Summary
Her beskriver vi en protokoll, den utvidede endotelcellekulturmetoden (EECM), som tillater differensiering av pluripotente stamceller til hjernens mikrovaskulære endotelcelle (BMEC)-lignende celler. Disse cellene viser endotelcelleadhesjonsmolekyluttrykk og er dermed en human blod-hjernebarrieremodell egnet til å studere immuncelleinteraksjoner in vitro.
Abstract
Dysfunksjon av blod-hjernebarriere (BBB) er et patologisk kjennetegn på mange nevrodegenerative og nevroinflammatoriske sykdommer som påvirker sentralnervesystemet (CNS). På grunn av den begrensede tilgangen til sykdomsrelaterte BBB-prøver, er det fortsatt ikke godt forstått om BBB-funksjonsfeil er årsaksmessig for sykdomsutvikling eller snarere en konsekvens av den nevroinflammatoriske eller nevrodegenerative prosessen. Humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs) gir derfor en ny mulighet til å etablere in vitro BBB-modeller fra friske donorer og pasienter, og dermed studere sykdomsspesifikke BBB-karakteristika fra individuelle pasienter. Flere differensieringsprotokoller er etablert for å utlede hjernemikrovaskulære endotelceller (BMEC)-lignende celler fra hissc. Vurdering av det spesifikke forskningsspørsmålet er obligatorisk for riktig valg av den respektive BMEC-differensieringsprotokollen. Her beskriver vi den utvidede endotelcellekulturmetoden (EECM), som er optimalisert for å skille hiPSCs i BMEC-lignende celler med en moden immunfenotype, noe som tillater studiet av immuncelle-BBB-interaksjoner. I denne protokollen differensieres hissc først til endoteliale stamceller (EPC) ved å aktivere Wnt/β-catenin-signalering. Den resulterende kulturen, som inneholder glatte muskellignende celler (SMLC), blir deretter sekvensielt passasjert for å øke renheten av endotelceller (EC) og for å indusere BBB-spesifikke egenskaper. Samkultur av EECM-BMEC med disse SMLC-ene eller betinget medium fra SMLC muliggjør reproduserbart, konstitutivt og cytokinregulert ekspresjon av EC-adhesjonsmolekyler. Det er viktig at EECM-BMEC-lignende celler etablerer barriereegenskaper som kan sammenlignes med primære humane BMECer, og på grunn av deres uttrykk for alle EC-adhesjonsmolekyler, er EECM-BMEC-lignende celler forskjellige fra andre hiPSC-avledede in vitro BBB-modeller. EECM-BMEC-lignende celler er dermed den valgte modellen for å undersøke den potensielle effekten av sykdomsprosesser på nivået av BBB, med innvirkning på immuncelleinteraksjon på en personlig måte.
Introduction
Den nevrovaskulære enheten (NVU) i sentralnervesystemet (CNS) består av de høyt spesialiserte mikrovaskulære endotelceller (ECs), pericytter innebygd i endotelkjellermembranen samt parenkymal kjellermembran og astrocyttens endeføtter1. Innenfor NVU er hjernens mikrovaskulære endotelceller (BMEC) nøkkelkomponentene som danner blod-hjernebarrieren (BBB). BMEC danner komplekse og kontinuerlige tette kryss og har ekstremt lav pinocytotisk aktivitet sammenlignet med mikrovaskulære ECs i perifere organer, noe som gjør at BBB kan hemme den frie paracellulære diffusjonen av vannløselige molekyler i CNS. Ekspresjonen av spesifikke tilstrømningstransportører og efflukspumper av BMECs sikrer opptak og eksport av henholdsvis næringsstoffer og skadelige molekyler fra CNS2. I tillegg kontrollerer BBB strengt immuncelleinngangen til CNS ved å uttrykke lave nivåer av endoteladhesjonsmolekyler som er avgjørende for immuncelletrafikk i CNS3. Under fysiologiske forhold er ekspresjonsnivåene av adhesjonsmolekyler på overflaten av BMEC, slik som intercellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) og vaskulært celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1), lave, men disse nivåene øker i noen nevrologiske lidelser2. Morfologisk og funksjonell nedbrytning av BBB er rapportert i mange nevrologiske sykdommer, som hjerneslag4, multippel sklerose (MS)5 og flere nevrodegenerative sykdommer 6,7,8. Detaljert undersøkelse av de cellulære og molekylære egenskapene til BMEC under både fysiologiske og patologiske forhold er en tilnærming til å identifisere nye terapeutiske strategier som retter seg mot BBB.
Inntil nylig ble primære eller udødeliggjorte BMEC-er for mennesker og gnagere brukt til å studere BBB. Hvorvidt konklusjoner basert på dyremodeller av BBB er lett anvendelige for den menneskelige BBB er imidlertid uklart, siden uttrykket av flere viktige molekyler, inkludert adhesjonsmolekyler og løsemiddelbærerproteiner, er forskjellig mellom mennesker og gnagere 9,10. Selv om menneskelige BMEC-linjer som hCMEC / D3 uttrykker passende nivåer av adhesjonsmolekyler11, har disse udødeliggjorte BMECene generelt ikke komplekse tette kryss og robuste barriereegenskaper12. Primære menneskelige BMECer er nyttige for å studere barrierefunksjoner13, men de er ikke lett tilgjengelige for alle forskere. Videre kan primære BMECs fra pasienter være vanskelig å få tak i siden de må samles inn gjennom en hjernebiopsi eller kirurgi som bare utføres under spesifikke kliniske forhold.
Nylige fremskritt innen stamcelleteknologi har gjort det mulig å differensiere ulike humane celletyper, som oppstår fra stamcellekilder som humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSCs). De hiPSC-avledede modellene lar oss etablere patofysiologiske modeller ved hjelp av pasientavledede prøver. Flere hiPSC-avledede celletyper kan kombineres for å etablere autologe kokulturer eller organoider som bedre etterligner fysiologiske forhold. Flere mye brukte protokoller 14,15,16,17,18,19 kan brukes til å differensiere hiPSC-avledede BMEC-lignende celler som har robuste diffusjonsbarriereegenskaper med ekspresjonen av BBB-spesifikke transportører og efflukspumper, og er nyttige for å studere paracellulær diffusjon av små molekyler, molekylære transportmekanismer og medikamentlevering til hjernen 20,21. Tidligere studier har imidlertid vist at mye brukte hiPSC-avledede BMEC-lignende celler mangler ekspresjon av viktige endoteladhesjonsmolekyler, inkludert VCAM-1, seliner og ICAM-2, som er ansvarlige for å formidle interaksjoner mellom immunceller og BBB22. Videre har tidligere hiPSC-deriverte BMECer blitt rapportert å vise blandede endotel- og epitelegenskaper på transkripsjonsnivå23. Derfor utviklet vi den utvidede endotelcellekulturmetoden (EECM), en ny protokoll som tillater differensiering av hissc i BMEC-lignende celler som ligner primære humane BMECer med hensyn til morfologi, barriereegenskaper og endoteladhesjonsmolekyluttrykk. Denne protokollen beskriver detaljerte metodologiske prosedyrer for å skille hiPSCs til BMEC-lignende celler som viser en moden immunfenotype.
Protocol
Figur 1: Oversikt over protokollen. Manuskriptet presenterer en trinnvis protokoll for å differensiere hiPSCs til EECM-BMEC-lignende celler. De riktige ordningene skildrer cellepopulasjonene på hvert trinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
HiPSC-linjen, HPS1006, ble levert av RIKEN BRC gjennom National Bio-Resource Project i MEXT/AMED, Japan.
1. Induksjon av hiPSC-differensiering i endoteliale stamceller (EPC)
- Ekstracellulære matriks (ECM)-belagte plater og reagenser
- Forbered kjellermembranmatriksbelagte 12-brønnsplater ved å kondensere 2,5 mg matriksgel i 50 ml sentrifugerør for oppbevaring ved -20 °C i opptil 6 måneder. Tilsett 30 ml kald Dulbeccos modifiserte Eagle's medium/næringsstoffblanding F-12 (DMEM/F12), som har blitt oppbevart i kjøleskap (4 °C), i tuben. Bland forsiktig ved pipettering til gelen har tint, og tilsett deretter 500 μL av løsningen til hver brønn på 12-brønnplaten. Plasser platen i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i minst 1 time.
MERK: Kjellermembranmatriksgelen er temperaturfølsom og skal håndteres i henhold til produsentens instruksjoner for alikotering og platebelegg. Konsentrasjonen av ekstracellulære matriksproteiner kan variere mellom batcher. For å sikre nøyaktighet bør den nøyaktige konsentrasjonen refereres til på kvalitetssertifikatarket for den spesifikke batchen, ved hjelp av partinummeret. For eksempel, hvis den nøyaktige konsentrasjonen er 10,0 mg / ml, bruk 250 μL gel for totalt 2,5 mg. - Klargjør rhokinasehemmerløsningen (ROCK) ved å løse opp ROCK-hemmeren i sterilt vann til en konsentrasjon på 10 mM (tab 1). Kalk stamløsningen i volum 100-200 μL og oppbevar ved -20 °C for å unngå fryse-tine-sykluser.
- Lag en 100 mg/ml stamløsning av L-askorbinsyre ved å løse opp 5 g L-askorbinsyre i 50 ml sterilt vann og oppbevar ved -20 °C (tabell 1). Tilsett 6,25 ml glutamin og 305 μL L-askorbinsyreoppløsning i 500 ml avansert DMEM/F12 for å lage et LaSR-medium24 (tabell 1). Oppbevares ved 2-8 °C i opptil 2 uker.
- Klargjør CHIR99021 oppløsning ved å oppløse CHIR99021 i ufortynnet dimetylsulfoksid (DMSO) til en endelig konsentrasjon på 10 mM (tabell 1). Aliquot oppløsningen i 100-200 μL volum for å unngå fryse-tine sykluser og lagre ved -20 ° C i opptil 1 år. Oppbevar arbeidsalikoter av stamløsningen ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Forbered DMEM / F12-10 medium ved å tilsette 50 ml varmeinaktivert føtal bovint serum til 450 ml DMEM / F12. Oppbevar mediet ved 2-8 °C i opptil 1 måned (tabell 1).
- Forbered strømningsbuffer-1 ved å tilsette 33,3 ml 7,5 % bovint serumalbumin (BSA) til 467 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (PBS) (tabell 1). Oppbevares ved 2-8 °C i opptil 6 måneder.
- Forbered kjellermembranmatriksbelagte 12-brønnsplater ved å kondensere 2,5 mg matriksgel i 50 ml sentrifugerør for oppbevaring ved -20 °C i opptil 6 måneder. Tilsett 30 ml kald Dulbeccos modifiserte Eagle's medium/næringsstoffblanding F-12 (DMEM/F12), som har blitt oppbevart i kjøleskap (4 °C), i tuben. Bland forsiktig ved pipettering til gelen har tint, og tilsett deretter 500 μL av løsningen til hver brønn på 12-brønnplaten. Plasser platen i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i minst 1 time.
- Såing av singulariserte hiPSCs og ekspansjon for EPC-differensiering (dag -3 til dag -1)
- Begynn differensiering når hiPSC-koloniene i en 6-brønnsplate ikke viser spontan differensiering og har passende tetthet for passering, typisk rundt 80% konfluens (2,5-3,5 x 106 celler). Overvåk nøye spontant differensierte celler under mikroskopet for å sikre om det kreves flere passasjer for å eliminere ikke-differensierte celler. Se notatet nedenfor trinn 1.4.15 for informasjon om cellekulturmedium og ekstracellulær matrise.
- Aspirer mediet og tilsett 1 ml dissosiasjonsreagens til brønnene og inkuber i 5-7 minutter ved 37 °C. Dissociere og singularisere cellene ved å pipetere dissosiasjonsreagensløsningen forsiktig over brønnens overflater to eller tre ganger.
- Overfør de frittliggende cellene til et 15 ml rør inneholdende 4 ml hiPSC vedlikeholdsmedium og resuspender cellene grundig. Reserver en 10 μL alikot for celletelling.
- Pellet cellene ved å sentrifugere i 5 min ved 200 x g ved 20-25 °C. Telle cellene og beregne ønsket volum for å oppnå en passende tetthet av hiPSCs (75-400 x 103 per brønn) i en kjellermembranmatrisebelagt 12-brønnsplate (trinn 1.1.1).
- Aspirer beleggløsningen fra brønnene og tilsett 1 ml hiPSC-medium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer i hver brønn (1:1000 fortynning). Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten og dissosierer pelleten i 1 ml hiPSC-medium.
- Legg til det nødvendige volumet av hiPSC, bestemt i trinn 1.2.4, til hver brønn på 12-brønnsplaten. To til fire 12-brønnsplater kan være tilstrekkelig for å skille en hiPSC-klon. Se trinn 1.2.4 for å bestemme antall plater som kreves for såceller.
- Plasser platen i en inkubator (37 ° C, 5% CO2). Fordel cellene jevnt ved å skyve platen forsiktig frem og tilbake og deretter side til side i inkubatoren.
- Neste dag (dvs. dag -2) bytter du ut mediet med 2 ml hiPSC vedlikeholdsmedium som mangler ROCK-hemmer. Neste dag (dag -1) bytter du ut mediet med 2 ml ferskt hiPSC vedlikeholdsmedium.
- Induksjon av EPC med glykogensyntasekinase 3 (GSK-3)-hemmeren CHIR99021 (dag 0 til dag 5)
- På dag 0 erstattes hiPSC vedlikeholdsmediet i hver brønn med 2 ml LaSR medium inneholdende 8 μM CHIR99021.
- På dag 1, aspirer mediet og tilsett 2 ml ferskt LaSR medium inneholdende 8 μM CHIR99021.
- På dag 2, 3 og 4 erstattes mediet med 2 ml ferskt LaSR-medium som mangler CHIR99021.
- Magnetisk aktivert cellesortering (MACS) for å rense CD31+ EPC (dag 5)
- På dag 5 aspirerer du mediet og tilsetter deretter 1 ml dissosiasjonsreagens til hver brønn, før du inkuberer i 6-8 minutter ved 37 °C.
- Dissosiere og singularisere cellene med en mikropipette og passere gjennom en 40 μm cellesil for å filtrere suspensjonen i et 50 ml rør inneholdende 10 ml DMEM / F12-10 medium. Filtrer cellesuspensjonen samlet fra mer enn to 12-brønnsplater i minst to 50 ml rør.
- Stopp fordøyelsesreaksjonen ved å tilsette DMEM / F12-10 medium (opptil 50 ml). Pipett grundig og reserver 10 μL for telling av celler. Pellet cellene ved å sentrifugere i 5 min ved 200 x g ved 20-25 °C.
- Etter fjerning av supernatanten, tilsett 10 ml DMEM/F12-10 medium og overfør cellesuspensjonen til friske 15 ml rør. Pellet cellene ved å sentrifugere i 5 min ved 200 x g ved 20-25 °C.
- Aspirer supernatanten og resuspender i strømningsbuffer-1 ved en tetthet på 1,0 x 107 celler per 100 μL buffer.
- Tilsett FcR-blokkerende reagens i forholdet 1:100 og inkuber i 5 minutter før tilsetning av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-merket CD31-antistoff fortynnet 1:200. Inkuber suspensjonen i 30 minutter i mørket ved 20-25 °C.
- Legg til 10 ml strømningsbuffer-1, reserver 10 μL av suspensjonen for flowcytometrianalyse for å bestemme fraksjonen av CD31+ -celler (figur 2).
- Pellet cellene ved å sentrifugere ved 200 x g i 5 minutter ved 20-25 °C. Fjern deretter supernatanten og resuspender til en tetthet på 1,0 x 107 celler per 100 μL strømningsbuffer-1-løsning. Tilsett FITC-utvalgscocktailen (5 μL per 100 μL cellesuspensjon). Bland godt med pipettering og rug i mørket i 15 minutter ved 20-25 °C.
- Tilsett 5 μL magnetiske nanopartikler per 100 μL cellesuspensjon, pipettebrønn og inkuber i mørket i 10 minutter ved 20-25 °C.
- Overfør cellesuspensjonen til et 5 ml flowcytometrirør og tilsett flowbuffer-1 for å oppnå et totalvolum på 2,5 ml. Plasser flowcytometrirøret i magneten i 5 minutter.
- I en kontinuerlig bevegelse, snu magneten og dekanter cellesuspensjonen som inneholder celler som ikke var merket med FITC-CD31-antistoffet. Hold magneten og røret i omvendt stilling i 2-3 sekunder, og fjern deretter gjenværende væske. Aspirer eventuelle dråper på rørkanten før du returnerer røret til oppreist stilling.
- Plukk opp flowcytometrirøret fra magneten og tilsett 2,5 ml strømningsbuffer-1 for å vaske de gjenværende CD31+ -cellene. Resuspender cellene ved å pipetere cellene forsiktig opp og ned to eller tre ganger. Plasser strømningsrøret i magneten i 5 minutter.
- Gjenta trinn 1.4.11-1.4.12 tre ganger, og deretter trinn 1.4.11 en gang til for totalt fire vask.
- Fjern strømningsrøret fra magneten og tilsett den angitte mengden av et egnet medium (f.eks. humant endotelfritt medium [hECSR] for utvidet EC-kultur eller frysemedium for frysing) til røret for å resuspendere de rensede CD31+ -cellene. Reserver to 10 μL alikoter av suspensjonen, en for celletelling og den andre for å utføre flowcytometrianalyse for å vurdere renheten til CD31+ -celler i post-MACS-prøver (figur 2). Hvis et flowcytometer ikke er tilgjengelig umiddelbart, oppbevares alikoten ved 4 °C inntil analyse.
- Hvis de neste trinnene (gjennom trinn 2) ikke kan utføres umiddelbart, fryser du CD31+ EPC-ene på dette tidspunktet. For utvidelse og selektiv passasje av EPC-er, gå videre til trinn 2.
MERK: Vitronectin25-belagte 12-brønnsplater og det mer stabile hiPSC vedlikeholdsmediet (mTeSR plus) kan brukes i stedet for kjellermembranmatrisebelagte plater og hiPSC vedlikeholdsmedium (mTeSR1). For å forberede vitronektinbelagte 12-brønnsplater, fortynn vitronectin med fortynningsbuffer til en endelig konsentrasjon på 10 μg / ml og overfør deretter 500 μL av den fortynnede løsningen til hver brønn på 12-brønnplatene. La platene stå ved 20-25 °C i minst 1 time. Såtettheten til singulariserte hiPSCer er sammenlignbar med den som brukes til kjellermembranmatrisebelagte plater. Endring av kulturmediet eller matrisesammensetningen kan påvirke spredning og spontan differensiering av hissc, som vanligvis krever 1-2 uker for å tilpasse seg nye kulturforhold. Hvis det mer stabile hiPSC vedlikeholdsmediet brukes til hiPSC-vedlikehold, kan dette mediet brukes til EPC-differensiering i stedet for hiPSC vedlikeholdsmedium. I dette tilfellet bør det mer stabile hiPSC vedlikeholdsmediet skiftes på dag -2 for å fjerne ROCK-hemmeren, og utskiftningen på dag -1 kan hoppes over.
2. Utvidet endotelcellekulturmetode (EECM) for å skille hjernens mikrovaskulære endotelcellelignende celler (BMEC-lignende celler) og glatte muskellignende celler (SMLC)
- Fremstilling av kollagenbelagte plater og reagenser
- Forbered kollagenbelagte 6-brønnsplater ved å oppløse 5 mg krystallisert kollagen type IV i 5 ml sterilt vann. Inkuberes over natten ved 4 °C før væske og oppbevaring ved -20 °C. Fortynn kollagen IV alikoter 1:100 i sterilt vann for å produsere 10 μg / ml løsninger og tilsett 1 ml 10 μg / ml kollagen IV-løsninger til hver brønn i 6-brønnplatene. Inkuber platene i minst 30 minutter ved 37 °C. Platene kan oppbevares ved 37 °C i inntil 1 uke.
- Forbered en stamløsning av human fibroblastvekstfaktor 2 (FGF2) ved å oppløse 500 μg FGF i 5 ml Dulbeccos PBS, tilsett 7,5% BSA til en endelig konsentrasjon på 0,1%, og alikot stamløsningen i 20-200 μL volumer. Disse kan oppbevares ved -20 °C i opptil 3 måneder (tab 1). Stamløsninger kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned. Unngå fryse-tine sykluser. Forbered hECSR-medium ved å tilsette 2 ml B-27-tilskudd og 20 μL FGF2 i 98 ml hECSR-medium (tabell 1). HECSR-mediet kan oppbevares ved 2-8 °C i opptil 2 uker.
- Forbered frysemedium for EPC, EECM-BMEC-lignende celler og SMLC ved å tilsette 15 ml føtal bovint serum, 5 ml DMSO og 25 μL ROCK-hemmerløsning til 30 ml hECSR-medium (tabell 1). Frysemediet kan oppbevares ved 2-8 °C i opptil 2 uker.
- Såing EPC for utvidet endotelcellekultur
- Fjern kollagenoppløsningen fra 6-brønnplatene. Overfør deretter 1,0-2,0 x 10 5 rensede CD31+ EPC i 2 ml hECSR-medium inneholdende5 μM ROCK-hemmer (1:2,000 fortynning). Plasser platen i en inkubator (37 ° C, 5% CO2). Fordel cellene jevnt ved å skyve platene forsiktig frem og tilbake, og deretter fra side til side.
- Neste dag fjernes hECSR-mediet som inneholder ROCK-hemmeren og tilsetter 2 ml ferskt hECSR-medium uten ROCK-hemmer. Bytt ut hECSR-mediet annenhver dag til 100 % sammenløp er nådd.
MERK: Hvis en vanlig fôringsplan ikke kan opprettholdes over en helg, kan mediet byttes ut om kvelden den siste arbeidsdagen i uken og igjen tidlig om morgenen etter helgen.
- Selektiv passasje for å rense EECM-BMEC-lignende celler og SMLC
- Fjern hECSR-mediet fra 6-brønnsplatene som inneholder en blanding av ECs og ikke-EC-populasjoner. Tilsett 1 ml dissosiasjonsreagens til hver brønn.
- Overvåk cellemorfologien nøye under et mikroskop. Når EC-ene (men ikke ikke-EC-er) virker lyse og runde (vanligvis innen 2-5 minutter), løsner du dem ved å banke på kanten av platen. De fleste ikke-EC-er forblir festet til platen.
- Samle opp de frittliggende EC-ene ved hjelp av en mikropipette, og pass på at ikke-EC-ene ikke resuspenderes. Overfør ECs til et 15 ml eller 50 ml sentrifugerør inneholdende 4 ml DMEM / F12-10 per 1 ml dissosiasjonsreagens.
- Tilsett 2 ml hECSR-medium til brønnene som inneholder de gjenværende vedlagte ikke-ECene for å etablere SMLC. Plasser platen i inkubatoren.
- Pipetter EC-suspensjonen i sentrifugerøret for å blande grundig og reserver 10 mikrol av suspensjonen for celletelling. Sentrifuger de resterende cellene i 5 minutter ved 200 x g ved 20-25 °C. Fjern supernatanten fra pelleten og tilsett 2 ml hECSR-medium per 1,0-2,0 x 105 EC.
- Ved fjerning av kollagen IV-oppløsningen fra en ny 6-brønnsplate, tilsett 2 ml EC-suspensjon til hver brønn, etterfulgt av inkubering ved 37 °C med 5 % CO2. For jevnt fordelt cellene i platen, flytt den forsiktig frem og tilbake og side til side bevegelse på inkubatorhyllen.
- Bytt ut hECSR-mediet annenhver dag til EC-ene når 100 % sammenløp.
- Gjenta trinn 2.3.1-2.3.7 til et rent EC-monolag er oppnådd. Hvis følgende trinn ikke kan utføres, fryser du CD31+ EC-ene (se trinn 2.4.2). For å analysere EC-funksjoner, gå videre til trinn 3.
MERK: Generelt er det nødvendig med to eller tre selektive passasjer for å oppnå nesten rene kulturer av ECs som er egnet for funksjonelle analyser, og vi anser disse cellene som EECM-BMEC-lignende celler. Etter mer enn fem eller seks passasjer bremser celleproliferasjonen vanligvis, selv om denne variabelen avhenger av hiPSC-linjen. - For å dyrke SMLC, bytt ut hECSR-mediet annenhver dag. For å samle SMLC-betinget medium (CM), pass det oppsamlede mediet gjennom et 0,22 μm filter ved hver mediumendring. CM kan brukes til å oppregulere VCAM-1-ekspresjonen av EECM-BMEC-lignende celler. Slå sammen SMLC-CM til SMLC-ene når 100 % sammenløp.
- EPC, EECM-BMEC-lignende celle og SMLC kryopreservering og tining
- For å fryse EPC-er, etter den endelige MACS-vasken (trinn 1.4.13), resuspender EPC-ene i frysemedium i stedet for hECSR-medium med en tetthet på 1,0-2,0 x 106 celler/ml. Fordel 1 ml av cellesuspensjonen i kryorør. Plasser kryorørene i en fryseenhet med kontrollert hastighet og overfør dem raskt til -80 °C. For langtidsoppbevaring, flytt rørene til en flytende nitrogentank 24 til 48 timer etter frysing.
- For å fryse EECM-BMEC-lignende celler og SMLC, etter å ha fjernet mediet fra brønner, tilsett dissosiasjonsreagens (1 ml / brønn) og inkuber platen ved 37 ° C med 5% CO2 til cellene løsner (henholdsvis 5-7 min og 20-30 min for EECM-BMEC-lignende celler og SMLC). Samle cellene i et 15 ml eller 50 ml sentrifugerør inneholdende 4 ml DMEM / F12-10 per 1 ml dissosiasjonsreagens.
- Pipetten blandes grundig og reserverer 10 mikrol av cellesuspensjonen for celletelling. Pellet cellene ved å sentrifugere ved 200 x g i 5 minutter ved 20-25 °C. Fjern supernatanten og resuspender cellene grundig i frysemedium til en tetthet på 1,0-2,0 x 106 celler/ml. Fordel 1 ml av cellesuspensjonen i friske kryorør.
- Plasser kryorørene i en fryseenhet med kontrollert hastighet og overfør dem umiddelbart til -80 °C. For langtidsoppbevaring kan rørene overføres til en flytende nitrogentank 24 til 48 timer etter frysing.
- For tining av EPC, EECM-BMEC-lignende celler og SMLC, rull hetteglass med kryorør mellom hendene eller inkuber i et vannbad på 37 °C til cellene er nesten helt tint. Tilsett 500 mikroliter DMEM/F12-10 og overfør cellesuspensjonen forsiktig til et 15 ml rør inneholdende 4 ml DMEM/F12-10 medium. Vask kryorøret én gang ved å tilsette 1 ml DMEM/F12-10 og sentrifuger deretter cellene ved 200 x g i 5 minutter ved 20-25 °C.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml hECSR-medium inneholdende 5 μM ROCK-hemmer (1:2000 fortynning) til en tetthet på 1,0-2,0 x 10 5 celler per 2 ml for EPC og 2,0-3,0 x 105 celler per 2 ml for EECM-BMEC-lignende celler og SMLC. Fordel cellesuspensjonen mellom brønnene i kollagenbelagte 6-brønnplater etter aspirasjon av kollagenoppløsningen.
- Beveg platene forsiktig frem og tilbake, deretter fra side til side, på hyllen til en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2 for å fordele cellene i brønnene jevnt.
- Neste dag bytter du ut mediet med ferskt hECSR-medium som mangler ROCK-hemmer. Bytt hECSR-mediet annenhver dag til 100 % sammenløp oppnås. Gå deretter videre til selektiv passasje for EPC (se trinn 2.3) og funksjonelle analyser for EECM-BMEC-lignende celler (se trinn 3). Før molekylær karakterisering og funksjonelle analyser utføres, bør EECM-BMEC-lignende celler være 100% konfluerende, noe som vanligvis oppnås 2-3 dager etter tining.
3. Validering av EECM-BMEC-lignende celler og SMLC
- Permeabilitetsanalyse for sporstoffer for små molekyler
- Vurder EECM-BMEC-lignende cellebarriereintegritet ved å måle natriumfluoresceinpermeabilitet, som beskrevet av Nishihara et al.26. Frø de EECM-BMEC-lignende cellene på filterinnsatser for å utvikle komplette monolag og måle permeabiliteten til natriumfluorescein.
- Immunfluorescensfarging for å vurdere nøkkelmolekyler.
- For immunfluorescensfarging for å overvåke ekspresjonen av kryssmolekyler, adhesjonsmolekyler eller cytoskeletale proteiner av EECM-BMEC-lignende celler i monolag eller av SMLC, bruk kammerlysbilder, 96-brønnplater eller membraner med innsatsfiltre. Vurder EECM-BMEC-lignende celleuttrykk av celleoverflateadhesjonsmolekyler med eller uten inflammatorisk cytokinstimulering, som beskrevet av Nishihara et al.26.
- Flowcytometri for å analysere ekspresjonen av adhesjonsmolekyler på celleoverflaten på EECM-BMEC-lignende celler
- Bruk flowcytometri til å vurdere semi-kvantitativt uttrykk for celleoverflateadhesjonsmolekyler involvert i immuncellemigrasjon til CNS, inkludert ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, P-selectin, E-selectin, CD99 og blodplateendotelcelleadhesjonsmolekyl-1 (PECAM-1), som beskrevet av Nishihara et al.26. Kultur de EECM-BMEC-lignende cellene med SMLC-betinget medium i nærvær og fravær av inflammatoriske cytokiner i 16-18 timer.
- Immuncelleadhesjonsanalyse under statiske forhold for å vurdere ekspresjonen av funksjonelle adhesjonsmolekyler
- Bruk metoden beskrevet av Nishihara et al.26 for å bestemme om celleoverflateadhesjonsmolekylene i EECM-BMEC-lignende celler er funksjonelle.
- Kort sagt, frø de EECM-BMEC-lignende cellene på et kammerlysbilde ved 5,5 x 104/cm2 og vokse til samløp. Omtrent 24 timer senere, endre kulturmediet til SMLC-betinget medium i nærvær eller fravær av proinflammatoriske cytokiner, og inkuber de EECM-BMEC-lignende cellene i ytterligere 16 timer.
- På forsøksdagen tiner du kryopreserverte immunceller (f.eks. T-celler eller mononukleære celler i perifert blod [PBMCs]) med T-cellevaskebuffer (tabell 1) og etikett med fluorescerende fargestoffer (f.eks. cellesporingsfarger) i T-cellemedium (tabell 1). Optimalisering av kulturmediet for immuncellene bør skreddersys til den spesifikke typen immunceller som studeres.
- I et 16-brønns kammerlysbilde, legg til 2 x 104 Th1-celler til EECM-BMEC-lignende celler. Spesielt når man arbeider med effektor T-celler som Th1-celler, har det blitt observert at de viser større vedlegg til EECM-BMEC-lignende celler sammenlignet med PBMC (Nishihara. et al. [2022]). Følgelig må antallet PBMCer som skal legges til de EECM-BMEC-lignende cellene være høyere sammenlignet med rene effektor-T-celler.
- Inkuber immuncellene med monolaget av EECM-BMEC-lignende celler i 30 minutter i migrasjonsanalysemedium (tabell 1). Etter 30 min, vask lysbildet forsiktig, to ganger ved å dyppe i en krukke som inneholder Dulbeccos PBS og deretter fikse med 2,5% glutaraldehydoppløsning ved 4 ° C i 2 timer.
- Etter fiksering, vask lysbildet to ganger ved å dyppe i en krukke som inneholder Dulbeccos PBS og monter med et deksel. Deretter får du fluorescensmikroskopibilder av midten av monolaget på lysbildene for å telle immunceller festet til EECM-BMEC-lignende cellemonolag.
Representative Results
Permeabilitetsanalyse
Permeabiliteten av natriumfluorescein ble beregnet ved å måle fluorescensintensiteten til mediet samlet fra det nedre kammeret ved 15, 30, 45 og 60 minutter. Totalt 150 μl medium samples ved hvert tidspunkt, og det manglende volumet på 150 μL erstattes med hECSR-medium. fluorescensintensiteten leses av ved hjelp av en fluorescerende plateleser (485 nm eksitasjon / 530 nm utslipp) og de riktige signalene, klaringsvolumene og permeabilitetene beregnes ved hjelp av en tidligere beskrevet formel18 (tabell 2). Det anbefales å bekrefte om fluorescensintensiteten av natriumfluorescein øker over tid. Flere filtre - minst triplikater - bør brukes til en analyse for å sikre reproduserbarhet. For friske kontrollderiverte EECM-BMEC-lignende celler bør permeabiliteten av natriumfluorescein (376 Da) være under 0,3 x 10-3 cm/min. For å bekrefte dannelsen av et konfluent EECM-BMEC-lignende cellemonolag, bør immunfluorescensfarging for koblingsproteiner i de EECM-BMEC-lignende cellene i hvert filter som brukes i permeabilitetsanalysene utføres etter denne analysen.
Farging av immunfluorescens
Immunfluorescensfarging av EECM-BMEC-lignende cellejunksjonsmolekyler, inkludert claudin-5, okkludin og VE-cadherin1, ble brukt for å vurdere cellemorfologi og tilstedeværelse av kontinuerlige og modne overganger (figur 4). Monolagene av EECM-BMEC-lignende celler på membranene i filterinnsatsene ble fiksert med kald metanol (-20 °C) i 20 s, blokkert med blokkeringsbuffer (tabell 1), og deretter inkubert med primære og sekundære antistoffer. De EECM-BMEC-lignende cellene viste spindellignende former og sikksakkformede kryss, som begge er karakteristiske morfologiske trekk ved BMECs27. Stimulering av de EECM-BMEC-lignende cellene sådd på kammerglass med proinflammatoriske cytokiner, slik som tumornekrosefaktor-α (TNF-α) og interferon-γ (INF-γ) (0,1 ng/ml TNF-α + 2 IE/ml IFN-γ) fortynnet i SMLC-derivert betinget medium, oppregulerte ekspresjonen av adhesjonsmolekyler, slik som ICAM-1 og VCAM-128 (figur 5). Representative bilder av glatte muskelcellemarkører, inkludert α-glatt muskelaktin (SMA), calponin og glatt muskelprotein 22-alfa (SM22a) 29, er vist i figur 6. SMLC-er sådd på kammerlysbildet ble festet med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, blokkert med blokkeringsbuffer og deretter inkubert med primære og sekundære antistoffer.
Flowcytometrianalyse av celleoverflateadhesjonsmolekylekspresjon av EECM-BMEC-lignende celler
Representative resultater for celleoverflateekspresjon av endoteladhesjonsmolekyler på EECM-BMEC-lignende celler er vist i figur 7. Stimulering med proinflammatoriske cytokiner, som TNF-α og INF-γ, oppregulerte celleoverflateekspresjonen av flere adhesjonsmolekyler, inkludert ICAM-1, VCAM-1 og P-selektin. Dyrking av EECM-BMEC-lignende celler med SMLC-betinget medium forbedret endotelial VCAM-1 celleoverflateuttrykk. Effekten av induksjon av VCAM-1 celleoverflateuttrykk kan variere mellom partier av SMLC-betinget medium. Det anbefales at flere partier av kondisjonert medium høstet fra SMLC, avledet fra samme hiPSC-kilde, lagres ved differensiering av SMLC, for å verifisere hvilken batch som induserer riktig uttrykk for VCAM-1.
Adhesjonsanalyse av immunceller under statiske forhold
Antall vedlagte immunceller korrelerte med ekspresjonsnivået av funksjonelle adhesjonsmolekyler på overflaten av EECM-BMEC-lignende celler. Stimulering med inflammatoriske cytokiner oppregulerte ekspresjonen av endoteladhesjonsmolekyler og fremmet det økte antallet immunceller som festet seg til EECM-BMEC-lignende cellemonolag (figur 8). Det nåværende eksperimentet demonstrerte funksjonaliteten til adhesjonsmolekyler på EECM-BMEC-lignende celler, noe som gjør denne modellen egnet for å studere immuncelle-EC-interaksjoner.
Figur 2: Rensing av CD31+ EC. Punktplott av representative flowcytometridata fra spredningsgating av ECs og FITC-merket CD31-farging av cellepopulasjoner før (trinn 1.4.7) og etter (trinn 1.4.14) MACS. MACS forbedrer renheten til CD31+ EPC i befolkningen. Forkortelser: SSC = side scatter; FSC = fremoverspredning; FITC = fluoresceinisotiocyanat; MACS = magnetisk aktivert cellesortering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: EECM-BMEC-monolayer permeabilitet (10-3 cm/min) beregnet ut fra rå fluorescensintensitet av natriumfluorescein. Den lineære helningen til klaringsvolumet beregnes ved hjelp av lineær regresjon for hvert filter (figur 3A). Permeabiliteten av natriumfluorescein beregnes ved hjelp av to formler (figur 3B). (A) Den lineære helningen for klaringsvolum kontra tid ble beregnet ved hjelp av lineær regresjon for filter 1 (mc1) og det tomme filteret (mf). M c1 og m f er koeffisienter av henholdsvis Xc1 og Xf. (B) Formel for beregning av fluoresceinpermeabilitet (Pe) ved bruk av mc og mf (Formel 1). Pe enheter ble konvertert ved hjelp av overflaten av et filter (Formel 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: EECM-BMEC-lignende celler viser modne cellulære veikryss. Immunfluorescensfarging for claudin-5, okkludin eller VE-cadherin (rød) i EECM-BMEC-lignende celler dyrket på membraner av innsatsfiltre. Kjerner ble farget med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå). Farging ble utført på nøyaktig samme filterinnsatser som ble brukt til permeabilitetsanalysene. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Ekspresjon av endoteladhesjonsmolekyler av EECM-BMEC-lignende celler. Immunfluorescensfarging ble utført på EECM-BMEC-lignende celler dyrket på membraner av filterinnsatser i nærvær av SMLC-avledet CM. Immunfarging for ICAM-1 eller VCAM-1 (rød) er vist for ikke-stimulerte og 1 ng / ml TNF-α + 20 IE / ml IFN- γ stimulerte EECM-BMEC-lignende celler. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Karakterisering av SMLC. Immunocytokjemi av α-glatt muskelaktin (SMA), calponin eller glatt muskelprotein 22-alfa (SM22a) (rød) for SMLC-er dyrket på kammerlysbilder vises. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Endotelcelleoverflateekspresjon av adhesjonsmolekyler på EECM-BMEC-lignende celler. Resultater av flowcytometrianalyse av EC-overflateadhesjonsmolekyluttrykk på EECM-BMEC-lignende celler er vist. EECM-BMEC-lignende celler ble dyrket ved hjelp av SMLC-avledet betinget medium. Blå, røde og grå linjer i histogramoverleggene viser henholdsvis ikke-stimulert (NS) tilstand, 1 ng/ml TNF-α + 20 IE/ml IFN-γ-stimulert tilstand og isotypekontroll. Celleoverflateekspresjonen av endoteladhesjonsmolekyler, inkludert intercellulær adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1), ICAM-2, vaskulær celleadhesjonsmolekyl 1 (VCAM-1), P-selektin, E-selektin, CD99 og blodplateendotelcelleadhesjonsmolekyl-1 (PECAM-1) ble vurdert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Adhesjon av immunceller på EECM-BMEC-lignende celler. (A) Bilder av fluorescerende merkede adherente immunceller på ikke-stimulerte (NS) og 0,1 ng / ml TNF-α + 2 IE / ml IFN-γ-stimulerte (TNF-α + IFN-γ) EECM-BMEC-lignende cellemonolag. Bildene tilsvarer brønnens sentre. Skala bar = 50 μm. (B) Antall fluorescerende merkede immunceller på monolayers av NS og TNF-α + IFN-γ-stimulerte EECM-BMEC-lignende celler. Adherente immunceller/synsfelt (FOV) ble automatisk talt ved hjelp av FIJI-programvare. Prikker representerer antall tilknyttede T-celler. Stolper viser middelverdien, og feilfelt viser standardavviket (SD) for åtte forsøk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Detaljer om spesifikke reagenser for analysene. Navnet og den nøyaktige mengden ingredienser for hvert spesifikt reagens er beskrevet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Eksempel på rådata for fluorescensplateleseren for Pe-beregning. Tall i fet skrift er den rå fluorescensintensiteten til natriumfluorescein målt av en plateleser. For å kunne analysere dataene nøyaktig, er det nødvendig å fjerne bakgrunnssignalet fra råverdiene og ta hensyn til signaltap som følge av prøvetaking av bunnkammeret, og deretter korrigere signalet. For eksempel, etter å ha trukket bakgrunnen, viser 15 min-prøven et signal på 100 relative fluorescensenheter (RFU), og 30 min-prøven viser et signal på 150 RFU. Det korrigerte signalet ved 30 min er (150 RFU + de manglende verdiene ved 15 min [100 RFU x 150 μL/1,500 μL]), som er 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU. Klaringsvolumet = (1 500 x [S B,t])/(S T,60 min), hvor 1 500 er volumet til bunnkammeret (1 500 μL), S B,t er det korrigerte signalet på tidspunktet t, og ST,60 min er signalet fra toppkammeret ved 60 min. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Kritiske punkter og feilsøking
Før man starter EPC-differensiering, bør forskerne forsikre seg om at det ikke har forekommet spontane celledifferensieringshendelser i hiPSC-kulturene. Fraværet av spontant differensierte celler og bruk av rene hiPSC-kolonier er kritisk for å oppnå reproduserbare resultater. HiPSC-såtettheten på dag -3 er viktig for å oppnå en høy renhet av CD31+ EPC etter MACS. Såtettheten for hver hiPSC-linje og hver passasje kan kreve optimalisering. Avhengig av hiPSC-linjen og passasjenummeret, kan såtettheten variere mellom 75 x 10 3 til 400 x 10 3 hiPSCs per brønn på en 12-brønnsplate (20-100 x 103 / cm2). Minste tetthetskontrollpunkt for hiPSCs er celletettheten på dag 2. HiPSCene skal nå 100 % samløp senest innen dag 2. Hvis hisscene ikke er sammenflytende innen dag 2, vil renheten til CD31+ EPC etter MACS vanligvis være ganske lav. I dette tilfellet kan hiPSC-såingstettheten økes. Hvis et stort antall differensieringsceller løsner fra platen rundt dag 3 til dag 5, kan den opprinnelige hisc-såingstettheten reduseres. 7-8 μM CHIR99021 er etter vår erfaring den optimale konsentrasjonen for hiPSCs-linjene som brukes her, men konsentrasjonen må kanskje optimaliseres for andre hiPSC-linjer som kan reagere annerledes på inhibitorbehandlingen. Renheten til CD31+ EPC bør bekreftes før og etter MACS. Før du fortsetter med MACS, bør den forhåndssorterte celleblandingen være >10% CD31+ celler. CD31+-celleprosenter på <6 % resulterer vanligvis i <80 % EPC etter MACS. Optimalisering av den opprinnelige såtettheten og/eller CHIR99021-konsentrasjonen er nødvendig i denne situasjonen.
For vellykket selektiv passering og generering av rene EC-monolag, er renheten etter MACS til CD31+ EPC-er kritisk. Hvis renheten etter MACS er <90%, anbefales en eller to ekstra vasker (trinn 1.4.11-1.4.12). Ideelt sett bør renheten etter MACS være >95%. EPC-såtettheten på kollagenbelagte plater bør optimaliseres i henhold til hiPSC-linjen for å oppnå 100% sammenløp innen 3-7 dager. Å vente til EC er 100% sammenflytende vil vanligvis føre til vellykket selektiv passasje. Men selv for 100% sammenflytende EC-er, løsner noen hiPSC-linjers SMLC-er også tidlig. I slike tilfeller kan selektiv passasjering ved lavere konfluens (f.eks. ≤80 %) være effektivt. Hvis noen SMLC-er løsner tidligere enn EC-er, kan EC-ene ofte ikke reddes fra den blandede EC-SMLC-populasjonen. I dette tilfellet kan det være nyttig å forkorte aktiveringstiden for dissosiasjonsreagenset i passerende EC og repeterende selektiv passasje. Bruken av et kommersielt dissosiasjonsreagens i stedet for trypsin som dissosiasjonsreagens er gunstig for selektiv passasje, da trypsin ikke tillater separat løsrivelse av EC og SMLC. Våre permeabilitetsanalyser ved bruk av sporstoffer for små molekyler og testing av tette koblings- og adhesjonsmolekyluttrykksnivåer indikerer at EPC, EECM-BMEC-lignende celler og SMLC kan lagres i flytende nitrogen i minst 2 år.
Betydningen og begrensningene ved metoden
Metoden skiller CD31+ EPC fra hiPSC ved bruk av kjemiske GSK-3-hemmere for å aktivere Wnt/β-catenin-signalering. Etter positivt utvalg av CD31+ EPC av MACS, dyrkes EPC i et definert endotelmedium som fremmer differensiering i blandede endotel- og SMLC-populasjoner. Selektiv passering av disse blandede populasjonene med forskjellige klebende egenskaper tillater separasjon av EC fra SMLC. Etter en eller to passasjer viser EECM-BMEC-lignende celler barriereegenskaper og ekspresjonen av endoteladhesjonsmolekyler som rekapitulerer de primære humane BMECene. Samkultur med SMLC eller deres supernatanter induserer cytokinindusert ekspresjon av VCAM-1.
In vivo opprettholder BBB CNS-homeostase ved å etablere lav paracellulær og transcellulær permeabilitet av molekyler, gjennom transport av næringsstoffer via spesifikke transportører og kontroll av immuncelletrafikk inn i CNS. For studier av BBB er en egnet modell som viser de respektive molekylene og funksjonene av interesse avgjørende. Produksjon av EECM-BMEC-lignende celler ved bruk av definerte reagenser og prøver fra pasienter eller friske personer gir en skalerbar human BBB-modell. Fordelene med en modell som bruker EECM-BMEC-lignende celler over andre BBB-modeller er: 1) en morfologi og endotelial transkriptomprofil30 som ligner den for primære humane BMECer; 2) tilstedeværelsen av modne tette kryss; 3) ønskelige barriereegenskaper; og 4) det robuste uttrykket av endoteladhesjonsmolekyler, inkludert ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- og P-selektin, CD99, melanomcelleadhesjonsmolekyl (MCAM) og aktivert leukocyttcelleadhesjonsmolekyl (ALCAM)22. Dermed er denne modellen spesielt nyttig for å studere interaksjoner mellom immunceller og BMEC. Selv om permeabiliteten til små molekylsporstoffer er høyere for EECM-BMEC-lignende celler enn det som tidligere er rapportert for iPSC-avledede BMEC-lignende celler14,15, sammenligner barriereegenskapene ganske godt med de som er beskrevet for primære humane BMECer. Denne likheten indikerer at EECM-BMEC-lignende celler sannsynligvis vil være en god in vitro-modell av BBB. E-selektinekspresjon på EECM-BMEC-lignende celler under fysiologiske forhold må tas i betraktning ved bruk av denne modellen for å studere ikke-betente BBB som mangler konstitutivt E-selektinuttrykk in vivo31. I vår tidligere studie viste vi at EECM-BMEC-lignende celler kunne fenokopiere BBB, som observert i hjernen til MS-pasienter med hensyn til forstyrrede stramme kryss. Dette resulterer i en høyere permeabilitet av små molekyler og økt ekspresjon av funksjonelt adhesjonsmolekyl, som medierer økt vedheft og transmigrasjon av immunceller over BMEC-lignende celler32. Videre viste vi at aktivering av Wnt / β-catenin-signalering kan forbedre forstyrrelsen av stramme kryss og økt VCAM-1-uttrykk i MS-avledede EECM-BMEC-lignende celler32. Disse resultatene indikerer at modellen faktisk er nyttig for å studere BBBs rolle i nevroimmunologiske sykdommer, som MS.
Samlet sett er EECM-BMEC-lignende celler et lovende verktøy for grundig forståelse av patofysiologiske mekanismer på BBB-nivå og som et verktøy for å utvikle nye terapeutiske mål for BBB-stabilisering. I fremtiden kan modellen brukes til å studere BBB-dysfunksjon i et bredere spekter av sykdommer og kan åpne veier for nye terapeutiske tilnærminger.
Disclosures
BE mottok et stipend fra Biogen for å studere utvidet dosering av natalizumab på T-cellemigrasjon over blod-hjernebarrieren og et stipend fra CSL Behring for å undersøke molekylære grunnlaget for blod-hjernebarrieredysfunksjon ved nevrologiske lidelser. HN og BE er oppfinnere av de foreløpige amerikanske patentsøknadene relatert til EECM-BMEC-lignende celler (63/084980 og 63/185815).
Acknowledgments
HN ble støttet av Uehara Memorial Foundation, et ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS under Joint Research Program implementert i tilknytning til SNSF (JRPs) Grant nr. JPJSJRP20221507 og KAKENHI Grant No. 22K15711, JST FOREST Program (tilskuddsnummer JPMJFR2269, Japan), YOKOYAMA Foundation for Clinical Pharmacology Grant nr. YRY-2217, ICHIRO KANEHARA FOUNDATION, Narishige Neuroscience Research Foundation, NOVARTIS Foundation (Japan) for fremme av vitenskap, og YAMAGUCHI UNIVERSITY FUND. BE ble støttet av Swiss MS Society og Swiss National Science Foundation (tilskudd 310030_189080 og ZLJZ3_214086) og strategisk japansk-sveitsisk vitenskap og teknologi program (SJSSTP) tilskudd IZLJZ3_214086.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm Syringe filter | TPP | 99722 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Falcon | 352196 | |
| 40 μm Falcon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round-bottom tube | SPL | 40005 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| 96-Well plate, round bottom | SPL | 34096 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-500ml | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| B-27 Supplement (503), serum free | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | STEMCELL Technologies | ST-07183 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Chamber slides | Thermo Fischer Scientific | 178599 | |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Corning tissue culture plates (12-well) | Corning | 3512 | |
| Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
| Cryo tube innercap 2.0 mL | Watson | 1396-201S | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 31053-028 | |
| Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium) | Thermo Fisher | 14190250 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) | Thermo Fischer Scientific | 11320074 | |
| EasySepFITC Positive Selection Kit II | STEMCELL Technologies | 18558 | |
| EasySepMagnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS | Sigma | E8008-100ML | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Thermo Fischer Scientific | 10270106 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Ficoll-Paque PLUS | Sigma-Aldrich | GE17144002 | |
| FIJI software (Version 2.0.0) | Image J, USA | ||
| FlowJo version10 | BD | ||
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| HCL | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
| Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Thermo Fischer Scientific | 11111-044 | |
| Human fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Tocris | 233-FB-500 | |
| iPS human induced pluripotent stem cells | Riken RBC | HPS1006 | |
| Kanamycin Sulfate (100x) | Thermo Fischer Scientific | 15160-047 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-Glutamine 200 mM (1003) | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| MEM NEAA (1003) | Thermo Fischer Scientific | 11140-035 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| mTeSR Plus-cGMP | STEMCELL Technologies | ST-100-0276 | |
| mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 104005 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
| Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-2 | BD Biosciences | 554603 | |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI medium 1640 | Thermo Fischer Scientific | 21875-034 | |
| Scalpel | FEATHER | 2975-11 | |
| Skim milk | BD Biosciences | 232100 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | 71290 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 11360-039 | |
| Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated | Corning | 3401 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vitronectin XF | STEMCELL Technologies | 078180 | |
| Water, sterile, cell culture | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372 (2019).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).
- Marchetti, L., Engelhardt, B. Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation. Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).
- Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).
- Nishihara, H., Engelhardt, B. Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective. Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).
- Pan, Y., Nicolazzo, J. A. Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety. British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).
- Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
- Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
- Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Scientific Reports. 10 (1), 12358 (2020).
- Lecuyer, M. A., et al. Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32 (2018).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9 (2017).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Praca, C., et al. Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells. Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).
- Al-Ahmad, A. J. Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25 (2019).
- Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
- Lu, T. M., et al. Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118 (2021).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
- Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
- Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).
- Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development. Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).
- Gastfriend, B. D., et al. Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells. eLife. 10, e70992 (2021).
- Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo. Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).
- Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
