Summary
I denne protokollen ble fårekjøttoljebehandlingsteknologien til Epimedii folium (EF) optimalisert ved å bruke en Box-Behnken eksperimentell design-respons overflatemetodikk, og effekten av rå og optimalisert vannekstrahert EF på sebrafiskens embryonale utvikling ble foreløpig undersøkt.
Abstract
Som en tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har Epimedii folium (EF) en historie innen medisin og mat som er > 2000 år gammel. Klinisk brukes EF-behandlet med fårekjøttolje ofte som medisin. I de senere år har rapporter om sikkerhetsrisiko og bivirkninger av produkter som bruker EF som råstoff gradvis økt. Behandling kan effektivt forbedre sikkerheten til TCM. Ifølge TCM-teorien kan fårekjøttoljebehandling redusere giftigheten av EF og forbedre dens tonifiserende effekt på nyrene. Det mangler imidlertid systematisk forskning og evaluering av EF-teknologi for behandling av fårekjøtt. I denne studien brukte vi Box-Behnken eksperimentell design-respons overflatemetodikk for å optimalisere nøkkelparametrene til prosesseringsteknologien ved å vurdere innholdet i flere komponenter. Resultatene viste at den optimale fårekjøttoljebehandlingsteknologien til EF var som følger: oppvarming av fårekjøttoljen ved 120 °C ± 10 °C, tilsett råoljen EF, stek den forsiktig til 189 °C ± 10 °C til den er jevnt skinnende, og fjern den deretter og avkjøl. For hver 100 kg EF skal 15 kg fårekjøttolje brukes. Toksisiteten og teratogeniteten til et vandig ekstrakt av råolje og fårekjøttbehandlet EF ble sammenlignet i en utviklingsmodell for sebrafiskembryo. Resultatene viste at råurtgruppen var mer sannsynlig å forårsake sebrafiskdeformiteter, og dens halvmaksimale dødelige EF-konsentrasjon var lavere. Avslutningsvis var den optimaliserte fårekjøttoljebehandlingsteknologien stabil og pålitelig, med god repeterbarhet. Ved en viss dose var det vandige ekstraktet av EF giftig for utviklingen av sebrafiskembryoer, og toksisiteten var sterkere for råstoffet enn for det bearbeidede legemidlet. Resultatene viste at fårekjøtt-prosessering reduserte toksisiteten av rå EF. Disse funnene kan brukes til å forbedre kvaliteten, ensartetheten og den kliniske sikkerheten til fårekjøttoljebehandlet EF.
Introduction
Epimedii folium (EF) er de tørkede bladene av Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., eller Epimedium koreanum Nakai. EF kan brukes til å behandle osteoporose, menopausalt syndrom, brystklumper, hypertensjon, koronar hjertesykdom og andre sykdommer1. Som en tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har EF en historie innen medisin og mat på mer enn 2000 år. På grunn av sin lave pris og bemerkelsesverdige effekt av tonifisering av nyrene, er den mye brukt i medisiner og helsekost. EF behandles ved å steke den med fårekjøttolje, en prosess som først ble beskrevet i Lei Gong Processing Theory skrevet av Lei Xiao i Liu Song-perioden2. Effektiviteten av rå EF og wok EF er ganske forskjellige. Rå EF fordriver hovedsakelig revmatisme, mens den wokede EF varmer nyrene for å forsterke yang3. I dag er EF mye brukt som råstoff i legemidler og helsekost; det er 399 oppførte kinesiske patentmedisiner, ni importerte helsekost og 455 innenlandske helsekost med EF som råvare4. Dette medisinske materialet har gode applikasjonsutsikter. Imidlertid har det de siste årene vært økende rapporter om bivirkninger og menneskelig leverskade forårsaket av helsekost og kinesiske patentmedisiner som bruker EF som råmateriale, og relaterte toksisitetsstudier 5,6,7 har rapportert at EF som råvare har potensielle sikkerhetsrisikoer.
Kinesisk medisinsk behandling refererer til farmasøytiske teknikker som effektivt kan redusere eller eliminere toksisiteten og forbedre sikkerheten til TCM. Den tradisjonelle behandlingsmetoden til EF er steking med fårekjøttolje, noe som reduserer giftigheten til EF og forbedrer effekten av å varme nyrene og fremme yang8. Denne behandlingsmetoden er inkludert i den kinesiske farmakopéen og forskjellige behandlingsspesifikasjoner1. EF-prosessen er bare spesifisert som følger: for hver 100 kg EF tilsettes 20 kg fosterolje (raffinert), og den er mildfyrt til jevn og skinnende1. Det er ingen strenge EF-behandlingsmetodeparametere i standardene ovenfor, så lokale behandlingsspesifikasjoner er ikke samlet for å gi konsistens. Derfor vil det være nyttig å gjennomføre en systematisk studie av EF-prosessen. I denne artikkelen ble Box-Behnkens eksperimentelle design-respons overflatemetode brukt til å optimalisere prosesseringsteknologien til EF.
Box-Behnken eksperimentelle design er en metode som vanligvis brukes til å optimalisere faktorene i en prosess. Ekstraksjonsparametrene kan optimaliseres ved å etablere det funksjonelle forholdet mellom flere regresjonslikningstilpasningsfaktorer og effektverdier. Nylig har denne metoden blitt mye brukt til å studere TCM ekstraksjon 5,6,7 og behandling 9,10,11. Ulike studier har rapportert TCM-forberedelsesmetoder som involverer saltbehandling, vinbehandling og steking etter en Box-Behnken-design, for eksempel for saltbehandlet Psoraleae fructus 12, vinbehandlet Cnidii fructus13 og stekt Cinnamomi ramulus14. Denne metoden har redusert testtid, høy testnøyaktighet og er egnet for tester med flere faktorer og flere nivåer. Metoden er enklere enn den ortogonale designtestmetoden og mer omfattende enn den ensartede designmetoden15. De oppnådde forholdene kan bestemme den forutsagte verdien av et hvilket som helst testpunkt innenfor testområdet, noe som er en stor fordel. En sebrafiskmodell kan brukes til å teste om EF er mindre giftig etter prosessering.
I toksisitetsstudier av TCM har sebrafiskmodellen de doble fordelene med den høye gjennomstrømningen av celleforsøk og likhetene med gnagereksperimenter16. Denne modellen er preget av sin lille størrelse, høy gytehastighet, kort reproduksjonssyklus og enkel avl. Modellen kan brukes i storskala synkrone eksperimenter i cellekulturplater, og den eksperimentelle legemiddeldoseringen er liten, eksperimentell syklus er kort, kostnaden er lav, og hele eksperimentelle prosessen er lett å observere og betjene17. Sebrafiskembryoer er gjennomsiktige og utvikler seg raskt. Derfor kan toksisitet og teratogene effekter av legemidler på visceralt vev i forskjellige utviklingsstadier observeres direkte under et mikroskop18. Genhomologien mellom sebrafisk og mennesker er så høy som 85%18. Signaltransduksjonsveien til sebrafisk ligner på mennesker18. Den biologiske strukturen og fysiologiske funksjonen til sebrafisk er svært lik den hos pattedyr18. Derfor kan en sebrafiskmodell for narkotikatesting gi eksperimentelle dyr som er pålitelige og fullt anvendelige for mennesker19.
I denne studien brukte vi Box-Behnken design-response overflatemetodikk for å optimalisere mengden og temperaturen på fårekjøttolje og steketemperaturen som brukes i EF-prosesseringsteknologien, med innholdet av icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C og baohuoside I som evalueringsindekser. Sebrafiskmodellen ble brukt til å foreløpig undersøke effekten av et EF-vannekstrakt på sebrafiskens embryonale utvikling før og etter prosessering for å evaluere dempingseffekten av prosessering på EF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrerelaterte eksperimenter ble utført med godkjenning fra Experiment Ethics Committee ved Chongqing Institute of TCM (sertifikatnummer for gjennomgang av forsøksdyretikk: ZJS2022-03).
1. Bestemmelse av de bioaktive komponentene
MERK: Arten som ble brukt i denne undersøkelsen var Epimedium sagittatum, og prøvene ble samlet inn i Fengdu County, Chongqing. Prøven ble identifisert som en tørr overjordisk del av E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Leveregel. av forskere fra Institutt for biologisk medisin, Chongqing Institute of Traditional Chinese Medicine.
- Klargjør kontrollproduktløsningen ved nøyaktig veiing av riktig mengde av hvert referansestoff, nemlig icariin, epimedin A (EA), epimedin B (EB), epimedin C (EC) og baohuosid I (BI), ved hjelp av en elektronisk analysebalanse, og oppløses i metanol. Bruk disse til å lage en blandet referansestamløsning inneholdende 381,61 mikrogram / ml icariin, 124,14 mikrogram / ml EA, 110,24 mikrog / ml EB, 1091,75 mikrogram / ml EC og 184,98 mikrogram / ml BI.
- Forbered testproduktløsningen ved å knuse EF gjennom en sil nr. 3. Plasser ca. 0,2 g (ved hjelp av en elektronisk analytisk balanse) knust EF i en stoppet Erlenmeyer-kolbe, tilsett 20 ml fortynnet etanol, og deretter ultralyd ved 400 W effekt og 50 kHz frekvens i 1 time. Rist godt, og pass gjennom et 0,22 μm membranfilter for å oppnå testløsningen.
- Utfør kromatografien som følger. Bruk høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) med en C18-kolonne med dimensjoner på 4,6 mm x 250 mm og en indre diameter på 5 μm. Bruk acetonitril som mobil fase A og ultrarent vann som mobilt fase B. Bruk følgende gradientelueringsparametere: 0-30 min, 24% A til 26% A; 30-31 min, 26% A til 45% A; 31-45 min, 45% A til 47% A. Bruk en deteksjonsbølgelengde på 220 nm (for detektoren som brukes, se Materialfortegnelse). Hold kolonnetemperaturen på 30 °C og strømhastigheten på 1,0 ml/min, og bruk en prøvestørrelse på 10 μL.
- For å undersøke det lineære forholdet, bruk blandet referanseløsning som i trinn 1.1 fortynnet 2 ganger, 4 ganger, 8 ganger, 16 ganger og 32 ganger, for henholdsvis icariin, EA, EB, EC og BI. Bruk acetonitril som mobil fase A og ultrarent vann som mobil fase B.
- Bruk følgende gradientelueringsparametere: 0-30 min, 24% A til 26% A; 30-31 min, 26% A til 45% A; 31-45 min, 45% A til 47% A. Bruk en deteksjonsbølgelengde på 220 nm (for detektoren som brukes, se Materialfortegnelse). Hold kolonnetemperaturen på 30 °C og strømhastigheten på 1,0 ml/min og bruk en prøvestørrelse på 10 μL. Til slutt registrerer du toppområdene. Plott den lineære regresjonen med referansekonsentrasjonen (x-aksen, μg/ml) som abscissa og toppområdet (y-aksen) som ordinat ved hjelp av profesjonell programvare (se Materialfortegnelse).
- Utfør presisjonstesten ved å måle den blandede kontrollløsningen seks ganger på rad med HPLC ved hjelp av de kromatografiske forholdene vist i trinn 1.3. Registrer deteksjonstid og toppområder for hver kjemisk sammensetning, og beregne de relative standardavvikene (RSD) for toppområdene for å vurdere presisjonen (reproduserbarhet) ved hjelp av formelen nedenfor:
RSD% = standardavvik (SD)/aritmetisk gjennomsnitt av beregnede resultater (X) x 100 % - For å utføre reproduserbarhetstesten, vei EF-pulveret nøyaktig og klargjør seks deler av testproduktløsningen parallelt i henhold til metoden i trinn 1.2. Underkast de tilberedte løsningene for HPLC under kromatografiske forhold presentert i trinn 1.3. Registrer retensjonstider og toppområder for hver kjemisk sammensetning og beregne mengdene av hver forbindelse fra en standardkurve (toppområder versus konsentrasjoner). Beregn RSD% som ovenfor.
- For å utføre stabilitetstesten må du oppbevare testløsningene ved romtemperatur og måle innholdet ved hjelp av HPLC-metoden beskrevet i trinn 1.3 ved 0 timer, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 12 timer og 24 timer etter klargjøring for å vurdere stabiliteten. Registrer retensjonstider og toppområder for hver kjemisk sammensetning og beregne RSD% av toppområdene som ovenfor.
- For å utføre prøvegjenopprettingstesten, vei 0,2 g EF-pulver inn i en stoppet Erlenmeyer-kolbe for seks replikater. Tilsett en passende mengde referanseløsning (mengden referansesubstans tilsatt prøven tilsvarer 100 % av prøvens kjente innhold) og klargjør testoppløsningen i henhold til metoden presentert i trinn 1.2.
- Injiser prøvene i kromatografen og analyser i henhold til kromatografiske forhold i trinn 1.3. Registrer toppområdene, og beregn gjennomsnittlig utvinning og RSD% verdier som nedenfor:
Gjenvinningsgrad for piggprøven = (pigget prøveinnhold − prøveinnhold)/utvalgsmengde x 100 %
2. Optimalisering av EF fårekjøtt-olje prosesseringsteknologi ved hjelp av Box-Behnken design-respons overflatemetodikk
- Velg nøkkelparametrene i EF-prosessering, for eksempel mengden fårekjøttolje (A; 15%-35%), fårekjøttoljetemperaturen (B; 50-120 °C) og steketemperaturen (C; 80-300 °C), som innflytelsesrike faktorer. Bruk de omfattende poengsummene for icariin-, EA-, EB-, EC- og BI-innhold som evalueringsindekser. Prosentandelen fårekjøttolje her er masseprosenten.
- Bruk programvaren for responsoverflateanalyse (se Materialfortegnelse) til å designe Box-Behnken-responsoverflateeksperimentene, utforske den kvadratiske responsoverflaten og konstruere en andreordens polynommodell. Velg den nye Box-Behnken-designen, og sett alternativet Numeriske faktorer til 3; angi faktorene A, B og C. Klikk på Fortsett. Sett alternativet Svar til 1 (som var den omfattende poengsummen). Klikk på Fortsett for å fullføre designet. Det var planlagt 17 eksperimenter (se tabell 1).
MERK: For de uavhengige og avhengige variablene, sammen med deres lave, midtre og høye nivåer, se tabell 2. - Behandle EF i henhold til de spesifikke parametrene i tabell 1; For eksempel, for ordre nummer 1, vei raffinert fårekjøttolje som 15% V / V, og varm deretter til 50 ° C for å smelte den. Tilsett den rå EF-en i det smeltede fårekjøttet, stek over et forsiktig bål (190 °C) til det er jevnt blankt, og fjern deretter og avkjøl. Utførte 17 eksperimentelle operasjoner. Totalt 17 grupper EF-bearbeidede produkter ble innhentet i dette arbeidet.
MERK: Fårekjøttolje er fast ved romtemperatur (25 °C) og smelter til væske ved oppvarming. Fårekjøttolje i flytende tilstand kan brukes som hjelpestoff. - Forbered testløsningene til de bearbeidede produktene i henhold til metoden beskrevet i trinn 1.2. Analyser dem deretter ved hjelp av HPLC i henhold til de kromatografiske forholdene beskrevet i trinn 1.3. Registrer retensjonstider og toppområder for hver kjemisk sammensetning, og beregn innholdet i icariin, EA, EB, EC og BI i hver testløsning mot en ekstern standardkurve. Bruk den omfattende poengberegningsformelen nedenfor for å beregne de omfattende poengsummene til de 17 eksperimentelle gruppene:
Omfattende poengsum = Z/Z maks × 0,5 + BI/BImaks × 0,5
hvor Z er summen av innholdet i icariin, EA, EB og EC; Zmax er den maksimale verdien av summen av innholdet i icariin, EA, EB og EC i de 17 eksperimentelle gruppene; BI er BI-innholdet; og BImax er den maksimale verdien av BI-innholdet i de 17 eksperimentelle gruppene. - Importer de omfattende poengresultatene for de 17 gruppene av eksperimenter til dataanalyseprogramvaren (se Materialliste) for å analysere eksperimentelle data. Under evalueringselementene velger du alternativet for kvadratisk prosessrekkefølge og polynommodelltype.
3. Testing av effekten av prosessering på sebrafiskens embryonale utvikling
- Prøve forberedelse
- Knus råoljen og behandlet EF gjennom en sil nr. 3 (se materialfortegnelse). Til 100 g av hver EF-prøve, tilsett 1000 ml ultrarent vann. Bløtlegg EF i 0,5 timer, kok opp vannet to ganger i 30 minutter hver, og filtrer deretter med filterpapir.
- Kombiner filtratene og konsentrer prøven ved oppvarming. Tilsett ultrarent vann til et endelig volum på 100 ml for å oppnå de behandlede EF (PEF, 1 g/ml) og råolje-EF (CEF,1 g/ml) stamløsningene. Mål mengden rå stoff i hver stamløsning.
- Plasser alikoter med 1 ml, 1,5 ml, 2,5 ml, 5 ml, 5 ml og 7,5 ml stamløsninger i 10 ml volumetriske kolber, og tilsett deretter ultrarent vann i volum for å forberede testløsningene med konsentrasjoner på 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 500 mg/ml og 750 mg/ml for embryotoksisitetsstudien for sebrafisk.
MERK: Konsentrasjonene av testløsningene ble utarbeidet ved å referere til relevant litteratur 20,21 og ved å utføre foreløpige eksperimenter for å gi10 ganger konsentrasjonsgradienten som brukes i normal toksikologi. CEF var en ubearbeidet prøve, og PEF var en prøve fremstilt med den beste prosesseringsteknologien beskrevet i avsnitt 2.
- Sebrafiskhold og embryobehandling21
- Tilpass villtype sebrafisk (se materialfortegnelse) ved en kontrollert temperatur i 2 dager, hold dem i et gjennomstrømningsakvarium ved pH 7,0-7,4 og mate dem to ganger daglig.
MERK: Hemming av melanindannelse i sebrafisk ble oppnådd ved å tilsette 1-fenyl-2-tiourea i en konsentrasjon på 0,003% (masse/volum) til kulturmediet, noe som holdt kroppene gjennomsiktige for morfologisk observasjon. - Velg voksne fruktbare villsebrafisk om kvelden og skill dem ved å bruke baffler i parringsbokser. Fjern vaflene neste morgen, og la fisken gyte i 30 min. Samlet de befruktede eggene med en dropper hver 15. Totalt ble det samlet inn 520 friske villtypeembryoer. Hold sebrafiskembryoene i en inkubator ved 28,5 °C i 24 timer.
- Tilfeldig tilordne de sunne embryoene ved 24 timer etter befruktning (hpf) til 13 grupper, og sammen med en kontrollgruppe, suge separat i 10 ml av hver av følgende løsninger i en kulturskål: PEF: 100 μg / ml, 150 μg / ml, 200 μg / ml, 250 μg / ml, 500 μg / ml, 750 μg / ml; CEF: 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml. Behandle den tomme kontrollgruppen med mediet som en løsning. Hver gruppe inneholdt 40 embryoer i denne studien.
MERK: Mediesammensetningen er 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na 2 HPO 4, 0,45 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO 4 og 4 mM NaHCO3. - Dyrk sebrafisken i en konstant temperaturinkubator for opptil 120 hpf. Tell antall døde larver hver dag, observer larvenes hovedorganmorfologi i hver forsøksgruppe under et stereomikroskop (skalalinje = 500 μm, se materialtabell), og beregn halvdødskonsentrasjonen (LC50) av sebrafisk ved 72 hpf ved hjelp av dataanalyseprogramvare (se materialtabell).
- Tilpass villtype sebrafisk (se materialfortegnelse) ved en kontrollert temperatur i 2 dager, hold dem i et gjennomstrømningsakvarium ved pH 7,0-7,4 og mate dem to ganger daglig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodiske undersøkelsesresultater
En lineær sammenheng mellom konsentrasjonen av icariin, EA, EB, EC, BI og kromatografiske toppområder ble observert (se tabell 3). RSD%-verdiene (n = 6) av de kromatografiske toppområdene av icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 0,28 %, 1,22 %, 0,65 %, 1,67 % og 1,06 %, noe som indikerer at presisjonen til HPLC-målingene var god. RSD%-verdiene (n = 6) av innholdet i icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 1,59 %, 1,46 %, 1,86 %, 2,29 % og 0,98 %, noe som indikerer at metoden hadde god repeterbarhet. RSD%-verdiene (n = 6) av toppområdene av icariin, EA, EB, EC og BI i prøvene var henholdsvis 1,49 %, 1,96 %, 1,42 %, 0,96 % og 0,81 %, noe som indikerer at prøveløsningen var stabil innen 24 timer. Gjennomsnittlig utvinningsgrad av icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 99,98 %, 100,14 %, 100,09 %, 100,75 % og 100,94 %, og RSD%-verdiene var henholdsvis 0,56 %, 0,78 %, 0,84 %, 1,10 % og 1,47 % (se tabell 4). Disse resultatene viser at nøyaktigheten av metoden oppfylte kravene.
De ovennevnte eksperimentelle resultatene viste at analysemetoden ga resultater som hadde utmerket presisjon, reproduserbarhet og nøyaktighet og var akseptable for kvalitetsanalysen av de EF-behandlede produktene.
Optimalisering av fårekjøtt-oljebehandlingsteknologien til EF ved å anvende Box-Behnken design-response overflatemetodikk
Vi utførte kvadratisk polynomregresjonstilpasning av ovennevnte data for å få følgende modell: Y = 0,86 − 0,11 x A + 0,025 x B − 0,078 x C − 0,023 x A x B − 0,037 x A x C + 0,037 x B x C − 0,045 x A 2 + 2,5 x 10-3 x B 2 − 0,14 x C 2. Variansanalysen ga en verdi på P < 0,01, noe som indikerer at modellen var signifikant. P-verdien av manglende tilpasning var P > 0,05, noe som indikerer at mangelen på passform ikke var signifikant. R2-verdien var 0, 9300, noe som indikerer at passformen til modellen var god, og feilen var liten. Det var mulig å bruke denne modellen til å analysere og forutsi effekten av innholdet i kjemisk sammensetning av EF wokket med fårekjøttolje. I tillegg hadde A 2 og D2 en effekt på innholdet av de bearbeidede produktene, og forskjellen var statistisk signifikant (P < 0, 01). Effektene av A og C av engradstermen og C2 av andreordenstermen på den omfattende poengsummen var signifikante. Engradsbegrepet B, andreordens A 2, B2 og alle interaksjonselementene hadde ingen signifikant effekt på den omfattende poengsummen. Analysen av P-verdiene viste at av de eksperimentelle parametrene hadde fårekjøttoljemengden (A) størst effekt på den omfattende poengsummen, etterfulgt av steketemperaturen (C), og deretter fårekjøttoljetemperaturen (B). Resultatene ovenfor er vist i tabell 5.
Programvaren ble brukt til å sette fårekjøttoljemengde, fårekjøttoljetemperatur og steketemperatur til medianene og å bruke den omfattende poengsummen som indeks for å tegne et enkeltfaktor påvirkningsdiagram av en faktor (figur 1). Ved å øke steketemperaturen økte først den omfattende poengsummen og reduserte den deretter (figur 1). Fårekjøttoljetemperaturen hadde en ubetydelig effekt på den omfattende poengsummen. Fårekjøttoljemengden var den viktigste faktoren som påvirket endringen i den omfattende poengsummen, og etter hvert som mengden økte, trendet innholdet nedover.
For å bedre forstå resultatene presenteres de predikerte modellene i figur 2 som overflateplott for 3D-respons. Når det gjelder helningen på responsflaten, jo større betydning samspillseffekten mellom faktorer, jo mildere skråning, og jo mindre signifikant effekt. En ellipse i form av en konturlinje indikerer et sterkt samspill mellom faktorer, mens en sirkel indikerer det motsatte. Responsflaten til fårekjøttoljemengden og steketemperaturen var brattere sammenlignet med de andre testede faktorene, og konturlinjene hadde en tendens til å være mer elliptiske (se figur 2C,D), noe som indikerer at samspillet mellom disse to faktorene var mer signifikant; vekselvirkningene mellom andre faktorer var derimot ikke signifikante (se figur 2A,B,E,F).
Den optimale fårekjøttoljebehandlingsteknologien til EF ble valgt som følger: en fårekjøttoljemengde på 15%; en fårekjøttoljetemperatur på 120 °C; og en steketemperatur på 189 °C. Tatt i betraktning at temperaturen ikke kan kontrolleres veldig nøyaktig under faktisk drift, er temperaturverdien spesifisert som en variabel ±10 °C. Derfor var de endelige parametrene som følger: en fårekjøttoljemengde på 15%; en fårekjøttoljetemperatur på 120 °C ± 10 °C; og en steketemperatur på 189 °C ± 10 °C. Den optimale prosessen var som følger: oppvarming av fårekjøttoljen ved 120 °C ± 10 °C, tilsetning av råoljen EF, steking med mild ild (189 °C ± 10 °C) til den er jevnt blank, og fjerning og avkjøling. For hver 100 kg EF skal 15 kg fårekjøttolje (raffinert olje) brukes. Ved hjelp av disse forholdene ble det utført tre parallelle eksperimenter, og poengene som ble oppnådd var 0, 96, 0, 97 og 0, 94 (RSD% = 1, 60%), noe som indikerer stabile og gjennomførbare forhold. De typiske HPLC-kromatogrammene til de rå, bearbeidede og blandede referansestoffene i EF er vist i figur 3.
Test av effekten av behandling på den embryonale utviklingen av sebrafisk
Sebrafisken klekket til yngel på 72 hpf. Utviklingen av hvert organ var i utgangspunktet fullført. Fiskekroppene forble gjennomsiktige, og det var lett å legge dem på siden på glasssklien. Formen på organene var enkle å observere og identifisere når de ble sett under et mikroskop. Den tomme kontrollgruppen opplevde ingen død eller organtoksisitet i administrasjonsperioden. Sammenlignet med kontrollgruppen, ved en legemiddelkonsentrasjon på 100 μg / ml, ble det ikke funnet noen åpenbare abnormiteter i rå EF-gruppen (S) og den behandlede gruppen (P) ved 72 hpf. Ved 96 hpf og senere var svømmeblærens ufullstendighet og tap av svømmeblæren vanligere hos ungfisken i rågruppen, men var sjelden hos ungfisken i den bearbeidede gruppen. Ved en legemiddelkonsentrasjon på 150 μg/ml ble det sett åpenbare spinale deformiteter, kroppskurvaturdeformiteter, perikardødem og leverdeformasjon hos ungfisken i råoljegruppen på 72 hpf, men disse forandringene var sjeldne hos settefisken i den bearbeidede gruppen, og graden av teratogenitet var svakere enn hos rågruppen. Ved en legemiddelkonsentrasjon på 200 μg/ml døde all ungfisk i råoljegruppen, og det oppsto tydelig teratogenisitet hos settefisken i den bearbeidede gruppen. Ved en legemiddelkonsentrasjon på 250 μg/ml overlevde et lite antall sebrafisk i den bearbeidede gruppen. De mikroskopiske undersøkelsesresultatene av sebrafisken er vist i figur 4.
Dødeligheten av sebrafisk i de rå og bearbeidede Epimedium-urtegruppene var avhengig av konsentrasjon og tidspunkt for administrasjon. Tids-dose-dødelighet-forholdet er vist i figur 5. Resultatene for sebrafiskdødelighet viste at 24 timer etter administrering (48 hpf), ved en legemiddelkonsentrasjon på 200 μg/ml, døde all sebrafisk i råstoffgruppen, mens dødeligheten i den bearbeidede gruppen bare var 6,67 %. Ved 48 timer etter EF-administrasjon (72 hpf) var konsentrasjonen som forårsaket død av all sebrafisk i råstoffgruppen 200 μg/ml, og konsentrasjonen som forårsaket døden av all sebrafisk i den bearbeidede gruppen var 500 μg/ml. Median dødelig konsentrasjon av de to eksperimentelle gruppene ved 72 hpf ble beregnet. Resultatene viste at LC50 (se figur 6) var 151,3 μg/ml i råoljegruppen (S) og 219,8 μg/ml i den behandlede gruppen (P).
Figur 1 Univariat analyse. Figuren viser enkeltfaktor-påvirkningsdiagrammet. A er enkeltfaktorresultatet av mengden fårekjøtt (suet) olje; B er enkeltfaktorresultatet av temperaturen på fårekjøttoljen (suet); og C er enfaktorresultatet av steketemperaturen. Med en økende steketemperatur øker den omfattende poengsummen først og senker deretter. Fårekjøttoljetemperaturen har liten effekt på partituret. Mengden fårekjøttolje var den viktigste signifikante faktoren som påvirket endringen i den omfattende poengsummen, og innholdet viste en nedadgående trend med en økende mengde fårekjøttolje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Responsflate og konturplott av påvirkning av ulike faktorinteraksjoner på den omfattende skåren. (A) Denne figuren viser et 3D-responsoverflateplott av samspillet mellom fårekjøttoljemengden og temperaturen. (B) Denne figuren viser et konturplott av samspillet mellom fårekjøttoljemengde og temperatur. (C) Denne figuren viser et 3D-responsoverflateplott av samspillet mellom fårekjøttoljemengden og prosesseringstemperaturen. (D) Denne figuren viser et konturplott av samspillet mellom fårekjøttoljedosering og prosesseringstemperatur. (E) Denne figuren viser et 3D-responsoverflateplott av samspillet mellom fårekjøttoljemengde og prosesseringstemperatur. (F) Denne figuren viser et konturplott av samspillet mellom fårekjøttoljemengde og prosesseringstemperatur. Resultatet viser at responsflaten til fårekjøttoljemengden og steketemperaturen var bratt enn de andre testede parametrene og konturlinjene hadde en tendens til å være elliptiske (se C,D), noe som indikerer at samspillet mellom disse to faktorene var signifikant, mens interaksjonene mellom andre faktorer ikke var signifikante (se A,B,E, F). Suetoljebegrepet som brukes i figuren refererer til fårekjøttolje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: HPLC-kromatogrammer av rå, bearbeidede og blandede referansestoffer i EF . (A) Denne figuren viser HPLC-kromatogrammet til det blandede referansestoffet. (B) Denne figuren viser HPLC-kromatogrammet av rå Epimedii folium. (C) Denne figuren viser HPLC-kromatogrammet for Epimedii foliumbehandlede produkter. Disse tre bildene viser at BI-innholdet i rå EF er lavt, mens det øker etter prosessering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mikrografer av sebrafisk. Denne figuren viser mikrografer av sebrafisken. (A) Denne figuren viser resultatene for observasjon av sebrafisk under et mikroskop i den tomme gruppen. (B) Denne figuren viser resultatene for observasjon av sebrafisk under mikroskop i rågruppen. (C) Denne figuren viser resultatene for observasjon av sebrafisk under et mikroskop i den bearbeidede gruppen. Den tomme kontrollgruppen opplevde ingen død eller organtoksisitet i administrasjonsperioden. Ved en EF-legemiddelkonsentrasjon på 150 μg/ml ble det sett åpenbare spinaldeformiteter, kroppskurvatur, perikardødem og leverdeformasjon hos ungfisken i råoljegruppen ved 72 hpf, mens disse endringene var sjeldne hos ungfisk i den bearbeidede gruppen, og graden av teratogenitet var svakere enn hos råoljegruppen. Ved en legemiddelkonsentrasjon på 200 μg/ml døde all ungfisk i råoljegruppen, og tydelig teratogenitet dukket opp i den bearbeidede gruppen. Ved en legemiddelkonsentrasjon på 250 μg/ml overlevde bare et lite antall sebrafisk i den bearbeidede gruppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Forholdet mellom dosering av tid-dose-dødelighet. Denne figuren viser forholdet mellom dosering av tid-dose-dødelighet. (A) Denne figuren viser forholdet mellom dosering av tid-dose-dødelighet for råoljegruppen. (B) Denne figuren viser forholdet mellom dosering av tid-dose-dødelighet for den behandlede gruppen. n = 40. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: LC50-diagram over råolje og behandlet EF. LC50-diagrammet over den rå og behandlede EF er vist. Median dødelige konsentrasjoner av de to eksperimentelle gruppene ved 72 hpf ble beregnet. LC50 var 151,3 μg/ml i råoljegruppen (S) og 219,8 μg/ml i prosesseringsgruppen (P). n = 40. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Eksperimentell design og Box-Behnken-responsoverflatemetoden resultater fra de 17 forsøksgruppene. Tabell 1 viser de 17 gruppene av eksperimenter designet av Box-Behnken design-respons overflatemetode og deres omfattende poengsumresultater. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Variabler brukt i Box-Behnken-designet. De uavhengige og avhengige variablene er oppført her sammen med deres lave, midtre og høye nivåer. Box-Behnken-designet gjorde det mulig å identifisere de mest innflytelsesrike faktorene i EF-prosesseringen, med fårekjøttoljemengden (A) (15%-35%), fårekjøttoljetemperaturen (B) (50 °C-120 °C) og steketemperaturen (C) (80 °C-300 °C) som påvirkningsfaktorene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Regresjonsligninger og lineære områder av de kjemiske bestanddelene i EF. Resultatene av regresjonsligningen og det lineære området for EFs kjemiske sammensetning viser at det var god linearitet mellom hver av konsentrasjonene av icariin, EA, EB, EC og BI og deres kromatografiske toppområder. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Testrater for prøveutvinning. Den gjennomsnittlige utvinningsgraden av icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% og 100,94%, og RSD%-verdiene var henholdsvis 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% og 1,47%. Resultatene viser at metodens nøyaktighet var egnet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 5: Regresjonskoeffisienter for den predikerte kvadratiske modellen. P-verdien til modellen var P < 0,01, noe som indikerer at modellen var signifikant. P-verdien av manglende tilpasning var P > 0,05, noe som indikerer at mangelen på passform ikke var signifikant. R2-verdien var 0,9300, noe som indikerer at passformen til modellen var god, og feilen var liten, så modellen var egnet til å analysere og forutsi effekten av det kjemiske sammensetningsinnholdet i EF wok med fårekjøttolje. I tillegg hadde A 2 og D2 signifikante effekter på innholdet av bearbeidede produkter (P < 0, 01). Påvirkningen av A og C av engradsbegrepet og C2 i andreordenstermen på den omfattende poengsummen var signifikant. Engradsbegrepet B, andreordens A 2, B2 og alle interaksjonselementene hadde ingen signifikante effekter på den omfattende poengsummen. Analysen av P-verdien viste at mengden fårekjøttolje (A) av de eksperimentelle parametrene hadde størst innflytelse på den omfattende poengsummen, etterfulgt av steketemperaturen (C), og deretter temperaturen på fårekjøttoljen (B). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uavhengige variabler og bestemmelse av deres nivåer
EF-prosesseringsteknologien er bare beskrevet i 2020-utgaven av den kinesiske farmakopéen og de lokale kinesiske medisinbehandlingsspesifikasjonene publisert av 26 provinser, kommuner og autonome regioner over hele landet1. Beskrivelsen innebærer følgende trinn: ta fårekjøttolje og varme den opp til å smelte, tilsette EF-strimler, steke med langsom ild til den er jevn og skinnende, ta den ut og la den avkjøles. I tillegg brukes 20 kg (forkortet som 20%) fårekjøttolje (raffinert) for hver 100 kg Epimedium. Parametrene for prosesseringsprosessen til EF er imidlertid ikke spesifisert. Blant de uavhengige variablene i dette eksperimentet kan tre nøkkelfaktorer kvantifiseres i produksjonsprosessen: fårekjøttoljedoseringen, fårekjøttoljetemperaturen og steketemperaturen. Verdiområdet skal settes i henhold til beskrivelsen ovenfor. Fra resultatene av den foreløpige testen kan det ses at når mengden fårekjøttolje er 15%, kan EF-bladene være jevnt belagt med fårekjøttolje. Når dosen overstiger 35%, er det for mye fårekjøttolje. Til slutt bør rekkevidden av fårekjøttoljemengden være 15% -35%. Når temperaturen når 50 °C, smelter fårekjøttolje. Når temperaturen når >120 °C, begynner fårekjøttoljen å røyke, og temperaturen er for høy. Derfor bør temperaturområdet for fårekjøttoljen være 50 °C-120 °C. Den kinesiske farmakopéen 2020-utgaven fastsetter at EF skal stekes med langsom ild. Den langsomme brannen bør ikke overstige 200 °C, og steketemperaturen bør variere fra 80 °C til 300 °C.
Omfattende scoring
Under behandlingen av Epimedium brytes de glykosidiske bindingene, og de glykosidiske komponentene omdannes til lavere glykosidiske komponenter. Bestemmelsen av innholdet i EF-behandlede produkter i 2020-utgaven av den kinesiske farmakopéen er basert på bestemmelsen av det totale innholdet av icariin, EA, EB og EC i de originale legemidlene, og en monoglykosidkomponent, BI, er oppført separat som en indikator. I dette eksperimentet var totalvekten av icariin, EA, EB og EC i den behandlede EF 50%, vekten av BI var 50%, og den omfattende poengsummen ble satt basert på disse verdiene.
Responsoverflatemetodikk (RSM) er en statistisk teknikk for å identifisere optimale prosessparametere og løse multivariate problemer. I denne teknikken brukes en rimelig eksperimentell design for å oppnå visse data gjennom eksperimenter, og en multivariat kvadratisk regresjonsligning brukes til å utlede et funksjonelt forhold mellom faktorene og responsene22. Enhetlig design og ortogonal designprosessoptimalisering brukes ofte, men testnøyaktigheten er ikke høy, og den matematiske modellen er ikke veldig forutsigbar. Den matematiske modellen som ligger til grunn for RSM er svært forutsigbar. RSM krever færre eksperimenter og kortere sykluser, noe som ikke bare kan eliminere problemene knyttet til tradisjonell matematisk statistikk, men kan også klargjøre forholdet mellom faktorer og svar23. RSM konseptualiserer systemets respons som en funksjon av en eller flere faktorer og bruker grafiske teknikker for å vise dette funksjonelle forholdet for å hjelpe brukeren til å velge de optimale forholdene i eksperimentell design ved intuitiv visuell observasjon. Disse fordelene har ført til bred bruk av denne metoden i kjemisk industri24, biologisk ingeniørfag, næringsmiddelindustrien25, farmasøytisk industri og TCM-preparater.
Selv om RSM kan identifisere det funksjonelle forholdet mellom svar (indekser som skal undersøkes) og faktorer (uavhengige variabler), er ikke alle eksperimenter egnet for responsoverflateoptimalisering fordi det ikke alltid er et sterkt funksjonelt forhold mellom responsen og faktorene. RSM får ofte kontinuerlige funksjonsforhold, som krever at alle faktorene er kontinuerlige variabler. Likevel er ikke alle faktorer som skal undersøkes kontinuerlige variabler eller har signifikante effekter på responsverdiene i begynnelsen av det eksperimentelle designet. For å redusere antall eksperimenter og forbedre nøyaktigheten av responsflatemodelleringen, er screening nødvendig for å velge de viktige faktorene og bestemme nivåene deres gjennom faktoriell design, ensartet design eller ortogonal design før du utfører responsoverflatedesignmetodikk. Den største fordelen med responsflatemetodikk er at når modellen er korrekt etablert, kan responsverdien under en hvilken som helst kombinasjon av betingelser forutsies, og det funksjonelle forholdet kan ses mer intuitivt og visuelt gjennom 3D-responsflaten. Denne visualiseringen er til stor hjelp for forskere med å finne de optimale behandlingsforholdene26.
Denne studien brukte Box-Behnken-designprinsippet til RSM for å designe 17 kombinerte eksperimenter ved å bruke den omfattende kjemiske innholdspoengsummen til EF som responsverdi. Til slutt ble de beste prosessoptimaliseringsresultatene oppnådd ved regresjonsanalyse. Prosesseringsteknologien ble optimalisert som følger: oppvarming av fårekjøttoljen ved 120 °C ± 10 °C, tilsett råoljen EF, stek den med en mild ild (189 °C ± 10 °C) til den er jevnt blank, og deretter fjerning og avkjøling. For hver 100 kg EF skal 15 kg fårekjøttolje (raffinert olje) brukes. Våre resultater viste at EF-prosessen var stabil, pålitelig og repeterbar. I tillegg ble faktorinteraksjoner analysert, og samspillet mellom fårekjøttoljemengde og steketemperatur, men ikke interaksjonene mellom andre faktorer, var signifikant. Denne studien viste at responsflatedesignet, som en metode for å analysere samspillet mellom faktorer og forholdet mellom faktorer og deres responsoverflateverdier, muliggjorde optimalisering av behandlingsforholdene på kort tid med et minimalt antall eksperimenter. De utvalgte faktorene i denne studien var nøkkelfaktorene identifisert i enkeltfaktorscreeningseksperimentet, og nivåene ble bestemt i et foreløpig eksperiment. Testprøvene samsvarte med egenskapene til responsflatemetoden, slik at studien kunne bruke responsflatemetodikken til å etablere en prediktiv modell. De eksperimentelle resultatene kan gi en referanse for å forbedre kvaliteten og ensartetheten til den behandlede EF.
Sebrafiskembryoer brukes som modellorganismer innen utviklingsgenetikk fordi de er gjennomsiktige, utvikler in vitro og er enkle å observere27. Vanlige toksisitetsindikatorer for sebrafisk i utviklingstoksisitetsstudier inkluderer embryonal dødelighet, embryonal misdannelseshastighet, eggeplomme-sac-ødem, pigmentdannelse, eggkondensering, haleforlengelse, hodemorfologi og kroppssegmentdannelse, blant annet28. Sammenlignet med pattedyrs toksisitetsevalueringsteknikker er spesifisiteten til sebrafiskembryoer for påvisning av sammensatt toksisitet 70% -80%, og følsomheten overstiger 80%18. Ton et al.29 fant at nøyaktigheten av å evaluere utviklingstoksisiteten av ikke-teratogene forbindelser med sebrafiskembryoer var 75%. Teratogene forbindelser ble evaluert med 100% nøyaktighet her. Selv om TCM har egenskapene til komplekse komponenter og uklare målorganer for toksisitet, kan sebrafiskembryoer fortsatt brukes som en eksperimentell dyremodell for nøyaktig og rask evaluering av utviklingstoksisitet. Han et al.30 fant at emodin påvirket overlevelse og klekkefrekvens av sebrafiskembryoer, forårsaker stammebøyning og eggeplomme-sekk ødem. Chen et al.31 fant at muscone forårsaket sebrafisk embryo perikardial ødem, spinalkurvatur og eggeplomme-sac ødem. Han et al.32 fant at Arnebiae Radix hadde dødelige effekter på sebrafisk i alle utviklingsstadier, og 1,0 mg / L Arnebiae Radix hemmet embryonal utvikling, noe som resulterte i redusert antall somitter, haledeformiteter, kroppsbøyning og redusert melanin i sebrafiskembryoer.
For å undersøke effekten av rå og bearbeidet EF på utvikling av sebrafiskembryoer, ble det utført et utviklingstoksisitetseksperiment for sebrafiskembryo i denne studien. Dataene viste at LC50-verdiene var 151,3 μg/ml for råoljegruppen (S) og 219,8 μg/ml for den behandlede gruppen (P). Observasjon av sebrafiskkroppene i hver forsøksgruppe gjennom et mikroskop viste en tydelig grad av sebrafiskens teratogenisitet i rågruppen. De fleste fiskene viste varierende grad av teratogenisitet, inkludert spinal deformitet, kroppskurvaturdeformitet, perikardødem, ufullstendighet i svømmeblæren eller leverdeformasjon, og disse observasjonene var sjeldne i den behandlede gruppen. Disse eksperimentene viste at toksisiteten til EF ble signifikant redusert etter behandling, noe som tyder på at behandling kan redusere legemiddeltoksisitet hos mennesker. De eksperimentelle resultatene gir en referanse for å forbedre den kliniske medisinsikkerheten til fårekjøttoljebehandlet EF.
Tradisjonell kinesisk medisin antyder at nyrens funksjon er nært knyttet til vekst, utvikling og reproduksjon av menneskekroppen33. De gamle bøkene med tradisjonell kinesisk medisin registrerer at nyrene er kroppens benmarg. Nyren lagrer essensen, og margen ligger i beinhulen for å gi næring til beinet. Når nyreessensen er mangelfull, reduseres benmargen34. Den tradisjonelle kinesiske medisinen med tonifisering av nyre yang kan behandle lumbale svekkelse, osteoporose, impotens, for tidlig utløsning og livmor kald infertilitet35. EF er et av de representative medisinske materialene for tonifisering av nyre yang. Moderne farmakologiske studier har vist at EF har åpenbare effekter på skjelettsystemet, immunsystemet, reproduksjonssystemet, kardiovaskulærsystemet og nervesystemet, samt har antitumoreffekter36. Når det gjelder aktivitet på skjelettsystemet, kan icariin37 forbedre nivået av serum E2 hos ovariektomiserte rotter og oppregulere uttrykket av ERβ mRNA i beinvevet hos ovariektomiserte rotter. Syntesen av ERβ økes, og forbedrer dermed den biologiske effekten av ER, svekker benresorpsjonsaktiviteten til osteoklaster og forbedrer beindannelsen av osteoblaster. Endringene i benresorpsjon er større enn den negative balansen i benmetabolismen. Epimedin A kan forbedre benmikrostrukturen og serumbenomsetningsmarkørene i osteoporosemodellmus ved å hemme osteoklastdannelse, differensiering og benresorpsjon og spille en rolle i beinbeskyttelse38. Epimedin C har åpenbar anti-osteoporose aktivitet, hovedsakelig når det gjelder å øke benmassen og forbedre den trabekulære mikrostrukturen for til slutt å øke beinstyrken39. Andre studier har vist at epimedin B40 og baohuosid I41 har anti-osteoporose aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Basic Scientific Research Business Project of Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (prosjektnummer: jbky20200013), Performance Incentive Guidance Project of Chongqing Scientific Research Institutions (prosjektnummer: cstc2021jxjl 130025), og Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Medica Processing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
References
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , China Medical Science and Technology Press. Beijing, China. (2020).
- Wang, X. T. Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , Nanchang Science and Technology Press. Jiangxi, China. (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -L., Dai, Y. -P., Yan, X. -S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish's embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , Kunming University of Science and Technology. Kunming, China. (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -N., Xu, X. -Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -J., Sun, E., Xu, F. -J., Jia, X. -B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
