevægelse i et tyndt glasrør14. Enheden registrerer position kontinuerligt, hvilket repræsenterer automatiseret bevægelse ved at beregne strålekrydsningerne for at studere fluernes aktivitet og døgnrytme over en længere periode15. Selvom disse metoder har været meget udbredt til analyse af adfærdsfejl i bananfluer for at bestemme ændringer i adfærdsmæssig bevægelse, kræver de altid specielt testudstyr eller komplekse analyseprocesser og begrænser deres anvendelse i nogle modeller med en begrænset, enkel enhed. Dyresporingsgruppebaserede strategier til test af den voksne Drosophila, såsom FlyGrAM11 og Drosophila-øanalysen 10, implementerer social rekruttering og individuel sporing i et foruddefineret område. Ikke desto mindre kan sociale individuelle begrænsninger i trodsede områder have en negativ indvirkning på identifikationer på billederne, forårsaget af kollision eller overlapning af fluer. Selvom nogle open source-materialebaserede metoder, såsom TRex16, MARGO 12 og FlyPi17, har en nødsituation, kan de hurtigt spore fluerne med fleksibel brug i adfærdstest. Disse testmetoder er forbundet med udførlige eksperimentelle apparatinstallationer, specielle softwarekrav eller professionelle computersprog. For larver er måling af den samlede tilbagelagte afstand over antallet af gittergrænselinjer pr. tidsenhed18 eller grov tælling af kropsvægskontraktionerne for individermanuelt 19 de fremherskende metoder til vurdering af deres bevægelsesevne. På grund af manglende præcision i udstyr eller enheder og analysemetoder kan nogle adfærdsmæssige bevægelser af larver undslippe detektion, hvilket gør det vanskeligt at nøjagtigt vurdere adfærdsmæssig bevægelse, især fin bevægelse15.
Den nuværende udviklede metode anvender AnimalTracker applikationsprogrammeringsgrænsefladen (API), kompatibel med Fiji (ImageJ) billedbehandlingsprogrammet, til systematisk at evaluere bevægelsesaktiviteten hos både voksne og larvefluer ved at analysere deres sporingsadfærd fra high-definition (HD) videoer. Fiji er en open source-software ImageJ-distribution, der kan kombinere robuste softwarebiblioteker med adskillige scriptsprog, hvilket resulterer i hurtig prototyping af billedbehandlingsalgoritmer, hvilket gør det populært blandt biologer for dets billedanalysefunktioner20. I den nuværende tilgang udnyttes Fijis integration i AnimalTracker API til at udvikle et unikt Drosophila-adfærdsassay med personlig algoritmeindsættelse og giver et nyttigt trin til detaljeret dokumentation og tutorials til understøttelse af robuste analytiske evner i lokomotorisk adfærd (figur 1). For at omgå komplikationen af objektive identifikationer i billederne forårsaget af kollision eller overlapning af fluer er hver arena begrænset til kun at være vært for en flue. Efter vurdering af sporingspræcisionen af tilgangen blev den implementeret for at spore og kvantificere de lokomotoriske bevægelser af Drosophila , der blev administreret med det giftige lægemiddel rotenon, som generelt bruges til dyremodeller af Parkinsons sygdom, hvilket i sidste ende opdagede bevægelsesforringelse i lægemiddelbehandlingen21. Denne metode, der anvender open source og fri software, kræver ikke dyre instrumentering, og kan præcist og reproducerbart analysere Drosophila adfærdsmæssig bevægelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
W1118 voksne fluer og tredje stjernelarver blev brugt til denne undersøgelse.
1. Eksperimentel forberedelse
BEMÆRK: En åben arena til Drosophila bevægelsessporing er lavet meden farveløs og lugtfri silicagel.
- Bland reagens A og reagens B i forholdet 1:10 i henhold til producentens anvisninger for silicasættet (se materialetabellen). Sørg for, at natriumbicarbonat tilsættes til blandingen ved omrøring, indtil farven ændres til hvid. Overfør blandingen til en ren petriskål og sæt den i en ovn ved 40 °C til tørring i 48 timer.
- Sæt HD-kameraet (se materialetabellen) på et stativ, og juster det, så kameralinsen er vinkelret på overfladen af silicaarenaen. Justering af kameraets brændvidde og åbninger sikrer, at kameraet er fokuseret på silicaens overflade, og at displayet er tilstrækkeligt oplyst. Den eksperimentelle opsætning er illustreret i figur 1.
- Overfør en flue ind i arenaen med åbent felt for at optage en kontinuerlig video på mindst 61 s.
BEMÆRK: I betragtning af larvernes træge natur anbefales en videooptagelsestid på mere end 10 minutter.- Åbn videoen med Fiji, træk statuslinjen til den oprindelige ramme, og godkend stiltiende. Vælg hele fluens krop ved hjælp af værktøjet "frihåndsvalg" (figur 2B, C).
- Klik på billedet > justere > lysstyrke og kontrast for at justere hvidbalancen, indtil den grå værdi af det markerede område nærmer sig den brede baggrund (figur 2D-F).
BEMÆRK: Baggrundshomogenisering af den første ramme gør det muligt for softwaren at skelne baggrunden uden objekter og skabe en kontrast, når en flue er til stede, hvilket gør det muligt for softwaren at spore den.
- Udfør hele eksperimentet i et testmiljø, der er indstillet til 25 °C og 60 % relativ luftfugtighed, i et område, der er stille og uden udsættelse for stærkt lys.
2. Videooptagelse og forbehandling
- Efter en kort periode med anæstesi ved hjælp af 95% kuldioxid (CO2) skal du overføre en flue til den åbne arena og trykke på optageknappen på kameraapplikationen for at starte videooptagelse.
BEMÆRK: For at minimere bedøvelsens effekt på bevægelse skal du lade fluerne komme sig i 10 minutter, før du starter videooptagelse. Afkøling ved afkøling anbefales også.- Når fluerne er kommet sig efter bedøvelsen, skal du sætte arenaskålen med fluen under kameraet og ryste pladen hurtigt fra side til side for at sikre, at fluen er i bevægelse, når optagelsen begynder.
- Når optagelsen er afsluttet, skal du trykke på stopknappen for at afslutte videooptagelsen.
BEMÆRK: Sørg for, at videooptagelsestiden lidt overstiger destinationssporingstiden med en lille margin. For at forbedre den eksperimentelle effektivitet er det desuden muligt at spore flere fluer spontant. Dette afhænger af kameraets opløsning for at muliggøre en videobeskæring i høj kvalitet. - Konverter de optagede videoer til AVI-format med MJPEG-kodning, så de kan åbnes og analyseres ved hjælp af Fiji. I mellemtiden skal du indstille videoens billedhastighed pr. sekund (fps) til 15 fps for voksne fluer og 12 fps for larver.
3. Videoanalyse
- Åbn videoen, der er blevet transformeret med "brug virtuel stak" og "konverter til gråtoner", to muligheder i popup-vinduet, når du åbner videoen med Fiji (figur 2A).
- Lav en tom første ramme, som nævnt ovenfor.
- Få et behandlingsvindue ved hjælp af værktøjet "set active image" i AnimalTracker-pluginet , og opret et sporingsområde, der cirkler arenaen i det originale videovindue ved hjælp af værktøjet "oval" (figur 3A).
- Indstil filtrene (figur 3A,3) og parametrene for de to filtre (figur 4A-G) for den første tomme ramme i behandlingsvinduet. Vælg derefter det næste billede i det originale videovindue, og vælg den filtrerede overflade i behandlingsvinduet (figur 5A-C).
BEMÆRK: Filtreringstrinnet tjener til at reducere billedstøj og / eller fjerne baggrunden, hvilket gør det enklere at adskille forgrunden fra baggrunden i binariseringen af rammerne. - Når et filtreret behandlingsvindue er valgt, skal du dreje den sporede flue med en rød profil dækket i behandlingsvinduet ved hjælp af værktøjet "sæt tærskel" (figur 3A,4, figur 5D-E og figur 6A).
- Brug "set blob-detector" til at lade computeren genkende fluen med en rød profil, der er dækket af behandlingsvinduet (figur 3A,5 og figur 6B).
- Indstil billede 901 som det sidste billede for den voksne flue, beregnet ud fra videoens optagevarighed og fps (figur 3A,6, figur 6C).
OBS: Følgende forsøg med larver har været fulgt i 10 min, så ramme 7200 er sat som sidste billede. - Brug værktøjet "vis blobs" til at præsentere et sporingsrektangel i det originale videovindue (figur 3A,7 og figur 6D,E). Start derefter sporingen, og eksportér sporingsfilen, når overvågningen er fuldført (figur 3A,8,9 og figur 7A,B).
4. Sporing af filanalyse
- Indlæs spor- og zonefilerne ved hjælp af plugin'et Animal tracker > Tracking analyzer (figur 8A).
- Vælg det ønskede indeks ved hjælp af zoneindstillinger, og skift parameterindstillingerne (figur 8). Beregn tidspunktet for billedintervallet ved hjælp af billedhastigheden.
BEMÆRK: I denne tilstand er billedhastigheden 15 fps, og billedintervallet er ca. 0,067 s, hvilket er standardindstillingen (figur 8D). - Fremstil de kvantitative analysediagrammer ved hjælp af regnearkssoftwaren og GraphPad Prism efter analyse i sporingsanalysator (figur 9).
5. Analyse pr. ramme
- Udfør hastighedsanalyse pr. rammeinterval. Analyser sporfilen uden Fiji, hvis der er behov for mere detaljeret forskning.
- Åbn sporfilen, kopier alle koordinater til Microsoft Office Excel, og opdel cellerne ved hjælp af mellemrumstasten.
BEMÆRK: For eksempel, når filen er blevet opdelt i kolonnerne "C" og "D", beregnes hastigheden af Drosophila pr. rammeinterval ved hjælp af formlen SQRT((C5-C4)^ 2+(D5-D4)^2), som vises i kolonnen "E" (figur 10A). Dataene i kolonne "E" angiver antallet af pixels, som fluen flyttede mellem to rammer, hvor den første ramme ikke tages i betragtning. Vælg alle beregnede resultater, og indsæt et kurvediagram for at vise en intuitiv flyvebevægelseshastighed pr. billedinterval med et højdepunkt på kurvediagrammet (figur 10B).
- Åbn sporfilen, kopier alle koordinater til Microsoft Office Excel, og opdel cellerne ved hjælp af mellemrumstasten.
- Beregn immobilitetstiden pr. Rammeinterval. Når filen er blevet opdelt i kolonnerne "C" og "D", skal du beregne Drosophilas immobilitetsstatus pr. rammeinterval ved hjælp af formlen HVIS(SQRT((C6-C5)^ 2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), som vises i kolonnen "E". (Figur 10C).
BEMÆRK: I modsætning til hastighedsanalyse blev resultaterne af den første ramme defineret. Fluer, der bevægede sig færre end 20 pixels, blev betragtet som immobile og registreret som "0" i kolonne "E".- Vælg alle beregnede resultater, og indsæt et søjlediagram for visuelt at vise immobilitetstiden med margenen for hele søjlediagrammet (figur 10D).
- Sørg for, at retningsvinklen ændres.
BEMÆRK: Analysen af retningsændringsvinklen repræsenterer fluernes retningsvalg. Når filen er opdelt i kolonnerne "C" og "D", beregnes retningsvinklen ved hjælp af formlen ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2)^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*(SQRT((C7-C6)^ 2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), som vises i kolonnen "E" (figur 10E). De beregnede resultater angiver vinklen mellem tre koordinater.- Vælg alle beregnede resultater, og indsæt et spredningsdiagram for at illustrere retningsvinklen for fluernes bevægelse (figur 10F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse blev lokomotoriske underskud hos voksne fluer og tredje stjernelarver behandlet med rotenon undersøgt og sammenlignet i deres motoriske aktivitet med en kontrolflue fodret med lægemidlet opløsningsmiddel dimethylsulfoxid (DMSO). Behandling med rotenon i Drosophila har vist sig at forårsage dopaminerge neuron tab i hjernen22 og føre til betydelige lokomotoriske underskud23. Som vist i figur 11 og figur 12 har voksne fluer og tredje stjernelarver behandlet med rotenon betydelige bevægelsesunderskud sammenlignet med kontrolfluer fodret med DMSO. Figur 11 og figur 12B-E illustrerer de relative ændringer i afstand, hastighed og immobilitetstid for bevægelsesparametre mellem fluer behandlet med eller uden rotenon. Figur 11 og figur 12F-K illustrerer en repræsentativ analyse af parametrene hastighed, immobilitetstid og retningsvalg, med eller uden rotenonbehandling hos voksne og larver. Kvantitativ analyse af parametrene for afstand, immobilitetstid og hastighed ved hjælp af Fiji-software i voksne fluer (figur 11) og tredje stjernelarver (figur 12) i lægemiddelfodringsgrupperne validerer yderligere, at behandling med rotenon kan bruges til at undersøge lokomotoriske underskud i menneskelige sygdomme, herunder neurodegenerative tilstande, og replikere nogle af de adfærdsmæssige egenskaber, der observeres hos mennesker og pattedyr.
Figur 1: Rutediagram, der skitserer udstyrsopsætning og eksperimentel procedure for Drosophila-bevægelsessporingsanalyse . Den lokomotoriske sporingsarena er afbildet med et overliggende HD-kamera, der er indbygget i og styret af en computer. Proceduren til analyse af Drosophilas bevægelse består af videooptagelse, bevægelsessporing, sporing af filanalyse, databehandling og parametrisk analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Baggrundshomogenisering af den første ramme. (A) Kontroller indstillingen "konverter til gråtoner", mens du åbner den transformerede video, for at omdanne videoen til gråtoner og undgå farveinterferens. (B) Skitser Drosophila ved hjælp af værktøjet "frihåndsvalg", der vises i den røde boks. (C) Som analysevalg blev der brugt en gul linje til at afgrænse fluernes konturer. At holde den gule linje tæt på fluens konturer reducerer sandsynligheden for at vælge en region, der ikke er optaget af fluen. Skalabjælke = 1 cm. (D) Juster lysstyrken og kontrasten for det første billede, indtil det område, der er indrammet med gult, skifter til samme gråtoner som baggrunden. (E) Fuldfør lysstyrke- og kontrastjusteringen for det første billede, men ikke for alle billeder, ved at klikke på "Nej" i vinduet "stak". (F) I sidste ende justeres den første ramme for at skabe en ensartet og pletfri baggrund. Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Indstillinger for sporingsvindue og sporingszone. (A) Fuldfør sporingsanalysen ved at klikke på tracker-plugins i den rækkefølge, der er markeret i vinduet Dyresporing. (B) Efter indstilling af det aktive billede i figur A,1 vises et behandlingsvindue, der kun viser det aktuelle billede. Det primære videovindue og behandlingsvinduet skelnes tydeligt og bruges i forskellige situationer. For at ændre den aktuelle ramme skal du sørge for, at ændringen udføres i det primære videovindue; Ændringen vil være synlig i begge vinduer. Skalabjælke = 1 cm. (C) Opret et sporingsområde, der omkranser arenaen, ved hjælp af det "ovale" værktøj til computergenkendelse. Valg af sporingszone skal være i en cirkelformet arena i et åbent videovindue i stedet for i et behandlingsvindue. (D) Skitser et sporingsområde med de gule linjer, der passer bedst muligt til arenaen for at minimere forstyrrelsen af eksternt lys. Skalabjælke = 1 cm. (E) For at indstille interesseområdet (ROI ) i sporingsområdet skal du klikke på knapperne efter den rækkefølge, der er markeret med de tal, der vises i vinduet "zonedesigner". I dette trin skal hele operationen være afsluttet, når det valgte videovindue åbnes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Filterindstilling for det første billede. (A) Ved at fuldføre indstillingen af ROI for sporingsområdet ændres den gule linje, der omkranser arenaen, til grøn i både det åbnede videovindue og behandlingsvinduet. Skalabjælke = 1 cm. (B) Tilføjelse af formålet med filtre indstiller en sort baggrund for at gøre målobjektet mere tydeligt for det første billede i behandlingsvinduet. Hele operationen skal udføres inden for et behandlingsvindue snarere end et åbent videovindue. (C,D) Tilføjelse af filtrene "baggrundssubtraktor" og "Gaussisk sløring" til vinduet "filterindstillinger" gør den første ramme i behandlingsvinduet sort. Hele filterindstillingsprocessen skal være afsluttet i den første ramme. (E) Parametrene indstilles trin for trin ved at klikke på knapper markeret med et tal og et rødt rektangel i vinduet "baggrundssubtraktor". Trinnet "sæt billede" skal betjenes, når behandlingsvinduet er valgt. (F) Skalastang = 1 cm. Vinduet "medianbillede" vises, når du har klikket på knappen "Vis filter" i "E4" og lukker vinduet direkte uden nogen handling. (G) Parameteren for den gaussiske sløring er indstillet med en standard sigma-værdi på 2,0. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Tærskelindstillinger for det andet billede. (A) Ved at klikke på den nederste statuslinje skal du få videovinduet til at gå videre til det andet billede. Fluen gentager sig midt på skærmen og identificeres af Fiji. Skalabjælke = 1 cm. (B,C) Vis behandlingsvinduet før og efter filtrering. (B) Vis det filtrerede behandlingsvindue ved at vælge den tilstand, der er markeret med et rødt rektangel. (C) Et eksempel på et behandlingsvindue med et rødt rektangel, efter at tilstanden "filtreret" blev valgt. Vægtbjælke = 1 cm. (D) Indstil tærsklen ved at vælge standardtærskelmetoden, "gråtonetærskel", der vises i vinduet "tærskelværdier", efter at du har valgt værktøjet "indstil tærskel" i figur 3A,4. (E) Juster parametrene ved at skubbe statuslinjeboksen i midten, indtil sporingsfluen ses og dækkes af den røde profil. Det anbefales ikke at ændre standardindstillingerne for parametrene i det røde rektangel nedenfor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Blobdetektor, sidste rammeindstilling og valg af dyresporing. (A) Når tærsklen i figur 5E er nået, viser behandlingsvinduet en betydelig rød profil, der følger fluen i det andet billede. Gør den røde profil, der dækker fluen, egnet til at spore fluen. Skalabjælke = 1 cm. (B) Definer den røde profildækkede flue som målet for sporing ved at vælge standard blob detector-metoden, "base blob detector". (C) Sæt ramme 901 som den sidste ramme ved hjælp af værktøjet "sæt sidste ramme" i figur 3A,6. Det samlede rammenummer beregnes ved hjælp af formlen "rammenummer = fps * optagetid". (D) Sporingen flyver med et gult rektangel indrammet efter vis klatter i det åbnede videovindue (venstre panelsektion). I det forstørrede venstre panel er frugtfluer fastgjort i rødt (højre panelsektion). Skalabjælke = 1 cm. (E) Sporingsfluen med et rødt rektangel indrammet efter at have klikket for at vælge det røde rektangel i "D" (øverste panelsektion). I den øverste panelforstørrelse er frugtfluer fastgjort i rødt (nederste panelsektion). Sørg for, at valget af et gult rektangel omkring en sporingsflue er afsluttet i det åbnede videovindue. Afslut markeringen i det åbnede videovindue, og fluen identificeres af Fiji i alle rammer. Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Resultater af sporing af sporing. Sporingssporingen vises separat i det åbnede videovindue ( A) og behandlingsvinduet (B). For at få sporingssporingsprofilen skal du klikke på statuslinjen i det originale videovindue og skubbe statuslinjen for at kontrollere kontinuiteten i sporingen. Sporingssporet viser fluernes kravleafstand intuitivt. Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Sporing af filanalyse ved hjælp af AnimalTracker-plugins. (A) Sporingsanalysatoren letter en detaljeret analyse af sporingsfilen; Hvert trin markeret med et rødt rektangel er angivet med et tal. (B) Indstil parametrene "zoneindstillinger" i A,4. Fire parametre, tid, afstand, immobilitetstid og hastighedsvektor, vises i det røde rektangel. Parameteren vælges ud fra det ønskede resultat. (C-G) Indstil konfigurationsparametrene individuelt i vinduet "sæt parametre" i A,5. (C) Fire justerbare parametre er illustreret i vinduet "config parameters settings" (D-G), der viser henholdsvis vinduerne "time settings", "immobility time setting", "distance settings" og "velocity vector setting". Det anbefales ikke at ændre standardværdien for parameterindstillingerne. For "billedintervallet" skal parameteren dog beregnes ved hjælp af formlen "billedinterval = 1 / fps", når videoens fps ændres. Derudover er det muligt at anvende en kendt skala til at fastslå den faktiske afstand og hastighed ved at korrelere de pixels, der er registreret med sporing af en flue, til en håndgribelig værdi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Resultat, der viser analyse af sporingsfiler. (A) Indstillingen af figur 8A,6. Der findes to metoder til visning af dataene: "grupperet efter zoner" og "grupperet efter parametre". B) Resultaterne af analysen af sporingsfilen vises som "grupperet efter zoner" i "A,6.1". (C-F) Resultaterne af sporingsfilanalyse vises som "grupperet efter parametre" i A,6.2 og udviser "immobilitetstid" (C), "hastighedsvektor" (D), "tid" (E) og "afstand" (F) separat. Resultaterne af immobilitetstiden og afstanden kvantificeres som "s" og "pixels". Enheden for hastighedsvektoren skal defineres som "pixel / s" og output med annotationen "længde". Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Resultaterne af dataanalysen for hastighed pr. fps. (A, C og E) Eksportdataene indeholder koordinater for pixels i vandrette (kolonne "C") og lodrette (kolonne "D") partitioner samt bevægelse af pixels, immobilitet og retningsændringsvinkel mellem to-frame-intervaller (kolonne "E" i henholdsvis A, C og E), som automatisk beregnes ved hjælp af den formel, der er beskrevet i konteksten. Da de resultater, der eksporteres fra Fiji, er tekstdokumenter, anbefales det at åbne filen med Microsoft Office Excel og opdele dataene i tre kolonner ved at tilføje mellemrum mellem dem. (B, D og F) Et kurvediagram viser de beregnede resultater fra datasættet for bevægelsen af pixel (B). Den globale topværdi repræsenterer hastigheden, der indikerer bevægelsesdetekteringsfunktionerne; søjlediagrammet viser de beregnede resultater fra datasættet for immobilitet (D). Graden af sparsomhed i søjlediagrammet repræsenterer immobiliteten, der udviser fluernes motoriske evnefejl; et punktdiagram viser de beregnede resultater fra datasættet for retningsændringsvinklen (F). Berigelsen af stænk vist i spredningsdiagrammet repræsenterer den retning, som fluen vælger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: En sammenlignende analyse af bevægelser mellem fluer behandlet med eller uden rotenon. (A) Der vises repræsentative grafer over sporsporet af W1118 voksne fluer, der er fodret med standardfoder indeholdende 500 μM rotenon eller DMSO til kontrol. W1118 fluer blev indsamlet og derefter anbragt i et kontrolleret miljø bestående af standardfoder med 500 μM rotenon eller DMSO, 25 °C og 60 % fugtighed. Seks fluer blev brugt til analyse fra hver gruppe efter 48 timer. Resultatet afslører, at bevægelsesafstanden for sporing af fluer fodret med rotenon er signifikant reduceret sammenlignet med kontrolens. Resultatet viste en defekt motorisk evne hos fluer fodret med rotenon. (B-E) Kvantitativ analyse af rotenonbehandlingen på den gennemsnitlige tilbagelagte afstand, immobilitetstid, gennemsnitshastighed og maksimal hastighed udføres ved hjælp af Fiji. Resultaterne af rotenonbehandlingen viste et signifikant fald i den tilbagelagte afstand og gennemsnitshastigheden samt en signifikant stigning i immobilitetstiden. (F-K) Analyse af pixels pr. billede (F,G), immobilitetstid pr. billede (H,I) og retningsvinkelændringer (J,K) mellem fluer behandlet med rotenon (G,I,K) eller DMSO (F,H,J). Eksempler på grafer, der illustrerer rotenons virkninger på bevægelseshastigheden, viser færre toppe, der repræsenterer bevægelseshastigheden pr. rammeinterval hos fluer fodret med rotenon (G) sammenlignet med dem i kontrollen (F), hvilket angiver sværhedsgraden af den lokomotoriske aktivitetsdefekt (F,G). Den intuitionistiske immobilitetskolonne med bevægede pixels pr. billede er lavere og viser signifikant mindre bevægelse inden for 1 min for rotenonfodrede fluer (I) sammenlignet med kontrolfluerne (H). Eksempler på grafer over ændringer i bevægelsesretningen hos rotenonfodrede (K) og kontroldyr (J) afslører ændringer i den retning, fluer vælger. Data er den gennemsnitlige ± SEM af seks hanfluer overvåget i 1 min. Stjerner indikerer signifikante forskelle mellem grupper (***p < 0,001; uparret t-test, p = 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12: En sammenlignende analyse af bevægelsen mellem larver behandlet med eller uden rotenon. (A) Repræsentative resultater af sammenligningen af bevægelsesaktivitet ved at spore sporene af W1118 tredje stjernelarver fodret med rotenon eller DMSO. Kort fortalt blev W1118 tredje stjernelarver indsamlet og dyrket i 10% saccharose eller 10% saccharose indeholdende 500 μM rotenon i et miljø på 25 °C med 60% fugtighed. Seks larver pr. Gruppe blev brugt til analyse. Under hensyntagen til larvernes langsomme bevægelse er dataoptagelsen over et tidsrum på 5 minutter blevet kvantificeret og analyseret for at evaluere rotenons virkninger på bevægelse. (B-E) Den gennemsnitlige afstand, immobilitetstid, gennemsnitshastighed og maksimale hastighed for de to grupper, der analyseres i Fiji, analyseres kvantitativt. De kvantitative resultater viser, at bevægelsesafstanden, middelhastigheden og den maksimale hastighed falder signifikant i larver fodret med rotenon, og immobilitetstiden øges signifikant hos larver fodret med rotenon. (F-K) I lighed med voksne fluer viste analyse af pixels pr. ramme, immobilitetstid og retningsvinklen mellem fluer behandlet med rotenon (G, I, K) og uden rotenon (F, H, J), at larver behandlet med rotenon havde lavere bevægelseshastighed, mere immobilitetstid og skiftede deres retninger. Resultaterne afslører, at adfærdsbevægelsen af sporingslarver fodret med rotenon er signifikant svækket sammenlignet med kontrollen. Resultaterne viser en defekt bevægelsesaktivitet af fluer fodret med rotenon. Data er den gennemsnitlige ± SEM for seks 3 dage gamle larver overvåget i 5 min. Stjerner indikerer en signifikant forskel mellem grupperne (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; uparret t-test, p = 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammenligning af metoder baseret på sporing af dyr til kvantificering af den bevægelige aktivitet i Drosophila. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har designet en metode, baseret på open source-materialet AnimalTracker API, der er kompatibelt med Fiji-billedbehandlingsprogrammet, der kan gøre det muligt for forskere systematisk at evaluere bevægelsesaktivitet ved at spore både voksne og individuelle larvefluer. AnimalTracke er et værktøj skrevet i Java, der nemt kan integreres i eksisterende databaser eller andre værktøjer for at lette analysen af applikationsdesignet dyresporingsadfærd24. Efter en ramme-for-ramme-analyse ved hjælp af en softwareberegningsformel, der kvantificerer bevægelsesaktiviteten hos voksne og larver, kan flere parametre, herunder bevægelseshastighed, tilbagelagt afstand, immobilitet og retningsvinkelændringer, analyseres fleksibelt. Disse parametre, som repræsenterer forskellige aspekter af adfærdsmæssig bevægelse, kan plottes for at illustrere lokomotoriske ændringer over tid. Ved at oprette en grafisk brugergrænseflade, der giver detaljeret dokumentation om dens anvendelse og en applikationsprogrammeringsgrænseflade, sigter vi desuden mod at gøre denne metode tilgængelig for forskere, der mangler programmeringserfaring og erfarne brugere, der skaber brugerdefinerede eksperimentelle paradigmer.
For at verificere, at metoden nøjagtigt kan overvåge adfærd, er der udført lokomotorisk test af voksne fluer og larver behandlet med rotenon samt en sammenligning af deres motoriske aktivitet med kontrolfluer fodret med lægemidlets opløsningsmiddel. Fiji-softwaren med sine plugins bruges til at analysere pixelkoordinaterne for hver ramme i videooptagelsen af bevægelsen, hvilket muliggør beregning af hastighed, afstand og andre parametre for de eksperimentelle fluer. Vi observerede et signifikant fald i tilbagelagt afstand over tid i rotenonadministration (figur 11), hvilket er i overensstemmelse med rapporterede resultater23. I mellemtiden er den stigende bevægelseshastighed og unormale retning, der er valgt, blevet observeret i stoffodrede grupper for at hjælpe med at illustrere flere detaljer om adfærdsmæssig mangel hos fluer. I betragtning af succesen med at detektere voksne fluers bevægelsesaktivitet forsøgte vi derefter at evaluere larvernes mobilitet (figur 12). Sammenlignet med kontrollen var resultaterne af sporingslarverne fodret med rotenon signifikant svækket, parallelt med resultaterne af voksne fluer fodret med stoffer. Eksperimenter med voksne og larver fodret med rotenon tyder på, at denne metode nøjagtigt kan registrere reduktionen af fluer, der producerede lokomotoriske underskud sammenlignet med kontroller. Denne rapport har med succes demonstreret anvendelser af den nuværende metode til kvantificering og analyse af lokomotorisk evne og andre facetter af adfærdsfejl hos bananfluer i testmodeller eller farmakologisk forskning hos dyr.
For at sikre, at video- og sporingsanalysen giver vellykkede og reproducerbare resultater, anbefales det at overholde følgende retningslinjer. For det første anbefaler vi at konvertere den optagede video til et format på 15 billeder pr. Sekund (fps) til valg af videobilledhastighed. Dette kan ikke kun opretholde god bevægelsessporing, men også undgå langsommeligheden af computeranalyse forårsaget af store mængder data. Ved at forbedre videobilledhastigheden bliver bevægelsesbaneanalysen mere detaljeret. For det andet kan parametrene i formlen også justeres, så de passer til det tilsvarende eksperimentelle skema, når man analyserer den statiske bevægelse mellem hver anden ramme. Til larvernes lokomotoriske overvågning er det vigtigt at bruge silicagel i stedet for agar, da den størknede silicagel er tæt, og larverne ikke kan komme ind i den. Desuden er silicagel gennemsigtig og kan farves ved at tilføje farvestof for at producere optimal baggrund, hvilket letter ønskede optiske effekter, der forbedrer billedkvaliteten.
Dyresporingssystemer bliver avanceret for at levere omfattende løsninger til ætiologi, neurovidenskab og adfærdsgenetik. Tabel 1 giver en sammenligning af funktionerne i flere sporingsprogrammer, der i øjeblikket er tilgængelige 10,11,12,16,17,25,26. Denne tilgang er ekstremt omkostningseffektiv, ligetil at lære og præcis til måling af bevægelsesadfærd uden at kræve dyr software og udstyr. Der er ingen tvivl om, at denne metode nemt kan udvides til andre Drosophila-lignende dyremodeller og endda til større dyr som rotter og mus. Strukturen af AnimalTracker API kan nemt udvides gennem uafhængige ImageJ-applikationer eller plugins, der tilbyder en bred vifte af nyttige værktøjssæt til tilpasset adfærdsforskning og analyse24. Ikke desto mindre har denne undersøgelse visse begrænsninger. Da en enkelt flue placeres i en åben arena til billedoptagelse, og videosporing udføres individuelt, er denne metode ineffektiv og tidskrævende. Vi har forsøgt at udvide kapaciteten til at optage flere arenaer samtidigt, hvilket giver mulighed for op til seks individuelle optagelser. Det er teoretisk muligt at registrere et større antal Drosophila samtidigt; Dette afhænger af arenaens størrelse og kameraets konfiguration. Alternativt, hvis brugerne ønsker at udvide til optagelse af grupperet Drosophila, anbefales det at overveje det begrænsede antal enkeltposter og en konfiguration af tilstrækkelig kvalitet til at identificere kollisioner og overlapninger mellem fluerne. Forbedringer i testeffektiviteten ved maskinindlæring blev ikke overvejet i undersøgelsen, da der ikke er fundet ud af en overkommelig og kompatibel tilgang, der kan integreres med det nuværende system for visuelt at skelne identiteter og spore modeller nøjagtigt.
Sammenfattende udvikler og validerer metoden beskrevet her en effektiv og ligetil tilgang baseret på gratis open source-software, designet til at reducere tidsforbruget og forfine eksperimentelle teknikker til kvantitativ indikation og analyse af Drosophila-bevægelse i larverne og voksne stadier. Gennem systematisk analyse kan denne metode hjælpe os med at forstå, hvordan dyrets hastighed ændrer sig over tid under bevægelse, samt egenskaberne ved retningsvalg. Således giver inkorporeringen af open source-software i almindeligt anvendte digitale enheder en pålidelig måde at teste lokomotorisk aktivitet i forskellige fluemodeller. Dette kan være nyttigt til evaluering af fysiologiske og patologiske lokomotoriske output ved test af neurodegenerative sygdomsmodeller afledt af farmakologisk behandling og transgen modifikation hos Drosophila såvel som andre dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en særlig lanceringsfond fra Soochow University og National Science Foundation of China (NSFC) (82171414). Vi takker professor Chunfeng Lius laboratoriemedlemmer for deres diskussion og kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
References
- Ham, S. J., et al. Loss of UCHL1 rescues the defects related to Parkinson's disease by suppressing glycolysis. Science Advances. 7 (28), (2021).
- Algarve, T. D., Assmann, C. E., Aigaki, T., da Cruz, I. B. M. Parental and preimaginal exposure to methylmercury disrupts locomotor activity and circadian rhythm of adult Drosophila melanogaster. Drug and Chemical Toxicology. 43 (3), 255-265 (2020).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental Gerontology. 46 (5), 320-325 (2011).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 1-10 (2018).
- Rothenfluh, A., Heberlein, U. Drugs, files, and videotape: the effects of ethanol and cocaine on Drosophila locomotion. Current Opinion in Neurobiology. 12 (6), 639-645 (2002).
- Tsuda, L., Lim, Y. M. Alzheimer's disease model system using Drosophila. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1076, 25-40 (2018).
- Dung, V. M., Thao, D. T. P.
- Liguori, F., Amadio, S., Volonte, C. Fly for ALS: Drosophila modeling on the route to amyotrophic lateral sclerosis modifiers. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (17-18), 6143-6160 (2021).
- Cao, W., et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (127), 56507 (2017).
- Eidhof, I., et al. High-throughput analysis of locomotor behavior in the Drosophila island assay. Journal of Visualized Experiments. (129), 55892 (2017).
- Scaplen, K. M., et al. Automated real-time quantification of group locomotor activity in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 9 (1), 4427 (2019).
- Werkhoven, Z., Rohrsen, C., Qin, C., Brembs, B., de Bivort, B. MARGO (Massively Automated Real-time GUI for Object-tracking), a platform for high-throughput ethology. PLoS One. 14 (11), e0224243 (2019).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
- Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).
- McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. 98, e52684 (2015).
- Walter, T., Couzin, I. D. TRex, a fast multi-animal tracking system with markerless identification, and 2D estimation of posture and visual fields. eLife. 10, (2021).
- Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), e2002702 (2017).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Xiao, G. Methods to assay the behavior of Drosophila melanogaster for toxicity study. Methods in Molecular Biology. 2326, 47-54 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Johnson, M. E., Bobrovskaya, L. An update on the rotenone models of Parkinson's disease: their ability to reproduce the features of clinical disease and model gene-environment interactions. Neurotoxicology. 46, 101-116 (2015).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. The Journal of Neuroscience. 24 (48), 10993-10998 (2004).
- Kumar, P. P., Bawani, S. S., Anandhi, D. U., Prashanth, K. V. H. Rotenone mediated developmental toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 93, 103892 (2022).
- Gulyas, M., Bencsik, N., Pusztai, S., Liliom, H., Schlett, K. AnimalTracker: an ImageJ-based tracking API to create a customized behaviour analyser program. Neuroinformatics. 14 (4), 479-481 (2016).
- Qu, S. EasyFlyTracker: a simple video tracking Python package for analyzing adult Drosophila locomotor and sleep activity to facilitate revealing the effect of psychiatric drugs. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 15, 809665 (2022).
- Yarwais, Z. H., Najmalddin, H. O., Omar, Z. J., Mohammed, S. A. Automated data collection of Drosophila movement behaviour assays using computer vision in Python. International Journal of Innovative Approaches in Science Research. 4 (1), 15-22 (2020).
