Summary
I denne protokol blev fåreolieforarbejdningsteknologien i Epimedii folium (EF) optimeret ved at anvende en Box-Behnken eksperimentel design-respons overflademetode, og effekten af rå og optimeret vandekstraheret EF på zebrafiskens embryonale udvikling blev foreløbigt undersøgt.
Abstract
Som en traditionel kinesisk medicin (TCM) har Epimedii folium (EF) en historie inden for medicin og mad, der er > 2.000 år gammel. Klinisk anvendes EF behandlet med fårekødolie ofte som medicin. I de senere år er antallet af indberetninger om sikkerhedsrisici og bivirkninger ved produkter, der anvender miljøaftryk som råmateriale, gradvist steget. Behandling kan effektivt forbedre sikkerheden ved TCM. Ifølge TCM-teorien kan fåreolieforarbejdning reducere toksiciteten af EF og forbedre dens tonificerende virkning på nyrerne. Der mangler imidlertid systematisk forskning og evaluering af EF-fårekødsolieforarbejdningsteknologi. I denne undersøgelse brugte vi Box-Behnkens eksperimentelle design-respons-overflademetode til at optimere nøgleparametrene for behandlingsteknologien ved at vurdere indholdet af flere komponenter. Resultaterne viste, at den optimale fåreolieforarbejdningsteknologi for EF var som følger: opvarmning af fårekødolien ved 120 °C ± 10 °C, tilsætning af rå EF, omrøring til den forsigtigt til 189 °C ± 10 °C, indtil den er jævnt skinnende, og derefter fjernelse og afkøling. For hver 100 kg EF skal der anvendes 15 kg fårekødolie. Toksiciteten og teratogeniciteten af et vandigt ekstrakt af råolie og fåreolieforarbejdet EF blev sammenlignet i en udviklingsmodel for zebrafiskembryoner. Resultaterne viste, at den rå urtegruppe var mere tilbøjelig til at forårsage zebrafiskdeformiteter, og dens halvmaksimale dødelige EF-koncentration var lavere. Afslutningsvis var den optimerede fåreolieforarbejdningsteknologi stabil og pålidelig med god repeterbarhed. Ved en vis dosis var det vandige ekstrakt af EF giftigt for udviklingen af zebrafiskembryoner, og toksiciteten var stærkere for det rå lægemiddel end for det forarbejdede lægemiddel. Resultaterne viste, at fårekødsolieforarbejdning reducerede toksiciteten af rå EF. Disse resultater kan bruges til at forbedre kvaliteten, ensartetheden og den kliniske sikkerhed af fårekødsolieforarbejdet EF.
Introduction
Epimedii folium (EF) er de tørrede blade af Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., eller Epimedium koreanum Nakai. EF kan anvendes til behandling af osteoporose, menopausalt syndrom, knuder i brystet, hypertension, koronar hjertesygdom og andre sygdomme1. Som en traditionel kinesisk medicin (TCM) har EF en historie inden for medicin og mad på mere end 2.000 år. På grund af sin lave pris og bemærkelsesværdige effekt af tonificering af nyrerne anvendes den i vid udstrækning i medicin og helsekost. EF behandles ved omrøring med fåreolie, en proces, der først blev beskrevet i Lei Gong Processing Theory skrevet af Lei Xiao i Liu Song periode2. Effektiviteten af rå EF og lynstegt EF er helt forskellige. Rå EF fjerner hovedsageligt gigt, mens den stegte EF opvarmer nyrerne for at forstærke yang3. På nuværende tidspunkt anvendes EF i vid udstrækning som råmateriale i lægemidler og helsekost; der er 399 listede kinesiske patentlægemidler, ni importerede helsekostprodukter og 455 indenlandske helsekost med EF som råmateriale4. Dette lægemiddelmateriale har gode anvendelsesmuligheder. I de senere år har der imidlertid været stigende rapporter om bivirkninger og leverskader forårsaget af helsekost og kinesiske patentlægemidler, der bruger EF som råmateriale, og relaterede toksicitetsundersøgelser 5,6,7 har rapporteret, at EF som råmateriale har potentielle sikkerhedsrisici.
Kinesisk medicinsk behandling refererer til farmaceutiske teknikker, der effektivt kan reducere eller eliminere toksiciteten og forbedre sikkerheden af TCM'er. Den traditionelle behandlingsmetode for EF er omrøring med fåreolie, hvilket reducerer toksiciteten af EF og forbedrer dens virkning af opvarmning af nyrerne og fremme yang8. Denne behandlingsmetode er inkluderet i den kinesiske farmakopé og forskellige behandlingsspecifikationer1. Processen med EF er kun specificeret som følger: For hver 100 kg EF tilsættes 20 kg fosterolie (raffineret), og den er mildfyret, indtil den er ensartet og skinnende1. Der er ingen strenge parametre for EF-behandlingsmetoder i ovenstående standarder, så lokale behandlingsspecifikationer er ikke blevet samlet for at give konsistens. Det ville derfor være nyttigt at gennemføre en systematisk undersøgelse af El-processen. I dette papir blev Box-Behnken-eksperimentel design-respons-overflademetode brugt til at optimere EF's behandlingsteknologi.
Box-Behnkens eksperimentelle design er en metode, der typisk bruges til at optimere faktorerne i en proces. Udtrækningsparametrene kan optimeres ved at etablere det funktionelle forhold mellem multiple regressionsligningstilpasningsfaktorer og effektværdier. For nylig er denne metode blevet brugt i vid udstrækning til at studere TCM-ekstraktion 5,6,7 og behandling 9,10,11. Forskellige undersøgelser har rapporteret TCM-tilberedningsmetoder, der involverer saltforarbejdning, vinforarbejdning og omrøring efter et Box-Behnken-design, såsom til saltforarbejdet Psoraleae fructus 12, vinforarbejdet Cnidii fructus13 og ristet Cinnamomi ramulus14. Denne metode har reduceret testtid, høj testnøjagtighed og er velegnet til multifaktor- og multiniveautest. Metoden er enklere end testmetoden for ortogonalt design og mere omfattende end den ensartede designmetode15. De opnåede relationer kan bestemme den forudsagte værdi af ethvert testpunkt inden for testområdet, hvilket er en stor fordel. En zebrafiskmodel kan bruges til at teste, om EF er mindre giftigt efter forarbejdning.
I TCM-toksicitetsundersøgelser har zebrafiskmodellen de dobbelte fordele ved den høje gennemstrømning af celleeksperimenter og lighederne med gnaverforsøg16. Denne model er kendetegnet ved sin lille størrelse, høje gydehastighed, korte reproduktionscyklus og lette avl. Modellen kan bruges i store synkrone eksperimenter i cellekulturplader, og den eksperimentelle lægemiddeldosering er lille, den eksperimentelle cyklus er kort, omkostningerne er lave, og hele eksperimentprocessen er let at observere og betjene17. Zebrafiskembryoner er gennemsigtige og udvikler sig hurtigt. Derfor kan toksiciteten og teratogene virkninger af lægemidler på viscerale væv i forskellige udviklingsstadier observeres direkte under et mikroskop18. Genhomologien mellem zebrafisk og mennesker er så høj som 85%18. Zebrafiskens signaltransduktionsvej svarer til menneskers18. Zebrafiskens biologiske struktur og fysiologiske funktion minder meget om pattedyrs18. Derfor kan en zebrafiskmodel til lægemiddeltest give forsøgsdyr, der er pålidelige og fuldt anvendelige på mennesker19.
I denne undersøgelse brugte vi Box-Behnkens design-responsoverflademetode til at optimere mængden og temperaturen af fårekødolie og stegetemperaturen, der anvendes i EF-behandlingsteknologien, med indholdet af icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C og baohuosid I som evalueringsindekser. Zebrafiskmodellen blev brugt til foreløbigt at undersøge effekten af et vandekstrakt fra EF på zebrafiskens embryonale udvikling før og efter forarbejdning for at evaluere behandlingens dæmpningseffekt på EF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrerelaterede forsøg blev udført med godkendelse fra Experiment Ethics Committee of the Chongqing Institute of TCM (laboratoriedyretisk gennemgang certifikatnummer: ZJS2022-03).
1. Bestemmelse af de bioaktive bestanddele
BEMÆRK: De arter, der blev brugt i denne forskning, var Epimedium sagittatum, og prøverne blev indsamlet i Fengdu County, Chongqing. Prøven blev identificeret som en tør overjordisk del af E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Grundsætning. af forskere fra Institut for Biologisk Medicin, Chongqing Institut for Traditionel Kinesisk Medicin.
- Kontrolproduktopløsningen fremstilles ved nøjagtigt at afveje den passende mængde af hvert referencestof, dvs. icariin, epimedin A (EA), epimedin B (EB), epimedin C (EC) og baohuosid I (BI), ved hjælp af en elektronisk analysevægt, og opløses i methanol. Ved hjælp af disse fremstilles en blandet referencestamopløsning indeholdende 381,61 μg/ml icariin, 124,14 μg/ml EA, 110,24 μg/ml EB, 1091,75 μg/ml EC og 184,98 μg/ml BI.
- Testproduktopløsningen fremstilles ved at knuse EF gennem en sigte nr. 3. Anbring ca. 0,2 g (ved hjælp af en elektronisk analysebalance) knust EF i en proppet Erlenmeyerkolbe, tilsæt 20 ml fortyndet ethanol, og ultralyd derefter ultralyd ved 400 W effekt og 50 kHz frekvens i 1 time. Ryst godt, og passér gennem et 0,22 μm membranfilter for at opnå testopløsningen.
- Udfør kromatografien som følger. Brug højtydende væskekromatografi (HPLC) med en C18-søjle med dimensioner på 4,6 mm x 250 mm og en indvendig diameter på 5 μm. Brug acetonitril som mobil fase A og ultrarent vand som mobil fase B. Brug følgende gradientelueringsparametre: 0-30 min, 24% A til 26% A; 30-31 min, 26% A til 45% A; 31-45 min, 45% A til 47% A. Brug en detektionsbølgelængde på 220 nm (for den anvendte detektor, se Materialetabel). Hold kolonnetemperaturen på 30 °C og strømhastigheden på 1,0 ml/min, og brug en prøvestørrelse på 10 μL.
- For at undersøge det lineære forhold skal du bruge den blandede referenceopløsning som i trin 1.1 fortyndet 2 gange, 4 gange, 8 gange, 16 gange og 32 gange for henholdsvis icariin, EA, EB, EC og BI. Brug acetonitril som mobil fase A og ultrarent vand som mobil fase B.
- Brug følgende gradientelueringsparametre: 0-30 min, 24% A til 26% A; 30-31 min, 26% A til 45% A; 31-45 min, 45% A til 47% A. Brug en detektionsbølgelængde på 220 nm (for den anvendte detektor, se Materialetabel). Hold kolonnetemperaturen på 30 °C og strømhastigheden på 1,0 ml/min, og brug en prøvestørrelse på 10 μL. Til sidst skal du registrere topområderne. Den lineære regression afbildes med referencekoncentrationen (x-aksen, μg/ml) som abscissen og toparealet (y-aksen) som ordinat ved hjælp af professionel software (se materialetabel).
- Præcisionstesten udføres ved at måle den blandede kontrolopløsning seks på hinanden følgende gange med HPLC under anvendelse af de kromatografiske betingelser, der er vist i trin 1.3. Detektionstid og topområder for hver kemisk sammensætning registreres, og topområdernes relative standardafvigelser (RSD) beregnes for at vurdere præcisionen (reproducerbarheden) ved hjælp af nedenstående formel:
RSD% = standardafvigelse (SD)/aritmetisk gennemsnit af beregnede resultater (X) x 100 % - For at udføre reproducerbarhedstesten vejes EF-pulveret nøjagtigt, og seks dele af testproduktopløsningen fremstilles parallelt efter metoden i trin 1.2. De fremstillede opløsninger udsættes for HPLC under de kromatografiske betingelser, der er beskrevet i trin 1.3. Registrer retentionstider og topområder for hver kemisk sammensætning, og beregn mængderne af hver forbindelse ud fra en standardkurve (toparealer versus koncentrationer). Beregn RSD% som ovenfor.
- For at udføre stabilitetstesten opbevares testopløsningerne ved stuetemperatur, og deres indhold måles ved HPLC-metoden beskrevet i trin 1.3 ved 0 timer, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 12 timer og 24 timer efter klargøring for at vurdere stabiliteten. Retentionstid og topområder for hver kemisk sammensætning registreres, og RSD-procenten for toparealerne beregnes som ovenfor.
- For at udføre prøvegenvindingstesten vejes 0,2 g EF-pulver i en Erlenmeyerkolbe med prop for seks replikater. Der tilsættes en passende mængde referenceopløsning (mængden af referencestof, der tilsættes prøven, svarer til 100 % af det kendte indhold af prøven), og analyseopløsningen fremstilles efter metoden i trin 1.2.
- Prøverne injiceres i kromatografen, og der foretages en analyse i henhold til de kromatografiske betingelser i trin 1.3. Registrer topområderne, og beregn de gennemsnitlige genvindings- og RSD%-værdier som nedenfor:
Spiked sample recovery rate = (spiked sample content − sample content)/sample amount x 100%
2. Optimering af EF-fåreolieforarbejdningsteknologien ved hjælp af Box-Behnkens design-respons-overflademetode
- Vælg nøgleparametrene i EF-forarbejdning, såsom mængden af fåreolie (A; 15%-35%), fåreolietemperaturen (B; 50-120 °C) og stegetemperaturen (C; 80-300 °C), som indflydelsesrige faktorer. Brug de omfattende scorer for icariin-, EA-, EB-, EC- og BI-indhold som evalueringsindeks. Procentdelen af fårekød olie her er masseprocenten.
- Brug responsoverfladeanalysesoftwaren (se materialetabel) til at designe Box-Behnken-responsoverfladeeksperimenterne, udforske den kvadratiske responsoverflade og konstruere en andenordens polynomialmodel. Vælg det nye Box-Behnken-design, og indstil indstillingen Numeriske faktorer til 3; sæt faktorerne A, B og C. Klik på Fortsæt. Angiv indstillingen Svar til 1 (hvilket var den omfattende score). Klik på Fortsæt for at færdiggøre designet. Der blev planlagt i alt 17 forsøg (se tabel 1).
BEMÆRK: For de uafhængige og afhængige variabler sammen med deres lave, midterste og høje niveauer, se tabel 2. - behandle miljøaftrykselementet i henhold til de specifikke parametre i tabel 1 For eksempel vejes raffineret fårekødolie som 15% v / v for løbenummer 1 og opvarmes derefter til 50 ° C for at smelte den. Tilsæt den rå EF til det smeltede fårekød, steg det ved svag ild (190 °C), indtil det er jævnt skinnende, og fjern det derefter og afkøl. Udførte 17 eksperimentelle operationer. I alt 17 grupper af EF-forarbejdede produkter blev opnået i dette arbejde.
BEMÆRK: Fårekødolie er fast ved stuetemperatur (25 °C) og smelter til væske, når den opvarmes. Fårekødolie i flydende tilstand kan anvendes som hjælpestof. - Analyseopløsningerne af de forarbejdede produkter fremstilles efter metoden beskrevet i trin 1.2. Derefter analyseres de ved hjælp af HPLC i henhold til de kromatografiske betingelser, der er beskrevet i trin 1.3. Retentionstider og topområder for hver kemisk sammensætning registreres, og indholdet af icariin, EA, EB, EC og BI beregnes i hver testopløsning i forhold til en ekstern standardkurve. Brug den omfattende scoreberegningsformel nedenfor til at beregne de omfattende scorer for de 17 eksperimentelle grupper:
Omfattende score = Z/Z maks. × 0,5 + BI/BImaks . × 0,5
hvor Z er summen af indholdet af icariin, EA, EB og EF Zmax er den maksimale værdi af summen af icariin-, EA-, EB- og EC-indholdet i de 17 eksperimentelle grupper; BI er BI-indholdet; og BImax er den maksimale værdi af BI-indholdet i de 17 eksperimentgrupper. - Importer de omfattende scoringsresultater for de 17 grupper af eksperimenter til dataanalysesoftwaren (se materialetabel) for at analysere de eksperimentelle data. Under evalueringselementerne skal du vælge indstillingen kvadratisk procesrækkefølge og polynomisk modeltype.
3. Test af behandlingens indvirkning på zebrafiskens embryonale udvikling
- Forberedelse af prøver
- Knus den rå og forarbejdede EF gennem en sigte nr. 3 (se tabel over materialer). Til 100 g af hver prøve tilsættes 1.000 ml ultrarent vand. Blødgør EF'en i 0,5 time, kog vandet to gange i 30 minutter hver, og filtrer derefter med filterpapir.
- Filtraterne kombineres, og prøven koncentreres ved opvarmning. Der tilsættes ultrarent vand til et slutvolumen på 100 ml for at opnå de forarbejdede EF-opløsninger (PEF, 1 g/ml) og råstofopløsningerne (CEF,1 g/ml). Mål mængden af råstof i hver stamopløsning.
- I 10 ml målekolber anbringes delprøver af 1 ml, 1,5 ml, 2,5 ml, 5 ml og 7,5 ml stamopløsninger, og der tilsættes derefter ultrarent vand til mærket for at forberede testopløsningerne med koncentrationer på 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 500 mg/ml og 750 mg/ml til embryotoksicitetsundersøgelsen af zebrafisk.
BEMÆRK: Koncentrationerne af testopløsningerne blev fremstillet ved henvisning til den relevante litteratur 20,21 og ved at udføre indledende forsøg for at give den10-foldige koncentrationsgradient, der anvendes i normal toksikologi. CEF var en uforarbejdet prøve, og PEF var en prøve fremstillet med den bedste forarbejdningsteknologi, der er beskrevet i afsnit 2.
- Zebrafiskehold og embryobehandling21
- Tilpas vildtype zebrafisk (se materialetabel) ved en kontrolleret temperatur i 2 dage, hold dem i et gennemstrømningsakvarium ved pH 7,0-7,4 og fodre dem to gange dagligt.
BEMÆRK: Hæmningen af melanindannelse i zebrafisk blev opnået ved at tilsætte 1-phenyl-2-thiourea i en koncentration på 0,003% (masse/volumen) til dyrkningsmediet, hvilket holdt deres kroppe gennemsigtige for morfologisk observation. - Vælg voksne frugtbare vildtype zebrafisk om aftenen og adskil dem ved hjælp af baffler i parringskasser. Fjern bafflerne næste morgen, og lad fisken gyde i 30 min. Samlede de befrugtede æg med en dråber hvert 15. minut. I alt blev der indsamlet 520 sunde vildtypeembryoner. Zebrafiskembryonerne opbevares i en inkubator ved 28,5 °C i 24 timer.
- Tildel tilfældigt de sunde embryoner 24 timer efter befrugtning (hpf) til 13 grupper, og sammen med en kontrolgruppe blødlægges separat i 10 ml af hver af følgende opløsninger i en kulturskål: PEF: 100 μg / ml, 150 μg / ml, 200 μg / ml, 250 μg / ml, 500 μg / ml, 750 μg / ml; CEF: 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml . Behandl den tomme kontrolgruppe med mediet som en opløsning. Hver gruppe indeholdt 40 embryoner i denne undersøgelse.
BEMÆRK: Middelsammensætningen er 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na 2 HPO 4, 0,45 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO 4 og 4 mM NaHCO3. - Dyrk zebrafisken i en konstant temperatur inkubator i op til 120 hpf. Tæl antallet af døde larver hver dag, observer larvernes hovedorganmorfologi i hver forsøgsgruppe under et stereomikroskop (skalabjælke = 500 μm, se materialetabel), og beregn halvdødskoncentrationen (LC50) af zebrafisk ved 72 hpf ved hjælp af dataanalysesoftware (se materialetabel).
- Tilpas vildtype zebrafisk (se materialetabel) ved en kontrolleret temperatur i 2 dage, hold dem i et gennemstrømningsakvarium ved pH 7,0-7,4 og fodre dem to gange dagligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodologiske undersøgelsesresultater
Der blev observeret et lineært forhold mellem koncentrationen af icariin, EA, EB, EC, BI og kromatografiske topområder (se tabel 3). RSD%-værdierne (n = 6) for de kromatografiske topområder af icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% og 1,06%, hvilket indikerer, at præcisionen af HPLC-målingerne var god. RSD%-værdierne (n = 6) for indholdet af icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 1,59%, 1,46%, 1,86%, 2,29% og 0,98%, hvilket indikerer, at metoden havde god repeterbarhed. RSD%-værdierne (n = 6) for toparealerne af icariin, EA, EB, EC og BI i prøverne var henholdsvis 1,49%, 1,96%, 1,42%, 0,96% og 0,81%, hvilket indikerer, at prøveopløsningen var stabil inden for 24 timer. De gennemsnitlige genfindingsrater for icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% og 100,94%, og RSD%-værdierne var henholdsvis 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% og 1,47% (se tabel 4). Disse resultater viser, at metodens nøjagtighed opfyldte kravene.
Ovennævnte eksperimentelle resultater viste, at analysemetoden gav resultater, der havde fremragende præcision, reproducerbarhed og nøjagtighed og var acceptable til kvalitetsanalyse af de EF-forarbejdede produkter.
Optimering af EF's fåre-olie-forarbejdningsteknologi ved anvendelse af Box-Behnkens design-respons-overflademetode
Vi udførte kvadratisk polynomial regressionstilpasning af ovenstående data for at opnå følgende model: Y = 0,86 - 0,11 x A + 0,025 x B - 0,078 x C - 0,023 x A x B - 0,037 x A x C + 0,037 x B x C - 0,045 x A 2 + 2,5 x 10-3 x B 2 - 0,14 x C2. Variansanalysen gav en værdi på P < 0,01, hvilket indikerer, at modellen var signifikant. P-værdien for den manglende pasform var P > 0,05, hvilket indikerer, at den manglende pasform ikke var signifikant. R2-værdien var 0,9300, hvilket indikerer, at modellens pasform var god, og fejlen var lille. Det var muligt at bruge denne model til at analysere og forudsige effekten af det kemiske sammensætningsindhold i EF omrørt med fårekødolie. Derudover havde A 2 og D2 en effekt på indholdet af de forarbejdede produkter, og forskellen var statistisk signifikant (P < 0,01). Virkningerne af A og C af en-graders sigt og C2 af anden ordens sigt på den omfattende score var signifikante. En-graders udtrykket B, andenordens A 2, B2 og alle interaktionselementerne havde ingen signifikant effekt på den omfattende score. Analysen af P-værdierne viste, at af de eksperimentelle parametre havde fåreoliemængden (A) den største effekt på den omfattende score efterfulgt af stegetemperaturen (C) og derefter fåreolietemperaturen (B). Ovenstående resultater er vist i tabel 5.
Softwaren blev brugt til at indstille fåreoliemængden, fåreolietemperaturen og stegetemperaturen til medianerne og til at bruge den omfattende score som indeks til at tegne et enkeltfaktorindflydelsesdiagram for en faktor (figur 1). Forøgelse af stegetemperaturen øgede først den omfattende score og reducerede den derefter (figur 1). Fårekødsolietemperaturen havde en ubetydelig effekt på den omfattende score. Mængden af fårekød var den vigtigste væsentlige faktor, der påvirkede ændringen i den omfattende score, og efterhånden som mængden steg, gik indholdet nedad.
For bedre at forstå resultaterne præsenteres de forudsagte modeller i figur 2 som 3D-responsoverfladeplot. Med hensyn til responsfladens hældning gælder det, at jo større betydning interaktionseffekten er mellem faktorer, jo blidere hældningen er, og jo mindre signifikant er effekten. En ellipse i form af en konturlinje indikerer et stærkt samspil mellem faktorer, mens en cirkel indikerer det modsatte. Responsoverfladen for fåreoliemængden og stegetemperaturen var stejlere sammenlignet med de andre testede faktorer, og konturlinjerne havde tendens til at være mere elliptiske (se figur 2C, D), hvilket indikerer, at samspillet mellem disse to faktorer var mere signifikant; derimod var interaktionerne mellem andre faktorer ikke signifikante (se figur 2A, B, E og F).
Den optimale fåreolieforarbejdningsteknologi af EF blev valgt som følger: en fåreoliemængde på 15%; en fåreolietemperatur på 120 °C og en stegetemperatur på 189 °C. Da temperaturen ikke kan kontrolleres meget nøjagtigt under faktisk drift, angives temperaturværdien som en variabel ±10 °C. Derfor var de endelige parametre som følger: en fåreoliemængde på 15%; en fåreolietemperatur på 120 °C ± 10 °C og en stegetemperatur på 189 °C ± 10 °C. Den optimale proces var som følger: opvarmning af fårekødolien ved 120 °C ± 10 °C, tilsætning af rå EF, stegning med en mild ild (189 °C ± 10 °C), indtil den er jævnt skinnende, og fjernelse og afkøling. For hver 100 kg EF, 15 kg fårekød olie (raffineret olie) anvendes. Under anvendelse af disse betingelser blev der udført tre parallelle eksperimenter, og de opnåede scorer var 0, 96, 0, 97 og 0, 94 (RSD% = 1, 60%), hvilket indikerer stabile og gennemførlige forhold. De typiske HPLC-kromatogrammer for rå, forarbejdede og blandede referencestoffer i EF er vist i figur 3.
Test af behandlingens indvirkning på zebrafiskens embryonale udvikling
Zebrafisken klækkede til unge ved 72 hkf. Udviklingen af hvert organ var stort set komplet. Fiskekroppene forblev gennemsigtige, og det var let at lægge dem på deres side på glasrutschebanen. Organernes former var lette at observere og identificere, når de blev set under et mikroskop. Den blinde kontrolgruppe oplevede ingen død eller organtoksicitet i administrationsperioden. Sammenlignet med kontrolgruppen blev der ved en lægemiddelkoncentration på 100 μg/ml ikke fundet nogen åbenlyse abnormiteter i den rå EF-gruppe (S) og den forarbejdede gruppe (P) ved 72 hpf. Ved 96 hpf og senere var svømmeblærens ufuldstændighed og tab af svømmeblæren mere almindelig hos ungfiskene i rågruppen, men var sjældne hos ungfiskene i den forarbejdede gruppe. Ved en lægemiddelkoncentration på 150 μg/ml sås åbenlyse spinaldeformiteter, kropskrumningsdeformiteter, perikardieødem og leverdeformation hos ungfisk i rågruppen ved 72 hpf, men disse ændringer var sjældne hos ungfisk i den forarbejdede gruppe, og graden af teratogenicitet var svagere end i den rå gruppe. Ved en lægemiddelkoncentration på 200 μg/ml døde alle unge fisk i rågruppen, og tydelig teratogenicitet forekom i ungfiskene i den forarbejdede gruppe. Ved en lægemiddelkoncentration på 250 μg/ml overlevede et lille antal zebrafisk i den forarbejdede gruppe. Zebrafiskens mikroskopiske undersøgelsesresultater er vist i figur 4.
Zebrafiskdødeligheden i de rå og forarbejdede Epimedium urtegrupper afhang af koncentrationen og administrationstidspunktet. Forholdet mellem tid, dosis og dødelighed er vist i figur 5. Zebrafiskdødelighedsresultaterne viste, at 24 timer efter administration (48 hpf) ved en lægemiddelkoncentration på 200 μg/ml døde alle zebrafisk i den rå lægemiddelgruppe, mens dødeligheden i den forarbejdede gruppe kun var 6,67%. 48 timer efter administration af EF (72 hpf) var koncentrationen, der forårsagede død af alle zebrafisk i den rå lægemiddelgruppe, 200 μg/ml, og koncentrationen, der forårsagede død af alle zebrafisk i den forarbejdede gruppe, var 500 μg/ml. Den mediane dødelige koncentration af de to eksperimentelle grupper ved 72 hpf blev beregnet. Resultaterne viste, at LC50 (se figur 6) var 151,3 μg/ml i rågruppen (S) og 219,8 μg/ml i den forarbejdede gruppe (P).
Figur 1: Univariat analyse. Figuren viser enkeltfaktorindflydelsesdiagrammet. A er enkeltfaktorresultatet af mængden af fårekød (suet) olie; B er enkeltfaktorresultatet af fårekødets (suet)oliens temperatur; og C er enkeltfaktorresultatet af stegetemperaturen. Med en stigende stegetemperatur øges den omfattende score først og falder derefter. Fårekødsolietemperaturen har ringe effekt på scoren. Mængden af fårekødolie var den vigtigste væsentlige faktor, der påvirkede ændringen i den omfattende score, og indholdet viste en nedadgående tendens med en stigende mængde fårekødolie. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Responsoverflade og konturplot af indflydelsen af forskellige faktorinteraktioner på den omfattende score. (A) Denne figur viser et 3D-responsoverfladeplot af interaktionen mellem fårekødsoliemængden og temperaturen. (B) Denne figur viser et konturdiagram over vekselvirkningen mellem fårekødsoliemængde og -temperatur. (C) Denne figur viser et 3D-responsoverfladeplot af vekselvirkningen mellem fårekødsoliemængden og forarbejdningstemperaturen. (D) Denne figur viser et konturdiagram over vekselvirkningen mellem fåreoliedosering og forarbejdningstemperatur. (E) Denne figur viser et 3D-responsoverfladeplot af interaktionen mellem fåreoliemængde og forarbejdningstemperatur. (F) Denne figur viser et konturplot af vekselvirkningen mellem fårekødsoliemængde og forarbejdningstemperatur. Resultatet viser, at responsoverfladen for fåreoliemængden og stegetemperaturen var stejl end de andre testede parametre, og konturlinjerne havde tendens til at være elliptiske (se C,D), hvilket indikerer, at interaktionen mellem disse to faktorer var signifikant, mens interaktionerne mellem andre faktorer ikke var signifikante (se A, B, E, F). Det talgolieudtryk, der anvendes i figuren, henviser til fårekødolie. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: HPLC-kromatogrammer af rå, forarbejdede og blandede referencestoffer af EF. (A) Denne figur viser HPLC-kromatogrammet for det blandede referencestof. (B) Denne figur viser HPLC-kromatogrammet for rå Epimedii folium. (C) Denne figur viser HPLC-kromatogrammet for forarbejdede produkter af epimediifolium. Disse tre billeder viser, at BI-indholdet i rå EF er lavt, mens det øges efter behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Mikrografier af zebrafisk. Denne figur viser mikrografier af zebrafisken. (A) Denne figur viser resultaterne for observationen af zebrafisken under mikroskop i blindgruppen. (B) Denne figur viser resultaterne for observation af zebrafisken under mikroskop i rågruppen. (C) Denne figur viser resultaterne for observation af zebrafisken under mikroskop i den forarbejdede gruppe. Den blinde kontrolgruppe oplevede ingen død eller organtoksicitet i administrationsperioden. Ved en EF-lægemiddelkoncentration på 150 μg/ml sås tydelige spinaldeformiteter, kropskrumning, perikardieødem og leverdeformation hos unge fisk i rågruppen ved 72 hpf, mens disse ændringer var sjældne hos unge fisk i den forarbejdede gruppe, og graden af teratogenicitet var svagere end i rågruppen. Ved en lægemiddelkoncentration på 200 μg/ml døde alle ungfisk i rågruppen, og der fremkom tydelig teratogenicitet i den forarbejdede gruppe. Ved en lægemiddelkoncentration på 250 μg/ml overlevede kun et lille antal zebrafisk i den forarbejdede gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Forholdet mellem doseringstid, dosis og dødelighed. Denne figur viser forholdet mellem doseringstid, dosis og dødelighed. (A) Denne figur viser forholdet mellem doseringstid, dosis og dødelighed for den rå gruppe. (B) Denne figur viser forholdet mellem doseringstid, dosis og dødelighed for den behandlede gruppe. n = 40. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: LC50-diagram over rå og forarbejdet EF. LC50-diagrammet over den rå og forarbejdede EF vises. De mediane dødelige koncentrationer af de to eksperimentelle grupper ved 72 hpf blev beregnet. LC50 var 151,3 μg/ml i rågruppen (S) og 219,8 μg/ml i forarbejdningsgruppen (P). n = 40. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Eksperimentelt design og Box-Behnken-responsoverflademetodens resultater af de 17 grupper af eksperimenter. Tabel 1 viser de 17 grupper af eksperimenter designet af Box-Behnken design-respons overflademetoden og deres omfattende scoreresultater. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Variabler anvendt i Box-Behnken-designet. De uafhængige og afhængige variabler er angivet her sammen med deres lave, midterste og høje niveauer. Box-Behnken-designet gjorde det muligt at identificere de mest indflydelsesrige faktorer i EF-forarbejdningen med fåreoliemængden (A) (15%-35%), fåreolietemperaturen (B) (50 °C-120 °C) og stegetemperaturen (C) (80 °C-300 °C) som de påvirkende faktorer. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Regressionsligninger og lineære områder af de kemiske bestanddele af EF. Resultaterne af regressionsligningen og det lineære område af den kemiske sammensætning af EF viser, at der var god linearitet mellem hver af koncentrationerne af icariin, EA, EB, EC og BI og deres kromatografiske topområder. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Prøvegenvindingstestrater. De gennemsnitlige genvindingsrater for icariin, EA, EB, EC og BI var henholdsvis 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% og 100,94%, og RSD%-værdierne var henholdsvis 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% og 1,47%. Resultaterne viser, at metodens nøjagtighed var egnet. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 5: Regressionskoefficienter for den forudsagte kvadratiske model. P-værdien af modellen var P < 0,01, hvilket indikerer, at modellen var signifikant. P-værdien for den manglende pasform var P > 0,05, hvilket indikerer, at den manglende pasform ikke var signifikant. R2-værdien var 0,9300, hvilket indikerer, at modellens pasform var god, og fejlen var lille, så modellen var egnet til at analysere og forudsige effekten af det kemiske sammensætningsindhold i EF omrørt med fårekødolie. Desuden havde A 2 og D2 signifikant indvirkning på indholdet af forarbejdede produkter (P < 0,01). Indflydelsen af A og C af en-graders sigt og C2 af anden ordens sigt på den omfattende score var signifikante. En-graders udtrykket B, andenordens A 2, B2 og alle interaktionselementerne havde ingen signifikant effekt på den omfattende score. Analysen af P-værdien viste, at af de eksperimentelle parametre havde mængden af fåreolie (A) størst indflydelse på den omfattende score efterfulgt af stegetemperaturen (C) og derefter temperaturen på fårekødolien (B). Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uafhængige variabler og bestemmelse af deres niveauer
EF-behandlingsteknologien er kun beskrevet i 2020-udgaven af den kinesiske farmakopé og de lokale kinesiske lægemiddelbehandlingsspecifikationer, der er offentliggjort af 26 provinser, kommuner og autonome regioner over hele landet1. Beskrivelsen involverer følgende trin: at tage fåreolie og opvarme den til at smelte, tilføje EF-strimler, omrøre med langsom ild, indtil den er ensartet og skinnende, tage den ud og lade den køle af. Derudover anvendes 20 kg (forkortet som 20%) fårekødolie (raffineret) for hver 100 kg Epimedium. Parametrene for behandlingsprocessen for EF er imidlertid ikke specificeret. Blandt de uafhængige variabler i dette eksperiment kunne tre nøglefaktorer kvantificeres i produktionsprocessen: fårekødoliedoseringen, fåreolietemperaturen og stegetemperaturen. Værdiintervallet skal indstilles i henhold til ovenstående beskrivelse. Fra resultaterne af den foreløbige test kan det ses, at når mængden af fårekødolie er 15%, kan EF-bladene jævnt belægges med fårekødolie. Når doseringen overstiger 35%, er der for meget fåreolie. Endelig bør intervallet for fåreoliemængden være 15% -35%. Når temperaturen når 50 °C, smelter fårekødsolie. Når temperaturen når >120 °C, begynder fåreolien at ryge, og temperaturen er for høj. Derfor bør fårekødoliens temperaturområde være 50 °C-120 °C. Den kinesiske farmakopé 2020-udgave fastsætter, at EF skal omrøres med en langsom ild. Den langsomme ild bør ikke overstige 200 °C, og stegetemperaturen bør ligge mellem 80 °C-300 °C.
Omfattende scoring
Under behandlingen af Epimedium brydes glycosidbindingerne, og de glycosidiske komponenter omdannes til lavere glycosidiske komponenter. Bestemmelsen af indholdet af EF-forarbejdede produkter i 2020-udgaven af den kinesiske farmakopé er baseret på bestemmelsen af det samlede indhold af icariin, EA, EB og EC i de originale medicinske materialer, og en monoglycosidkomponent, BI, er opført separat som indikator. I dette eksperiment var den samlede vægt af icariin, EA, EB og EC i den forarbejdede EF 50%, vægten af BI var 50%, og den omfattende score blev indstillet ud fra disse værdier.
Responsoverflademetode (RSM) er en statistisk teknik til identifikation af optimale procesparametre og løsning af multivariate problemer. I denne teknik anvendes et rimeligt eksperimentelt design til at opnå visse data gennem eksperimenter, og en multivariat kvadratisk regressionsligning anvendes til at udlede et funktionelt forhold mellem faktorerne og svarene22. Ensartet design og ortogonal designprocesoptimering er almindeligt anvendt, men deres testnøjagtighed er ikke høj, og den matematiske model er ikke særlig forudsigelig. Den matematiske model, der ligger til grund for RSM, er meget forudsigelig. RSM kræver færre eksperimenter og kortere cyklusser, hvilket ikke kun kan eliminere de problemer, der er forbundet med traditionel matematisk statistik, men også kan klarlægge forholdet mellem faktorer og svar23. RSM konceptualiserer systemets respons som en funktion af en eller flere faktorer og bruger grafiske teknikker til at vise dette funktionelle forhold for at hjælpe brugeren med at vælge de optimale forhold i det eksperimentelle design ved intuitiv visuel observation. Disse fordele har ført til den brede anvendelse af denne metode i den kemiske industri24, bioteknik, fødevareindustrien25, medicinalindustrien og TCM-præparater.
Selvom RSM kan identificere det funktionelle forhold mellem responser (indekser, der skal undersøges) og faktorer (uafhængige variabler), er ikke alle eksperimenter egnede til responsoverfladeoptimering, fordi der ikke altid er et stærkt funktionelt forhold mellem respons og faktorer. RSM opnår ofte kontinuerlige funktionsrelationer, som kræver, at alle faktorer er kontinuerlige variabler. Ikke desto mindre er ikke alle faktorer, der skal undersøges, kontinuerlige variabler eller har signifikante virkninger på responsværdierne i begyndelsen af det eksperimentelle design. For at reducere antallet af eksperimenter og forbedre nøjagtigheden af responsoverflademodelleringen er screening nødvendig for at vælge de væsentlige faktorer og bestemme deres niveauer gennem faktordesign, ensartet design eller ortogonalt design, inden der udføres responsoverfladedesignmetode. Den største fordel ved responsoverflademetoden er, at når modellen er korrekt etableret, kan responsværdien under enhver kombination af betingelser forudsiges, og det funktionelle forhold kan ses mere intuitivt og visuelt gennem 3D-responsoverfladen. Denne visualisering er til stor hjælp for forskere i at finde de optimale behandlingsbetingelser26.
Denne undersøgelse brugte Box-Behnken-designprincippet for RSM til at designe 17 kombinerede eksperimenter ved hjælp af den omfattende kemiske indholdsscore for EF som responsværdi. Endelig blev de bedste procesoptimeringsresultater opnået ved regressionsanalyse. Forarbejdningsteknologien blev optimeret som følger: opvarmning af fårekødolien ved 120 °C ± 10 °C, tilsætning af rå EF, stegning med en mild ild (189 °C ± 10 °C), indtil den er jævnt skinnende, og derefter fjernelse og afkøling af den. For hver 100 kg EF, 15 kg fårekød olie (raffineret olie) anvendes. Vores resultater viste, at processen med miljøaftryk var stabil, pålidelig og repeterbar. Derudover blev faktorinteraktioner analyseret, og interaktionen mellem fåreoliemængden og stegetemperaturen, men ikke interaktionerne mellem andre faktorer, var signifikant. Denne undersøgelse viste, at responsoverfladedesignet, som en metode til at analysere interaktionerne mellem faktorer og forholdet mellem faktorer og deres responsoverfladeværdier, muliggjorde optimering af behandlingsbetingelserne på kort tid med et minimalt antal eksperimenter. De udvalgte faktorer i denne undersøgelse var nøglefaktorerne identificeret i enkeltfaktorscreeningseksperimentet, og deres niveauer blev bestemt i et foreløbigt eksperiment. Testprøverne var i overensstemmelse med egenskaberne ved responsoverflademetoden, så undersøgelsen var i stand til at bruge responsoverflademetoden til at etablere en prædiktiv model. De eksperimentelle resultater kan tjene som reference for forbedring af kvaliteten og ensartetheden af den forarbejdede EF.
Zebrafiskembryoner anvendes som modelorganismer inden for udviklingsgenetik, fordi de er gennemsigtige, udvikler sig in vitro og er lette at observere27. Almindeligt anvendte zebrafisktoksicitetsindikatorer i udviklingstoksicitetsundersøgelser inkluderer embryonal dødelighed, embryonal misdannelsesrate, æggeblomme-sækødem, pigmentdannelse, ægkondensation, haleforlængelse, hovedmorfologi og dannelse af kropssegmenter, blandt andre28. Sammenlignet med teknikker til evaluering af toksicitet hos pattedyr er zebrafiskembryoners specificitet med hensyn til påvisning af sammensat toksicitet 70-80 %, og følsomheden overstiger 80 %18. Ton et al.29 fandt, at nøjagtigheden af at evaluere udviklingstoksiciteten af ikke-teratogene forbindelser med zebrafiskembryoner var 75%. Teratogene forbindelser blev evalueret med 100% nøjagtighed her. Selvom TCM har karakteristika som komplekse komponenter og uklare målorganer for toksicitet, kan zebrafiskembryoner stadig bruges som en forsøgsdyremodel til nøjagtig og hurtig evaluering af udviklingstoksicitet. Han et al.30 fandt, at emodin påvirkede overlevelses- og rugehastigheden for zebrafiskembryoner, hvilket forårsagede kropsbøjning og æggeblomme-sækødem. Chen et al.31 fandt, at muskone forårsagede zebrafisk embryo perikardial ødem, spinal krumning og æggeblomme-sækødem. Han et al.32 fandt, at Arnebiae Radix havde dødelige virkninger på zebrafisk på alle udviklingsstadier, og 1,0 mg / L Arnebiae Radix hæmmede embryonal udvikling, hvilket resulterede i et reduceret antal somitter, haledeformiteter, kropsbøjning og reduceret melanin i zebrafiskembryoner.
For at undersøge virkningerne af rå og forarbejdet EF på zebrafiskens embryoudvikling blev der udført et udviklingstoksicitetsforsøg med zebrafiskembryoner i denne undersøgelse. Dataene viste, at LC50-værdierne var 151,3 μg / ml for den rå gruppe (S) og 219,8 μg / ml for den forarbejdede gruppe (P). Observation af zebrafisklegemerne i hver forsøgsgruppe gennem et mikroskop viste en tydelig grad af zebrafiskteratogenicitet i den rå gruppe. De fleste af fiskene viste varierende grader af teratogenicitet, herunder spinal deformitet, kropskrumningsdeformitet, perikardieødem, svømmeblære ufuldstændighed eller leverdeformation, og disse observationer var sjældne i den forarbejdede gruppe. Disse eksperimenter viste, at toksiciteten af EF blev signifikant reduceret efter forarbejdning, hvilket tyder på, at forarbejdning kunne reducere lægemiddeltoksicitet hos mennesker. De eksperimentelle resultater giver en reference til forbedring af den kliniske medicinsikkerhed af fåreolieforarbejdet EF.
Traditionel kinesisk medicin antyder, at nyrens funktion er tæt forbundet med vækst, udvikling og reproduktion af menneskekroppen33. De gamle bøger af traditionel kinesisk medicin registrerer, at nyrerne er kroppens knoglemarv. Nyren lagrer essens, og marven ligger i knoglehulen for at nære knoglen. Når nyrens essens er mangelfuld, reduceres knoglemarven34. Den traditionelle kinesiske medicin til tonificering af nyreyang kan behandle lændehvirvelsvækkelse, osteoporose, impotens, for tidlig sædafgang og livmoderkold infertilitet35. EF er et af de repræsentative medicinske materialer til tonificering af nyreyang. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at EF har indlysende virkninger på skelettet, immunsystemet, reproduktionssystemet, hjerte-kar-systemet og nervesystemet samt har antitumoreffekter36. Med hensyn til aktivitet på skeletsystemet kan icariin37 forbedre niveauet af serumE2 hos ovariektomiserede rotter og opregulere ekspressionen af ERβ mRNA i knoglevævet hos ovariektomiserede rotter. Syntesen af ERβ øges, hvorved den biologiske virkning af ER forbedres, svækker osteoklasters knogleresorptionsaktivitet og forbedrer knogledannelsen af osteoblaster. Ændringerne i knogleresorption er større end den negative balance i knoglemetabolisme. Epimedin A kan forbedre knoglemikrostrukturen og serumknogleomsætningsmarkørerne i osteoporosemodelmus ved at hæmme osteoklastdannelse, differentiering og knogleresorption og spille en rolle i knoglebeskyttelse38. Epimedin C har åbenlys anti-osteoporose aktivitet, primært med hensyn til at øge knoglemassen og forbedre den trabekulære mikrostruktur for i sidste ende at øge knoglestyrken39. Andre undersøgelser har vist, at epimedin B40 og baohuosid I41 har anti-osteoporose aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine Basic Scientific Research Business Project (projektnummer: jbky20200013), Performance Incentive Guidance Project fra Chongqing Scientific Research Institutions (projektnummer: cstc2021jxjl 130025) og Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Medica Processing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
References
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , China Medical Science and Technology Press. Beijing, China. (2020).
- Wang, X. T. Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , Nanchang Science and Technology Press. Jiangxi, China. (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -L., Dai, Y. -P., Yan, X. -S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish's embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , Kunming University of Science and Technology. Kunming, China. (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -N., Xu, X. -Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -J., Sun, E., Xu, F. -J., Jia, X. -B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
