Summary
このプロトコルでは、Box-Behnken実験計画応答表面法を適用してEpimedii folium(EF)の羊油処理技術を最適化し、ゼブラフィッシュの胚発生に対する粗水および最適化された水抽出EFの影響を予備的に調査しました。
Abstract
伝統的な漢方薬(TCM)として、エピメディフォリウム(EF)は、>2,000年前の医学と食品の歴史があります。臨床的には、マトンオイルで処理されたEFは薬としてよく使用されます。近年、EFを原料とした製品の安全性リスクや副作用の報告が徐々に増加しています。処理により、TCMの安全性を効果的に向上させることができます。TCM理論によれば、マトンオイル処理はEFの毒性を軽減し、腎臓に対するその調子効果を高めることができます。しかし、EFマトンオイル加工技術の体系的な研究と評価は不足しています。この研究では、Box-Behnken実験計画応答曲面法を使用して、複数のコンポーネントの内容を評価することにより、処理技術の主要なパラメーターを最適化しました。その結果、EFの最適なマトン油加工技術は、マトンオイルを120°C±10°Cで加熱し、粗EFを加え、均一に光沢があるまで189°C±10°Cまで穏やかに炒め、取り除いて冷却することであることが示された。EF100 kgごとに、15 kgのマトンオイルを使用する必要があります。粗精製および羊油処理EFの水性抽出物の毒性および催奇形性をゼブラフィッシュ胚発生モデルで比較した。結果は、粗ハーブグループがゼブラフィッシュ奇形を引き起こす可能性が高く、その半分の最大致死EF濃度が低いことを示しました。結論として、最適化されたマトンオイル処理技術は安定していて信頼性が高く、再現性も良好でした。EFの水性抽出物は、特定の用量ではゼブラフィッシュ胚の発生に対して毒性があり、毒性は加工薬よりも生薬の方が強かった。結果は、マトン油処理が粗EFの毒性を低下させることを示した。これらの知見は、マトン油処理EFの品質、均一性、および臨床的安全性を向上させるために使用できます。
Introduction
エピメディイフォリウム(EF)は、イカリソウブレビコルヌマキシム、イカリソウサジタタム(Sieb. et Zucc)の乾燥葉です。マキシム、エピカリソウ思春期マキシム、またはエピメディウムコリアナムナカイ。EFは、骨粗鬆症、更年期障害、乳房のしこり、高血圧、冠状動脈性心臓病、およびその他の疾患の治療に使用できます1。伝統的な中国医学(TCM)として、EFは2,000年以上の医学と食品の歴史があります。その低価格と腎臓の緊張の顕著な効果のために、それは医薬品や健康食品に広く使用されています。EFは、羊肉油で炒めて加工されますが、これは劉宋時代の2年にレイシャオによって書かれたレイゴン加工理論で最初に説明されたプロセスです。粗EFとEF炒めの効果はかなり異なります。粗EFは主にリウマチを払拭しますが、炒めたEFは腎臓を温めて陽を強化します3。現在、EFは医薬品や健康食品の原料として広く使用されています。中国の特許医薬品は399件、輸入健康食品は9件、EFを原料とする国内健康食品は455件です。この医薬品は大きな応用の見通しがあります。しかし、近年、EFを原料とした健康食品や中国特許医薬品による副作用やヒト肝障害の報告が増えており、関連する毒性試験5,6,7では、EFを原料とする潜在的な安全性リスクが報告されています。
漢方加工とは、毒性を効果的に軽減または排除し、TCMの安全性を向上させることができる製薬技術を指します。EFの伝統的な加工方法は、マトン油で炒めることで、EFの毒性を軽減し、腎臓を温め、陽8を促進する効果を高めます。この処理方法は、中国薬局方および各種処理仕様に含まれています1.EFのプロセスは次のようにのみ指定されています:EF100 kgごとに20 kgの羊水(精製)が追加され、均一で光沢がある1になるまで穏やかに焼成されます。上記の標準には厳密なEF処理メソッドパラメータがないため、一貫性を提供するためにローカル処理仕様が統一されていません。したがって、EFプロセスの体系的な研究を行うことは有用でしょう。本論文では、Box-Behnken実験計画応答曲面法を用いてEFの処理技術を最適化した。
Box-Behnken実験計画は、工程の因子を最適化するために通常使用される方法です。抽出パラメータは、重回帰式適合因子と効果値の間の関数関係を確立することによって最適化できます。最近、この方法は、TCM抽出5、6、7および処理9、10、11の研究に広く使用されています。塩加工ソラレ科フルクタス12、ワイン加工フルータス13、ローストシナモミラムルス14など、ボックスベンケン設計に従った塩加工、ワイン加工、炒め物を含むTCM調製方法がさまざまな研究で報告されています。この方法は、テスト時間が短縮され、テスト精度が高く、多要素およびマルチレベルのテストに適しています。この方法は、直交計画試験方法よりも単純であり、均一設計方法15よりも包括的である。得られた関係は、テスト範囲内の任意のテストポイントの予測値を決定することができ、これは大きな利点である。ゼブラフィッシュモデルを使用して、EFが処理後に毒性が低いかどうかをテストできます。
TCM毒性試験において、ゼブラフィッシュモデルには、細胞実験のハイスループットとげっ歯類実験との類似性という2つの利点があります16。このモデルは、サイズが小さく、産卵率が高く、繁殖サイクルが短く、繁殖が容易であることが特徴です。このモデルは、細胞培養プレートでの大規模な同期実験に使用でき、実験薬の投与量が少なく、実験サイクルが短く、コストが低く、実験プロセス全体の観察と操作が容易です17。ゼブラフィッシュの胚は透明で急速に成長します。したがって、異なる発生段階における内臓組織に対する薬物の毒性および催奇形性効果は、顕微鏡下で直接観察することができる18。ゼブラフィッシュとヒトの遺伝子相同性は85%にもなります18。ゼブラフィッシュのシグナル伝達経路はヒトのそれと類似している18。ゼブラフィッシュの生物学的構造と生理学的機能は、哺乳類のものと非常に類似しています18。したがって、薬物検査用のゼブラフィッシュモデルは、信頼性が高く、ヒトに完全に適用可能な実験動物を提供することができます19。
本研究では,イカリイン,エピメジンA,エピメジンB,エピメジンC,バオフオシドIの含有量を評価指標として,EF加工技術で使用するマトン油の量と温度,揚げ温度を最適化するためにBox-Behnken設計応答曲面法を用いた。ゼブラフィッシュモデルを用いて、EFに対する処理の減衰効果を評価するために、処理前後のゼブラフィッシュ胚発生に対するEF水抽出物の効果を予備的に調査した。
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Protocol
すべての動物関連実験は、重慶TCM研究所の実験倫理委員会の承認を得て実施されました(実験動物倫理審査証明書番号:ZJS2022-03)。
1.生理活性成分の測定
注:この研究で使用された種は イカリソウサジッタタムであり、サンプルは重慶市豊都県で収集されました。試料は、 E. sagittatum (Sieb. et Zucc)の乾燥した地上部分として同定された。諺。重慶中医薬研究所生物医学研究所の研究者による。
- 電子分析天秤を用いて、各基準物質、すなわちイカリイン、エピメジンA(EA)、エピメジンB(EB)、エピメジンC(EC)、バオフオシドI(BI)の適量を正確に秤量し、メタノールに溶解して対照品溶液を調製する。これらを用いて、381.61 μg/mLのイカリイン、124.14 μg/mL EA、110.24 μg/mL EB、1091.75 μg/mL EC、および184.98 μg/mL BIを含む混合基準原液を調製します。
- EFを3番の篩を通して粉砕することにより、試験生成物溶液を調製する。粉砕したEFの約0.2g(電子分析天秤を使用)を栓付き三角フラスコに入れ、20mLの希エタノールを加え、400Wの電力と50kHzの周波数で1時間超音波処理します。よく振とうし、0.22 μmのメンブレンフィルターを通過させて試験溶液を得た。
- 以下のようにクロマトグラフィーを行う。寸法 4.6 mm x 250 mm、内径 5 μm の C18 カラムを備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用してください。移動相Aとしてアセトニトリルを使用し、移動相Bとして超純水を使用します。 以下のグラジエント溶出パラメータを使用します:0〜30分、24%A〜26%A;30〜31分、26%A〜45%A;31〜45分、45%A〜47%A.220nmの検出波長を使用します(使用する検出器については、 材料の表を参照してください)。カラム温度を30°C、流速を1.0 mL/minに保ち、サンプルサイズは10 μLです。
- 線形関係を調べるには、ステップ1.1と同様に、イカリイン、EA、EB、EC、BIについてそれぞれ2倍、4倍、8倍、16倍、32倍に希釈した混合参照溶液を使用します。移動相Aにはアセトニトリルを、移動相Bには超純水を使用します。
- 以下のグラジエント溶出パラメータを使用してください:0-30分、24%Aから26%A;30〜31分、26%A〜45%A;31〜45分、45%A〜47%A.220nmの検出波長を使用します(使用する検出器については、 材料の表を参照してください)。カラム温度を30°C、流速を1.0 mL/minに保ち、サンプルサイズ10 μLを使用します。最後に、ピーク領域を記録します。専門のソフトウェアを使用して、基準濃度(x軸、μg/mL)を横軸、ピーク面積(y軸)を縦軸として線形回帰をプロットします( 材料表を参照)。
- ステップ1.3に示すクロマトグラフィー条件を用いてHPLCにより混合対照溶液を6回連続して測定することにより精密試験を行う。各化学組成の検出時間とピーク面積を記録し、ピーク面積の相対標準偏差(RSD)を計算し、以下の式を使用して精度(再現性)を評価します。
RSD% = 標準偏差 (SD)/計算結果の算術平均 (X) x 100 % - 再現性試験を行うには、EF粉末を正確に秤量し、ステップ1.2の方法に従って6部の試験生成物溶液を並行して調製する。調製した溶液を、ステップ1.3で提示したクロマトグラフィー条件下でHPLCにかけます。各化学組成の保持時間とピーク面積を記録し、標準曲線(ピーク面積対濃度)から各化合物の量を計算します。上記のようにRSD%を計算します。
- 安定性試験を行うには、試験溶液を室温で保存し、調製後0時間、2時間、4時間、8時間、12時間、および24時間にステップ1.3に記載したHPLC法によってその内容物を測定し、安定性を評価します。各化学組成の保持時間とピーク面積を記録し、上記のようにピーク面積のRSD%を計算します。
- サンプル回収試験を実施するには、0.2 gのEF粉末を栓付き三角フラスコに入れて6回の反復を行います。適量の参照溶液(サンプルに添加される参照物質の量は、サンプルの既知の含有量の100%に相当します)を追加し、ステップ1.2で提示された方法に従って試験溶液を調製します。
- サンプルをクロマトグラフに注入し、ステップ1.3のクロマトグラフィー条件に従って分析します。ピーク面積を記録し、以下のように平均回収率とRSD%値を計算します。
スパイクサンプル回収率=(スパイクサンプル含有量-サンプル含有量)/サンプル量x100%
2. Box-Behnken設計応答曲面法を用いたEF羊油加工技術の最適化
- マトンオイルの量(A; 15%-35%)、マトンオイルの温度(B; 50-120°C)、揚げ温度(C; 80-300°C)など、EF処理の主要なパラメータを影響力のある要因として選択します。評価指標として、イカリイン、EA、EB、EC、およびBIコンテンツの包括的なスコアを使用します。ここでのマトンオイルの割合は質量百分率です。
- 応答曲面解析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、Box-Behnken応答曲面実験を設計し、2次応答曲面を探索し、2階多項式モデルを構築します。新しいボックス-ベンケン計画を選択し、数値因子オプションを3に設定します。因子A、B、Cを設定し、[ 続行]をクリックします。回答 オプションを 1 (包括的なスコア) に設定します。 [続行 ]をクリックしてデザインを完了します。合計17の実験が計画されました( 表1を参照)。
注: 独立変数と従属変数、およびそれらの低水準、中水準、高水準については、 表 2 を参照してください。 - 表 1 の特定のパラメーターに従って EF を処理します。たとえば、注文番号1の場合、精製マトンオイルを15%V / Vとして計量し、50°Cに加熱して溶かします。溶かした羊肉に粗EFを加え、弱火(190°C)で均一に光沢が出るまで炒め、取り出して冷まします。17回の実験操作を実行しました。この作業では、合計17グループのEF加工製品が得られました。
注意: マトンオイルは室温(25°C)で固体であり、加熱すると液体に溶けます。液体状態のマトン油を賦形剤として使用することができる。 - ステップ1.2で説明した方法に従って、処理された製品のテスト溶液を調製します。次に、ステップ1.3に記載したクロマトグラフィー条件に従ってHPLCを用いてそれらを分析します。各化学組成の保持時間とピーク面積を記録し、外部標準曲線に対して各試験溶液中のイカリイン、EA、EB、EC、およびBIの含有量を計算します。以下の総合スコア計算式を使用して、17の実験グループの総合スコアを計算します。
総合スコア = Z/Z最大 × 0.5 + BI/BI最大 × 0.5
ここで、Zはイカリイン、EA、EB、およびECコンテンツの合計です。Zmax は、17の実験群におけるイカリイン、EA、EB、およびEC含有量の合計の最大値です。BI は BI コンテンツです。BImax は、17の実験グループにおけるBIコンテンツの最大値です。 - 17グループの実験の包括的なスコアリング結果をデータ解析ソフトウェア( 材料表を参照)にインポートして、実験データを分析します。評価項目で、2次プロセス次数オプションと多項式モデルタイプオプションを選択します。
3. ゼブラフィッシュの胚発生に対する加工効果の試験
- サンプル調製
- 粗製および処理済みのEFを3番のふるいで粉砕します( 材料表を参照)。各EFサンプル100gに、1,000mLの超純水を加えます。EFを0.5時間浸し、水をそれぞれ30分間2回沸騰させてから、ろ紙でろ過します。
- ろ液を混ぜ合わせ、加熱してサンプルを濃縮します。最終容量100 mLまで超純水を加えて、処理済みEF(PEF、1 g/mL)および粗EF(CEF、1 g/mL)ストック溶液を得ます。各原液中の生薬量を測定します。
- 1 mL、1.5 mL、2.5 mL、5 mL、および7.5 mLのストック溶液を10 mLメスフラスコに入れ、超純水を容量まで加えて、ゼブラフィッシュ胚毒性試験用の濃度100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、500 mg/mL、および750 mg/mLの濃度の試験溶液を調製します。
注:試験溶液の濃度は、関連文献20,21を参照し、予備実験を実施して、通常の毒物学で使用される10倍の濃度勾配を与えることによって調製されました。CEFは未処理のサンプルであり、PEFはセクション2で説明されている最高の処理技術で調製されたサンプルでした。
- ゼブラフィッシュの飼育と胚処理21
- 野生型ゼブラフィッシュ( 材料表参照)を制御された温度で2日間適応させ、pH 7.0〜7.4のフロースルー水槽に保管し、1日2回給餌します。
注:ゼブラフィッシュのメラニン生成抑制は、1-フェニル-2-チオ尿素を0.003%(質量/体積)の濃度で培地に添加し、形態観察のために体を透明に保つことによって達成されました。 - 夕方に成体の肥沃な野生型ゼブラフィッシュを選択し、交配ボックスのバッフルを使用してそれらを分離します。翌朝バッフルを外し、魚を30分間産卵させます。15分ごとにスポイトで受精卵を集めた。合計で520個の健康な野生型胚が収集された。ゼブラフィッシュの胚を28.5°Cのインキュベーターで24時間保管します。
- 受精後24時間(hpf)の健康な胚を13のグループにランダムに割り当て、1つの対照群とともに、培養皿に次の各溶液の10 mLを別々に浸します:PEF:100 μg / mL、150 μg / mL、200 μg / mL、250 μg / mL、500 μg / mL、750 μg / mL;CEF: 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL .ブランクコントロールグループを溶液として培地で処理します。この研究では、各グループに40個の胚が含まれていました。
注:培地組成は、0.15 M NaCl、5 mM KCl、0.25 mM Na 2 HPO 4、0.45 mM KH 2 PO 4、1.3 mM CaCl2、1.0 mM MgSO 4、および 4 mM NaHCO3です。 - ゼブラフィッシュを恒温インキュベーターで最大120 hpfまで培養します。毎日死んだ幼虫の数を数え、実体顕微鏡(スケールバー= 500μm、材料表を参照)で各実験群の幼虫の主な器官形態を観察し、データ解析ソフトウェアを使用して72hpfでのゼブラフィッシュの半死濃度(LC50)を計算します(材料表を参照)。
- 野生型ゼブラフィッシュ( 材料表参照)を制御された温度で2日間適応させ、pH 7.0〜7.4のフロースルー水槽に保管し、1日2回給餌します。
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Representative Results
方法論的調査結果
イカリインの濃度、EA、EB、EC、BI、およびクロマトグラフィーのピーク面積の間に線形関係が観察されました( 表3を参照)。イカリイン、EA、EB、EC、BIのクロマトグラフィーピーク面積のRSD%値(n=6)はそれぞれ0.28%、1.22%、0.65%、1.67%、1.06%であり、HPLC測定の精度が良好であった。イカリイン,EA,EB,EC,BIの含有量のRSD%値(n=6)はそれぞれ1.59%,1.46%,1.86%,2.29%,0.98%であり,再現性が良好であった。試料中のイカリイン、EA、EB、EC、BIのピーク面積のRSD%値(n=6)はそれぞれ1.49%、1.96%、1.42%、0.96%、0.81%であり、試料溶液が24時間以内に安定であったことが示された。イカリイン、EA、EB、EC、BIの平均回収率はそれぞれ99.98%、100.14%、100.09%、100.75%、100.94%であり、RSD%値はそれぞれ0.56%、0.78%、0.84%、1.10%、1.47%であった( 表4参照)。これらの結果は、方法の精度が要件を満たしていることを示しています。
以上の実験結果から,EF加工品の品質分析において,精度,再現性,精度に優れた分析結果が得られた。
Box-Behnken設計応答曲面法の適用によるEFの羊油加工技術の最適化
上記のデータの二次多項式回帰フィッティングを実行して、次のモデルを得ました:Y = 0.86 − 0.11 x A + 0.025 x B − 0.078 x C − 0.023 x A x B − 0.037 x A x C + 0.037 x B x C − 0.045 x A 2 + 2.5 x 10-3 x B 2 − 0.14 x C 2。分散分析では、P < 0.01の値が得られ、モデルが有意であることを示しています。不適合のP値はP > 0.05であり,不適合は有意ではないことが示された。R2値は0.9300であり、モデルの適合度が良好で誤差が小さいことを示しています。このモデルを使用して、羊肉油で炒めたEFの化学組成含有量の影響を分析および予測することが可能でした。また、A2とD2は加工品の含有量に影響し、その差は統計学的に有意であった(P < 0.01)。1次項のA,C,2次項のC2が包括得点に及ぼす影響は有意であった。1次項B、2次A2、B2、およびすべての交互作用項目は、包括的スコアに有意な影響を及ぼさなかった。P値の分析は、実験パラメータのうち、マトン油量(A)が総合スコアに最も大きな影響を及ぼし、次に揚げ温度(C)、次にマトン油温度(B)が続くことを示しました。以上の結果を表5に示す。
ソフトを用いて、マトン油量、マトン油温度、揚げ温度を中央値に設定し、総合スコアを指標として、1因子の単一因子影響図を描いた(図1)。揚げる温度を上げると、最初に総合スコアが増加し、次に低下しました(図1)。マトン油の温度は、総合スコアにほとんど影響を与えませんでした。包括得点の変化を左右した主な要因は羊肉油量であり,量が増えるにつれて含量は減少傾向にあった。
結果をよりよく理解できるように、予測モデルを3D応答曲面プロットとして 図2 に示します。応答曲面の傾きに関しては、因子間の交互作用効果の有意性が大きいほど傾きは緩やかになり、効果の有意性は低くなります。等高線の形をした楕円は因子間の強い交互作用を示し、円はその逆を示します。マトン油量と揚げ温度の応答面は、他の試験因子と比較して急峻であり、等高線はより楕円形になる傾向があり( 図2C、Dを参照)、これら2つの要因間の相互作用がより有意であることを示しています。対照的に、他の因子間の交互作用は有意ではなかった( 図2A、B、E、F参照)。
EFの最適なマトンオイル処理技術は、次のように選択されました:マトンオイルの量15%。マトン油温120°C;揚げ温度は189°Cです。 実際の運転では温度をあまり正確に制御できないことを考慮して、温度値は変数±10°Cとして指定されています。 したがって、最終的なパラメータは次のとおりでした:15%のマトンオイル量。マトン油温120°C±10°C;揚げ温度は189°C±10°Cです。 最適なプロセスは、マトンオイルを120°C±10°Cで加熱し、粗EFを加え、穏やかに光沢があるまで弱火(189°C±10°C)で揚げ、取り出して冷却した。EF100 kgごとに、15 kgのマトンオイル(精製油)を使用する必要があります。これらの条件を用いて3回の並行実験を行い、得られたスコアは0.96、0.97、0.94(RSD%=1.60%)であり、安定かつ実現可能な条件を示した。EFの粗物質、加工物質、および混合標準物質の典型的なHPLCクロマトグラムを 図3に示します。
ゼブラフィッシュの胚発生に対する処理の影響のテスト
ゼブラフィッシュは72hpfで幼体に孵化した。各臓器の開発は基本的に完了しました。魚の体は透明なままで、スライドガラスの上に横向きに置くのは簡単でした。臓器の形状は、顕微鏡で見ると観察や識別が容易でした。ブランク対照群は、投与期間中に死亡または臓器毒性を経験しなかった。対照群と比較して、薬物濃度100 μg/mLでは、粗EF群(S)および処理群(P)に72 hpfで明らかな異常は見られませんでした。96 hpf以降では、水泳膀胱の不完全性と水泳膀胱の喪失は、粗群の幼魚でより一般的でしたが、処理群の幼魚ではまれでした。薬剤濃度150 μg/mLでは,72 hpfの粗群の稚魚に明らかな脊椎変形,体湾曲変形,心膜浮腫,肝変形が認められたが,処理群の稚魚では稀であり,催奇形性の程度は粗群より弱かった。薬剤濃度200 μg/mLでは、粗群の稚魚はすべて死亡し、処理群の稚魚に明らかな催奇形性が出現した。薬物濃度250 μg/mLでは、処理群で少数のゼブラフィッシュが生存した。ゼブラフィッシュの顕微鏡検査結果を 図4に示す。
粗および加工されたイカリソウハーブ群におけるゼブラフィッシュ死亡率は、濃度および投与時間に依存した。時間-線量-死亡率の関係を 図5に示します。ゼブラフィッシュの死亡率の結果は、投与後24時間(48 hpf)、薬物濃度200 μg/mLで、生薬群のすべてのゼブラフィッシュが死亡したのに対し、処理群の死亡率はわずか6.67%であったことを示しました。EF投与後48時間(72 hpf)の時点で、生薬群の全ゼブラフィッシュの死因となった濃度は200 μg/mLであり、処理群の全ゼブラフィッシュの死因となった濃度は500 μg/mLであった。72hpfでの2つの実験群の致死濃度の中央値が計算されました。結果は、LC50 ( 図6を参照)が粗群(S)で151.3 μg/mL、処理群(P)で219.8 μg/mLであることを示しました。
図1:単変量解析。 この図は、単一因子影響図を示しています。Aは、マトン(スエット)油の量の単一因子結果です。Bは、マトン(スエット)オイルの温度の単一因子結果です。Cは揚げ温度の単一因子の結果です。揚げ物の温度が上がると、総合スコアは最初に増加し、次に減少します。マトンオイルの温度はスコアにほとんど影響を与えません。包括得点の変化に影響を与える主な重要な要因はマトン油の量であり、マトン油の量の増加に伴い、含有量は減少傾向を示しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:包括的スコアに対するさまざまな因子交互作用の影響の応答曲面と等高線プロット 。 (A)この図は、マトン油量と温度の交互作用の3D応答曲面プロットを示しています。(B)この図は、マトン油量と温度の相互作用のコンタープロットを示しています。(C)この図は、マトン油量と処理温度の相互作用の3D応答曲面プロットを示しています。(D)この図は、マトンオイルの投与量と処理温度の相互作用のコンタープロットを示しています。(E)この図は、マトン油量と処理温度の相互作用の3D応答曲面プロットを示しています。(F)この図は、マトン油量と処理温度の相互作用のコンタープロットを示しています。結果は、マトン油量と揚げ温度の応答面が他の試験パラメータよりも急峻であり、等高線が楕円形である傾向があり( C、Dを参照)、これら2つの因子間の交互作用が有意であるのに対し、他の因子間の交互作用は有意ではなかったことを示しています( A、B、Eを参照)。図で使用されているスエットオイルの用語は、マトンオイルを指します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:EFの粗、加工、および混合標準物質のHPLCクロマトグラム。 (A)この図は、混合標準物質のHPLCクロマトグラムを示す。(B)この図は、粗エピメディフォリウムのHPLCクロマトグラムを示す。(C)この図は、エピメディフォリウム加工品のHPLCクロマトグラムを示す。これらの 3 つの図は、未加工の EF の BI コンテンツが低い一方で、処理後に増加することを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ゼブラフィッシュの顕微鏡写真。 この図はゼブラフィッシュの顕微鏡写真を示しています。(A)この図は、ブランク群におけるゼブラフィッシュの顕微鏡観察の結果を示す。(B)この図は、粗群におけるゼブラフィッシュの顕微鏡観察の結果を示す。(C)この図は、処理群におけるゼブラフィッシュの顕微鏡観察の結果を示す。ブランク対照群は、投与期間中に死亡または臓器毒性を経験しなかった。EF薬物濃度150 μg/mLでは,72 hpfの粗群の稚魚に明らかな脊椎変形,体湾曲,心膜浮腫,肝変形が認められたが,処理群の稚魚では稀であり,催奇形性の程度は粗群より弱かった。薬物濃度200 μg/mLでは、粗群の幼魚はすべて死亡し、処理群には明らかな催奇形性が出現した。薬物濃度250 μg/mLでは、処理群で生存したゼブラフィッシュはごくわずかでした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:投薬時間-線量-死亡率の関係。 この図は、投薬時間-線量-死亡率の関係を示しています。(A)この図は、粗群の投与時間-線量-死亡率の関係を示しています。(B)この図は、処理群の投与時間-線量-死亡率の関係を示しています。n = 40。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:粗および処理されたEFのLC50図。粗および処理されたEFのLC50図が示されている。72hpfでの2つの実験群の致死濃度の中央値が計算されました。LC50は粗群(S)で151.3 μg/mL、処理群(P)で219.8 μg/mLであった。n = 40。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:17群の実験計画とBox-Behnken応答曲面法の結果。表1 は、Box-Behnken設計応答曲面法によって設計された17グループの実験と、それらの包括的なスコア結果を示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:ボックス-ベンケン計画で使用される変数。 独立変数と従属変数は、低水準、中水準、高水準とともにここにリストされます。Box-Behnkenデザインは、マトン油の量(A)(15%-35%)、マトン油の温度(B)(50°C-120°C)、および揚げ温度(C)(80°C-300°C)を影響因子として、EF加工に最も影響を与える要因を特定することを可能にしました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:EFの化学成分の回帰式と線形範囲。 EF化学組成の回帰式と線形範囲の結果は、イカリイン、EA、EB、EC、BIの各濃度とそれらのクロマトグラフィーピーク面積との間に良好な直線性があったことを示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:サンプル回復テスト率。 イカリイン、EA、EB、EC、BIの平均回収率はそれぞれ99.98%、100.14%、100.09%、100.75%、100.94%であり、RSD%値はそれぞれ0.56%、0.78%、0.84%、1.10%、1.47%であった。結果は、この方法の精度が適切であることを示しています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 5: 予測された 2 次モデルの回帰係数。モデルのP値はP < 0.01であり、モデルが有意であることを示しています。適合度不足のP値はP > 0.05であり,適合度不足は有意ではないことが示された。R2値は0.9300であり、モデルの適合度が良好であり、誤差が小さいことを示しており、マトン油で炒めたEFの化学組成含有量の影響を分析および予測するのにモデルが適していた。また、A2及びD2は加工品の含有量に有意な影響を及ぼした(P<0.01)。1次項のAとC,2次項のC2が包括得点に及ぼす影響は有意であった。1次項B、2次A2、B2、およびすべての交互作用項目は、包括的スコアに有意な影響を及ぼさなかった。P値の分析は、実験パラメータのうち、マトンオイルの量(A)が総合スコアに最も大きく影響し、次に揚げ温度(C)、次にマトンオイルの温度(B)が続くことを示しました。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
独立変数とその水準の決定
EF加工技術は、2020年版の中国薬局方と、全国の26の省、市、自治区が発行している地元の漢方加工仕様書にのみ記載されています1。説明には、マトンオイルを取り、加熱して溶かし、EF細切りを加え、均一で光沢が出るまでゆっくりと火で炒め、取り出して冷まします。さらに、イカリソウ100kgごとに20kg(20%と略して)のマトンオイル(精製)が使用されます。ただし、EFの処理処理のパラメータは指定されていません。この実験の独立変数の中で、製造プロセスでは、マトン油の投与量、マトン油の温度、および揚げる温度の3つの重要な要素を定量化できました。値の範囲は、上記の説明に従って設定する必要があります。予備試験の結果から、マトンオイルの量が15%の場合、EFの葉をマトンオイルで均一にコーティングできることがわかる。投与量が35%を超えると、マトンオイルが多すぎます。最後に、マトンオイルの量の範囲は15%-35%でなければなりません。温度が50°Cに達すると、マトンオイルが溶けます。温度が>120°Cに達すると、マトンオイルが煙を出し始め、温度が高すぎます。したがって、マトンオイルの温度範囲は50°C〜120°Cである必要があります。 中国薬局方2020年版では、EFはゆっくりと火で炒める必要があると規定されています。スローファイアは200°Cを超えてはならず、揚げ温度は80°C〜300°Cの範囲である必要があります。
包括的なスコアリング
イカリソウの処理中に、グリコシド結合が切断され、グリコシド成分が低級グリコシド成分に変換されます。中国薬局方2020年版におけるEF加工品の含有量の決定は、元の医薬品中のイカリイン、EA、EB、およびECの総含有量の決定に基づいており、モノグリコシド成分であるBIが指標として別途リストされています。この実験では、処理されたEF中のイカリイン、EA、EB、およびECの総重量を50%、BIの重量を50%とし、これらの値に基づいて包括的なスコアを設定しました。
応答曲面法(RSM)は、最適な工程パラメータを特定し、多変量問題を解決するための統計的手法です。この手法では、合理的な実験計画を使用して実験を通じて特定のデータを取得し、多変量二次回帰式を使用して因子と応答の間の関数関係を導き出します22。均一設計と直交設計プロセスの最適化が一般的に使用されますが、テスト精度は高くなく、数学モデルはあまり予測できません。RSMの基礎となる数学モデルは、非常に予測可能です。RSMは、より少ない実験とより短いサイクルを必要とするため、従来の数学的統計に関連する問題を排除できるだけでなく、因子と応答の関係を明らかにすることもできます23。RSMは、システムの応答を1つ以上の要因の関数として概念化し、グラフィカルな手法を使用してこの機能関係を表示し、ユーザーが直感的な視覚的観察によって実験計画の最適な条件を選択できるようにします。これらの利点は、化学工業24、生物工学、食品工業25、製薬工業、およびTCM調製物においてこの方法の広範な使用をもたらした。
RSMは応答(調査対象の指標)と因子(独立変数)の間の関数関係を特定できますが、応答と因子の間に常に強い関数関係があるとは限らないため、すべての実験が応答曲面の最適化に適しているわけではありません。RSMは、すべての因子が連続変数であることを必要とする連続関数関係を取得することがよくあります。それにもかかわらず、調査するすべての因子が連続変数であるか、実験計画の開始時の応答値に有意な影響を与えるわけではありません。実験回数を減らし、応答曲面モデリングの精度を向上させるためには、応答曲面計画手法を実施する前に、要因計画、一様計画、または直交計画を通じて有意因子を選択し、それらのレベルを決定するスクリーニングが必要です。応答曲面法の最大の利点は、モデルが正しく確立されると、任意の条件の組み合わせでの応答値を予測でき、3D応答曲面を通じて機能関係をより直感的かつ視覚的に確認できることです。この視覚化は、研究者が最適な処理条件を見つけるのに非常に役立ちます26。
この研究では、RSMのBox-Behnken設計原理を使用して、EFの包括的な化学物質含有量スコアを応答値として使用して17の複合実験を設計しました。最後に、回帰分析によって最良のプロセス最適化結果が得られました。加工技術は、マトンオイルを120°C±10°Cに加熱し、粗EFを加え、穏やかに火(189°C±10°C)で均一に光沢が出るまで揚げ、取り出して冷却するというように最適化されました。EF100 kgごとに、15 kgのマトンオイル(精製油)を使用する必要があります。私たちの結果は、EFプロセスが安定していて、信頼性が高く、再現性があることを示しました。さらに因子交互作用を解析したところ,羊油量と揚げ温度の交互作用は有意であったが,他の因子間の交互作用は有意ではなかった。本研究では、因子間の交互作用や因子と応答曲面値との関係を解析する手法として、応答曲面設計により、最小限の実験回数で短期間で処理条件を最適化できることを示した。この研究で選択された因子は、単一因子スクリーニング実験で特定された重要な因子であり、それらのレベルは予備実験で決定されました。テストサンプルは応答曲面法の特性に準拠していたため、この研究では応答曲面法を使用して予測モデルを確立することができました。実験結果は、処理されたEFの品質と均一性を向上させるための基準を提供することができます。
ゼブラフィッシュ胚は、透明で 体外で発生し、観察が容易であるため、発生遺伝学の分野でモデル生物として使用されています27。発生毒性試験で一般的に使用されるゼブラフィッシュ毒性指標には、胚死亡率、胚奇形率、卵黄嚢浮腫、色素形成、卵凝縮、尾伸展、頭部形態、および体節形成などがあります28。哺乳類の毒性評価技術と比較して、化合物毒性検出のためのゼブラフィッシュ胚の特異性は70%〜80%であり、感度は80%を超えています18。Tonら29 は、ゼブラフィッシュ胚を用いた非催奇形性化合物の発生毒性を評価する精度が75%であることを発見した。催奇形性化合物は、ここで100%の精度で評価されました。TCMは複雑な成分や毒性の標的器官が不明という特徴がありますが、ゼブラフィッシュ胚は発生毒性を正確かつ迅速に評価するための実験動物モデルとして使用することができます。Heら30 は、エモジンがゼブラフィッシュ胚の生存率と孵化率に影響を与え、体幹の曲がりと卵黄嚢浮腫を引き起こすことを発見しました。Chenら31 は、ムスコンがゼブラフィッシュ胚の心膜浮腫、脊椎湾曲、および卵黄嚢浮腫を引き起こすことを発見しました。彼は32 、Arnebiae Radixがすべての発生段階でゼブラフィッシュに致命的な影響を及ぼし、1.0 mg/LのArnebiae Radixが胚発生を阻害し、ゼブラフィッシュ胚の体節数の減少、尾の変形、体の曲がり、メラニンの減少をもたらすことを発見しました。
ゼブラフィッシュ胚発生に及ぼす粗および加工EFの影響を調べるために、本研究ではゼブラフィッシュ胚発生毒性実験を行った。データは、LC50 値が粗群(S)で151.3 μg/mL、処理群(P)で219.8 μg/mLであることを示した。各実験群のゼブラフィッシュ体を顕微鏡で観察したところ、粗群では明らかな程度のゼブラフィッシュの催奇形性を示した。ほとんどの魚は、脊椎変形、体湾曲変形、心膜浮腫、水泳膀胱不完全性、または肝臓変形など、さまざまな程度の催奇形性を示し、これらの観察は処理されたグループではまれでした。これらの実験は、EFの毒性が処理後に有意に減少したことを示し、処理がヒトの薬物毒性を低減できることを示唆しています。実験結果は、マトン油加工EFの臨床服薬安全性を向上させるための参考となる。
伝統的な漢方薬は、腎臓の機能が人体の成長、発達、生殖と密接に関連していることを示唆しています33。伝統的な漢方薬の古代の本は、腎臓が体の骨髄であることを記録しています。腎臓はエッセンスを蓄え、骨髄は骨に栄養を与えるために骨腔内にあります。腎臓エッセンスが不足すると、骨髄が減少します34。腎臓陽を緊張させる伝統的な漢方薬は、腰椎の衰弱、骨粗鬆症、インポテンス、早漏、および子宮の冷たい不妊症を治療することができます35。EFは腎臓陽を緊張させるための代表的な薬用材料の一つです。現代の薬理学的研究は、EFが骨格系、免疫系、生殖器系、心臓血管系、および神経系に明らかな影響を及ぼし、抗腫瘍効果を有することを示している36。骨格系に対する活性に関して、イカリイン37 は、卵巣摘出ラットにおける血清E2 のレベルを改善し、卵巣摘出ラットの骨組織におけるERβ mRNAの発現をアップレギュレートすることができる。ERβの合成が増加し、それによってERの生物学的効果が改善され、破骨細胞の骨吸収活性が弱まり、骨芽細胞の骨形成が促進されます。骨吸収の変化は、骨代謝の負のバランスよりも大きい。エピメジンAは、破骨細胞の形成、分化、および骨吸収を阻害し、骨保護に役割を果たすことにより、骨粗鬆症モデルマウスの骨微細構造および血清骨代謝回転マーカーを改善することができる38。エピメディンCは、主に骨量を増加させ、骨梁の微細構造を改善して最終的に骨強度を増加させるという点で、明らかな抗骨粗鬆症活性を有する39。他の研究は、エピメジンB40 およびバオフオシドI41 が抗骨粗鬆症活性を有することを示している。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作業は、重慶中医薬アカデミーの基礎科学研究事業プロジェクト(プロジェクト番号:jbky20200013)、重慶科学研究機関のパフォーマンスインセンティブガイダンスプロジェクト(プロジェクト番号:cstc2021jxjl 130025)、および重慶市衛生委員会の主要規律建設プロジェクトによってサポートされています中国マテリアメディカ処理。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
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