Summary
في هذا البروتوكول ، تم تحسين تقنية معالجة زيت الضأن ل Epimedii folium (EF) من خلال تطبيق منهجية سطح التصميم والاستجابة التجريبية Box-Behnken ، وتم التحقيق بشكل أولي في تأثير EF الخام والمحسنة المستخرجة بالماء على التطور الجنيني لسمك الزرد.
Abstract
كطب صيني تقليدي (TCM) ، فإن Epimedii folium (EF) له تاريخ في الطب والغذاء > عمره 2000 عام. سريريا ، غالبا ما يستخدم EF المعالج بزيت لحم الضأن كدواء. في السنوات الأخيرة ، زادت تدريجيا تقارير مخاطر السلامة وردود الفعل السلبية للمنتجات التي تستخدم EF كمادة خام. يمكن أن تؤدي المعالجة إلى تحسين سلامة الطب الصيني التقليدي بشكل فعال. وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي ، يمكن أن تقلل معالجة زيت الضأن من سمية EF وتعزز تأثيرها التنغيم على الكلى. ومع ذلك ، هناك نقص في البحث والتقييم المنهجي لتكنولوجيا معالجة زيت الضأن EF. في هذه الدراسة ، استخدمنا منهجية سطح التصميم والاستجابة التجريبية Box-Behnken لتحسين المعلمات الرئيسية لتكنولوجيا المعالجة من خلال تقييم محتويات المكونات المتعددة. أظهرت النتائج أن تقنية معالجة زيت الضأن المثلى ل EF كانت على النحو التالي: تسخين زيت لحم الضأن عند 120 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية ، وإضافة EF الخام ، وقليه برفق إلى 189 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية حتى يصبح لامعا بالتساوي ، ثم إزالته وتبريده. لكل 100 كجم من EF ، يجب استخدام 15 كجم من زيت لحم الضأن. تمت مقارنة السمية والمسخة لمستخلص مائي من EF الخام وزيت الضأن المعالج في نموذج نمو جنين الزرد. أظهرت النتائج أن مجموعة الأعشاب الخام كانت أكثر عرضة للتسبب في تشوهات الزرد ، وكان تركيز EF المميت نصف الأقصى أقل. في الختام ، كانت تقنية معالجة زيت الضأن المحسنة مستقرة وموثوقة ، مع إمكانية تكرار جيدة. عند جرعة معينة ، كان المستخلص المائي من EF ساما لتطور أجنة الزرد ، وكانت السمية أقوى بالنسبة للدواء الخام من الدواء المعالج. أظهرت النتائج أن معالجة زيت الضأن قللت من سمية الخام EF. يمكن استخدام هذه النتائج لتحسين الجودة والتوحيد والسلامة السريرية ل EF المعالج بزيت الضأن.
Introduction
Epimedii folium (EF) هي الأوراق المجففة ل Epimedium brevicornu Maxim. ، Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) مكسيم ، إبيمديوم بوبيسنسنس مكسيم ، أو إبيميديوم كوريانوم ناكاي. يمكن استخدام EF لعلاج هشاشة العظام ومتلازمة انقطاع الطمث وكتل الثدي وارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب التاجية وأمراض أخرى1. كطب صيني تقليدي (TCM) ، تتمتع EF بتاريخ في الطب والغذاء لأكثر من 2000 عام. نظرا لانخفاض سعره وتأثيره الملحوظ في تنغيم الكلى ، فإنه يستخدم على نطاق واسع في الأدوية والأطعمة الصحية. تتم معالجة EF عن طريق قليها بزيت لحم الضأن ، وهي عملية تم وصفها لأول مرة في نظرية معالجة Lei Gong التي كتبها Lei Xiao في فترة Liu Song2. تختلف كفاءة EF الخام و EF المقلي تماما. يبدد EF الخام الروماتيزم بشكل أساسي ، في حين أن EF المقلي يسخن الكلى لتعزيز يانغ3. في الوقت الحاضر ، يستخدم EF على نطاق واسع كمادة خام في الأدوية والأطعمة الصحية. هناك 399 دواء صيني مدرج ، وتسعة أغذية صحية مستوردة ، و 455 من الأطعمة الصحية المحلية مع EF كمادة خام4. هذه المواد الطبية لديها آفاق تطبيق كبيرة. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، كانت هناك تقارير متزايدة عن ردود الفعل السلبية وإصابة الكبد البشري الناجمة عن الأطعمة الصحية وأدوية براءات الاختراع الصينية التي تستخدم EF كمادة خام ، وقد ذكرت دراسات السمية ذات الصلة5،6،7 أن EF كمادة خام لها مخاطر محتملة على السلامة.
تشير المعالجة الطبية الصينية إلى التقنيات الصيدلانية التي يمكن أن تقلل بشكل فعال أو تقضي على السمية وتحسن سلامة الطب الصيني التقليدي. طريقة المعالجة التقليدية ل EF هي القلي السريع بزيت لحم الضأن ، مما يقلل من سمية EF ويعزز تأثيره في تدفئة الكلى وتعزيز يانغ8. يتم تضمين طريقة المعالجة هذه في دستور الأدوية الصيني ومواصفات المعالجة المختلفة1. يتم تحديد عملية EF فقط على النحو التالي: لكل 100 كجم من EF ، تتم إضافة 20 كجم من الزيت الأمنيوسي (المكرر) ، ويتم إطلاقه بشكل خفيف حتى يصبح موحدا ولامعا1. لا توجد معلمات صارمة لطريقة معالجة EF في المعايير المذكورة أعلاه ، لذلك لم يتم توحيد مواصفات المعالجة المحلية لتوفير الاتساق. لذلك ، سيكون من المفيد إجراء دراسة منهجية لعملية EF. في هذا البحث ، تم استخدام طريقة سطح التصميم والاستجابة التجريبية Box-Behnken لتحسين تقنية معالجة EF.
التصميم التجريبي Box-Behnken هو طريقة تستخدم عادة لتحسين العوامل في العملية. يمكن تحسين معلمات الاستخراج من خلال إنشاء العلاقة الوظيفية بين عوامل ملاءمة معادلة الانحدار المتعددة وقيم التأثير. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة استخراج الطب الصيني التقليدي5،6،7 ومعالجة9،10،11. أبلغت دراسات مختلفة عن طرق تحضير الطب الصيني التقليدي التي تتضمن معالجة الملح ومعالجة النبيذ والقلي السريع وفقا لتصميم Box-Behnken ، مثل Psoraleae fructus 12 المعالج بالملح ، و Cnidii fructus13 المعالج بالنبيذ ، و Cinnamomi ramulus14 المحمص. لقد قللت هذه الطريقة من وقت الاختبار ، ودقة الاختبار العالية ، وهي مناسبة للاختبارات متعددة العوامل ومتعددة المستويات. الطريقة أبسط من طريقة اختبار التصميم المتعامد وأكثر شمولا من طريقة التصميم الموحدة15. يمكن للعلاقات التي تم الحصول عليها تحديد القيمة المتوقعة لأي نقطة اختبار ضمن نطاق الاختبار ، وهي ميزة كبيرة. يمكن استخدام نموذج الزرد لاختبار ما إذا كانت EF أقل سمية بعد المعالجة.
في دراسات سمية الطب الصيني التقليدي ، يتمتع نموذج الزرد بمزايا مزدوجة تتمثل في الإنتاجية العالية لتجارب الخلايا وأوجه التشابه مع تجارب القوارض16. يتميز هذا النموذج بصغر حجمه وارتفاع معدل التفريخ ودورة التكاثر القصيرة وسهولة التكاثر. يمكن استخدام النموذج في التجارب المتزامنة واسعة النطاق في لوحات زراعة الخلايا ، وجرعة الدواء التجريبية صغيرة ، والدورة التجريبية قصيرة ، والتكلفة منخفضة ، والعملية التجريبية بأكملها سهلة الملاحظة والتشغيل17. أجنة الزرد شفافة وتتطور بسرعة. لذلك ، يمكن ملاحظة السمية والآثار المسخية للأدوية على الأنسجة الحشوية في مراحل النمو المختلفة مباشرة تحت المجهر18. يصل التماثل الجيني بين الزرد والبشر إلى 85٪ 18. يشبه مسار نقل إشارة الزرد مسار البشر18. التركيب البيولوجي والوظيفة الفسيولوجية لسمك الزرد متشابهان إلى حد كبير مع تلك الموجودة في الثدييات18. لذلك ، يمكن أن يوفر نموذج الزرد لاختبار المخدرات تجريبية موثوقة وقابلة للتطبيق بشكل كامل على البشر19.
في هذه الدراسة ، استخدمنا منهجية سطح استجابة التصميم Box-Behnken لتحسين كمية ودرجة حرارة زيت الضأن ودرجة حرارة القلي المستخدمة في تقنية معالجة EF ، مع محتويات icariin و epimedin A و epimedin B و epimedin C و baohuoside I كمؤشرات تقييم. تم استخدام نموذج الزرد لاستكشاف أولي لتأثير مستخلص الماء EF على التطور الجنيني لسمك الزرد قبل وبعد المعالجة لتقييم تأثير التوهين للمعالجة على EF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب المتعلقة بالحيوان بموافقة من لجنة أخلاقيات التجارب التابعة لمعهد تشونغتشينغ للطب الصيني التقليدي (رقم شهادة مراجعة أخلاقيات المختبر: ZJS2022-03).
1. تحديد المكونات النشطة بيولوجيا
ملاحظة: الأنواع المستخدمة في هذا البحث كانت Epimedium sagittatum ، وتم جمع العينات في مقاطعة Fengdu ، تشونغتشينغ. تم تحديد العينة على أنها جزء جاف فوق سطح الأرض من E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) مكسيم. من قبل باحثين من معهد الطب البيولوجي ، معهد تشونغتشينغ للطب الصيني التقليدي.
- قم بإعداد محلول منتج التحكم عن طريق وزن الكمية المناسبة من كل مادة مرجعية بدقة ، وهي icariin و epimedin A (EA) و epimedin B (EB) و epimedin C (EC) و baohuoside I (BI) ، باستخدام ميزان تحليلي إلكتروني ، وتذوب في الميثانول. باستخدام هذه ، قم بإعداد محلول مخزون مرجعي مختلط يحتوي على 381.61 ميكروغرام / مل إيكارين ، 124.14 ميكروغرام / مل EA ، 110.24 ميكروغرام / مل EB ، 1091.75 ميكروغرام / مل EC ، و 184.98 ميكروغرام / مل BI.
- قم بإعداد حل منتج الاختبار عن طريق سحق EF من خلال غربال رقم 3. ضع ما يقرب من 0.2 جم (باستخدام ميزان تحليلي إلكتروني) من EF المسحوق في دورق Erlenmeyer سدادة ، وأضف 20 مل من الإيثانول المخفف ، ثم الموجات فوق الصوتية عند طاقة 400 واط وتردد 50 كيلو هرتز لمدة 1 ساعة. رج العبوة جيدا ، وقم بالمرور عبر مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر للحصول على محلول الاختبار.
- أداء اللوني على النحو التالي. استخدم كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) مع عمود C18 بأبعاد 4.6 مم × 250 مم وقطر داخلي 5 ميكرومتر. استخدم الأسيتونيتريل كمرحلة متنقلة A وماء فائق النقاء كمرحلة متنقلة B. استخدم معلمات شطف التدرج التالية: 0-30 دقيقة ، 24٪ A إلى 26٪ A ؛ 30-31 دقيقة ، 26٪ أ إلى 45٪ أ ؛ 31-45 دقيقة ، 45٪ A إلى 47٪ A. استخدم طولا موجيا للكشف يبلغ 220 نانومتر (للكاشف المستخدم ، انظر جدول المواد). حافظ على درجة حرارة العمود عند 30 درجة مئوية والسرعة الحالية عند 1.0 مل / دقيقة ، واستخدم حجم عينة 10 ميكرولتر.
- للتحقق من العلاقة الخطية، استخدم الحل المرجعي المختلط كما في الخطوة 1.1 المخففة مرتين و4 مرات و8 مرات و16 مرة و32 مرة، ل icariin وEA وEB وEC وBI، على التوالي. استخدم الأسيتونيتريل كمرحلة متنقلة A والماء عالي النقاء كمرحلة متنقلة B.
- استخدم معلمات شطف التدرج التالية: 0-30 دقيقة ، 24٪ A إلى 26٪ A ؛ 30-31 دقيقة ، 26٪ أ إلى 45٪ أ ؛ 31-45 دقيقة ، 45٪ A إلى 47٪ A. استخدم طولا موجيا للكشف يبلغ 220 نانومتر (للكاشف المستخدم ، انظر جدول المواد). حافظ على درجة حرارة العمود عند 30 درجة مئوية والسرعة الحالية عند 1.0 مل / دقيقة واستخدم حجم عينة 10 ميكرولتر. أخيرا ، سجل مناطق الذروة. ارسم الانحدار الخطي مع التركيز المرجعي (المحور السيني ، ميكروغرام / مل) كإحداثي ومنطقة الذروة (المحور ص) كإحداثي باستخدام برنامج احترافي (انظر جدول المواد).
- قم بإجراء اختبار الدقة عن طريق قياس محلول التحكم المختلط ست مرات متتالية بواسطة HPLC باستخدام الظروف الكروماتوغرافية الموضحة في الخطوة 1.3. سجل وقت الكشف ومناطق الذروة لكل تركيبة كيميائية ، واحسب الانحرافات المعيارية النسبية (RSD) لمناطق الذروة لتقييم الدقة (قابلية التكاثر) باستخدام الصيغة أدناه:
RSD٪ = الانحراف المعياري (SD) / المتوسط الحسابي للنتائج المحسوبة (X) × 100٪ - لإجراء اختبار قابلية التكاثر ، قم بوزن مسحوق EF بدقة ، وقم بإعداد ستة أجزاء من محلول منتج الاختبار بالتوازي وفقا للطريقة الواردة في الخطوة 1.2. إخضاع الحلول المعدة ل HPLC في ظل الظروف الكروماتوغرافية المعروضة في الخطوة 1.3. سجل أوقات الاحتفاظ ومناطق الذروة لكل تركيبة كيميائية واحسب كميات كل مركب من منحنى قياسي (مناطق الذروة مقابل التركيزات). احسب RSD٪ على النحو الوارد أعلاه.
- لإجراء اختبار الثبات ، قم بتخزين محاليل الاختبار في درجة حرارة الغرفة ، وقم بقياس محتوياتها بطريقة HPLC الموضحة في الخطوة 1.3 عند 0 ساعة و 2 ساعة و 4 ساعات و 8 ساعات و 12 ساعة و 24 ساعة بعد التحضير لتقييم الاستقرار. سجل أوقات الاحتفاظ ومناطق الذروة لكل تركيبة كيميائية واحسب RSD٪ من مناطق الذروة على النحو الوارد أعلاه.
- لإجراء اختبار استعادة العينة، قم بوزن 0.2 غرام من مسحوق EF في دورق Erlenmeyer سدادة لستة تكرارات. أضف كمية مناسبة من المحلول المرجعي (كمية المادة المرجعية المضافة إلى العينة تعادل 100٪ من المحتوى المعروف للعينة) وقم بإعداد محلول الاختبار وفقا للطريقة الموضحة في الخطوة 1.2.
- حقن العينات في الكروماتوجراف وتحليلها وفقا للظروف الكروماتوغرافية في الخطوة 1.3. سجل مناطق الذروة ، واحسب متوسط قيم الاسترداد و RSD٪ على النحو التالي:
معدل استرداد العينة المسننة = (محتوى العينة المسننة - محتوى العينة) / مقدار العينة × 100٪
2. تحسين تقنية معالجة زيت الضأن EF باستخدام منهجية سطح استجابة التصميم Box-Behnken
- حدد المعلمات الرئيسية في معالجة EF ، مثل كمية زيت لحم الضأن (A ؛ 15٪ -35٪) ، ودرجة حرارة زيت لحم الضأن (B ؛ 50-120 درجة مئوية) ، ودرجة حرارة القلي (C ؛ 80-300 درجة مئوية) ، كعوامل مؤثرة. استخدم الدرجات الشاملة لمحتوى icariin و EA و EB و EC و BI كفهارس تقييم. النسبة المئوية لزيت لحم الضأن هنا هي النسبة المئوية للكتلة.
- استخدم برنامج تحليل سطح الاستجابة (انظر جدول المواد) لتصميم تجارب سطح استجابة Box-Behnken ، واستكشاف سطح الاستجابة التربيعي ، وبناء نموذج متعدد الحدود من الدرجة الثانية. حدد تصميم Box-Behnken الجديد ، واضبط خيار العوامل الرقمية على 3 ؛ اضبط العوامل A و B و C. انقر فوق متابعة. قم بتعيين خيار الردود إلى 1 (وهي النتيجة الشاملة). انقر فوق متابعة لإكمال التصميم. تم التخطيط لما مجموعه 17 تجربة (انظر الجدول 1).
ملاحظة: للاطلاع على المتغيرات المستقلة والتابعة، إلى جانب مستوياتها المنخفضة والمتوسطة والعالية، انظر الجدول 2. - معالجة EF وفقا للمعايير المحددة في الجدول 1 ؛ على سبيل المثال ، بالنسبة للطلب رقم 1 ، قم بوزن زيت لحم الضأن المكرر بنسبة 15٪ فولت / فولت ، ثم سخنه إلى 50 درجة مئوية لإذابته. يضاف EF الخام إلى لحم الضأن المذاب ، ويقلب على نار خفيفة (190 درجة مئوية) حتى يصبح لامعا بالتساوي ، ثم يرفع ويبرد. أجرى 17 عملية تجريبية. تم الحصول على ما مجموعه 17 مجموعة من المنتجات المعالجة EF في هذا العمل.
ملاحظة: زيت لحم الضأن صلب في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ويذوب في سائل عند تسخينه. يمكن استخدام زيت لحم الضأن في الحالة السائلة كسواغ. - قم بإعداد حلول الاختبار للمنتجات المصنعة وفقا للطريقة الموضحة في الخطوة 1.2. ثم قم بتحليلها باستخدام HPLC وفقا للظروف الكروماتوغرافية الموضحة في الخطوة 1.3. سجل أوقات الاحتفاظ ومناطق الذروة لكل تركيبة كيميائية ، واحسب محتويات icariin و EA و EB و EC و BI في كل حل اختبار مقابل منحنى قياسي خارجي. استخدم صيغة حساب النتيجة الشاملة أدناه لحساب الدرجات الشاملة للمجموعات التجريبية ال 17:
الدرجة الشاملة = Z / Zكحد أقصى × 0.5 + BI/ BI بحد أقصى × 0.5
حيث Z هو مجموع محتويات icariin و EA و EB و EC ؛ Zmax هي القيمة القصوى لمجموع محتويات icariin و EA و EB و EC في 17 مجموعة تجريبية ؛ BI هو محتوى BI. و BImax هي القيمة القصوى لمحتوى BI في 17 مجموعة تجريبية. - استيراد نتائج التسجيل الشاملة لمجموعات التجارب ال 17 إلى برنامج تحليل البيانات (انظر جدول المواد) لتحليل البيانات التجريبية. ضمن عناصر التقييم، حدد خيار ترتيب العملية التربيعية وخيار نوع النموذج متعدد الحدود.
3. اختبار تأثير المعالجة على التطور الجنيني لسمك الزرد
- إعداد العينة
- سحق الخام ومعالجة EF من خلال غربال رقم 3 (انظر جدول المواد). إلى 100 جم من كل عينة EF ، أضف 1000 مل من الماء عالي النقاء. انقع EF لمدة 0.5 ساعة ، وقم بغلي الماء مرتين لمدة 30 دقيقة لكل منهما ، ثم قم بالتصفية باستخدام ورق الترشيح.
- الجمع بين الترشيحات وتركيز العينة عن طريق التسخين. أضف الماء عالي النقاء إلى حجم نهائي يبلغ 100 مل للحصول على حلول مخزون EF (PEF ، 1 جم / مل) والخام EF (CEF ، 1 جم / مل). قياس كمية الدواء الخام في كل محلول مخزون.
- ضع حصصا من 1 مل و 1.5 مل و 2.5 مل و 5 مل و 7.5 مل في قوارير حجمية سعة 10 مل ، ثم أضف ماء عالي النقاء إلى الحجم لإعداد محاليل الاختبار بتركيزات 100 مجم / مل ، 150 مجم / مل ، 200 مجم / مل ، 250 مجم / مل ، 500 مجم / مل ، و 750 مجم / مل لدراسة السمية الجنينية لسمك الزرد.
ملاحظة: تم تحضير تركيزات محاليل الاختبار بالرجوع إلى الأدبيات ذات الصلة 20،21 وبإجراء تجارب أولية لإعطاء تدرج التركيز10 أضعاف المستخدم في علم السموم الطبيعي. وكان المركز عينة غير مجهزة، وكان صندوق PEF عينة أعدت بأفضل تكنولوجيا المعالجة الموصوفة في القسم 2.
- تربية الزرد وعلاج الأجنة21
- تكييف الزرد من النوع البري (انظر جدول المواد) في درجة حرارة خاضعة للرقابة لمدة 2 أيام ، والاحتفاظ بها في حوض السمك المتدفق في درجة الحموضة 7.0-7.4 وإطعامهم مرتين يوميا.
ملاحظة: تم تثبيط تكوين الميلانين في الزرد بإضافة 1-فينيل-2-ثيوريا بتركيز 0.003٪ (كتلة / حجم) إلى وسط الاستزراع ، مما أبقى أجسامهم شفافة للمراقبة المورفولوجية. - اختر الزرد البري الخصب البالغ في المساء وافصله باستخدام الحواجز في صناديق التزاوج. قم بإزالة الحواجز في صباح اليوم التالي ، واترك السمك يفرخ لمدة 30 دقيقة. جمع البيض المخصب مع قطارة كل 15 دقيقة. في المجموع ، تم جمع 520 جنينا بريا سليما. احتفظ بأجنة الزرد في حاضنة عند 28.5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- تعيين الأجنة السليمة بشكل عشوائي في 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) إلى 13 مجموعة ، جنبا إلى جنب مع مجموعة واحدة ، نقع بشكل منفصل في 10 مل من كل من الحلول التالية في طبق الاستزراع: PEF: 100 ميكروغرام / مل ، 150 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل ، 250 ميكروغرام / مل ، 500 ميكروغرام / مل ، 750 ميكروغرام / مل ؛ CEF: 100 ميكروغرام / مل ، 150 ميكروغرام / مل ، 200 ميكروغرام / مل ، 250 ميكروغرام / مل ، 500 ميكروغرام / مل ، 750 ميكروغرام / مل. تعامل مع مجموعة التحكم الفارغة مع الوسيط كحل. احتوت كل مجموعة على 40 جنينا في هذه الدراسة.
ملاحظة: التركيب المتوسط هو 0.15 M NaCl و 5 mM KCl و 0.25 mMNa2 HPO 4 و 0.45 mM KH 2 PO 4 و 1.3 mM CaCl2و 1.0 mM MgSO 4 و 4 mM NaHCO3. - استزرع الزرد في حاضنة درجة حرارة ثابتة تصل إلى 120 حصان. عد عدد اليرقات الميتة كل يوم ، ولاحظ مورفولوجيا الأعضاء الرئيسية لليرقات في كل مجموعة تجريبية تحت المجهر المجسم (شريط المقياس = 500 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) ، واحسب تركيز نصف الموت (LC50) لسمك الزرد عند 72 hpf باستخدام برنامج تحليل البيانات (انظر جدول المواد).
- تكييف الزرد من النوع البري (انظر جدول المواد) في درجة حرارة خاضعة للرقابة لمدة 2 أيام ، والاحتفاظ بها في حوض السمك المتدفق في درجة الحموضة 7.0-7.4 وإطعامهم مرتين يوميا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائج التحقيق المنهجي
لوحظت علاقة خطية بين تركيز icariin و EA و EB و EC و BI ومناطق الذروة الكروماتوغرافية (انظر الجدول 3). كانت قيم RSD٪ (n = 6) لمناطق الذروة الكروماتوغرافية ل icariin و EA و EB و EC و BI 0.28٪ و 1.22٪ و 0.65٪ و 1.67٪ و 1.06٪ على التوالي ، مما يشير إلى أن دقة قياسات HPLC كانت جيدة. كانت قيم RSD٪ (n = 6) لمحتويات icariin و EA و EB و EC و BI 1.59٪ و 1.46٪ و 1.86٪ و 2.29٪ و 0.98٪ على التوالي ، مما يشير إلى أن الطريقة تتمتع بتكرار جيد. كانت قيم RSD٪ (n = 6) لمناطق الذروة من icariin و EA و EB و EC و BI في العينات 1.49٪ و 1.96٪ و 1.42٪ و 0.96٪ و 0.81٪ على التوالي ، مما يشير إلى أن محلول العينة كان مستقرا خلال 24 ساعة. كان متوسط معدلات استرداد icariin و EA و EB و EC و BI 99.98٪ و 100.14٪ و 100.09٪ و 100.75٪ و 100.94٪ على التوالي ، وكانت قيم RSD٪ 0.56٪ و 0.78٪ و 0.84٪ و 1.10٪ و 1.47٪ على التوالي (انظر الجدول 4). تظهر هذه النتائج أن دقة الطريقة تفي بالمتطلبات.
أظهرت النتائج التجريبية المذكورة أعلاه أن الطريقة التحليلية قدمت نتائج ذات دقة وقابلية استنساخ ودقة ممتازة وكانت مقبولة لتحليل جودة المنتجات المعالجة ب EF.
تحسين تقنية معالجة زيت الضأن في EF من خلال تطبيق منهجية سطح استجابة التصميم Box-Behnken
أجرينا تركيب الانحدار متعدد الحدود التربيعي للبيانات المذكورة أعلاه للحصول على النموذج التالي: Y = 0.86 - 0.11 × A + 0.025 × B - 0.078 × C - 0.023 × A x B - 0.037 x A x C + 0.037 x B x C - 0.045 x A 2 + 2.5 × 10-3 x B 2 - 0.14 x C2. أعطى تحليل التباين قيمة P < 0.01 ، مما يشير إلى أن النموذج كان مهما. كانت قيمة P لعدم الملاءمة P > 0.05 ، مما يشير إلى أن عدم الملاءمة لم يكن كبيرا. كانت قيمة R2 0.9300 ، مما يشير إلى أن ملاءمة النموذج كانت جيدة ، وكان الخطأ صغيرا. كان من الممكن استخدام هذا النموذج لتحليل وتوقع تأثير محتوى التركيب الكيميائي ل EF المقلي بزيت الضأن. بالإضافة إلى ذلك ، كان ل A 2 و D2 تأثير على محتوى المنتجات المصنعة ، وكان الفرق ذا دلالة إحصائية (P < 0.01). كانت تأثيرات A و C لمصطلح الدرجة الواحدة و C2 من مصطلح الدرجة الثانية على النتيجة الشاملة كبيرة. لم يكن للمصطلح B من الدرجة الواحدة ، والدرجة الثانية A 2 ، B2 ، وجميع عناصر التفاعل تأثير كبير على النتيجة الشاملة. أظهر تحليل قيم P أنه من بين المعلمات التجريبية ، كان لكمية زيت الضأن (A) التأثير الأكبر على الدرجة الشاملة ، تليها درجة حرارة القلي (C) ، ثم درجة حرارة زيت الضأن (B). النتائج المذكورة أعلاه موضحة في الجدول 5.
تم استخدام البرنامج لضبط كمية زيت لحم الضأن ودرجة حرارة زيت الضأن ودرجة حرارة القلي على المتوسطات واستخدام النتيجة الشاملة كمؤشر لرسم مخطط تأثير أحادي العامل لعامل واحد (الشكل 1). أدت زيادة درجة حرارة القلي أولا إلى زيادة النتيجة الشاملة ثم خفضها (الشكل 1). كان لدرجة حرارة زيت لحم الضأن تأثير ضئيل على النتيجة الشاملة. كانت كمية زيت الضأن هي العامل الرئيسي المهم الذي أثر على التغيير في النتيجة الشاملة ، ومع زيادة الكمية ، اتجه المحتوى نحو الانخفاض.
للمساعدة في فهم النتائج بشكل أفضل ، يتم تقديم النماذج المتوقعة في الشكل 2 كمخططات سطحية استجابة 3D. من حيث ميل سطح الاستجابة ، كلما زادت أهمية تأثير التفاعل بين العوامل ، كان المنحدر ألطف ، وأقل أهمية التأثير. يشير القطع الناقص على شكل خط كفاف إلى تفاعل قوي بين العوامل ، بينما تشير الدائرة إلى عكس ذلك. كان سطح استجابة كمية زيت الضأن ودرجة حرارة القلي أكثر حدة مقارنة بالعوامل الأخرى المختبرة ، وكانت الخطوط الكنتورية تميل إلى أن تكون أكثر بيضاوية الشكل (انظر الشكل 2C ، D) ، مما يشير إلى أن التفاعل بين هذين العاملين كان أكثر أهمية. في المقابل ، لم تكن التفاعلات بين العوامل الأخرى مهمة (انظر الشكل 2 أ ، ب ، ه ، و).
تم اختيار تقنية معالجة زيت الضأن المثلى ل EF على النحو التالي: كمية زيت لحم الضأن 15٪. درجة حرارة زيت لحم الضأن 120 درجة مئوية ؛ ودرجة حرارة القلي 189 درجة مئوية. بالنظر إلى أنه لا يمكن التحكم في درجة الحرارة بدقة شديدة في التشغيل الفعلي ، يتم تحديد قيمة درجة الحرارة كمتغير ±10 درجة مئوية. لذلك ، كانت المعلمات النهائية على النحو التالي: كمية زيت لحم الضأن بنسبة 15 ٪. درجة حرارة زيت لحم الضأن 120 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية ؛ ودرجة حرارة القلي 189 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية. كانت العملية المثلى على النحو التالي: تسخين زيت لحم الضأن عند 120 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية ، وإضافة EF الخام ، وقليه بنار لطيفة (189 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية) حتى يصبح لامعا بالتساوي ، وإزالته وتبريده. لكل 100 كجم من EF ، يجب استخدام 15 كجم من زيت لحم الضأن (الزيت المكرر). باستخدام هذه الظروف ، أجريت ثلاث تجارب متوازية ، وكانت الدرجات التي تم الحصول عليها 0.96 و 0.97 و 0.94 (RSD٪ = 1.60٪) ، مما يشير إلى ظروف مستقرة ومجدية. يوضح الشكل 3 مخططات كروماتوجرام HPLC النموذجية للمواد المرجعية الخام والمعالجة والمختلطة ل EF.
اختبار تأثير المعالجة على التطور الجنيني لسمك الزرد
فقس الزرد إلى أحداث عند 72 حصان. كان تطوير كل جهاز كاملا بشكل أساسي. ظلت أجسام الأسماك شفافة ، وكان من السهل وضعها على جانبها على الشريحة الزجاجية. كان من السهل ملاحظة أشكال الأعضاء وتحديدها عند عرضها تحت المجهر. لم تشهد المجموعة الضابطة الفارغة أي وفاة أو سمية للأعضاء خلال فترة الإعطاء. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، عند تركيز دواء يبلغ 100 ميكروغرام / مل ، لم يتم العثور على تشوهات واضحة في مجموعة EF الخام (S) والمجموعة المعالجة (P) عند 72 hpf. عند 96 hpf وما بعده ، كان عدم اكتمال المثانة السباحة وفقدان مثانة السباحة أكثر شيوعا في الأسماك اليافعة في المجموعة الخام ولكنها كانت نادرة في الأسماك اليافعة في المجموعة المعالجة. عند تركيز الدواء 150 ميكروغرام / مل ، شوهدت تشوهات العمود الفقري الواضحة ، وتشوهات انحناء الجسم ، وذمة التامور ، وتشوه الكبد في الأسماك اليافعة في المجموعة الخام عند 72 hpf ، ولكن هذه التغييرات كانت نادرة في الأسماك اليافعة في المجموعة المعالجة ، وكانت درجة المسخية أضعف من المجموعة الخام. وعند تركيز دواء قدره 200 ميكروغرام/مل، نفقت جميع الأسماك اليافعة في المجموعة الخام، وظهرت ماسخة واضحة في الأسماك اليافعة في المجموعة المصنعة. وعند تركيز دواء قدره 250 ميكروغرام/مل، نجا عدد صغير من أسماك الزرد في المجموعة المعالجة. تظهر نتائج الفحص المجهري لسمك الزرد في الشكل 4.
تعتمد معدلات نفوق أسماك الزرد في مجموعات أعشاب Epimedium الخام والمعالجة على تركيز ووقت تناولها. يوضح الشكل 5 العلاقة بين الوقت والجرعة والوفيات. أظهرت نتائج نفوق أسماك الزرد أنه بعد 24 ساعة من الإعطاء (48 hpf) ، بتركيز دواء قدره 200 ميكروغرام / مل ، مات جميع أسماك الزرد في مجموعة الأدوية الخام ، في حين أن معدل الوفيات في المجموعة المعالجة كان 6.67٪ فقط. عند 48 ساعة بعد إعطاء EF (72 hpf) ، كان التركيز الذي تسبب في نفوق جميع أسماك الزرد في مجموعة الأدوية الخام 200 ميكروغرام / مل ، وكان التركيز الذي تسبب في نفوق جميع أسماك الزرد في المجموعة المعالجة 500 ميكروغرام / مل. تم حساب متوسط التركيز المميت للمجموعتين التجريبيتين عند 72 hpf. أظهرت النتائج أن LC50 (انظر الشكل 6) كان 151.3 ميكروغرام / مل في المجموعة الخام (S) و 219.8 ميكروغرام / مل في المجموعة المعالجة (P).
الشكل 1: تحليل أحادي المتغير. يوضح الشكل مخطط التأثير أحادي العامل. A هي النتيجة أحادية العامل لكمية زيت لحم الضأن (الشحم) ؛ B هي النتيجة أحادية العامل لدرجة حرارة زيت لحم الضأن (الشحم) ؛ و C هي النتيجة أحادية العامل لدرجة حرارة القلي. مع زيادة درجة حرارة القلي ، تزداد النتيجة الشاملة أولا ثم تنخفض. درجة حرارة زيت الضأن لها تأثير ضئيل على النتيجة. كانت كمية زيت الضأن هي العامل الرئيسي المهم الذي يؤثر على التغيير في النتيجة الشاملة ، وأظهر المحتوى اتجاها هبوطيا مع زيادة كمية زيت لحم الضأن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سطح الاستجابة والمخطط الكنتوري لتأثير تفاعلات العوامل المختلفة على النتيجة الشاملة. (أ) يوضح هذا الشكل مخطط سطح استجابة 3D للتفاعل بين كمية زيت لحم الضأن ودرجة الحرارة. (ب) يوضح هذا الشكل مخططا كنتوريا للتفاعل بين كمية زيت لحم الضأن ودرجة الحرارة. (ج) يوضح هذا الشكل مخططا سطحيا لاستجابة 3D للتفاعل بين كمية زيت لحم الضأن ودرجة حرارة المعالجة. (د) يوضح هذا الشكل مخططا كنتوريا للتفاعل بين جرعة زيت لحم الضأن ودرجة حرارة المعالجة. (ه) يوضح هذا الشكل مخططا سطحيا لاستجابة 3D للتفاعل بين كمية زيت لحم الضأن ودرجة حرارة المعالجة. (F) يوضح هذا الشكل مخططا كنتوريا للتفاعل بين كمية زيت لحم الضأن ودرجة حرارة المعالجة. أظهرت النتائج أن سطح الاستجابة لكمية زيت لحم الضأن ودرجة حرارة القلي كان حادا ، مقارنة بالمعلمات الأخرى التي تم اختبارها وتميل الخطوط الكنتورية إلى أن تكون بيضاوية الشكل (انظر C ، D) ، مما يشير إلى أن التفاعل بين هذين العاملين كان كبيرا ، في حين أن التفاعلات بين العوامل الأخرى لم تكن كبيرة (انظر A ، B ، E ، F). يشير مصطلح زيت الشحم المستخدم في الشكل إلى زيت لحم الضأن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كروماتوجرام HPLC للمواد المرجعية الخام والمعالجة والمختلطة ل EF. (أ) يوضح هذا الشكل مخطط كروماتوجرام HPLC للمادة المرجعية المختلطة. (ب) يوضح هذا الشكل كروماتوجرام HPLC لورقة Epimedii الخام. (ج) يوضح هذا الشكل مخطط كروماتوجرام HPLC للمنتجات المصنعة لفوليوم Epimedii. توضح هذه الصور الثلاث أن محتوى BI في EF الخام منخفض ، بينما يزداد بعد المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الصور المجهرية لسمك الزرد. يوضح هذا الشكل الصور المجهرية لسمك الزرد. (أ) يوضح هذا الشكل نتائج رصد سمك الزرد تحت المجهر في المجموعة الفارغة. (ب) يوضح هذا الشكل نتائج مراقبة الزرد تحت المجهر في المجموعة الخام. (ج) يوضح هذا الشكل نتائج مراقبة سمك الزرد تحت المجهر في المجموعة المعالجة. لم تشهد المجموعة الضابطة الفارغة أي وفاة أو سمية للأعضاء خلال فترة الإعطاء. عند تركيز دواء EF يبلغ 150 ميكروغرام / مل ، شوهدت تشوهات واضحة في العمود الفقري ، وانحناء الجسم ، وذمة التامور ، وتشوه الكبد في الأسماك اليافعة في المجموعة الخام عند 72 hpf ، في حين كانت هذه التغييرات نادرة في الأسماك اليافعة في المجموعة المعالجة ، وكانت درجة المسخية أضعف من تلك الموجودة في المجموعة الخام. عند تركيز الدواء 200 ميكروغرام / مل ، ماتت جميع الأسماك اليافعة في المجموعة الخام ، وظهرت ماسخة واضحة في المجموعة المعالجة. وعند تركيز دواء قدره 250 ميكروغرام/مل، نجا عدد قليل فقط من أسماك الزرد في المجموعة المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: العلاقة بين وقت الجرعات والجرعة والوفيات. يوضح هذا الشكل العلاقة بين وقت الجرعات والجرعة والوفيات. (أ) يوضح هذا الشكل العلاقة بين الجرعات والجرعة والوفيات للمجموعة الخام. (ب) يوضح هذا الشكل العلاقة بين وقت الجرعات والجرعة والوفيات للمجموعة المعالجة. ن = 40. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: رسم تخطيطي LC50 للنفط الخام والمعالج EF. يظهر مخطط LC50 ل EF الخام والمعالج. تم حساب متوسط التركيزات المميتة للمجموعتين التجريبيتين عند 72 hpf. كان LC50 151.3 ميكروغرام / مل في مجموعة الخام (S) و 219.8 ميكروغرام / مل في مجموعة المعالجة (P). ن = 40. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: التصميم التجريبي ونتائج طريقة سطح استجابة Box-Behnken ل 17 مجموعة من التجارب. يوضح الجدول 1 17 مجموعة من التجارب التي صممتها طريقة سطح Box-Behnken للتصميم والاستجابة ونتائج درجاتها الشاملة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: المتغيرات المستخدمة في تصميم Box-Behnken. يتم سرد المتغيرات المستقلة والتابعة هنا جنبا إلى جنب مع مستوياتها المنخفضة والمتوسطة والعالية. مكن تصميم Box-Behnken من تحديد العوامل الأكثر تأثيرا في معالجة EF ، مع كمية زيت الضأن (A) (15٪ -35٪) ، ودرجة حرارة زيت الضأن (B) (50 °C -120 °C) ، ودرجة حرارة القلي (C) (80 °C -300 °C) كعوامل مؤثرة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: معادلات الانحدار والنطاقات الخطية للمكونات الكيميائية ل EF. أظهرت نتائج معادلة الانحدار والمدى الخطي للتركيب الكيميائي EF أن هناك خطية جيدة بين كل من تركيزات icariin و EA و EB و EC و BI ومناطق الذروة الكروماتوغرافية الخاصة بهم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: معدلات اختبار استرداد العينة. كان متوسط معدلات استرداد icariin و EA و EB و EC و BI 99.98٪ و 100.14٪ و 100.09٪ و 100.75٪ و 100.94٪ على التوالي ، وكانت قيم RSD٪ 0.56٪ و 0.78٪ و 0.84٪ و 1.10٪ و 1.47٪ على التوالي. أظهرت النتائج أن دقة الطريقة كانت مناسبة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 5: معاملات الانحدار للنموذج التربيعي المتوقع. كانت قيمة P للنموذج P < 0.01 ، مما يشير إلى أن النموذج كان مهما. كانت القيمة P لعدم الملاءمة P > 0.05 ، مما يشير إلى أن عدم الملاءمة لم يكن كبيرا. كانت قيمة R2 0.9300 ، مما يشير إلى أن ملاءمة النموذج كانت جيدة ، وكان الخطأ صغيرا ، لذلك كان النموذج مناسبا لتحليل وتوقع تأثير محتوى التركيب الكيميائي ل EF المقلي بزيت الضأن. بالإضافة إلى ذلك ، كان ل A 2 و D2 تأثيرات كبيرة على محتوى المنتجات المصنعة (P < 0.01). كانت تأثيرات A و C من مصطلح الدرجة الواحدة و C2 من الحد من الدرجة الثانية على النتيجة الشاملة كبيرة. لم يكن للمصطلح B من الدرجة الواحدة ، والدرجة الثانية A 2 ، و B2 ، وجميع عناصر التفاعل أي تأثيرات كبيرة على النتيجة الشاملة. أظهر تحليل قيمة P أنه من بين المعلمات التجريبية ، كان لكمية زيت الضأن (A) التأثير الأكبر على النتيجة الشاملة ، تليها درجة حرارة القلي (C) ، ثم درجة حرارة زيت لحم الضأن (B). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المتغيرات المستقلة وتحديد مستوياتها
تم وصف تقنية معالجة EF فقط في إصدار 2020 من دستور الأدوية الصيني ومواصفات معالجة الأدوية الصينية المحلية المنشورة من قبل 26 مقاطعة وبلدية ومنطقة ذاتية الحكم في جميع أنحاء البلاد1. يتضمن الوصف الخطوات التالية: أخذ زيت لحم الضأن وتسخينه ليذوب ، وإضافة قطع EF ، والقلي السريع بنار بطيئة حتى يصبح موحدا ولامعا ، وإخراجه ، وتركه يبرد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام 20 كجم (يختصر باسم 20٪) من زيت لحم الضأن (المكرر) لكل 100 كجم من Epimedium. ومع ذلك ، لم يتم تحديد معلمات عملية معالجة EF. من بين المتغيرات المستقلة في هذه التجربة ، يمكن قياس ثلاثة عوامل رئيسية في عملية الإنتاج: جرعة زيت لحم الضأن ، ودرجة حرارة زيت الضأن ، ودرجة حرارة القلي. يجب تعيين نطاق القيمة وفقا للوصف أعلاه. من نتائج الاختبار الأولي ، يمكن ملاحظة أنه عندما تكون كمية زيت الضأن 15٪ ، يمكن طلاء أوراق EF بالتساوي بزيت لحم الضأن. عندما تتجاوز الجرعة 35٪ ، يكون هناك الكثير من زيت الضأن. أخيرا ، يجب أن يكون نطاق كمية زيت الضأن 15٪ -35٪. عندما تصل درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية ، يذوب زيت لحم الضأن. عندما تصل درجة الحرارة إلى >120 درجة مئوية ، يبدأ زيت لحم الضأن في التدخين ، وتكون درجة الحرارة مرتفعة للغاية. لذلك ، يجب أن يكون نطاق درجة حرارة زيت الضأن 50 °C -120 °C. ينص إصدار دستور الأدوية الصيني لعام 2020 على أنه يجب قلي EF بنار بطيئة. يجب ألا تتجاوز النار البطيئة 200 درجة مئوية ، ويجب أن تتراوح درجة حرارة القلي من 80 درجة مئوية إلى 300 درجة مئوية.
تسجيل شامل
أثناء معالجة Epimedium ، يتم كسر الروابط الجليكوسيدية ، وتتحول مكونات الجليكوسيديك إلى مكونات جليكوسيدية أقل. يعتمد تحديد محتوى المنتجات المعالجة ب EF في إصدار 2020 من دستور الأدوية الصيني على تحديد المحتوى الكلي لل icariin و EA و EB و EC في المواد الطبية الأصلية ، ويتم سرد مكون أحادي الجليكوزيد ، BI ، بشكل منفصل كمؤشر. في هذه التجربة ، كان الوزن الإجمالي ل icariin و EA و EB و EC في EF المعالج 50٪ ، وكان وزن BI 50٪ ، وتم تعيين النتيجة الشاملة بناء على هذه القيم.
منهجية سطح الاستجابة (RSM) هي تقنية إحصائية لتحديد معلمات العملية المثلى وحل المشكلات متعددة المتغيرات. في هذه التقنية ، يتم استخدام تصميم تجريبي معقول للحصول على بيانات معينة من خلال التجارب ، ويتم استخدام معادلة الانحدار التربيعي متعددة المتغيرات لاشتقاق علاقة وظيفية بين العوامل والاستجابات22. يشيع استخدام التصميم الموحد وتحسين عملية التصميم المتعامد ، لكن دقة الاختبار ليست عالية ، والنموذج الرياضي لا يمكن التنبؤ به للغاية. النموذج الرياضي الكامن وراء RSM يمكن التنبؤ به للغاية. يتطلب RSM تجارب أقل ودورات أقصر ، والتي لا يمكن أن تقضي على المشكلات المرتبطة بالإحصاء الرياضي التقليدي فحسب ، بل يمكنها أيضا توضيح العلاقات بين العوامل والاستجابات23. يتصور RSM استجابة النظام كدالة لعامل واحد أو أكثر ويستخدم تقنيات رسومية لعرض هذه العلاقة الوظيفية لمساعدة المستخدم على اختيار الظروف المثلى في التصميم التجريبي من خلال الملاحظة البصرية البديهية. وقد أدت هذه المزايا إلى الاستخدام الواسع لهذه الطريقة في الصناعة الكيميائية24 ، والهندسة البيولوجية ، وصناعة الأغذية25 ، وصناعة الأدوية ، ومستحضرات الطب الصيني التقليدي.
على الرغم من أن RSM يمكنها تحديد العلاقة الوظيفية بين الاستجابات (الفهارس التي سيتم التحقيق فيها) والعوامل (المتغيرات المستقلة) ، إلا أن جميع التجارب ليست مناسبة لتحسين سطح الاستجابة لأنه لا توجد دائما علاقة وظيفية قوية بين الاستجابة والعوامل. غالبا ما يحصل RSM على علاقات دوال مستمرة ، والتي تتطلب أن تكون جميع العوامل متغيرات مستمرة. ومع ذلك ، ليست كل العوامل التي سيتم التحقيق فيها متغيرات مستمرة أو لها تأثيرات كبيرة على قيم الاستجابة في بداية التصميم التجريبي. لتقليل عدد التجارب وتحسين دقة نمذجة سطح الاستجابة ، يعد الفحص ضروريا لتحديد العوامل المهمة وتحديد مستوياتها من خلال التصميم العاملي أو التصميم الموحد أو التصميم المتعامد قبل إجراء منهجية تصميم سطح الاستجابة. أكبر ميزة لمنهجية سطح الاستجابة هي أنه بمجرد إنشاء النموذج بشكل صحيح ، يمكن التنبؤ بقيمة الاستجابة تحت أي مجموعة من الظروف ، ويمكن رؤية العلاقة الوظيفية بشكل أكثر حدسية وبصريا من خلال سطح استجابة 3D. هذا التصور هو مساعدة كبيرة للباحثين في العثور على ظروف المعالجة المثلى26.
استخدمت هذه الدراسة مبدأ تصميم Box-Behnken ل RSM لتصميم 17 تجربة مجمعة باستخدام درجة المحتوى الكيميائي الشاملة ل EF كقيمة استجابة. أخيرا ، تم الحصول على أفضل نتائج تحسين العملية من خلال تحليل الانحدار. تم تحسين تقنية المعالجة على النحو التالي: تسخين زيت لحم الضأن عند 120 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية ، وإضافة EF الخام ، وقليه بنار لطيفة (189 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية) حتى يصبح لامعا بالتساوي ، ثم إزالته وتبريده. لكل 100 كجم من EF ، يجب استخدام 15 كجم من زيت لحم الضأن (الزيت المكرر). أظهرت نتائجنا أن عملية EF كانت مستقرة وموثوقة وقابلة للتكرار. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل تفاعلات العوامل ، وكان التفاعل بين كمية زيت لحم الضأن ودرجة حرارة القلي ، ولكن ليس التفاعلات بين العوامل الأخرى ، كبيرا. أظهرت هذه الدراسة أن تصميم سطح الاستجابة ، كطريقة لتحليل التفاعلات بين العوامل والعلاقات بين العوامل وقيم سطح الاستجابة الخاصة بها ، مكن من تحسين ظروف المعالجة في فترة قصيرة مع الحد الأدنى من التجارب. كانت العوامل المختارة في هذه الدراسة هي العوامل الرئيسية التي تم تحديدها في تجربة الفحص أحادية العامل ، وتم تحديد مستوياتها في تجربة أولية. تطابقت عينات الاختبار مع خصائص طريقة سطح الاستجابة ، لذلك تمكنت الدراسة من استخدام منهجية سطح الاستجابة لإنشاء نموذج تنبؤي. يمكن أن توفر النتائج التجريبية مرجعا لتحسين جودة وتوحيد EF المعالج.
تستخدم أجنة الزرد ككائنات نموذجية في مجال علم الوراثة التنموية لأنها شفافة وتتطور في المختبر ويسهل ملاحظتها27. تشمل مؤشرات سمية الزرد شائعة الاستخدام في دراسات السمية التنموية الوفيات الجنينية ، ومعدل التشوه الجنيني ، وذمة كيس الصفار ، وتكوين الصباغ ، وتكثيف البيض ، وتمديد الذيل ، ومورفولوجيا الرأس ، وتشكيل جزء الجسم ، من بين أمور أخرى28. بالمقارنة مع تقنيات تقييم سمية الثدييات ، فإن خصوصية أجنة الزرد للكشف عن السمية المركبة هي 70٪ -80٪ ، وتتجاوز الحساسية 80٪ 18. وجد Ton et al.29 أن دقة تقييم السمية التنموية للمركبات غير المسخية مع أجنة الزرد كانت 75٪. تم تقييم المركبات المسخية بدقة 100٪ هنا. على الرغم من أن الطب الصيني التقليدي له خصائص المكونات المعقدة والأعضاء المستهدفة غير الواضحة للسمية ، إلا أنه لا يزال من الممكن استخدام أجنة الزرد كنموذج حيواني تجريبي للتقييم الدقيق والسريع للسمية التنموية. وجد He et al.30 أن الإيمودين يؤثر على معدلات بقاء وفقس أجنة الزرد ، مما يتسبب في ثني الجذع وذمة كيس الصفار. وجد Chen et al.31 أن العضل تسبب في وذمة التامور الجنينية لجنين الزرد ، وانحناء العمود الفقري ، وذمة كيس الصفار. وجد He et al.32 أن Arnebiae Radix كان له آثار قاتلة على الزرد في جميع مراحل النمو ، وأن 1.0 مجم / لتر Arnebiae Radix يثبط التطور الجنيني ، مما يؤدي إلى انخفاض عدد السوميت ، وتشوهات الذيل ، وثني الجسم ، وتقليل الميلانين في أجنة الزرد.
للتحقيق في آثار EF الخام والمعالج على تطور جنين الزرد ، أجريت تجربة السمية التنموية لجنين الزرد في هذه الدراسة. أظهرت البيانات أن قيم LC50 كانت 151.3 ميكروغرام / مل لمجموعة الخام (S) و 219.8 ميكروغرام / مل للمجموعة المعالجة (P). أظهرت مراقبة أجسام الزرد في كل مجموعة تجريبية من خلال المجهر درجة واضحة من المسخية لأسماك الزرد في المجموعة الخام. أظهرت معظم الأسماك درجات متفاوتة من المسخية ، بما في ذلك تشوه العمود الفقري ، وتشوه انحناء الجسم ، وذمة التامور ، وعدم اكتمال المثانة السباحة ، أو تشوه الكبد ، وكانت هذه الملاحظات نادرة في المجموعة المعالجة. أظهرت هذه التجارب أن سمية EF قد انخفضت بشكل كبير بعد المعالجة ، مما يشير إلى أن المعالجة يمكن أن تقلل من سمية الدواء لدى البشر. توفر النتائج التجريبية مرجعا لتحسين سلامة الأدوية السريرية ل EF المعالج بزيت الضأن.
يشير الطب الصيني التقليدي إلى أن وظيفة الكلى ترتبط ارتباطا وثيقا بنمو وتطور وتكاثر جسم الإنسان33. تسجل الكتب القديمة للطب الصيني التقليدي أن الكلى هي نخاع عظم الجسم. تخزن الكلى الجوهر ، ويتواجد النخاع في تجويف العظام لتغذية العظام. عندما يكون جوهر الكلى ناقصا ، يتم تقليل نخاع العظم34. الطب الصيني التقليدي من التنغيم يانغ الكلى يمكن علاج الوهن القطني ، وهشاشة العظام ، والعجز الجنسي ، وسرعة القذف ، والعقم البارد في الرحم35. EF هي واحدة من المواد الطبية التمثيلية لتنغيم يانغ الكلى. أظهرت الدراسات الدوائية الحديثة أن EF له تأثيرات واضحة على الجهاز الهيكلي والجهاز المناعي والجهاز التناسلي والجهاز القلبي الوعائي والجهاز العصبي ، فضلا عن وجود تأثيرات مضادة للورم36. من حيث النشاط على نظام الهيكل العظمي ، يمكن ل icariin37 تحسين مستوى المصل E2 في الفئران المبيض وتنظيم التعبير عن ERβ mRNA في الأنسجة العظمية للفئران المبيضة. يتم زيادة تخليق ERβ ، وبالتالي تحسين التأثير البيولوجي ل ER ، وإضعاف نشاط ارتشاف العظام من الخلايا الآكلة للعظم ، وتعزيز تكوين العظام من بانيات العظم. التغيرات في ارتشاف العظام أكبر من التوازن السلبي لعملية التمثيل الغذائي للعظام. يمكن ل Epimedin A تحسين البنية المجهرية للعظام وعلامات دوران العظام في مصل الدم في الفئران النموذجية لهشاشة العظام عن طريق تثبيط تكوين ناقضة العظم والتمايز وارتشاف العظام ولعب دور في حماية العظام38. Epimedin C له نشاط واضح مضاد لهشاشة العظام ، خاصة من حيث زيادة كتلة العظام وتحسين البنية المجهرية التربيقية لزيادة قوة العظام في نهاية المطاف39. أظهرت دراسات أخرى أن إبيميدين ب40 وباوهوسيد I41 لهما نشاط مضاد لهشاشة العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل من قبل مشروع أعمال البحث العلمي الأساسي لأكاديمية تشونغتشينغ للطب الصيني التقليدي (رقم المشروع: jbky20200013) ، ومشروع توجيه حوافز الأداء لمؤسسات البحث العلمي في تشونغتشينغ (رقم المشروع: cstc2021jxjl 130025) ، ومشروع بناء الانضباط الرئيسي للجنة الصحة البلدية في تشونغتشينغ لمعالجة المواد الطبية الصينية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
References
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , China Medical Science and Technology Press. Beijing, China. (2020).
- Wang, X. T. Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , Nanchang Science and Technology Press. Jiangxi, China. (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -L., Dai, Y. -P., Yan, X. -S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish's embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , Kunming University of Science and Technology. Kunming, China. (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -N., Xu, X. -Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -J., Sun, E., Xu, F. -J., Jia, X. -B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
