Summary
In dit protocol werd de schapenolieverwerkingstechnologie van Epimedii folium (EF) geoptimaliseerd door een Box-Behnken experimentele ontwerp-respons oppervlaktemethodologie toe te passen, en het effect van ruwe en geoptimaliseerde watergeëxtraheerde EF op de embryonale ontwikkeling van zebravissen werd voorlopig onderzocht.
Abstract
Als een traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft Epimedii folium (EF) een geschiedenis in geneeskunde en voedsel die > 2.000 jaar oud is. Klinisch wordt EF verwerkt met schapenolie vaak gebruikt als geneesmiddel. In de afgelopen jaren zijn de meldingen van veiligheidsrisico's en bijwerkingen van producten die EF als grondstof gebruiken geleidelijk toegenomen. Verwerking kan de veiligheid van TCM effectief verbeteren. Volgens de TCM-theorie kan de verwerking van schapenolie de toxiciteit van EF verminderen en het tonificerende effect op de nieren versterken. Er is echter een gebrek aan systematisch onderzoek en evaluatie van EF-technologie voor de verwerking van schapenolie. In deze studie gebruikten we de Box-Behnken experimentele ontwerp-respons oppervlaktemethodologie om de belangrijkste parameters van de verwerkingstechnologie te optimaliseren door de inhoud van meerdere componenten te beoordelen. De resultaten toonden aan dat de optimale verwerking van schapenolie van EF als volgt was: de schapenolie verwarmen bij 120 °C ± 10 °C, de ruwe EF toevoegen, voorzichtig roerbakken tot 189 °C ± 10 °C totdat deze gelijkmatig glanzend is, en vervolgens verwijderen en afkoelen. Voor elke 100 kg EF moet 15 kg schapenolie worden gebruikt. De toxiciteiten en teratogeniciteiten van een waterig extract van ruwe en schapenolie verwerkte EF werden vergeleken in een zebravisembryo-ontwikkelingsmodel. De resultaten toonden aan dat de ruwe kruidengroep meer kans had om zebravismisvormingen te veroorzaken en dat de half-maximale dodelijke EF-concentratie lager was. Kortom, de geoptimaliseerde schapenolieverwerkingstechnologie was stabiel en betrouwbaar, met een goede herhaalbaarheid. Bij een bepaalde dosis was het waterige extract van EF giftig voor de ontwikkeling van zebravisembryo's en de toxiciteit was sterker voor het ruwe medicijn dan voor het verwerkte medicijn. De resultaten toonden aan dat de verwerking van schapenolie de toxiciteit van ruwe EF verminderde. Deze bevindingen kunnen worden gebruikt om de kwaliteit, uniformiteit en klinische veiligheid van met schapenolie verwerkte EF te verbeteren.
Introduction
Epimedii folium (EF) is het gedroogde blad van Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., of Epimedium koreanum Nakai. EF kan worden gebruikt voor de behandeling van osteoporose, menopauzale syndroom, borstknobbels, hypertensie, coronaire hartziekten en andere ziekten1. Als traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft EF een geschiedenis in geneeskunde en voedsel van meer dan 2.000 jaar. Vanwege de lage prijs en het opmerkelijke effect van tonificatie van de nieren, wordt het veel gebruikt in medicijnen en gezonde voedingsmiddelen. EF wordt verwerkt door het te roerbakken met schapenolie, een proces dat voor het eerst werd beschreven in Lei Gong Processing Theory geschreven door Lei Xiao in de Liu Song-periode2. De werkzaamheid van ruwe EF en roergebakken EF is heel verschillend. Ruwe EF verdrijft voornamelijk reuma, terwijl de gewokte EF de nieren verwarmt om yang3 te versterken. Op dit moment wordt EF veel gebruikt als grondstof in geneesmiddelen en gezonde voedingsmiddelen; er zijn 399 beursgenoteerde Chinese patentgeneesmiddelen, negen geïmporteerde gezondheidsvoedingsmiddelen en 455 binnenlandse gezondheidsvoedingsmiddelen met EF als grondstof4. Dit medicinale materiaal heeft geweldige toepassingsperspectieven. In de afgelopen jaren zijn er echter steeds meer meldingen geweest van bijwerkingen en menselijke leverbeschadiging veroorzaakt door gezondheidsvoeding en Chinese patentgeneesmiddelen die EF als grondstof gebruiken, en gerelateerde toxiciteitsstudies 5,6,7 hebben gemeld dat EF als grondstof potentiële veiligheidsrisico's met zich meebrengt.
Chinese medicinale verwerking verwijst naar farmaceutische technieken die de toxiciteit effectief kunnen verminderen of elimineren en de veiligheid van TCM's kunnen verbeteren. De traditionele verwerkingsmethode van EF is roerbakken met schapenolie, wat de toxiciteit van EF vermindert en het effect ervan op het verwarmen van de nieren en het bevorderen van yang8 versterkt. Deze verwerkingsmethode is opgenomen in de Chinese Farmacopee en verschillende verwerkingsspecificaties1. Het proces van EF wordt alleen als volgt gespecificeerd: voor elke 100 kg EF wordt 20 kg vruchtwaterolie (geraffineerd) toegevoegd en het wordt mild gebakken tot uniform en glanzend1. Er zijn geen strikte EF-verwerkingsmethodeparameters in de bovenstaande normen, dus lokale verwerkingsspecificaties zijn niet geharmoniseerd om consistentie te bieden. Daarom zou het nuttig zijn om een systematische studie van het EF-proces uit te voeren. In dit artikel werd de Box-Behnken experimentele design-response oppervlaktemethode gebruikt om de verwerkingstechnologie van EF te optimaliseren.
Het experimentele ontwerp van Box-Behnken is een methode die meestal wordt gebruikt om de factoren in een proces te optimaliseren. De extractieparameters kunnen worden geoptimaliseerd door de functionele relatie tussen meerdere regressievergelijkingsaanpassingsfactoren en effectwaarden vast te stellen. Onlangs is deze methode op grote schaal gebruikt om TCM-extractie 5,6,7 en verwerking9,10,11 te bestuderen. Verschillende studies hebben TCM-bereidingsmethoden gemeld met betrekking tot zoutverwerking, wijnverwerking en roerbakken volgens een Box-Behnken-ontwerp, zoals voor met zout verwerkte Psoraleae fructus 12, wijnverwerkte Cnidii fructus13 en geroosterde Cinnamomi ramulus14. Deze methode heeft een kortere testtijd, een hoge testnauwkeurigheid en is geschikt voor multi-factor en multi-level tests. De methode is eenvoudiger dan de orthogonale ontwerptestmethode en uitgebreider dan de uniforme ontwerpmethode15. De verkregen relaties kunnen de voorspelde waarde van elk testpunt binnen het testbereik bepalen, wat een groot voordeel is. Een zebravismodel kan worden gebruikt om te testen of EF na verwerking minder giftig is.
In TCM-toxiciteitsstudies heeft het zebravismodel de dubbele voordelen van de hoge doorvoer van celexperimenten en de overeenkomsten met knaagdierexperimenten16. Dit model wordt gekenmerkt door zijn kleine formaat, hoge paaisnelheid, korte reproductiecyclus en gemak van fokken. Het model kan worden gebruikt in grootschalige synchrone experimenten in celkweekplaten, en de experimentele medicijndosering is klein, de experimentele cyclus is kort, de kosten zijn laag en het hele experimentele proces is gemakkelijk te observeren en te bedienen17. Zebravisembryo's zijn transparant en ontwikkelen zich snel. Daarom kunnen de toxiciteit en teratogene effecten van geneesmiddelen op viscerale weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia direct worden waargenomen onder een microscoop18. De gen-homologie tussen zebravissen en mensen is zo hoog als 85%18. De signaaltransductieroute van zebravissen is vergelijkbaar met die van mensen18. De biologische structuur en fysiologische functie van zebravissen lijken sterk op die van zoogdieren18. Daarom kan een zebravismodel voor drugstests proefdieren bieden die betrouwbaar en volledig toepasbaar zijn op mensen19.
In deze studie gebruikten we de Box-Behnken design-response oppervlaktemethodologie om de hoeveelheid en temperatuur van schapenolie en de frituurtemperatuur die wordt gebruikt in de EF-verwerkingstechnologie te optimaliseren, met de inhoud van icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C en baohuoside I als de evaluatie-indexen. Het zebravismodel werd gebruikt om het effect van een EF-waterextract op de embryonale ontwikkeling van zebravissen voor en na de verwerking te onderzoeken om het verzwakkingseffect van verwerking op EF te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle diergerelateerde experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van de Experiment Ethics Committee van het Chongqing Institute of TCM (proefdierethiek review certificaatnummer: ZJS2022-03).
1. Bepaling van de bioactieve bestanddelen
OPMERKING: De soort die in dit onderzoek werd gebruikt was Epimedium sagittatum en de monsters werden verzameld in Fengdu County, Chongqing. Het monster werd geïdentificeerd als een droog bovengronds deel van E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Spreuk. door onderzoekers van The Institute of Biological Medicine, Chongqing Institute of Traditional Chinese Medicine.
- Bereid de oplossing van het controleproduct door de juiste hoeveelheid van elke referentiestof, namelijk icariïne, epimedine A (EA), epimedine B (EB), epimedine C (EC) en baohuoside I (BI), nauwkeurig af te wegen met behulp van een elektronische analytische balans, en los op in methanol. Bereid hiermee een gemengde referentie-stamoplossing met 381,61 μg/ml icariïne, 124,14 μg/ml EA, 110,24 μg/ml EB, 1091,75 μg/ml EC en 184,98 μg/ml BI.
- Bereid de oplossing van het testproduct door EF door een zeef nr. 3 te pletten. Plaats ongeveer 0,2 g (met behulp van een elektronische analytische balans) gemalen EF in een erlenmeyer met stop, voeg 20 ml verdunde ethanol toe en ultrasoon met een vermogen van 400 W en een frequentie van 50 kHz gedurende 1 uur. Schud goed en ga door een membraanfilter van 0,22 μm om de testoplossing te verkrijgen.
- Voer de chromatografie als volgt uit. Gebruik high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) met een C18-kolom met afmetingen van 4,6 mm x 250 mm en een binnendiameter van 5 μm. Gebruik acetonitril als mobiele fase A en ultrapuur water als mobiele fase B. Gebruik de volgende gradiëntrelutieparameters: 0-30 min, 24% A tot 26% A; 30-31 min, 26% A tot 45% A; 31-45 min, 45% A tot 47% A. Gebruik een detectiegolflengte van 220 nm (voor de gebruikte detector, zie Materiaaltabel). Houd de kolomtemperatuur op 30 °C en de stroomsnelheid op 1,0 ml/min en gebruik een monstergrootte van 10 μl.
- Om de lineaire relatie te onderzoeken, gebruikt u de gemengde referentieoplossing zoals in stap 1.1 verdund 2 keer, 4 keer, 8 keer, 16 keer en 32 keer, voor respectievelijk icariin, EA, EB, EC en BI. Gebruik acetonitril als mobiele fase A en ultrapuur water als mobiele fase B.
- Gebruik de volgende gradiëntrelutieparameters: 0-30 min, 24% A tot 26% A; 30-31 min, 26% A tot 45% A; 31-45 min, 45% A tot 47% A. Gebruik een detectiegolflengte van 220 nm (voor de gebruikte detector, zie Materiaaltabel). Houd de kolomtemperatuur op 30 °C en de stroomsnelheid op 1,0 ml/min en gebruik een monstergrootte van 10 μl. Noteer ten slotte de piekgebieden. Plot de lineaire regressie met de referentieconcentratie (x-as, μg/ml) als abscis en het piekoppervlak (y-as) als ordinaat met behulp van professionele software (zie Materiaaltabel).
- Voer de precisietest uit door de gemengde regeloplossing zes keer achtereen te meten met HPLC met behulp van de chromatografische omstandigheden die worden weergegeven in stap 1.3. Noteer de detectietijd en piekgebieden van elke chemische samenstelling en bereken de relatieve standaardafwijkingen (RSD) van de piekgebieden om de precisie (reproduceerbaarheid) te beoordelen met behulp van de onderstaande formule:
RSD% = standaardafwijking (SD)/rekenkundig gemiddelde van de berekende resultaten (X) x 100 % - Om de reproduceerbaarheidstest uit te voeren, weegt u het EF-poeder nauwkeurig en bereidt u zes delen van de testproductoplossing parallel volgens de methode in stap 1.2. Onderwerp de bereide oplossingen aan HPLC onder de chromatografische omstandigheden in stap 1.3. Noteer de retentietijden en piekgebieden van elke chemische samenstelling en bereken de hoeveelheden van elke verbinding op basis van een standaardcurve (piekgebieden versus concentraties). Bereken de RSD% zoals hierboven.
- Bewaar de testoplossingen bij kamertemperatuur en meet de inhoud ervan volgens de in stap 1.3 beschreven HPLC-methode om 0 uur, 2 uur, 4 uur, 8 uur, 12 uur en 24 uur na bereiding de stabiliteit te beoordelen. Noteer de retentietijden en piekgebieden van elke chemische samenstelling en bereken de RSD% van de piekgebieden zoals hierboven.
- Om de monsterterugwinningstest uit te voeren, weegt u 0,2 g EF-poeder in een erlenmeyer met stop gedurende zes replicaties. Voeg een passende hoeveelheid van de referentieoplossing toe (de hoeveelheid referentiestof die aan het monster wordt toegevoegd, is gelijk aan 100% van de bekende inhoud van het monster) en bereid de testoplossing volgens de in stap 1.2 beschreven methode.
- Injecteer de monsters in de chromatograaf en analyseer volgens de chromatografische omstandigheden in stap 1.3. Noteer de piekgebieden en bereken de gemiddelde herstel- en RSD%-waarden zoals hieronder:
Spiked sample recovery rate = (spiked sample content − sample content)/sample amount x 100%
2. Optimalisatie van de EF-technologie voor de verwerking van schapenolie met behulp van de Box-Behnken design-response oppervlaktemethodologie
- Selecteer de belangrijkste parameters in EF-verwerking, zoals de hoeveelheid schapenolie (A; 15%-35%), de schapenolietemperatuur (B; 50-120 °C) en de frituurtemperatuur (C; 80-300 °C), als invloedrijke factoren. Gebruik de uitgebreide scores van icariin-, EA-, EB-, EC- en BI-inhoud als evaluatie-indexen. Het percentage schapenolie is hier het massapercentage.
- Gebruik de responsoppervlakanalysesoftware (zie materiaaltabel) om de Box-Behnken-responsoppervlakexperimenten te ontwerpen, het kwadratische responsoppervlak te verkennen en een tweede-orde polynomiaal model te construeren. Selecteer het nieuwe Box-Behnken-ontwerp en stel de optie Numerieke factoren in op 3; stel de factoren A, B en C in. Klik op Doorgaan. Stel de optie Reacties in op 1 (wat de uitgebreide score was). Klik op Doorgaan om het ontwerp te voltooien. In totaal waren 17 experimenten gepland (zie tabel 1).
OPMERKING: Voor de onafhankelijke en afhankelijke variabelen, samen met hun lage, middelste en hoge niveaus, zie tabel 2. - Verwerk de EF volgens de specifieke parameters in tabel 1; weeg bijvoorbeeld voor order nummer 1 geraffineerde schapenolie af als 15% v/v en verwarm vervolgens tot 50 °C om het te smelten. Voeg de ruwe EF toe aan het gesmolten schapenvlees, roerbak boven een zacht vuur (190 °C) tot het gelijkmatig glanzend is en verwijder en laat afkoelen. 17 experimentele operaties uitgevoerd. In dit werk werden in totaal 17 groepen EF-verwerkte producten verkregen.
OPMERKING: Schapenolie is vast bij kamertemperatuur (25 °C) en smelt bij verhitting tot vloeistof. Schapenolie in vloeibare toestand kan worden gebruikt als hulpstof. - Bereid de testoplossingen van de verwerkte producten volgens de in stap 1.2 beschreven methode. Analyseer ze vervolgens met HPLC volgens de chromatografische omstandigheden beschreven in stap 1.3. Noteer de retentietijden en piekgebieden van elke chemische samenstelling en bereken de inhoud van de icariin, EA, EB, EC en BI in elke testoplossing tegen een externe standaardcurve. Gebruik de uitgebreide scoreberekeningsformule hieronder om de uitgebreide scores van de 17 experimentele groepen te berekenen:
Uitgebreide score = Z/Z max × 0,5 + BI/BImax × 0,5
waarbij Z de som is van de icariin-, EA-, EB- en EC-inhoud; Zmax is de maximale waarde van de som van de icariin-, EA-, EB- en EC-gehalten in de 17 experimentele groepen; BI is de BI-inhoud; en BImax is de maximale waarde van de BI-inhoud in de 17 experimentele groepen. - Importeer de uitgebreide scoreresultaten voor de 17 groepen experimenten in de data-analysesoftware (zie Materiaaltabel) om de experimentele gegevens te analyseren. Selecteer onder de evaluatie-items de kwadratische procesvolgordeoptie en de polynomiale modeltypeoptie.
3. Testen van het effect van verwerking op de embryonale ontwikkeling van zebravissen
- Monstervoorbereiding
- Plet de ruwe en verwerkte EF door een zeef nr. 3 (zie materiaaltabel). Voeg aan 100 g van elk EF-monster 1.000 ml ultrapuur water toe. Week de EF gedurende 0,5 uur, kook het water twee keer gedurende 30 minuten elk en filtreer vervolgens met filtreerpapier.
- Combineer de filtraten en concentreer het monster door verhitting. Voeg ultrapuur water toe aan een eindvolume van 100 ml om de verwerkte EF (PEF, 1 g/ml) en de ruwe EF (CEF,1 g/ml) stamoplossingen te verkrijgen. Meet de hoeveelheid ruw geneesmiddel in elke stockoplossing.
- Plaats aliquots van 1 ml, 1,5 ml, 2,5 ml, 5 ml en 7,5 ml stamoplossingen in maatkolven van 10 ml en voeg vervolgens ultrapuur water toe aan het volume om de testoplossingen te bereiden met concentraties van 100 mg / ml, 150 mg / ml, 200 mg / ml, 250 mg / ml, 500 mg / ml en 750 mg / ml voor het onderzoek naar embryotoxiciteit van zebravissen.
OPMERKING: De concentraties van de testoplossingen werden bereid door te verwijzen naar de relevante literatuur 20,21 en door voorbereidende experimenten uit te voeren om de10-voudige concentratiegradiënt te geven die in de normale toxicologie wordt gebruikt. CEF was een onbewerkt monster en PEF was een monster dat was bereid met de beste verwerkingstechnologie zoals beschreven in punt 2.
- Zebravishouderij en embryobehandeling21
- Pas wilde zebravissen (zie materiaaltabel) gedurende 2 dagen aan bij een gecontroleerde temperatuur, houd ze in een doorstroomaquarium met een pH van 7,0-7,4 en voer ze twee keer per dag.
OPMERKING: De remming van melaninevorming bij zebravissen werd bereikt door 1-fenyl-2-thioureum in een concentratie van 0,003% (massa/volume) toe te voegen aan het kweekmedium, dat hun lichaam transparant hield voor morfologische observatie. - Selecteer 's avonds volwassen vruchtbare zebravissen van het wilde type en scheid ze door schotten in paringsdozen te gebruiken. Verwijder de schotten de volgende ochtend en laat de vis 30 minuten paaien. Verzamelde de bevruchte eieren met een druppelaar om de 15 minuten. In totaal werden 520 gezonde wild-type embryo's verzameld. Bewaar de zebravisembryo's gedurende 24 uur in een broedmachine bij 28,5 °C.
- Wijs de gezonde embryo's willekeurig toe op 24 uur na de bevruchting (hpf) aan 13 groepen en week samen met één controlegroep afzonderlijk 10 ml van elk van de volgende oplossingen in een kweekschaal: PEF: 100 μg / ml, 150 μg / ml, 200 μg / ml, 250 μg / ml, 500 μg / ml, 750 μg / ml; CEF: 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml. Behandel de lege controlegroep met het medium als oplossing. Elke groep bevatte 40 embryo's in deze studie.
OPMERKING: De mediumsamenstelling is 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na 2 HPO 4, 0,45 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO 4 en 4 mM NaHCO3. - Kweek de zebravis in een incubator met constante temperatuur voor maximaal 120 pk. Tel elke dag het aantal dode larven, observeer de belangrijkste orgaanmorfologie van de larven in elke experimentele groep onder een stereomicroscoop (schaalbalk = 500 μm, zie Materiaaltabel) en bereken de halfdoodconcentratie (LC50) van zebravissen bij 72 hpf met behulp van data-analysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Pas wilde zebravissen (zie materiaaltabel) gedurende 2 dagen aan bij een gecontroleerde temperatuur, houd ze in een doorstroomaquarium met een pH van 7,0-7,4 en voer ze twee keer per dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten methodologisch onderzoek
Er werd een lineair verband waargenomen tussen de concentratie van icariin, EA, EB, EC, BI en chromatografische piekgebieden (zie tabel 3). De RSD%-waarden (n = 6) van de chromatografische piekgebieden van icariin, EA, EB, EC en BI waren respectievelijk 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% en 1,06%, wat aangeeft dat de precisie van de HPLC-metingen goed was. De RSD%-waarden (n = 6) van de inhoud van icariin, EA, EB, EC en BI waren respectievelijk 1,59%, 1,46%, 1,86%, 2,29% en 0,98%, wat aangeeft dat de methode een goede herhaalbaarheid had. De RSD%-waarden (n = 6) van de piekgebieden van icariin, EA, EB, EC en BI in de monsters waren respectievelijk 1,49%, 1,96%, 1,42%, 0,96% en 0,81%, wat aangeeft dat de monsteroplossing binnen 24 uur stabiel was. De gemiddelde herstelpercentages van icariin, EA, EB, EC en BI waren respectievelijk 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% en 100,94%, en de RSD%-waarden waren respectievelijk 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% en 1,47% (zie tabel 4). Deze resultaten tonen aan dat de nauwkeurigheid van de methode aan de eisen voldeed.
De bovenstaande experimentele resultaten toonden aan dat de analysemethode resultaten opleverde die een uitstekende precisie, reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid hadden en aanvaardbaar waren voor de kwaliteitsanalyse van de EF-verwerkte producten.
Optimalisatie van de schapenolieverwerkingstechnologie van EF door toepassing van de Box-Behnken design-response oppervlaktemethodologie
We hebben kwadratische polynomiale regressieaanpassing van de bovenstaande gegevens uitgevoerd om het volgende model te verkrijgen: Y = 0,86 − 0,11 x A + 0,025 x B − 0,078 x C − 0,023 x A x B − 0,037 x A x C + 0,037 x B x C − 0,045 x A 2 + 2,5 x 10-3 x B 2 − 0,14 x C 2. De variantieanalyse gaf een waarde van P < 0,01, wat aangeeft dat het model significant was. De P-waarde van het gebrek aan pasvorm was P > 0,05, wat aangeeft dat het gebrek aan pasvorm niet significant was. De R2-waarde was 0,9300, wat aangeeft dat de pasvorm van het model goed was en de fout klein was. Het was mogelijk om dit model te gebruiken om het effect van de chemische samenstellingsgehalte van de EF geroerbakt met schapenolie te analyseren en te voorspellen. Bovendien hadden A 2 en D2 een effect op de inhoud van de verwerkte producten en was het verschil statistisch significant (P < 0,01). De effecten van A en C van de eengraadsterm en C2 van de tweede-ordeterm op de totaalscore waren significant. De term B van één graad, de tweede orde A 2, B2 en alle interactie-items hadden geen significant effect op de uitgebreide score. Uit de analyse van de P-waarden bleek dat van de experimentele parameters de hoeveelheid schapenolie (A) het grootste effect had op de uitgebreide score, gevolgd door de frituurtemperatuur (C) en vervolgens de schapenolietemperatuur (B). Bovenstaande resultaten zijn weergegeven in tabel 5.
De software werd gebruikt om de hoeveelheid schapenolie, de temperatuur van schapenolie en de frituurtemperatuur in te stellen op de medianen en om de uitgebreide score als index te gebruiken om een invloedsdiagram met één factor van één factor te tekenen (figuur 1). Het verhogen van de frituurtemperatuur verhoogde eerst de uitgebreide score en verlaagde deze vervolgens (figuur 1). De temperatuur van de schapenolie had een verwaarloosbaar effect op de uitgebreide score. De hoeveelheid schapenolie was de belangrijkste belangrijke factor die de verandering in de uitgebreide score beïnvloedde, en naarmate de hoeveelheid toenam, daalde de inhoud.
Om de resultaten beter te begrijpen, worden de voorspelde modellen in figuur 2 gepresenteerd als 3D-responsoppervlakplots. In termen van de helling van het responsoppervlak, hoe groter de betekenis van het interactie-effect tussen factoren, hoe zachter de helling en hoe minder significant het effect. Een ellips in de vorm van een contourlijn duidt op een sterke interactie tussen factoren, terwijl een cirkel het tegenovergestelde aangeeft. Het responsoppervlak van de hoeveelheid schapenolie en de frituurtemperatuur was steiler in vergelijking met de andere geteste factoren, en de contourlijnen waren meestal elliptischer (zie figuur 2C,D), wat aangeeft dat de interactie tussen deze twee factoren significanter was; daarentegen waren de interacties tussen andere factoren niet significant (zie figuur 2A,B,E,F).
De optimale schapenolieverwerkingstechnologie van EF werd als volgt geselecteerd: een hoeveelheid schapenolie van 15%; een temperatuur van schapenolie van 120 °C; en een frituurtemperatuur van 189 °C. Aangezien de temperatuur in de praktijk niet zeer nauwkeurig kan worden geregeld, wordt de temperatuurwaarde gespecificeerd als een variabele ±10 °C. Daarom waren de uiteindelijke parameters als volgt: een hoeveelheid schapenolie van 15%; een schapenolietemperatuur van 120 °C ± 10 °C; en een frituurtemperatuur van 189 °C ± 10 °C. Het optimale proces was als volgt: de schapenolie verwarmen op 120 °C ± 10 °C, de ruwe EF toevoegen, braden met een zacht vuur (189 °C ± 10 °C) tot het gelijkmatig glanzend is, en verwijderen en afkoelen. Voor elke 100 kg EF moet 15 kg schapenolie (geraffineerde olie) worden gebruikt. Met behulp van deze omstandigheden werden drie parallelle experimenten uitgevoerd en de verkregen scores waren 0,96, 0,97 en 0,94 (RSD% = 1,60%), wat wijst op stabiele en haalbare omstandigheden. De typische HPLC-chromatogrammen van de ruwe, verwerkte en gemengde referentiestoffen van EF zijn weergegeven in figuur 3.
Test van het effect van verwerking op de embryonale ontwikkeling van zebravissen
De zebravis kwam uit in juvenielen bij 72 pk. De ontwikkeling van elk orgel was in principe voltooid. De vislichamen bleven transparant en het was gemakkelijk om ze op hun kant op de glazen glijbaan te leggen. De vormen van de organen waren gemakkelijk te observeren en te identificeren wanneer ze onder een microscoop werden bekeken. De blanco controlegroep ondervond geen sterfte of orgaantoxiciteit tijdens de toedieningsperiode. Vergeleken met de controlegroep werden bij een geneesmiddelconcentratie van 100 μg/ml geen duidelijke afwijkingen gevonden in de ruwe EF-groep (S) en de verwerkte groep (P) bij 72 hpf. Bij 96 pk en later kwamen zwemblaasonvolledigheid en verlies van de zwemblaas vaker voor bij de jonge vissen in de ruwe groep, maar waren zeldzaam bij de jonge vissen in de verwerkte groep. Bij een geneesmiddelconcentratie van 150 μg / ml werden duidelijke spinale misvormingen, lichaamskrommingsmisvormingen, pericardoedeem en leververvorming waargenomen bij de jonge vissen in de ruwe groep bij 72 hpf, maar die veranderingen waren zeldzaam bij de jonge vissen in de verwerkte groep en de mate van teratogeniteit was zwakker dan die van de ruwe groep. Bij een medicijnconcentratie van 200 μg / ml stierven alle jonge vissen in de ruwe groep en duidelijke teratogeniciteit verscheen in de jonge vissen in de verwerkte groep. Bij een medicijnconcentratie van 250 μg/ml overleefde een klein aantal zebravissen in de verwerkte groep. De microscopische onderzoeksresultaten van de zebravis zijn weergegeven in figuur 4.
De sterftecijfers van zebravissen in de ruwe en verwerkte Epimedium-kruidengroepen waren afhankelijk van de concentratie en het tijdstip van toediening. De relatie tijd-dosis-mortaliteit is weergegeven in figuur 5. De zebravissterfteresultaten toonden aan dat 24 uur na toediening (48 hpf), bij een medicijnconcentratie van 200 μg / ml, alle zebravissen in de ruwe medicijngroep stierven, terwijl de mortaliteit in de verwerkte groep slechts 6,67% was. 48 h na EF-toediening (72 hpf) was de concentratie die de dood van alle zebravissen in de ruwe geneesmiddelengroep veroorzaakte 200 μg / ml en de concentratie die de dood van alle zebravissen in de verwerkte groep veroorzaakte 500 μg / ml. De mediane letale concentratie van de twee experimentele groepen bij 72 hpf werd berekend. De resultaten toonden aan dat de LC50 (zie figuur 6) 151,3 μg/ml was in de ruwe groep (S) en 219,8 μg/ml in de verwerkte groep (P).
Figuur 1: Univariate analyse. De figuur toont het single-factor invloedsdiagram. A is het single-factor resultaat van de hoeveelheid schapenvlees (suèt) olie; B is het single-factor resultaat van de temperatuur van de schapen(suèt)olie; en C is het resultaat van de frituurtemperatuur. Bij een stijgende frituurtemperatuur neemt de uitgebreide score eerst toe en neemt vervolgens af. De schapenolietemperatuur heeft weinig effect op de score. De hoeveelheid schapenolie was de belangrijkste belangrijke factor die de verandering in de uitgebreide score beïnvloedde, en de inhoud vertoonde een neerwaartse trend met een toenemende hoeveelheid schapenolie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Responsoppervlak en contourplot van de invloed van verschillende factorinteracties op de totaalscore. (A) Deze figuur toont een 3D-responsoppervlakplot van de interactie tussen de hoeveelheid schapenolie en de temperatuur. (B) Deze figuur toont een contourgrafiek van de interactie tussen de hoeveelheid schapenolie en de temperatuur. (C) Deze figuur toont een 3D-responsoppervlakdiagram van de interactie tussen de hoeveelheid schapenolie en de verwerkingstemperatuur. (D) Deze figuur toont een contourgrafiek van de interactie tussen de dosering van schapenolie en de verwerkingstemperatuur. (E) Deze figuur toont een 3D-responsoppervlakdiagram van de interactie tussen de hoeveelheid schapenolie en de verwerkingstemperatuur. (F) Deze figuur toont een contourgrafiek van de interactie tussen de hoeveelheid schapenolie en de verwerkingstemperatuur. Het resultaat toont aan dat het responsoppervlak van de hoeveelheid schapenolie en de frituurtemperatuur steil was dan de andere geteste parameters en dat de contourlijnen meestal elliptisch waren (zie C,D), wat aangeeft dat de interactie tussen deze twee factoren significant was, terwijl de interacties tussen andere factoren niet significant waren (zie A,B,E, F). De in de figuur gebruikte term suètolie verwijst naar schapenolie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: HPLC-chromatogrammen van de ruwe, verwerkte en gemengde referentiestoffen van EF. (A) Deze figuur toont het HPLC-chromatogram van de gemengde referentiestof. (B) Deze figuur toont het HPLC-chromatogram van ruw Epimedii-folium. (C) Deze figuur toont het HPLC-chromatogram van epimedii folium verwerkte producten. Deze drie foto's laten zien dat het BI-gehalte in raw EF laag is, terwijl het na verwerking toeneemt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Microfoto's van zebravissen. Deze figuur toont microfoto's van de zebravis. (A) Deze figuur toont de resultaten voor de waarneming van de zebravis onder een microscoop in de blanco groep. (B) Deze figuur toont de resultaten voor de waarneming van de zebravis onder een microscoop in de ruwe groep. (C) Deze figuur toont de resultaten voor de waarneming van de zebravis onder een microscoop in de verwerkte groep. De blanco controlegroep ondervond geen sterfte of orgaantoxiciteit tijdens de toedieningsperiode. Bij een EF-geneesmiddelconcentratie van 150 μg / ml werden duidelijke spinale misvormingen, lichaamskromming, pericardoedeem en leververvorming waargenomen bij de jonge vissen in de ruwe groep bij 72 hpf, terwijl die veranderingen zeldzaam waren bij jonge vissen in de verwerkte groep, en de mate van teratogeniteit was zwakker dan die in de ruwe groep. Bij een medicijnconcentratie van 200 μg / ml stierven alle jonge vissen in de ruwe groep en verscheen duidelijke teratogeniciteit in de verwerkte groep. Bij een medicijnconcentratie van 250 μg/ml overleefde slechts een klein aantal zebravissen in de verwerkte groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De doseringstijd-dosis-mortaliteitsrelatie. Deze figuur toont de doseringstijd-dosis-mortaliteitsrelatie. (A) Deze figuur toont de relatie tussen doseringstijd, dosis-mortaliteit van de ruwe groep. (B) Deze figuur toont de relatie tussen doseringstijd-dosis-mortaliteit van de verwerkte groep. n = 40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: LC50-diagram van ruwe en verwerkte EF. Het LC50-diagram van de ruwe en verwerkte EF wordt weergegeven. De mediane letale concentraties van de twee experimentele groepen bij 72 hpf werden berekend. De LC50 was 151,3 μg/ml in de ruwe groep (S) en 219,8 μg/ml in de verwerkingsgroep (P). n = 40. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Experimenteel ontwerp en de Box-Behnken response surface methode resultaten van de 17 groepen experimenten. Tabel 1 toont de 17 groepen experimenten ontworpen door de Box-Behnken design-response surface methode en hun uitgebreide scoreresultaten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Variabelen gebruikt in het Box-Behnken ontwerp. De onafhankelijke en afhankelijke variabelen worden hier vermeld, samen met hun lage, middelste en hoge niveaus. Het Box-Behnken-ontwerp maakte het mogelijk om de meest invloedrijke factoren in de EF-verwerking te identificeren, met de hoeveelheid schapenolie (A) (15% -35%), de temperatuur van schapenolie (B) (50 °C-120 °C) en de frituurtemperatuur (C) (80 °C-300 °C) als beïnvloedende factoren. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Regressievergelijkingen en lineaire bereiken van de chemische bestanddelen van EF. De resultaten van de regressievergelijking en het lineaire bereik van de chemische samenstelling van EF laten zien dat er een goede lineariteit was tussen elk van de concentraties van icariin, EA, EB, EC en BI en hun chromatografische piekgebieden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Testpercentages voor monsterherstel. De gemiddelde herstelpercentages van icariin, EA, EB, EC en BI waren respectievelijk 99,98%, 100,14%, 100,09%, 100,75% en 100,94%, en de RSD%-waarden waren respectievelijk 0,56%, 0,78%, 0,84%, 1,10% en 1,47%. De resultaten laten zien dat de nauwkeurigheid van de methode geschikt was. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5: Regressiecoëfficiënten van het voorspelde kwadratische model. De P-waarde van het model was P < 0,01, wat aangeeft dat het model significant was. De P-waarde van het gebrek aan pasvorm was P > 0,05, wat aangeeft dat het gebrek aan pasvorm niet significant was. De R2-waarde was 0,9300, wat aangeeft dat de pasvorm van het model goed was en de fout klein was, dus het model was geschikt voor het analyseren en voorspellen van het effect van de chemische samenstellingsinhoud van de EF geroerbakt met schapenolie. Bovendien hadden A 2 en D2 significante effecten op het gehalte aan verwerkte producten (P < 0,01). De invloeden van A en C van de eengraadsterm en C2 van de tweede-ordeterm op de totaalscore waren significant. De term B van één graad, de tweede orde A 2, B2 en alle interactie-items hadden geen significante effecten op de uitgebreide score. Uit de analyse van de P-waarde bleek dat van de experimentele parameters de hoeveelheid schapenolie (A) de grootste invloed had op de totaalscore, gevolgd door de frituurtemperatuur (C) en vervolgens de temperatuur van de schapenolie (B). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onafhankelijke variabelen en de bepaling van hun niveaus
De EF-verwerkingstechnologie wordt alleen beschreven in de 2020-editie van de Chinese Farmacopee en de lokale Chinese medicijnverwerkingsspecificaties die zijn gepubliceerd door 26 provincies, gemeenten en autonome regio's in het hele land1. De beschrijving omvat de volgende stappen: schapenolie nemen en verwarmen om te smelten, EF-snippers toevoegen, roerbakken met een langzaam vuur tot het uniform en glanzend is, het eruit halen en laten afkoelen. Bovendien wordt 20 kg (afgekort als 20%) schapenolie (geraffineerd) gebruikt voor elke 100 kg Epimedium. De parameters van het verwerkingsproces van EF zijn echter niet gespecificeerd. Onder de onafhankelijke variabelen in dit experiment konden drie belangrijke factoren in het productieproces worden gekwantificeerd: de dosering van schapenolie, de temperatuur van schapenolie en de frituurtemperatuur. Het waardebereik moet worden ingesteld volgens de bovenstaande beschrijving. Uit de resultaten van de voorlopige test kan worden afgeleid dat wanneer de hoeveelheid schapenolie 15% is, de EF-bladeren gelijkmatig kunnen worden bedekt met schapenolie. Wanneer de dosering hoger is dan 35%, is er te veel schapenolie. Ten slotte moet het bereik van de hoeveelheid schapenolie 15% -35% zijn. Wanneer de temperatuur 50 °C bereikt, smelt schapenolie. Wanneer de temperatuur >120 °C bereikt, begint de schapenolie te roken en is de temperatuur te hoog. Daarom moet het temperatuurbereik van de schapenolie 50 °C-120 °C zijn. De Chinese Farmacopee 2020-editie bepaalt dat EF met een langzaam vuur moet worden geroerbakt. Het langzame vuur mag niet hoger zijn dan 200 °C en de frituurtemperatuur mag variëren van 80 °C-300 °C.
Uitgebreide score
Tijdens de verwerking van Epimedium worden de glycosidische bindingen verbroken en worden de glycosidische componenten omgezet in lagere glycosidische componenten. De bepaling van het gehalte aan EF-verwerkte producten in de 2020-editie van de Chinese Farmacopee is gebaseerd op de bepaling van het totale gehalte aan icariin, EA, EB en EC in de oorspronkelijke geneesmiddelen, en een monoglycosidecomponent, BI, wordt afzonderlijk vermeld als indicator. In dit experiment was het totale gewicht van de icariin, EA, EB en EC in de verwerkte EF 50%, het gewicht van de BI was 50% en de uitgebreide score werd vastgesteld op basis van deze waarden.
Response surface methodology (RSM) is een statistische techniek voor het identificeren van optimale procesparameters en het oplossen van multivariate problemen. In deze techniek wordt een redelijk experimenteel ontwerp gebruikt om bepaalde gegevens te verkrijgen door middel van experimenten, en een multivariate kwadratische regressievergelijking wordt gebruikt om een functionele relatie tussen de factoren en responsen af te leiden22. Uniform ontwerp en orthogonale ontwerpprocesoptimalisatie worden vaak gebruikt, maar hun testnauwkeurigheid is niet hoog en het wiskundige model is niet erg voorspelbaar. Het wiskundige model dat ten grondslag ligt aan RSM is zeer voorspelbaar. RSM vereist minder experimenten en kortere cycli, die niet alleen de problemen in verband met traditionele wiskundige statistieken kunnen elimineren, maar ook de relaties tussen factoren en responsen kunnen verduidelijken23. RSM conceptualiseert de reactie van het systeem als een functie van een of meer factoren en gebruikt grafische technieken om deze functionele relatie weer te geven om de gebruiker te helpen de optimale omstandigheden in het experimentele ontwerp te selecteren door intuïtieve visuele observatie. Deze voordelen hebben geleid tot het brede gebruik van deze methode in de chemische industrie24, biologische engineering, de voedingsmiddelenindustrie25, de farmaceutische industrie en TCM-preparaten.
Hoewel RSM de functionele relatie tussen responsen (te onderzoeken indexen) en factoren (onafhankelijke variabelen) kan identificeren, zijn niet alle experimenten geschikt voor optimalisatie van het responsoppervlak omdat er niet altijd een sterke functionele relatie is tussen de respons en factoren. RSM verkrijgt vaak continue functierelaties, die vereisen dat alle factoren continue variabelen zijn. Toch zijn niet alle te onderzoeken factoren continue variabelen of hebben ze significante effecten op de responswaarden aan het begin van het experimentele ontwerp. Om het aantal experimenten te verminderen en de nauwkeurigheid van de responsoppervlakmodellering te verbeteren, is screening nodig om de significante factoren te selecteren en hun niveaus te bepalen door middel van factoriaal ontwerp, uniform ontwerp of orthogonaal ontwerp voordat de methodologie voor het ontwerpen van responsoppervlakken wordt uitgevoerd. Het grootste voordeel van responsoppervlakmethodologie is dat zodra het model correct is vastgesteld, de responswaarde onder elke combinatie van omstandigheden kan worden voorspeld en de functionele relatie intuïtiever en visueler kan worden gezien via het 3D-responsoppervlak. Deze visualisatie is van grote hulp voor onderzoekers bij het vinden van de optimale verwerkingsomstandigheden26.
Deze studie gebruikte het Box-Behnken-ontwerpprincipe van RSM om 17 gecombineerde experimenten te ontwerpen met de uitgebreide chemische inhoudsscore van EF als responswaarde. Ten slotte werden de beste procesoptimalisatieresultaten verkregen door regressieanalyse. De verwerkingstechnologie werd als volgt geoptimaliseerd: de schapenolie verwarmen bij 120 °C ± 10 °C, de ruwe EF toevoegen, frituren met een zacht vuur (189 °C ± 10 °C) tot het gelijkmatig glanzend is, en vervolgens verwijderen en afkoelen. Voor elke 100 kg EF moet 15 kg schapenolie (geraffineerde olie) worden gebruikt. Onze resultaten toonden aan dat het EF-proces stabiel, betrouwbaar en herhaalbaar was. Bovendien werden factorinteracties geanalyseerd en de interactie tussen de hoeveelheid schapenolie en de frituurtemperatuur, maar niet de interacties tussen andere factoren, was significant. Deze studie toonde aan dat het ontwerp van het responsoppervlak, als een methode om de interacties tussen factoren en de relaties tussen factoren en hun responsoppervlakwaarden te analyseren, de optimalisatie van de verwerkingsomstandigheden in een korte periode met een minimaal aantal experimenten mogelijk maakte. De geselecteerde factoren in deze studie waren de belangrijkste factoren die werden geïdentificeerd in het single-factor screeningexperiment en hun niveaus werden bepaald in een voorlopig experiment. De testmonsters voldeden aan de kenmerken van de responsoppervlakmethode, zodat de studie de responsoppervlakmethodologie kon gebruiken om een voorspellend model op te stellen. De experimentele resultaten kunnen een referentie zijn voor het verbeteren van de kwaliteit en uniformiteit van de verwerkte EF.
Zebravisembryo's worden gebruikt als modelorganismen op het gebied van ontwikkelingsgenetica omdat ze transparant zijn, zich in vitro ontwikkelen en gemakkelijk waarneembaar zijn27. Veelgebruikte toxiciteitsindicatoren voor zebravissen in ontwikkelingstoxiciteitsstudies omvatten embryonale mortaliteit, embryonale misvorming, dooierzakoedeem, pigmentvorming, eicondensatie, staartverlenging, kopmorfologie en lichaamssegmentvorming, onder andere28. Vergeleken met evaluatietechnieken voor de toxiciteit van zoogdieren is de specificiteit van zebravisembryo's voor detectie van toxiciteit van verbindingen 70% -80% en de gevoeligheid is hoger dan 80% 18. Ton et al.29 vonden dat de nauwkeurigheid van het evalueren van de ontwikkelingstoxiciteit van niet-teratogene verbindingen met zebravisembryo's 75% was. Teratogene verbindingen werden hier met 100% nauwkeurigheid geëvalueerd. Hoewel TCM de kenmerken heeft van complexe componenten en onduidelijke doelorganen van toxiciteit, kunnen zebravisembryo's nog steeds worden gebruikt als een experimenteel diermodel voor de nauwkeurige en snelle evaluatie van ontwikkelingstoxiciteit. He et al.30 vonden dat emodin de overlevings- en broedsnelheden van zebravisembryo's beïnvloedde, waardoor stambuiging en dooierzakoedeem ontstonden. Chen et al.31 vonden dat muscone zebravisembryo-pericardiaal oedeem, spinale kromming en dooierzakoedeem veroorzaakte. He et al.32 vonden dat Arnebiae Radix dodelijke effecten had op zebravissen in alle ontwikkelingsstadia, en 1,0 mg / L Arnebiae Radix remde de embryonale ontwikkeling, wat resulteerde in een verminderd aantal somites, staartmisvormingen, lichaamsbuiging en verminderde melanine in zebravisembryo's.
Om de effecten van ruwe en bewerkte EF op de ontwikkeling van zebravisembryo's te onderzoeken, werd in deze studie een experimenteel ontwikkelingstoxiciteitsexperiment voor zebravisembryo's uitgevoerd. De gegevens toonden aan dat de LC50-waarden 151,3 μg / ml waren voor de ruwe groep (S) en 219,8 μg / ml voor de verwerkte groep (P). Het observeren van de zebravislichamen in elke experimentele groep door een microscoop toonde een duidelijke mate van zebravisteratogeniteit in de ruwe groep. De meeste vissen vertoonden verschillende gradaties van teratogeniciteit, waaronder spinale misvorming, lichaamskrommingsmisvorming, pericardiaal oedeem, onvolledigheid van de zwemblaas of leververvorming, en deze waarnemingen waren zeldzaam in de verwerkte groep. Deze experimenten toonden aan dat de toxiciteit van EF na verwerking aanzienlijk was verminderd, wat suggereert dat verwerking de toxiciteit van geneesmiddelen bij mensen zou kunnen verminderen. De experimentele resultaten bieden een referentie voor het verbeteren van de klinische medicatieveiligheid van met schapenolie verwerkte EF.
Traditionele Chinese geneeskunde suggereert dat de functie van de nier nauw verbonden is met de groei, ontwikkeling en reproductie van het menselijk lichaam33. De oude boeken van de traditionele Chinese geneeskunde vermelden dat de nier het beenmerg van het lichaam is. De nier slaat essentie op en het merg bevindt zich in de botholte om het bot te voeden. Wanneer de nieressentie tekortschiet, wordt het beenmerg verminderd34. De traditionele Chinese geneeskunde van tonificeren van de nier yang kan lumbale zwakte, osteoporose, impotentie, voortijdige ejaculatie en baarmoederkoude onvruchtbaarheidbehandelen 35. EF is een van de representatieve geneesmiddelen voor het tonificeren van de nier yang. Moderne farmacologische studies hebben aangetoond dat EF duidelijke effecten heeft op het skelet, het immuunsysteem, het voortplantingssysteem, het cardiovasculaire systeem en het zenuwstelsel, evenals antitumoreffectenheeft 36. In termen van activiteit op het skelet kan icariin37 het niveau van serum E2 bij ovariëctomie ratten verbeteren en de expressie van ERβ-mRNA in het botweefsel van ovariëctomie ratten upreguleren. De synthese van ERβ wordt verhoogd, waardoor het biologische effect van ER wordt verbeterd, de botresorptieactiviteit van osteoclasten wordt verzwakt en de botvorming van osteoblasten wordt verbeterd. De veranderingen in botresorptie zijn groter dan de negatieve balans van het botmetabolisme. Epimedin A kan de botmicrostructuur en serumbotomzetmarkers bij osteoporosemodelmuizen verbeteren door osteoclastische vorming, differentiatie en botresorptie te remmen en een rol te spelen bij botbescherming38. Epimedin C heeft een duidelijke anti-osteoporose activiteit, voornamelijk in termen van het verhogen van de botmassa en het verbeteren van de trabeculaire microstructuur om uiteindelijk de botsterkte te verhogen39. Andere studies hebben aangetoond dat epimedin B40 en baohuoside I41 anti-osteoporose activiteit hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het Basic Scientific Research Business Project van de Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (projectnummer: jbky20200013), het Performance Incentive Guidance Project van Chongqing Scientific Research Institutions (projectnummer: cstc2021jxjl 130025) en het Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project van Chinese Materia Medica Processing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
References
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , China Medical Science and Technology Press. Beijing, China. (2020).
- Wang, X. T. Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , Nanchang Science and Technology Press. Jiangxi, China. (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -L., Dai, Y. -P., Yan, X. -S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish's embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , Kunming University of Science and Technology. Kunming, China. (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -N., Xu, X. -Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -J., Sun, E., Xu, F. -J., Jia, X. -B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
