Summary
Neste protocolo, a tecnologia de processamento de óleo de carneiro de Epimedii folium (EF) foi otimizada pela aplicação de uma metodologia experimental de superfície de resposta e delineamento Box-Behnken, e o efeito da FE bruta e otimizada extraída em água sobre o desenvolvimento embrionário do zebrafish foi preliminarmente investigado.
Abstract
Como uma medicina tradicional chinesa (MTC), Epimedii folium (EF) tem uma história na medicina e alimentos que é > 2.000 anos de idade. Clinicamente, EF processado com óleo de carneiro é frequentemente usado como um medicamento. Nos últimos anos, os relatos de riscos à segurança e reações adversas de produtos que utilizam EF como matéria-prima têm aumentado gradualmente. O processamento pode efetivamente melhorar a segurança da MTC. De acordo com a teoria TCM, o processamento de óleo de carneiro pode reduzir a toxicidade da FE e aumentar seu efeito tonificante nos rins. No entanto, há uma falta de pesquisa sistemática e avaliação da tecnologia de processamento de óleo de carneiro EF. Neste estudo, utilizou-se a metodologia experimental de superfície-resposta de Box-Behnken para otimizar os parâmetros-chave da tecnologia de processamento, avaliando o conteúdo de múltiplos componentes. Os resultados mostraram que a tecnologia ótima de processamento de óleo de carneiro da EF foi a seguinte: aquecer o óleo de carneiro a 120 °C ± 10 °C, adicionar o EF bruto, fritá-lo suavemente a 189 °C ± 10 °C até que esteja uniformemente brilhante e, em seguida, removê-lo e esfriar. Para cada 100 kg de EF, 15 kg de óleo de carneiro devem ser usados. As toxicidades e teratogenicidades de um extrato aquoso de FE processado em óleo bruto e óleo de carneiro foram comparadas em um modelo de desenvolvimento de embriões de peixe-zebra. Os resultados mostraram que o grupo de ervas brutas foi mais propenso a causar deformidades em peixe-zebra, e sua concentração de FE letal metade-máxima foi menor. Em conclusão, a tecnologia otimizada de processamento de óleo de carneiro mostrou-se estável e confiável, com boa repetibilidade. Em uma determinada dose, o extrato aquoso de EF foi tóxico para o desenvolvimento de embriões de peixe-zebra, e a toxicidade foi mais forte para a droga bruta do que para a droga processada. Os resultados mostraram que o processamento de óleo de carneiro reduziu a toxicidade da FE bruta. Esses achados podem ser usados para melhorar a qualidade, uniformidade e segurança clínica da FE processada com óleo de carneiro.
Introduction
Epimedii folium (EF) é a folha seca de Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., ou Epimedium koreanum Nakai. A FE pode ser usada para tratar osteoporose, síndrome menopausal, nódulos mamários, hipertensão, doença coronariana e outras doenças1. Como uma medicina tradicional chinesa (MTC), EF tem uma história na medicina e alimentação de mais de 2.000 anos. Devido ao seu baixo preço e notável efeito de tonificar os rins, é amplamente utilizado em medicamentos e alimentos saudáveis. EF é processado por meio de fritura com óleo de carneiro, um processo descrito pela primeira vez na Teoria de Processamento de Lei Gong escrita por Lei Xiao no período Liu Song2. As eficácias do EF bruto e do EF frito são bem diferentes. A FE bruta dissipa principalmente o reumatismo, enquanto a FE frita aquece os rins para reforçar o yang3. Atualmente, a FE é amplamente utilizada como matéria-prima em medicamentos e alimentos saudáveis; há 399 medicamentos chineses patenteados listados, nove alimentos saudáveis importados e 455 alimentos saudáveis domésticos com FE como matéria-prima4. Este material medicinal tem grandes perspectivas de aplicação. No entanto, nos últimos anos, tem havido relatos crescentes de reações adversas e lesão hepática humana causadas por alimentos saudáveis e medicamentos patenteados na China que utilizam FE como matéria-prima, e estudos relacionados à toxicidade 5,6,7 relataram que a FE como matéria-prima apresenta riscos potenciais à segurança.
Processamento medicinal chinês refere-se a técnicas farmacêuticas que podem efetivamente reduzir ou eliminar a toxicidade e melhorar a segurança dos MTCs. O método tradicional de processamento de EF é a fritura com óleo de carneiro, que reduz a toxicidade da EF e aumenta seu efeito de aquecimento dos rins e promoção do yang8. Este método de processamento está incluído na Farmacopeia Chinesa e em várias especificações de processamento1. O processo de FE só é especificado da seguinte forma: para cada 100 kg de FE, 20 kg de óleo amniótico (refinado) é adicionado, e é de queima leve até ficar uniforme e brilhante1. Não há parâmetros rigorosos do método de processamento EF nos padrões acima, portanto, as especificações de processamento local não foram unificadas para fornecer consistência. Portanto, seria útil realizar um estudo sistemático do processo de FE. Neste trabalho, o método experimental de superfície de resposta e delineamento Box-Behnken foi utilizado para otimizar a tecnologia de processamento de FE.
O planejamento experimental Box-Behnken é um método tipicamente usado para otimizar os fatores em um processo. Os parâmetros de extração podem ser otimizados estabelecendo-se a relação funcional entre fatores de ajuste de equações de regressão múltipla e valores de efeito. Recentemente, esse método tem sido amplamente utilizado para estudar a extração da MTC 5,6,7 e o processamento9,10,11. Vários estudos relataram métodos de preparação de MTC envolvendo processamento de sal, processamento de vinho e fritura seguindo um projeto Box-Behnken, como para Psoraleae fructus 12 processado com sal, Cnidii fructus13 processado em vinho e Cinnamomi ramulustorrado 14. Este método tem tempo de teste reduzido, alta precisão de teste e é adequado para testes multifatoriais e multiníveis. O método é mais simples do que o método de ensaio de desenho ortogonal e mais abrangente do que o método de concepção uniforme15. As relações obtidas podem determinar o valor previsto de qualquer ponto de teste dentro da faixa de teste, o que é uma grande vantagem. Um modelo de peixe-zebra pode ser usado para testar se a FE é menos tóxica após o processamento.
Em estudos de toxicidade de MTC, o modelo do peixe-zebra tem a dupla vantagem do alto rendimento dos experimentos celulares e as semelhanças com os experimentos comroedores16. Este modelo é caracterizado por seu pequeno tamanho, alta taxa de desova, ciclo reprodutivo curto e facilidade de reprodução. O modelo pode ser utilizado em experimentos sincrônicos em larga escala em placas de cultura celular, sendo a dosagem experimental do fármaco pequena, o ciclo experimental curto, o custo baixo e todo o processo experimental de fácil observação eoperação17. Os embriões de peixe-zebra são transparentes e se desenvolvem rapidamente. Portanto, a toxicidade e os efeitos teratogênicos de drogas sobre os tecidos viscerais em diferentes estágios de desenvolvimento podem ser observados diretamente ao microscópio18. A homologia gênica entre zebrafish e humanos chega a 85%18. A via de transdução de sinal do peixe-zebra é semelhante à do ser humano18. A estrutura biológica e a função fisiológica do zebrafish são muito semelhantes às dos mamíferos18. Portanto, um modelo de peixe-zebra para testes de fármacos pode fornecer animais experimentais confiáveis e totalmente aplicáveis a humanos19.
Neste estudo, utilizou-se a metodologia Box-Behnken design-response surface para otimizar a quantidade e a temperatura do óleo de carneiro e a temperatura de fritura utilizada na tecnologia de processamento EF, tendo como índices de avaliação os teores de icariina, epimedina A, epimedina B, epimedina C e baohuosídeo I. O modelo de zebrafish foi usado para explorar preliminarmente o efeito de um extrato de água EF sobre o desenvolvimento embrionário de zebrafish antes e após o processamento para avaliar o efeito de atenuação do processamento sobre a FE.
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Protocol
Todos os experimentos relacionados a animais foram conduzidos com aprovação do Comitê de Ética em Experimentos do Instituto Chongqing de TCM (número do certificado de revisão ética em animais de laboratório: ZJS2022-03).
1. Determinação dos componentes bioativos
NOTA: A espécie utilizada nesta pesquisa foi Epimedium sagittatum, e as amostras foram coletadas no Condado de Fengdu, Chongqing. A amostra foi identificada como uma parte seca acima do solo de E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Máxima. por pesquisadores do Instituto de Medicina Biológica, Instituto Chongqing de Medicina Tradicional Chinesa.
- Preparar a solução do produto de controlo pesando com precisão a quantidade adequada de cada substância de referência, a saber, icariina, epimedina A (EA), epimedina B (EB), epimedina C (CE) e baohuosídeo I (BI), utilizando uma balança analítica electrónica, e dissolver-se em metanol. Com eles, prepare uma solução-estoque de referência mista contendo 381,61 μg/mL de icariina, 124,14 μg/mL EA, 110,24 μg/mL EB, 1091,75 μg/mL EC e 184,98 μg/mL BI.
- Prepare a solução do produto de teste esmagando o EF através de uma peneira nº 3. Colocar aproximadamente 0,2 g (utilizando uma balança analítica electrónica) de EF triturado num balão de Erlenmeyer com tampa, adicionar 20 ml de etanol diluído e, em seguida, ultra-onicar a 400 W de potência e 50 kHz de frequência durante 1 h. Agitar bem e passar por um filtro de membrana de 0,22 μm para obter a solução de ensaio.
- Execute a cromatografia da seguinte forma. Utilizar cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com uma coluna C18 com dimensões de 4,6 mm x 250 mm e um diâmetro interno de 5 μm. Use acetonitrila como fase móvel A e água ultrapura como fase móvel B. Use os seguintes parâmetros de eluição de gradiente: 0-30 min, 24% A a 26% A; 30-31 min, 26% A a 45% A; 31-45 min, 45% A a 47% A. Use um comprimento de onda de detecção de 220 nm (para o detector usado, consulte Tabela de Materiais). Manter a temperatura da coluna em 30 °C e a velocidade da corrente em 1,0 mL/min e usar um tamanho de amostra de 10 μL.
- Para investigar a relação linear, use a solução de referência mista como na etapa 1.1 diluída 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes e 32 vezes, para icariin, EA, EB, EC e BI, respectivamente. Use acetonitrila como fase A móvel e água ultrapura como fase B móvel.
- Use os seguintes parâmetros de eluição de gradiente: 0-30 min, 24% A a 26% A; 30-31 min, 26% A a 45% A; 31-45 min, 45% A a 47% A. Use um comprimento de onda de detecção de 220 nm (para o detector usado, consulte Tabela de Materiais). Manter a temperatura da coluna em 30 °C e a velocidade da corrente em 1,0 mL/min e usar um tamanho de amostra de 10 μL. Por fim, registre as áreas de pico. Plote a regressão linear com a concentração de referência (eixo x, μg/mL) como a abscissa e a área do pico (eixo y) como a ordenada usando software profissional (ver Tabela de Materiais).
- Efectuar o ensaio de precisão medindo a solução de controlo mista seis vezes consecutivas por HPLC, utilizando as condições cromatográficas indicadas no passo 1.3. Registre o tempo de detecção e as áreas de pico de cada composição química e calcule os desvios padrão relativos (RSD) das áreas de pico para avaliar a precisão (reprodutibilidade) usando a fórmula abaixo:
RSD% = desvio padrão (DP)/média aritmética dos resultados calculados (X) x 100 % - Para efectuar o ensaio de reprodutibilidade, pesar com precisão o pó EF e preparar seis partes da solução do produto de ensaio em paralelo, de acordo com o método do passo 1.2. Submeter as soluções preparadas a HPLC nas condições cromatográficas apresentadas no passo 1.3. Registre os tempos de retenção e as áreas de pico de cada composição química e calcule as quantidades de cada composto a partir de uma curva padrão (áreas de pico versus concentrações). Calcule o RSD% como acima.
- Para realizar o teste de estabilidade, armazenar as soluções de teste à temperatura ambiente e medir seu conteúdo pelo método HPLC descrito na etapa 1.3 em 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h e 24 h após a preparação para avaliar a estabilidade. Registre os tempos de retenção e as áreas de pico de cada composição química e calcule o RSD% das áreas de pico como acima.
- Para realizar o teste de recuperação da amostra, pesar 0,2 g de pó EF em um frasco de Erlenmeyer com tampa para seis repetições. Adicionar uma quantidade adequada da solução de referência (a quantidade de substância de referência adicionada à amostra é equivalente a 100% do teor conhecido da amostra) e preparar a solução de ensaio de acordo com o método apresentado no ponto 1.2.
- Injectar as amostras no cromatógrafo e analisar de acordo com as condições cromatográficas da etapa 1.3. Registre as áreas de pico e calcule os valores médios de recuperação e RSD% conforme abaixo:
Taxa de recuperação de amostra com pico = (conteúdo da amostra com pico − conteúdo da amostra)/quantidade de amostra x 100%
2. Otimização da tecnologia de processamento de óleo de carneiro EF usando a metodologia Box-Behnken design-response surface
- Selecione os parâmetros-chave no processamento de EF, como a quantidade de óleo de carneiro (A; 15%-35%), a temperatura do óleo de carneiro (B; 50-120 °C) e a temperatura de fritura (C; 80-300 °C), como fatores influentes. Use as pontuações abrangentes do conteúdo de icariin, EA, EB, EC e BI como índices de avaliação. A porcentagem de óleo de carneiro aqui é a porcentagem de massa.
- Use o software de análise de superfície de resposta (consulte Tabela de Materiais) para projetar os experimentos de superfície de resposta Box-Behnken, explorar a superfície de resposta quadrática e construir um modelo polinomial de segunda ordem. Selecione o novo design Box-Behnken e defina a opção Fatores numéricos como 3; definir fatores A, B e C. Clique em Continuar. Defina a opção Respostas como 1 (que foi a pontuação abrangente). Clique em Continuar para concluir o design. Foram planejados 17 experimentos (Tabela 1).
NOTA: Para as variáveis independentes e dependentes, juntamente com seus níveis baixo, médio e alto, consulte a Tabela 2. - Processar a FE de acordo com os parâmetros específicos da Tabela 1; por exemplo, para o número de ordem 1, pesar o óleo de carneiro refinado como 15% v/v e, em seguida, aquecer a 50 °C para derretê-lo. Adicione o EF bruto ao carneiro derretido, refogue em fogo brando (190 °C) até ficar uniformemente brilhante e, em seguida, retire e arrefeça. Realizou 17 operações experimentais. Um total de 17 grupos de produtos processados por EF foi obtido neste trabalho.
NOTA: O óleo de carneiro é sólido à temperatura ambiente (25 °C) e derrete em líquido quando aquecido. O óleo de carneiro em estado líquido pode ser usado como excipiente. - Preparar as soluções de ensaio dos produtos transformados de acordo com o método descrito no ponto 1.2. Em seguida, analisá-los por HPLC de acordo com as condições cromatográficas descritas no passo 1.3. Registre os tempos de retenção e as áreas de pico de cada composição química e calcule os teores de icariin, EA, EB, EC e BI em cada solução de teste em relação a uma curva padrão externa. Use a fórmula de cálculo de pontuação abrangente abaixo para calcular os escores abrangentes dos 17 grupos experimentais:
Escore abrangente = Z/Z máx × 0,5 + BI/BImáx × 0,5
onde Z é a soma dos teores icariin, EA, EB e EC; Zmax é o valor máximo da soma dos teores de icariin, EA, EB e EC nos 17 grupos experimentais; BI é o conteúdo de BI; e BImax é o valor máximo do conteúdo de IB nos 17 grupos experimentais. - Importe os resultados de pontuação abrangentes para os 17 grupos de experimentos para o software de análise de dados (consulte Tabela de Materiais) para analisar os dados experimentais. Nos itens de avaliação, selecione a opção de ordem de processo quadrática e a opção de tipo de modelo polinomial.
3. Testando o efeito do processamento no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra
- Preparo da amostra
- Triture o EF bruto e processado através de uma peneira nº 3 (consulte a Tabela de Materiais). A 100 g de cada amostra EF, adicionar 1.000 mL de água ultrapura. Deixe o EF de molho por 0,5 h, ferva a água duas vezes por 30 min cada e, em seguida, filtre com papel de filtro.
- Combinar os filtrados e concentrar a amostra por aquecimento. Adicionar água ultrapura a um volume final de 100 mL para obter as soluções-estoque EF processadas (PEF, 1 g/mL) e EF bruta (CEF, 1 g/mL). Meça a quantidade de droga crua em cada solução de estoque.
- Coloque alíquotas de 1 mL, 1,5 mL, 2,5 mL, 5 mL e 7,5 mL em balões volumétricos de 10 mL e, em seguida, adicione água ultrapura ao volume para preparar as soluções de teste com concentrações de 100 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL e 750 mg/mL para o estudo de embriotoxicidade do peixe-zebra.
NOTA: As concentrações das soluções de ensaio foram preparadas consultando a literatura pertinente 20,21 e a realização de experiências preliminares para obter o gradiente de concentração de10 vezes utilizado na toxicologia normal. O CEF foi uma amostra não processada e o PFE foi uma amostra preparada com a melhor tecnologia de processamento descrita na seção 2.
- Criação de peixes-zebra e tratamento de embriões21
- Adapte peixes-zebra selvagens (ver Tabela de Materiais) a uma temperatura controlada por 2 dias, mantenha-os em um aquário de fluxo em pH 7,0-7,4 e alimente-os duas vezes ao dia.
NOTA: A inibição da formação de melanina em zebrafish foi obtida pela adição de 1-fenil-2-tiouréia em uma concentração de 0,003% (massa/volume) ao meio de cultura, o que manteve seus corpos transparentes para observação morfológica. - Selecione peixes-zebra adultos férteis selvagens à noite e separe-os usando defletores em caixas de acasalamento. Retire os defletores na manhã seguinte e deixe o peixe desovar por 30 min. Coletados os óvulos fertilizados com um conta-gotas a cada 15 min. No total, foram coletados 520 embriões silvestres saudáveis. Manter os embriões de peixe-zebra em estufa a 28,5 °C por 24 h.
- Atribuir aleatoriamente os embriões saudáveis 24 h após a fertilização (hpf) a 13 grupos e, juntamente com um grupo controle, mergulhar separadamente em 10 mL de cada uma das seguintes soluções em uma placa de cultura: PFE: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL; CEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL . Trate o grupo controle em branco com o meio como solução. Cada grupo continha 40 embriões neste estudo.
NOTA: A composição média é de 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na 2 HPO 4,0,45 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO 4 e 4 mM NaHCO3. - Cultivar o peixe-zebra em uma incubadora de temperatura constante para até 120 hpf. Contar o número de larvas mortas todos os dias, observar a morfologia do órgão principal das larvas em cada grupo experimental sob um estereomicroscópio (barra de escala = 500 μm, ver Tabela de Materiais) e calcular a concentração de meia-morte (LC50) do peixe-zebra a 72 hpf usando um software de análise de dados (ver Tabela de Materiais).
- Adapte peixes-zebra selvagens (ver Tabela de Materiais) a uma temperatura controlada por 2 dias, mantenha-os em um aquário de fluxo em pH 7,0-7,4 e alimente-os duas vezes ao dia.
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Representative Results
Resultados da investigação metodológica
Foi observada uma relação linear entre a concentração de icariin, EA, EB, EC, BI e áreas cromatográficas dos picos (ver Tabela 3). Os valores de RSD% (n = 6) das áreas cromatográficas dos picos de icariin, EA, EB, EC e BI foram 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% e 1,06%, respectivamente, indicando que a precisão das medidas por CLAE foi boa. Os valores de RSD% (n = 6) dos teores de icariin, EA, EB, EC e BI foram 1,59%, 1,46%, 1,86%, 2,29% e 0,98%, respectivamente, indicando boa repetibilidade do método. Os valores de RSD% (n = 6) das áreas de pico de icariin, EA, EB, EC e BI nas amostras foram 1,49%, 1,96%, 1,42%, 0,96% e 0,81%, respectivamente, indicando que a solução da amostra foi estável em 24 h. As taxas médias de recuperação de icariin, EA, EB, EC e BI foram de 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% e 100,94%, respectivamente, e os valores de RSD foram 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% e 1,47%, respectivamente (ver Tabela 4). Esses resultados mostram que a acurácia do método atendeu aos requisitos.
Os resultados experimentais acima mostraram que o método analítico proporcionou resultados de excelente precisão, reprodutibilidade e exatidão aceitáveis para a análise da qualidade dos produtos processados com FE.
Otimização da tecnologia de processamento de óleo de carneiro da EF aplicando a metodologia Box-Behnken design-response surface
Foi realizado ajuste de regressão polinomial quadrática dos dados acima para obter o seguinte modelo: Y = 0,86 − 0,11 x A + 0,025 x B − 0,078 x C − 0,023 x A x B − 0,037 x A x C + 0,037 x B x C − 0,045 x A 2 + 2,5 x 10-3 x B 2 − 0,14 x C 2. A análise de variância apresentou valor de P < 0,01, indicando que o modelo foi significativo. O valor de P da falta de ajuste foi de P > 0,05, indicando que a falta de ajuste não foi significativa. O valor de R2 foi de 0,9300, indicando que o ajuste do modelo foi bom, e o erro foi pequeno. Foi viável utilizar esse modelo para analisar e predizer o efeito do teor de composição química da FE frita com óleo de carneiro. Além disso, A 2 e D2 tiveram efeito sobre o teor dos produtos processados, e a diferença foi estatisticamente significativa (P < 0,01). Os efeitos de A e C do termo de um grau e C2 do termo de segunda ordem sobre o escore abrangente foram significativos. O termo B de um grau, o de segunda ordem A 2, B2 e todos os itens de interação não tiveram efeito significativo sobre o escore abrangente. A análise dos valores de P mostrou que, dos parâmetros experimentais, a quantidade de óleo de carneiro (A) teve o maior efeito sobre o escore abrangente, seguida pela temperatura de fritura (C) e, em seguida, a temperatura do óleo de carneiro (B). Os resultados acima são mostrados na Tabela 5.
O software foi usado para definir a quantidade de óleo de carneiro, a temperatura do óleo de carneiro e a temperatura de fritura para as medianas e para usar o escore abrangente como índice para desenhar um diagrama de influência de fator único de um fator (Figura 1). O aumento da temperatura de fritura primeiro aumentou o escore abrangente e depois o diminuiu (Figura 1). A temperatura do óleo de carneiro teve um efeito insignificante no escore abrangente. A quantidade de óleo de carneiro foi o principal fator significativo que afetou a mudança na pontuação abrangente e, à medida que a quantidade aumentou, o conteúdo tendeu a diminuir.
Para ajudar a entender melhor os resultados, os modelos previstos são apresentados na Figura 2 como gráficos de superfície de resposta 3D. Em termos de inclinação da superfície de resposta, quanto maior a significância do efeito de interação entre os fatores, mais suave a inclinação e menos significativo o efeito. Uma elipse na forma de uma linha de contorno indica uma forte interação entre fatores, enquanto um círculo indica o oposto. A superfície de resposta da quantidade de óleo de carneiro e a temperatura de fritura foram mais íngremes em comparação com os outros fatores testados, e as curvas de nível tenderam a ser mais elípticas (ver Figura 2C,D), indicando que a interação entre esses dois fatores foi mais significativa; em contraste, as interações entre outros fatores não foram significativas (ver Figura 2A,B,E,F).
A tecnologia ótima de processamento de óleo de carneiro da EF foi selecionada da seguinte forma: uma quantidade de óleo de carneiro de 15%; uma temperatura do óleo de carneiro de 120 °C; e temperatura de fritura de 189 °C. Considerando que a temperatura não pode ser controlada com muita precisão na operação real, o valor da temperatura é especificado como uma variável ±10 °C. Portanto, os parâmetros finais foram os seguintes: uma quantidade de óleo de carneiro de 15%; temperatura do óleo de carneiro de 120 °C ± 10 °C; e temperatura de fritura de 189 °C ± 10 °C. O processo ideal foi o seguinte: aquecer o óleo de carneiro a 120 °C ± 10 °C, adicionar o EF bruto, fritá-lo em fogo suave (189 °C ± 10 °C) até que fique uniformemente brilhante, e remover e esfriar. Para cada 100 kg de EF, 15 kg de óleo de carneiro (óleo refinado) devem ser usados. Utilizando essas condições, três experimentos paralelos foram conduzidos, e os escores obtidos foram 0,96, 0,97 e 0,94 (RSD% = 1,60%), indicando condições estáveis e viáveis. Os cromatogramas típicos por HPLC das substâncias de referência brutas, processadas e mistas de EF são mostrados na Figura 3.
Teste do efeito do processamento no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra
O peixe-zebra eclodiu em juvenis a 72 hpf. O desenvolvimento de cada órgão foi basicamente completo. Os corpos dos peixes permaneciam transparentes, e era fácil colocá-los de lado sobre a lâmina de vidro. As formas dos órgãos eram fáceis de observar e identificar quando vistas ao microscópio. O grupo controle em branco não apresentou nenhuma morte ou toxicidade orgânica durante o período de administração. Em comparação com o grupo controle, na concentração de 100 μg/mL, não foram encontradas anormalidades óbvias no grupo FE bruta (S) e no grupo processado (P) a 72 hpf. Aos 96 hpf e mais tarde, a incompletude da bexiga natatória e a perda da bexiga natatória foram mais comuns nos peixes juvenis do grupo bruto, mas foram raros nos peixes juvenis do grupo processado. A uma concentração de droga de 150 μg/mL, deformidades óbvias da coluna vertebral, deformidades da curvatura corporal, edema pericárdico e deformação hepática foram observadas nos peixes juvenis do grupo bruto a 72 hpf, mas essas alterações foram raras nos peixes juvenis do grupo processado, e o grau de teratogenicidade foi mais fraco do que o do grupo bruto. A uma concentração de droga de 200 μg/mL, todos os peixes juvenis do grupo bruto morreram, e teratogenicidade óbvia apareceu nos peixes juvenis do grupo processado. A uma concentração de droga de 250 μg/mL, um pequeno número de zebrafish sobreviveu no grupo processado. Os resultados do exame microscópico do zebrafish são mostrados na Figura 4.
As taxas de mortalidade do peixe-zebra nos grupos de ervas Epimedium brutas e processadas dependeram da concentração e do tempo de administração. A relação tempo-dose-mortalidade é mostrada na Figura 5. Os resultados de mortalidade do peixe-zebra mostraram que 24 h após a administração (48 hpf), a uma concentração de droga de 200 μg/mL, todos os peixes-zebra do grupo da droga bruta morreram, enquanto a mortalidade no grupo processado foi de apenas 6,67%. Em 48 h após a administração de EF (72 hpf), a concentração que causou a morte de todos os zebrafish no grupo da droga bruta foi de 200 μg/mL, e a concentração que causou a morte de todos os zebrafish no grupo processado foi de 500 μg/mL. A mediana da concentração letal dos dois grupos experimentais a 72 hpf foi calculada. Os resultados mostraram que a CL50 (ver Figura 6) foi de 151,3 μg/mL no grupo bruto (S) e 219,8 μg/mL no grupo processado (P).
Figura 1: Análise univariada. A figura mostra o diagrama de influência de fator único. A é o resultado de fator único da quantidade de óleo de carneiro (sueto); B é o resultado de fator único da temperatura do óleo de carneiro (suet); e C é o resultado unifatorial da temperatura de fritura. Com o aumento da temperatura de fritura, a pontuação abrangente primeiro aumenta e depois diminui. A temperatura do óleo de carneiro tem pouco efeito sobre a pontuação. A quantidade de óleo de carneiro foi o principal fator significativo que afetou a mudança na pontuação abrangente, e o conteúdo mostrou uma tendência de queda com uma quantidade crescente de óleo de carneiro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Superfície de resposta e gráfico de contorno da influência de diferentes interações fatoriais no escore abrangente. (A) Esta figura mostra um gráfico de superfície de resposta 3D da interação entre a quantidade de óleo de carneiro e a temperatura. (B) Esta figura mostra um gráfico de contorno da interação entre a quantidade de óleo de carneiro e a temperatura. (C) Esta figura mostra um gráfico de superfície de resposta 3D da interação entre a quantidade de óleo de carneiro e a temperatura de processamento. (D) Esta figura mostra um gráfico de contorno da interação entre a dosagem de óleo de carneiro e a temperatura de processamento. (E) Esta figura mostra um gráfico de superfície de resposta 3D da interação entre a quantidade de óleo de carneiro e a temperatura de processamento. (F) Esta figura mostra um gráfico de contorno da interação entre a quantidade de óleo de carneiro e a temperatura de processamento. O resultado mostra que a superfície de resposta da quantidade de óleo de carneiro e da temperatura de fritura foi íngreme do que os outros parâmetros testados e as curvas de nível tenderam a ser elípticas (ver C,D), indicando que a interação entre esses dois fatores foi significativa, enquanto as interações entre outros fatores não foram significativas (ver A,B,E, F). O termo óleo de suet usado na figura refere-se ao óleo de carneiro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cromatogramas por HPLC das substâncias de referência brutas, transformadas e mistas da EF. (A) Esta figura mostra o cromatograma HPLC da substância de referência mista. (B) Esta figura mostra o cromatograma por HPLC de Epimedii folium bruto. (C) Esta figura mostra o cromatograma por HPLC dos produtos transformados em Epimedii folium. Essas três imagens demonstram que o conteúdo de BI no EF bruto é baixo, enquanto aumenta após o processamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Micrografias do peixe-zebra. Esta figura mostra micrografias do peixe-zebra. (A) Esta figura mostra os resultados para a observação do peixe-zebra ao microscópio no grupo em branco. (B) Esta figura mostra os resultados para a observação do zebrafish ao microscópio no grupo bruto. (C) Esta figura mostra os resultados para a observação do zebrafish ao microscópio no grupo processado. O grupo controle em branco não apresentou nenhuma morte ou toxicidade orgânica durante o período de administração. Em uma concentração da droga EF de 150 μg/mL, deformidades óbvias da coluna vertebral, curvatura corporal, edema pericárdico e deformação hepática foram observadas nos peixes juvenis do grupo bruto a 72 hpf, enquanto essas alterações foram raras em peixes juvenis no grupo processado, e o grau de teratogenicidade foi mais fraco do que no grupo bruto. A uma concentração de droga de 200 μg/mL, todos os peixes juvenis do grupo bruto morreram, e teratogenicidade óbvia apareceu no grupo processado. A uma concentração de droga de 250 μg/mL, apenas um pequeno número de zebrafish sobreviveu no grupo processado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Relação dose-dose-mortalidade. Esta figura mostra a relação tempo de dose-dose-mortalidade. (A) Esta figura mostra a relação tempo de dose-dose-mortalidade do grupo bruto. (B) Esta figura mostra a relação dose-dose-mortalidade do grupo processado. n = 40. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Diagrama LC50 de FE bruto e processado. O diagrama LC50 do EF bruto e processado é mostrado. Foram calculadas as concentrações letais medianas dos dois grupos experimentais a 72 hpf. A CL50 foi de 151,3 μg/mL no grupo bruto (S) e 219,8 μg/mL no grupo processamento (P). n = 40. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Planejamento experimental e resultados do método de superfície de resposta Box-Behnken dos 17 grupos de experimentos. A Tabela 1 mostra os 17 grupos de experimentos desenhados pelo método de superfície de design-resposta Box-Behnken e seus resultados abrangentes de pontuação. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Variáveis utilizadas no delineamento Box-Behnken. As variáveis independentes e dependentes estão listadas aqui, juntamente com seus níveis baixo, médio e alto. O delineamento Box-Behnken permitiu identificar os fatores mais influentes no processamento de FE, sendo a quantidade de óleo de carneiro (A) (15%-35%), a temperatura do óleo de carneiro (B) (50 °C-120 °C) e a temperatura de fritura (C) (80 °C-300 °C) como fatores influenciadores. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Equações de regressão e intervalos lineares dos constituintes químicos da FE. Os resultados da equação de regressão e da faixa linear da composição química da FE mostram que houve boa linearidade entre cada uma das concentrações de icariin, EA, EB, EC e BI e suas áreas cromatográficas de pico. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 4: Taxas de teste de recuperação da amostra. As taxas médias de recuperação de icariin, EA, EB, EC e BI foram de 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% e 100,94%, respectivamente, e os valores de RSD foram 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% e 1,47%, respectivamente. Os resultados mostram que a acurácia do método foi adequada. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 5: Coeficientes de regressão do modelo quadrático predito. O valor de P do modelo foi de P < 0,01, indicando que o modelo foi significativo. O valor de P da falta de ajuste foi de P > 0,05, indicando que a falta de ajuste não foi significativa. O valor de R2 foi de 0,9300, indicando que o ajuste do modelo foi bom, e o erro foi pequeno, de modo que o modelo foi adequado para analisar e predizer o efeito do teor de composição química da FE frita com óleo de carneiro. Além disso, A 2 e D2 tiveram efeitos significativos sobre o teor de produtos processados (P < 0,01). As influências de A e C do termo de um grau e C2 do termo de segunda ordem sobre o escore abrangente foram significativas. O termo B de um grau, o termo de segunda ordem A 2, B2 e todos os itens de interação não tiveram efeitos significativos sobre o escore abrangente. A análise do valor de P mostrou que, dos parâmetros experimentais, a quantidade de óleo de carneiro (A) teve a maior influência no escore abrangente, seguida da temperatura de fritura (C) e, em seguida, da temperatura do óleo de carneiro (B). Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Variáveis independentes e determinação de seus níveis
A tecnologia de processamento EF só é descrita na edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa e nas especificações locais de processamento de medicamentos chineses publicadas por 26 províncias, municípios e regiões autônomas em todo o país1. A descrição envolve os seguintes passos: pegar óleo de carneiro e aquecê-lo para derreter, adicionar pedaços de EF, fritar com fogo lento até que fique uniforme e brilhante, retirá-lo e deixá-lo esfriar. Além disso, 20 kg (abreviado como 20%) de óleo de carneiro (refinado) é usado para cada 100 kg de Epimedium. No entanto, os parâmetros do processo de processamento de EF não são especificados. Dentre as variáveis independentes deste experimento, três fatores-chave puderam ser quantificados no processo produtivo: a dosagem do óleo de carneiro, a temperatura do óleo de carneiro e a temperatura de fritura. O intervalo de valores deve ser definido de acordo com a descrição acima. A partir dos resultados do teste preliminar, pode-se ver que, quando a quantidade de óleo de carneiro é de 15%, as folhas EF podem ser uniformemente revestidas com óleo de carneiro. Quando a dosagem excede 35%, há muito óleo de carneiro. Finalmente, a faixa da quantidade de óleo de carneiro deve ser de 15% a 35%. Quando a temperatura atinge 50 °C, o óleo de carneiro derrete. Quando a temperatura atinge >120 °C, o óleo de carneiro começa a fumar, e a temperatura é muito alta. Portanto, a faixa de temperatura do óleo de carneiro deve ser de 50 °C a 120 °C. A edição 2020 da Farmacopeia Chinesa estipula que o EF deve ser refogado com fogo lento. O fogo lento não deve exceder 200 °C, e a temperatura de fritura deve variar de 80 °C a 300 °C.
Pontuação abrangente
Durante o processamento de Epimedium, as ligações glicosídicas são quebradas, e os componentes glicosídicos são transformados em componentes glicosídicos inferiores. A determinação do teor de produtos processados EF na edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa baseia-se na determinação do teor total de icariina, EA, EB e CE nos materiais medicinais originais, e um componente monoglicosídeo, BI, é listado separadamente como indicador. Neste experimento, o peso total da icariina, EA, EB e CE na FE processada foi de 50%, o peso do IB foi de 50% e o escore abrangente foi estabelecido com base nesses valores.
A metodologia de superfície de resposta (MSR) é uma técnica estatística para identificar parâmetros ótimos do processo e resolver problemas multivariados. Nessa técnica, um planejamento experimental razoável é usado para obter certos dados por meio de experimentos, e uma equação de regressão quadrática multivariada é usada para derivar uma relação funcional entre os fatores e as respostas22. O projeto uniforme e a otimização do processo de projeto ortogonal são comumente usados, mas sua precisão de teste não é alta, e o modelo matemático não é muito previsível. O modelo matemático subjacente ao RSM é altamente previsível. A MSR requer menos experimentos e ciclos mais curtos, o que não só pode eliminar os problemas associados à estatística matemática tradicional, mas também pode esclarecer as relações entre fatores e respostas23. O RSM conceitua a resposta do sistema como uma função de um ou mais fatores e usa técnicas gráficas para exibir essa relação funcional para ajudar o usuário a selecionar as condições ótimas no projeto experimental por meio da observação visual intuitiva. Essas vantagens levaram à ampla utilização desse método na indústria química24, na engenharia biológica, na indústria alimentícia25, na indústria farmacêutica e nas preparações para MTC.
Embora o MSR possa identificar a relação funcional entre respostas (índices a serem investigados) e fatores (variáveis independentes), nem todos os experimentos são adequados para otimização da superfície de resposta, pois nem sempre há uma forte relação funcional entre a resposta e os fatores. O RSM geralmente obtém relações de função contínuas, que exigem que todos os fatores sejam variáveis contínuas. No entanto, nem todos os fatores a serem investigados são variáveis contínuas ou têm efeitos significativos sobre os valores de resposta no início do planejamento experimental. Para reduzir o número de experimentos e melhorar a precisão da modelagem de superfície de resposta, é necessário selecionar os fatores significativos e determinar seus níveis por meio de planejamento fatorial, planejamento uniforme ou planejamento ortogonal antes de conduzir a metodologia de planejamento de superfície de resposta. A maior vantagem da metodologia de superfície de resposta é que, uma vez que o modelo é estabelecido corretamente, o valor da resposta sob qualquer combinação de condições pode ser previsto, e a relação funcional pode ser vista de forma mais intuitiva e visual através da superfície de resposta 3D. Essa visualização é de grande ajuda para os pesquisadores encontrarem as condições ótimas deprocessamento26.
Este estudo usou o princípio de planejamento Box-Behnken do RSM para projetar 17 experimentos combinados usando o escore de conteúdo químico abrangente de EF como valor de resposta. Finalmente, os melhores resultados de otimização do processo foram obtidos por análise de regressão. A tecnologia de processamento foi otimizada da seguinte forma: aquecer o óleo de carneiro a 120 °C ± 10 °C, adicionar o EF bruto, fritá-lo em fogo suave (189 °C ± 10 °C) até que esteja uniformemente brilhante e, em seguida, removê-lo e resfriá-lo. Para cada 100 kg de EF, 15 kg de óleo de carneiro (óleo refinado) devem ser usados. Nossos resultados mostraram que o processo de FE foi estável, confiável e repetível. Adicionalmente, as interações fatoriais foram analisadas, e a interação entre a quantidade de óleo de carneiro e a temperatura de fritura, mas não as interações entre outros fatores, foi significativa. Este estudo demonstrou que o planejamento de superfície de resposta, como método para analisar as interações entre fatores e as relações entre os fatores e seus valores de superfície de resposta, possibilitou a otimização das condições de processamento em um curto período com um número mínimo de experimentos. Os fatores selecionados neste estudo foram os fatores-chave identificados no experimento de triagem de fator único, e seus níveis foram determinados em um experimento preliminar. As amostras de teste estavam de acordo com as características do método de superfície de resposta, de modo que o estudo foi capaz de usar a metodologia de superfície de resposta para estabelecer um modelo preditivo. Os resultados experimentais podem fornecer uma referência para a melhoria da qualidade e uniformidade da FE processada.
Embriões de peixe-zebra são utilizados como organismos modelo no campo da genética do desenvolvimento por serem transparentes, desenvolvidos in vitro e de fácil observação27. Indicadores de toxicidade comumente usados em estudos de toxicidade para o desenvolvimento incluem mortalidade embrionária, taxa de malformação embrionária, edema do saco vitelino, formação de pigmentos, condensação de ovos, extensão da cauda, morfologia da cabeça, formação de segmentos corporais, entre outros28. Em comparação com técnicas de avaliação da toxicidade em mamíferos, a especificidade dos embriões de zebrafish para detecção de toxicidade de compostos é de 70%-80%, e a sensibilidade excede 80%18. Ton et al.29 verificaram que a acurácia da avaliação da toxicidade para o desenvolvimento de compostos não teratogênicos com embriões de zebrafish foi de 75%. Compostos teratogênicos foram avaliados com 100% de acurácia. Embora a MTC tenha características de componentes complexos e órgãos-alvo de toxicidade pouco claros, embriões de zebrafish ainda podem ser usados como modelo animal experimental para a avaliação precisa e rápida da toxicidade no desenvolvimento. He et al.30 verificaram que a emodin afetou a sobrevivência e as taxas de eclosão de embriões de peixe-zebra, causando flexão do tronco e edema da vesícula vitelínica. Chen et al.31 verificaram que o muscone causava edema de pericárdio de embriões de peixe-zebra, curvatura da coluna vertebral e edema da vesícula vitelínica. He et al.32 verificaram que Arnebiae Radix teve efeitos letais sobre o peixe-zebra em todos os estágios de desenvolvimento, e 1,0 mg/L de Arnebiae Radix inibiu o desenvolvimento embrionário, resultando em um número reduzido de somitos, deformidades da cauda, flexão do corpo e redução da melanina em embriões de peixe-zebra.
Para investigar os efeitos da FE bruta e processada no desenvolvimento de embriões de zebrafish, um experimento de toxicidade para o desenvolvimento de embriões de zebrafish foi conduzido neste estudo. Os dados mostraram que os valores de CL50 foram 151,3 μg/mL para o grupo bruto (S) e 219,8 μg/mL para o grupo processado (P). A observação dos corpos de peixe-zebra em cada grupo experimental através de um microscópio mostrou um grau óbvio de teratogenicidade do peixe-zebra no grupo bruto. A maioria dos peixes apresentou graus variados de teratogenicidade, incluindo deformidade da coluna vertebral, deformidade da curvatura corporal, edema pericárdico, incompletude da bexiga natatória ou deformação hepática, e essas observações foram raras no grupo processado. Esses experimentos mostraram que a toxicidade da FE foi significativamente reduzida após o processamento, sugerindo que o processamento poderia reduzir a toxicidade de drogas em humanos. Os resultados experimentais fornecem uma referência para melhorar a segurança da medicação clínica da FE processada com óleo de carneiro.
A medicina tradicional chinesa sugere que a função do rim está intimamente relacionada ao crescimento, desenvolvimento e reprodução do corpo humano33. Os livros antigos da medicina tradicional chinesa registram que o rim é a medula óssea do corpo. O rim armazena essência, e a medula reside na cavidade óssea para nutrir o osso. Quando a essência renal é deficiente, a medula óssea é reduzida34. A medicina tradicional chinesa de tonificação do yang renal pode tratar debilidade lombar, osteoporose, impotência, ejaculação precoce e infertilidade uterina pelo frio35. EF é um dos materiais medicinais representativos para tonificar o yang renal. Estudos farmacológicos modernos têm demonstrado que a FE tem efeitos óbvios sobre o sistema esquelético, sistema imunológico, sistema reprodutivo, sistema cardiovascular e sistema nervoso, além de ter efeitos antitumorais36. Em termos de atividade sobre o sistema esquelético, icariin37 pode melhorar o nível sérico de E2 em ratas ovariectomizadas e upregulate a expressão de mRNA de ERβ no tecido ósseo de ratas ovariectomizadas. A síntese de REβ é aumentada, melhorando assim o efeito biológico do RE, enfraquecendo a atividade de reabsorção óssea dos osteoclastos e aumentando a formação óssea dos osteoblastos. As alterações na reabsorção óssea são maiores que o balanço negativo do metabolismo ósseo. A epimedina A pode melhorar a microestrutura óssea e os marcadores séricos de remodelação óssea em camundongos modelo de osteoporose, inibindo a formação, diferenciação e reabsorção óssea de osteoclastos e desempenhando um papel na proteção óssea38. A epimedina C tem evidente atividade anti-osteoporose, principalmente em termos de aumento da massa óssea e melhora da microestrutura trabecular para, finalmente, aumentar a resistência óssea39. Outros estudos mostraram que epimedin B40 e baohuoside I41 têm atividade anti-osteoporose.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo Projeto de Negócios de Pesquisa Científica Básica da Academia de Medicina Tradicional Chinesa de Chongqing (Número do Projeto: jbky20200013), pelo Projeto de Orientação de Incentivo ao Desempenho das Instituições de Pesquisa Científica de Chongqing (Número do Projeto: cstc2021jxjl 130025) e pelo Projeto de Construção da Disciplina-Chave da Comissão Municipal de Saúde de Chongqing do Processamento de Matéria Médica Chinesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
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