Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

إثراء الحويصلات خارج الخلية الأصلية والمؤتلفة من المتفطرات

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

يفصل هذا البروتوكول إثراء الحويصلات خارج الخلية المتفطرة الأصلية (mEVs) من الثقافات المحورية للمتفطرة smegmatis (Msm) وكيف يمكن تصميم وإثراء mCherry (مراسل الفلورسنت الأحمر) المحتوي على MSMEVs المؤتلفة. أخيرا ، يتحقق من النهج الجديد مع إثراء MsmEVs التي تحتوي على بروتين EsxA من المتفطرة السلية.

Abstract

معظم البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرات ، تولد حويصلات خارج الخلية (EVs). نظرا لأن EVs البكتيرية (bEVs) تحتوي على مجموعة فرعية من المكونات الخلوية ، بما في ذلك المستقلبات والدهون والبروتينات والأحماض النووية ، فقد قامت عدة مجموعات بتقييم الإصدارات الأصلية أو المؤتلفة من bEVs لقوتها الوقائية كمرشحين للقاح الوحدة الفرعية. على عكس المركبات الكهربائية الأصلية ، يتم تصميم المركبات الكهربائية المؤتلفة جزيئيا لتحتوي على واحد أو أكثر من مناعيات الاهتمام. على مدى العقد الماضي ، استكشفت مجموعات مختلفة مناهج متنوعة لتوليد المركبات الكهربائية المؤتلفة. ومع ذلك ، هنا ، نبلغ عن تصميم وبناء وإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة المؤتلفة (mEVs) في المتفطرات. نحو ذلك ، نستخدم المتفطرة smegmatis (MSM) ، وهي متفطرة التربة الطيرية كنظام نموذجي. نصف أولا توليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية ل MSM. بعد ذلك ، نصف تصميم وبناء mEVs المؤتلف التي تحتوي إما على mCherry ، وهو بروتين مراسل فلوري أحمر ، أو EsxA (Esat-6) ، وهو مناعي بارز للمتفطرة السلية. نحقق ذلك عن طريق دمج mCherry و EsxA N-termini بشكل منفصل مع الطرف C لبروتين MSM صغير Cfp-29. Cfp-29 هو واحد من البروتينات القليلة الموجودة بكثرة من MsmEVs. يظل بروتوكول توليد وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM مطابقا لتوليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.

Introduction

على الرغم من تطوير وإدارة مجموعة واسعة من اللقاحات ضد الأمراض المعدية ، حتى يومنا هذا ، ~ 30 ٪ من جميع الوفيات البشرية لا تزال تحدث من الأمراض المعدية1. قبل ظهور لقاح السل (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - كان السل هو القاتل الأول (~ 10000 إلى 15000 / 100000 نسمة) 2. مع إعطاء BCG وسهولة الوصول إلى أدوية الخط الأول والثاني المضادة للسل ، بحلول عام 2022 ، انخفضت الوفيات المرتبطة بالسل بشكل كبير إلى ~ 1 مليون / سنة بحلول عام 2022 (أي ~ 15-20 / 100000 نسمة1). ومع ذلك ، في السكان الموبوءين بالسل في العالم ، لا تزال الوفيات المرتبطة بالسل تقف عند ~ 100-550 / 100000 نسمة1. بينما يدرك الخبراء عدة أسباب تؤدي إلى هذه الأرقام المنحرفة ، يبدو أن الحماية بوساطة BCG التي لا تدوم حتى في العقد الأول من العمر هي السبب البارز3،4،5،6،7. ونتيجة لذلك، وبالنظر إلى "أهداف التنمية المستدامة" المتجددة للأمم المتحدة و"استراتيجية القضاء على السل" لمنظمة الصحة العالمية، هناك جهد عالمي متضافر لتطوير بديل لقاح أفضل بكثير من لقاح بوسطن كونسلتينج جروب الذي ربما يوفر حماية مدى الحياة من السل.

ولتحقيق هذا الهدف، تقوم عدة مجموعات حاليا بتقييم سلالات BCG المعدلة/المؤتلفة، والأنواع الفطرية غير المسببة للأمراض والموهنة بخلاف BCG، والوحدات الفرعية المرشحة8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18. عادة ما تكون لقاحات الوحدات الفرعية عبارة عن جسيمات شحمية محملة بشكل انتقائي بعدد قليل من البروتينات المناعية النقية (~ 1-6) كاملة الطول أو مبتورة من العامل الممرض. ومع ذلك ، بسبب طيها الزائف إلى توافقات غير أصلية و / أو تفاعلات عشوائية غير وظيفية بين البروتينات المحملة ، غالبا ما تفتقر الوحدات الفرعية إلى الحلقات الأصلية والوثيقة ، وبالتالي تفشل في تجهيز جهاز المناعة بشكل كاف14،19،20.

وبالتالي ، اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) للبكتيريا وتيرة كبديل واعد21،22،23،24،25،26. عادة ، تحتوي EVs البكتيرية (bEVs) على مجموعة فرعية من مكوناتها الخلوية ، بما في ذلك بعض أجزاء الأحماض النووية والدهون ومئات المستقلبات والبروتينات27,28. على عكس الجسيمات الشحمية حيث يتم تحميل عدد قليل من البروتينات النقية بشكل مصطنع ، تحتوي bEVs على مئات البروتينات المحملة بشكل طبيعي والمطوية محليا مع ميل أفضل لتجهيز جهاز المناعة ، خاصة بدون تعزيز / مساعدة المواد المساعدة ومستقبلات تشبه الرسوم (TLR)27،28،29. في هذا الخط من البحث ، استكشفنا نحن وآخرون فائدة المركبات الكهربائية المتفطرة كمعززات محتملة للوحدات الفرعية ل BCG30. على الرغم من المخاوف من أن المركبات الكهربائية تفتقر إلى أحمال مستضدات موحدة ، فقد نجحت المركبات الكهربائية من النيسرية السحائية الموهنة في حماية البشر من المكورات السحائية من المجموعة المصليةB 31,32.

من الناحية النظرية على الأقل ، فإن أفضل المركبات الكهربائية التي يمكن أن تعزز BCG بشكل جيد هي المركبات الكهربائية المخصبة من البكتيريا المسببة للأمراض. ومع ذلك ، فإن إثراء المركبات الكهربائية الناتجة عن المتفطرة المسببة للأمراض مكلف ويستغرق وقتا طويلا ومحفوفا بالمخاطر. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون المركبات الكهربائية الناتجة عن مسببات الأمراض أكثر ضراوة من الحماية. بالنظر إلى المخاطر المحتملة ، هنا ، نبلغ عن بروتوكول تم اختباره جيدا لتخصيب المركبات الكهربائية الناتجة عن MSM المزروعة محوريا ، وهي متفطرة طيرية الطيور.

ومع ذلك ، على الرغم من تشفير العديد من تقويم البروتين الممرض ، تفتقر المتفطرات الفيروسية إلى العديد من مستضدات اللقاح / حوامل البروتين المسببة للأمراض اللازمة لتجهيز الجهاز المناعي بشكل كاف نحو الحماية33. لذلك ، استكشفنا أيضا بناء وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM من خلال الهندسة الجزيئية ، بحيث يجب أن يصل جزء كبير من أي بروتين ممرض مهم يتم التعبير عنه وترجمته في MSM ، إلى EVs. افترضنا أن واحدا أو أكثر من أفضل 10 بروتينات وفيرة من MSM EVs عند دمجها مع البروتين محل الاهتمام سيساعد في هذا النقل.

بينما بدأنا في توحيد إثراء المركبات الكهربائية المتفطرة (mEVs) في مختبرنا ، في عام 2011 ، أبلغ Prados-Rosales et al. لأول مرة عن تصور وإثراء mEVs في المختبر30. في وقت لاحق ، في عام 2014 ، نشرت نفس المجموعة نسخة معدلة من طريقة2011 34. في عام 2015 ، أبلغ Lee et al. أيضا عن طريقة موحدة بشكل مستقل لتخصيب mEV مرة أخرى من الثقافات المحورية للمتفطرات35. من خلال الجمع بين كلا البروتوكولين 34,35 ودمج بعض تعديلاتنا بعد التوحيد الشامل ، نصف هنا بروتوكولا يساعد بشكل روتيني على إثراء mEVs من الثقافات المحورية للبكتيرياالفطرية 36.

هنا ، نفصل بشكل خاص إثراء المركبات الكهربائية الخاصة ب MSM ، وهو امتداد للبروتوكولالمنشور 36 لإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة بشكل عام. نحن أيضا بالتفصيل كيفية بناء mEVs المؤتلف (R-mEVs) التي تحتوي على بروتين mCherry (كمراسل فلوري أحمر) و EsxA (Esat-6) 37،38،39 وهو مناعي سائد ووحدة فرعية محتملة لقاح المتفطرة السلية. يظل بروتوكول إثراء R-mEVs مطابقا للبروتوكول الذي وصفناه لإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ظروف نمو المتفطرة السميغماتية ، الإشريكية القولونية ، ومشتقاتها

  1. وسائط
    1. ميدلبروك 7H9 مرق السائل
      1. قم بإعداد محلول مخزون Tween-80 بنسبة 20٪ عن طريق التسخين المسبق للحجم المطلوب من الماء المقطر المزدوج (ddw) في دورق زجاجي إلى ~ 45-50 درجة مئويةفي الميكروويف ، وأضف الحجم المطلوب من Tween-80 باستخدام أسطوانة قياس مناسبة ، وحركه باستمرار على محرك مغناطيسي صغير لإحضار 20٪ Tween-80 إلى محلول موحد. قم بتصفية 20٪ Tween-80 من خلال مرشح التخلص 0.22 um وقم بتخزين محلول المخزون الأصفر الباهت عند 4 درجة مئوية.
        ملاحظة: يجب نقل جميع آثار Tween-80 في أسطوانة القياس إلى الدورق للحصول على تركيز نهائي دقيق. لا الأوتوكلاف الأسهم توين 80 المعدة. مرشح (استخدام 0.22 ميكرومتر) تعقيم وتخزين في 4 درجة مئوية.
      2. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد مرق 7H9. تعليق 4.7 غرام من مسحوق 7H9 في 900 مل من DDW. أضف 2 مل من الجلسرين ، واخلطي المحتويات ، والأوتوكلاف عند 121 درجةمئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: لا تقم بإضافة ميدلبروك ADC التخصيب (ADC) و Tween-80 قبل التعقيم.
      3. بعد أن يبرد الوسائط المعقمة إلى درجة حرارة الغرفة (RT ، أي ~ 25 درجةمئوية) ، في خزانة قياسية للسلامة الحيوية من النوع A2 ، أضف بشكل معقم 10x مخزون 100 مل من ADC (النهائي 1x) و 2.5 مل (0.05٪ النهائي) من 20٪ Tween-80. قم بتصفية الخليط من خلال وحدة ترشيح يمكن التخلص منها 0.22 ميكرومتر وقم بتخزين محلول المرق الأخضر المصفر الفاتح والشفاف عند 4 درجاتمئوية.
        ملاحظة: يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للوسائط ~ 6.6 إلى 6.8 (إذا <6.4 أو >7.0 ، فتخلص منه واجعله جديدا). يخزن في درجة حرارة 4 درجاتمئوية (مستقر لمدة 3-4 أسابيع). يوصى بشدة بتصفية وسائط 7H9 (بعد إضافة ADC و Tween-80) مرتين من خلال وحدتي مرشح مستقلتين 0.22 ميكرومتر.
    2. مرق سائل Sauton (الحد الأدنى من الوسائط)
      1. قم بإذابة L-asparagine (0.4٪ وزن / حجم) وحامض الستريك (0.2٪ وزن / حجم) في 950 مل من DDW. أضف 1 مل لكل من مخزون 1000x المحضر حديثا (بالكيلو ووردو) من فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (عديم اللون ؛ مخزون 10 جم / 20 مل ؛ نهائي 1x 0.5 جم / لتر) ؛ كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتي (عديم اللون ؛ مخزون 10 جم / 20 مل ؛ نهائي 1x 0.5 جم / لتر) ؛ وسترات الأمونيوم الحديديك (بني فاتح جدا ؛ مخزون 1.6 جم / 40 مل ؛ نهائي 1x 0.04 جم / لتر) ويقلب جيدا على محرك مغناطيسي.
        ملاحظة: في أحسن الأحوال ، يمكن أن يكون عمر الأسهم 1,000x أسبوعين ؛ إذا كان أقدم من ذلك ، قم بإعداد مخزون طازج ؛ قم بتخزينها في RT في الظلام (على سبيل المثال ، داخل خزانة / رف). إذا كانت سترات الأمونيوم الحديديك بنية داكنة ، فتخلص منها واجعلها طازجة. من الأفضل إضافة الأملاح الثلاثة بالترتيب المذكور في الخطوة 1.1.2.1. قم بتدوير المحلول في كل مرة قبل إضافة كل محلول ملحي.
      2. قياس وملاحظة الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني ؛ تأكد من أنه حوالي 3.1 إلى 3.2. إذا كان الرقم الهيدروجيني أكثر من 3.7 ، فتخلص من الأسهم واستعد طازجا. لضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، استخدم العديد من قطرات هيدروكسيد الصوديوم 10 N حسب الحاجة. راقب الرقم الهيدروجيني النهائي مع التحريك المستمر للمحلول / الوسائط على محرك مغناطيسي.
      3. أضف 4.76 مل من الجلسرين ، 0.25 مل من 20٪ توين -80 (النهائي 0.005٪ ، انظر أيضا ملاحظة الخطوة 2.2.1.3) ، وبعد ذلك فقط ، قم بتكوين الحجم إلى 1 لتر. بعد ذلك ، قم بتعقيم المرشح مرتين من 1 لتر من الوسط باستخدام مرشحين منفصلين للتخلص 0.22 ميكرومتر. تخزين واضحة ، عديم اللون وسط في 4 درجة مئوية(مستقرة لمدة 2 أسابيع).
        ملاحظة: فقط بعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ، أضف الجلسرين. خلاف ذلك ، سوف تتحول وسائل الإعلام إلى اللون الأبيض الغائم. إذا كان الجو غائما ، فتخلص منه (لا تحاول تسخينه) وقم بإعداده طازجا. لجميع مستحضرات mEVs ، استخدم Sauton's الطازجة.
    3. قاعدة ميدلبروك 7H11 أجار
      1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للتحضير. تعليق 19 غرام من مسحوق 7H11 في 900 مل من DDW. أضف 5 مل من الجلسرين ، وقم بالدوران على محرك مغناطيسي للحصول على تعليق موحد (أخضر شاحب ؛ درجة الحموضة 6.6 إلى 6.8 ؛ إذا >7.2 ، تخلص منها وحضرها طازجة) ، والأوتوكلاف عند 121 درجةمئوية ، 15 رطل / بوصة مربعة ، ولمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: لا تقم بإضافة ADC و 0.05٪ Tween-80 قبل التعقيم.
      2. عندما يبرد الوسط إلى ~ 50 درجةمئوية ، معقم في خزانة السلامة الحيوية من النوع A2 ، أضف 100 مل من ADC (تم إحضاره إلى RT) و 2.5 مل من 20٪ (0.05٪ نهائي) Tween-80 (تم إحضاره إلى RT). الاستغناء على الفور في أطباق بتري.
        ملاحظة: الألواح مستقرة عند 4 درجاتمئوية لمدة 4-6 أسابيع على الأقل. تأكد من أن الألواح في RT طوال الليل قبل لف الألواح لتخزين 4 درجاتمئوية. خلاف ذلك ، سوف تنحصر الرطوبة في الألواح أثناء الحضانة عند 37 درجةمئوية.
    4. ميلر لوريا بيرتاني (LB) مرق وقاعدة أجار
      1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للتحضير. لتحضير مرق LB ، 25 جم من المسحوق في 1000 مل من DDW وحركه برفق لمدة 5 دقائق في دورق زجاجي على محرك مغناطيسي. عند التعليق الموحد ، قم بتقسيم الأحجام المطلوبة في زجاجات الوسائط (على سبيل المثال ، 300 مل في زجاجة وسائط سعة 500 مل) والأوتوكلاف. لتحضير LB Agar ، 40 جم من المسحوق في 1000 مل من DDW والأوتوكلاف (12 جم من المسحوق في 300 مل DDW في زجاجة وسائط زجاجية سعة 500 مل).
  2. ظروف النمو
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات عمل الاستزراع البكتيري في خزانة السلامة الحيوية (النوع A2). يجب معالجة جميع الثقافات بأنابيب معقمة وقوارير وأطراف ماصة.
    1. اليوم 1
      1. أضف 1 مل من كل من مخزون الجلسرين من MSM (من -80 درجة مئوية في الفريزر) إلى 2 × 10 مل (في أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة سعة 50 مل) من مرق 7H9 المعقم حديثا والمبرد والمسخن مسبقا (~ 37 درجة مئوية) ، ودوامة ثلاث مرات ، وأغلق الأغطية ، واحتضان الأنابيب طوال الليل عند 37 درجةمئوية و 200-220 دورة في الدقيقة (شاكر الحاضنة).
        ملاحظة: لزراعة المتفطرة السلية (Mtb) ، اتبع خطوات مماثلة ولكن احتضان أنابيب 50 مل لمدة 4-6 أيام عند 37 درجةمئوية و 120-150 دورة في الدقيقة (شاكر الحاضنة) في إعدادات BSL3. اتبع جميع الإرشادات الدولية وممارسات السلامة الأحيائية لمسببات الأمراض BSL3 و Risk Group 3 أثناء التعامل مع MTB وثقافاته والتخلص منها. استخدم خزانة السلامة الأحيائية من النوع B2 للتعامل مع MTB وثقافاته.
    2. اليوم 2
      1. عندما يصل OD 600 (A600nm ؛ مقياس كثافة الخلية) إلى ~ 1.0 ، يقوم جهاز الطرد المركزي بمزارع MSM لمدة 10 دقائق عند3200 × جم و RT (جهاز طرد مركزي على الطاولة). تخلص من المواد الطافية باستخدام أطراف ماصة معقمة سعة 1 مل.
        ملاحظة: تظل الخطوة أعلاه كما هي بالنسبة لثقافات MTB ، باستثناء أن عدد الأيام هو 4-7. تأكد من عدم لمس الحبيبات البكتيرية بطرف الماصة.
      2. غسل: لكل حبيبات MSM ، أضف 1 مل من وسائط Sauton (at RT) المسخنة مسبقا (الخطوة 1.1.2) وأعد التعليق برفق بأطراف ماصة سعة 1 مل للحصول على تعليق موحد. باستخدام أطراف ماصة معقمة ، قم بتكوين الأحجام إلى 10 مل (في كل منها) بنفس الوسائط. أجهزة الطرد المركزي تعليق لمدة 10 دقائق في 3200 × غرام و RT والتخلص من المواد الطافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
        ملاحظة: تظل الخطوة أعلاه كما هي بالنسبة لثقافات MTB.
      3. أعد تعليق خلايا MSM المغسولة مرتين في 20 مل (لكل منها) من Sauton المسخن مسبقا (المسخن مسبقا في لوحة أو حاضنة شاكر) وقياس الكثافة البصرية للخلايا عند 600 نانومتر. تلقيح الحجم المطلوب من مزارع MSM في قوارير Erlenmeyer معقمة سعة 1 لتر تحتوي على ~ 330 مل من Sauton المعقمة بحيث يكون OD600 النهائي ~ 0.05.
        ملاحظة: يجب أن تبدأ عمليات التعليق دائما بحجم صغير. إذا تمت إضافة الحجم النهائي مباشرة إلى الحبيبات كخطوة واحدة ، فستظل الخلايا كريات منتشرة (مؤشر على ضعف التعليق). الطريقة الوحيدة لحل المشكلة هي تدوير الثقافات وإعادة التعليق على النحو الموصى به. تظل الخطوة المذكورة أعلاه كما هي بالنسبة لثقافات MTB.
    3. اليوم 2/3
      1. احتضان ثقافة 330 مل في شاكر الحاضنة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئويةحتى تصل الثقافة OD600 إلى ~ 0.3. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرة واحدة (على غرار الخطوة 1.2.2.2 ولكن بحجم متساو) ثم أعد تعليق الحبيبات بنفس الحجم. قم بتوزيع 50 مل من المزارع المعاد تعليقها في ست قوارير Erlenmeyer معقمة سعة 1 لتر ، تحتوي كل منها على 280 مل من Sauton المعقمة المسخنة مسبقا مع 1/10th من الاستخدام العادي (0.05٪) Tween-80 أي 0.005٪ (انظر أيضا ملاحظة الخطوة 2.2.1.3. لفهم سبب 1/10). يجب أن يكون OD600 النهائي حوالي 0.05.
        ملاحظة: بالنسبة لثقافات MTB ، بدلا من قوارير Erlenmeyer ، استخدم زجاجات الأسطوانة (بسعة 1/2/4 لتر). اضبط حجم الثقافة لكل زجاجة بحيث لا تصل الثقافة إلى فم الزجاجة عند الاحتفاظ بها على جهاز الأسطوانة. يعتمد الحجم الفعلي في زجاجة الأسطوانة على سعة زجاجة الأسطوانة.
      2. احتضان كل من الثقافات 330 مل في شاكر الحاضنة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئويةحتى يصل OD600 إلى 2.0 إلى 2.5 (~ 15-18 ساعة).
        ملاحظة: بالنسبة لثقافات MTB ، تأكد من أن OD600 النهائي هو ~ 1.0-1.2 (يستغرق ~ 5-8 أيام).

2. إثراء أجهزة MSM mEVs من خلال استخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة

  1. اليوم 4
    1. أجهزة الطرد المركزي ~ 2 لتر من مزارع MSM في المرحلة المتوسطة الأسية في زجاجات طرد مركزي معقمة 6 × 400 مل عند 4 درجةمئوية لمدة 20 دقيقة عند ~ 8000 × جم (جهاز طرد مركزي نموذج أرضي). اجمع طاف الوسائط / الثقافة المستهلك في قارورتين من Erlenmeyer مبردة مسبقا ومعقمة سعة 1 لتر وقم بتخزين حصة من الحبيبات لأي إجراءات تحليلية (مثل SDS-PAGE والنشاف الغربي - غير مفصل هنا).
      ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في البرد (~ 4 °C) للحفاظ بشكل أفضل على سلامة mEVs. تعتبر mEVs مستقرة تماما في RT ولكن التبريد أمر لا بد منه لتحقيق الاستقرار على المدى الطويل (لا ينصح بالتجميد والذوبان المتكرر). أثناء نمو الثقافة المحورية ، تنفصل mEVs عن سطح MSM / Mtb وتتراكم في الوسائط الطافية / المستهلكة للثقافة.
    2. قم بتصفية طاف ثقافة MSM أولا من خلال وحدة (وحدات) مرشح التخلص 0.45 ميكرومتر ثم من خلال وحدة (وحدات) مرشح التخلص 0.22 ميكرومتر لإزالة جميع آثار البكتيريا.
      ملاحظة: غالبا ما يؤدي الترشيح المباشر من خلال مرشحات 0.22 ميكرومتر إلى خنق وحدات المرشح (حيث قد تنزعج الحبيبات البكتيرية أثناء تنفيذ الخطوة 2.1.1.). لتوليد طاف ثقافة Mtb ، قم بإجراء ثلاث عمليات ترشيح لمزارع Mtb (على سبيل المثال ، خطوة الترشيح الأولى بوحدة مرشح يمكن التخلص منها 0.45 ميكرومتر ؛ خطوتان متتاليتان للترشيح مع وحدات مرشح 0.22 ميكرومتر يمكن التخلص منها) قبل نقل ترشيحات الثقافة إلى إعدادات BSL-2.
  2. اليوم 4/5
    1. استخدم مكثفات الغشاء 30 كيلو دالتون لتركيز ترشيح ثقافة MSM (~ 2 لتر) وصولا إلى ~ 38 مل عن طريق الطرد المركزي لترشيح الثقافة عند 4 درجةمئوية و 20 دقيقة وعند 3200 × جم.
      1. اغسل المكثفات مسبقا أولا باستخدام DDW معقم وبارد (~ 15 مل) (اغسل عند 4 درجاتمئوية و 5 دقائق وعند 3200 × جم).
      2. اغسل ب ~ 15 مل من Sauton البارد المصفى مسبقا (نفس ظروف الماء (2.2.1.1.)) لإزالة جميع آثار المواد الكيميائية (المستخدمة أثناء التصنيع).
      3. نظرا لأن ~ 130 مركزا (إذا كان الاستخدام واحدا فقط) مطلوبة تقنيا لتركيز ~ 2 لتر من ترشيح الثقافة ، أعد استخدام المراكز المركزية 3-4 مرات على الأقل إذا لزم الأمر. اتبع هذه الخطوات: ركز 15 مل إلى 0.5 إلى 1.0 مل (اتبع الخطوة 2.2.1) ، وانقل المركز إلى أنبوب طرد مركزي فائق نظيف ومعقم وبارد سعة 38 مل ، ثم أعد نقل ترشيح الثقافة غير المركز المتبقي إلى المراكز المركزية المستخدمة لتكرار التركيز.
        ملاحظة: استخدام مكثفات 24 ، 30 كيلو دالتون لتركيز 2 لتر من ترشيح الثقافة سيستغرق ما يصل إلى 6 ساعات. عند تركيز ترشيح الثقافة ، يتركز Tween-80 أيضا ويمكنه منع المكثف. يساعد استخدام Tween-80 إلى 0.005٪ نهائي (بدلا من 0.05٪) في وسائط Sauton على منع هذا الانسداد. لا يؤثر التركيز المنخفض ل Tween-80 على التعليق المنتظم ل MSM أثناء النمو ولا يسبب تكتل خلايا MSM. ومع ذلك ، نظرا لأن خلايا Mtb تتكتل عند 0.005٪ Tween-80 ، استخدم 0.05٪ Tween-80 للمركبات الكهربائية الخاصة ب MTB.
    2. انقل ترشيح مزرعة Msm المركز (~ 38 مل) إلى أنبوب طرد مركزي نظيف ومغسول (مع ddw) ومبرد مسبقا 40-50 مل من مادة البولي بروبيلين وعرضه للطرد المركزي من خطوتين ، أولا عند 4000 × جم ثم عند 15000 × جم ، كلتا الخطوتين عند 4 درجاتمئوية لمدة 20 دقيقة (لإزالة جميع الحطام). استخدم جهاز طرد مركزي من النوع الأرضي لنفسه.
  3. اليوم 5/6
    1. انقل طاف الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي فائق التبريد سعة 38.5 مل من مادة البولي بروبيلين وقم بتدويره في جهاز طرد مركزي فائق عند 100000 × جم لمدة 4 ساعات عند 4 درجاتمئوية.
      ملاحظة: يعمل جرافة التأرجح بشكل أفضل عند هذه السرعة. تأكد من ملء أنبوب الطرد المركزي الفائق حتى أسنانه والحصول على أنبوب طرد مركزي فائق التوازن بوزن مكافئ. إذا كان أي من الأنبوبين عالقا في دلو التأرجح بعد الطرد المركزي (الذي يحدث بسبب التكثيف) ، باستخدام الملقط ، فقم بإزالته برفق من الدوار. إن مسح الرطوبة المكثفة الموجودة على السطح الخارجي لجهاز الطرد المركزي الفائق قبل الطرد المركزي الفائق يمنع الالتصاق.
    2. احفظ المادة الطافية في أنبوب مبرد سعة 50 مل (انظر الملاحظة). اقلب أنبوب الطرد المركزي الفائق على ورق ماص جديد خال من النسالة لإزالة آثار المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من محلول HEPES العازل (50 mM HEPES و 150 mM NaCl ، درجة الحموضة 7.4 ؛ تعقيم المرشح قبل الاستخدام).
      ملاحظة: احفظ المادة الطافية كنسخة احتياطية فقط. تظهر حبيبات mEV الأصلية على شكل هلام يشبه الهلام ، قطره 5-7 مم ، أصفر رمادي باهت إلى بقعة شفافة. إذا لم تكن هناك حبيبات مرئية ، كرر الخطوة 2.3.1 عن طريق إعادة استخدام المادة الطافية المحفوظة. إذا لم تظهر أي حبيبات بعد تكرار الخطوة 2.3.1 ، فتجاهل الخطوة 1.2 وأعد تشغيلها. تستغرق الحبيبات وقتا لإنعاشها. يوصى بإضافة المخزن المؤقت HEPES وتركه طوال الليل عند 4 درجاتمئوية لسهولة التعليق. أعد التعليق برفق ولكن مع سحب متكرر (استخدم أطراف P200 لإعادة التعليق بشكل أفضل) حتى يتم إعادة التعليق بشكل موحد.
  4. اليوم 6
    1. إخضاع الحبيبات المعاد تعليقها للطرد المركزي المتدرج القائم على "iodixanol".
      1. ضع طبقة من الحبيبات المعاد تعليقها في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق النعومة عالي الوضوح سعة 13 مل والمغسول (مع DDW) والمبرد مسبقا من مادة البولي بروبيلين فائقة الوضوح واخلطها برفق (استخدم ماصة 1 مل) مع ~ 4 مل من محلول "iodixanol" المتدرج بكثافة خاملة (متوفر تجاريا كمحلول ~ 60٪ w / v). بعد وضع طبقات من الحبيبات المعاد تعليقها في قاع الأنبوب (بحد أقصى 5 مل) ، ثم تراكب مع 1 مل (وزن / حجم) لكل 40٪ و 30٪ و 20٪ و 10٪ من المخزونات الفرعية من "iodixanol" بالترتيب المعني (تحضير مخزون فرعي (مع مخزن HEPES المؤقت) من مخزون 60٪). ثم أضف 4 مل من المخزون الفرعي 6٪ (محضر من 60٪ مخزون مع مخزن HEPES) في الأعلى لملء الأنبوب.
        ملاحظة: تحضير التدرج قبل الاستخدام مباشرة ؛ لا تقم أبدا بالتخزين والاستخدام.
      2. بعناية (بدون اهتزاز) ، قم بوزن الأنبوب في دورق زجاجي ، وانقله برفق إلى دوار الدلو المتأرجح.
        ملاحظة: الوزن ضروري لتحقيق التوازن مع أنبوب وهمي (وزنه أيضا).
      3. إخضاعه للطرد المركزي الفائق عند 141000 × جم لمدة 16 ساعة عند 4 درجة مئوية.
  5. اليوم 7
    1. قم بإزالة الأنبوب بعناية (انظر ملاحظة الخطوة 2.3.1) وجمع أجزاء 1 مل في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة حديثا ؛ انتبهإلى الكسور من4 إلى 6 ، والتي تحتوي عادة على MSM mEVs.
      ملاحظة: عادة ما تنقسم mEVs من هذه الكسور إلى ثلاثة أو أربعة نطاقات mEVs (واحد هو النطاق الرئيسي) التي تكون بيضاء باهتة اللون. تتجزأ R-mEVs التي تحتوي على mCherryفي الكسور من 5 إلى 7 وتظهر باللون الأرجوانيالداكن إلى الأرجواني. عادة ما تتجزأ Mtb EVsفي الكسور من5 إلى 7. يعتمد فصل mEVs في التدرج على تركيز التدرج المستخدم ومدى جودة طبقات التدرج. إذا تمزق mEVs جزئيا ، فقد تتكسر في الكسور السابقة. بدلا من ذلك ، إذا لم يتم إعادة تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها بعد الخطوة 2.3.2 جيدا ، فإن الحويصلات تشكل كريات دقيقة كثيفة تتكسر ككسور لاحقة. نوصي بالجمع الدقيق للكسور فقط عندما يريد المستخدم تقييم أي من الكسور سعة 1 مل تحتوي على mEVs. قد يرغب المستخدمون في تقسيم الاقتباس إلى أجزاء أصغر أو أكبر بناء على راحتهم. عندما نستخدمها لتطبيقات معينة ، على سبيل المثال ، اختبارها كمعزز لقاح وحدة فرعية محتملة ل BCG ، فإننا نقصر مجموعتنا من mEVs على أقل من 250 ميكرولتر من الكسور (حيث تتجزأ mEVs) حتى نتمكن على وجه التحديد من جمع نطاقات mEVs ومعالجتها فقط كما هو موضح في 2.7.5. هذا يساعد على إزالة جميع آثار اليوديكسانول التي قد تتداخل في طريق تجاربنا النهائية بشكل أكثر فعالية.
  6. اليوم 8
    1. قم بتجميع الكسور المحتوية على mEVs ، وقم بتخفيفها باستخدام مخزن HEPES المؤقت إلى 38 مل ، وكرر الطرد المركزي الفائق عند 4 درجةمئوية لمدة 16 ساعة عند 100000 × جم. أعد تعليق الحبيبات (كما في الخطوة 2.3.2 بنفس التحذيرات) إما في المخزن المؤقت HEPES أو في أي مخزن مؤقت تتطلبه تجارب المصب (غير المفصلة هنا) مثل تقدير البروتين ، وتحليلات تتبع النانو ، والتلوين السلبي ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، والنشاف الغربي ، ووضع العلامات على الذهب المناعي.
      ملاحظة: للحصول على تعليق أفضل ، صوتنة الأنبوب المحتوي على mEV لمدة 10 دقائق باستخدام صوتنة حمام مائي بالموجات فوق الصوتية. يمكن أن يؤدي Sonicating لفترة أطول إلى تمزق وفقدان mEVs سليمة. إذا تم تعليقه جيدا ، فإن صوتنة غير ضرورية. جميع الخطوات من 2.1 إلى 2.6 متطابقة أثناء إثراء المركبات الكهربائية التي تم إنشاؤها بواسطة MTB.

3. بناء وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة.

ملاحظة: أحد أكثر 10 بروتينات وفرة (تم تحديدها بواسطة مطياف الكتلة) ل MSM EVs هو Cfp-2930. نظرا لصغر حجمه (29 كيلو دالتون) ، وهيكله الثانوي البسيط40 ، وتوطينه في الغشاء 41 ، والميل إلى إفرازه في الوسائط المستهلكة في الثقافات المحورية (على سبيل المثال ، كبروتين ترشيح ثقافي ؛ يفرزه كل من MSM و Mtb42,43 ، هنا ، تم استغلاله لتوصيل مراسل فلوري أحمر وبروتين مهم (EsxAMtb) إلى mEVs. ولتحقيق ذلك،

  1. استخدم البادئات الأمامية والخلفية المناسبة (الجدول 1 ؛ متوافق ليتم استنساخه مباشرة في ناقل مكوك مثل pMV261) لتضخيم cfp-29 من MSM. باستخدام ~ 50 نانوغرام من الوزن الجزيئي العالي (~ >20 كيلو بايت) الحمض النووي الجينومي MSM كقالب ، يقوم PCR بتضخيم جزء الجين cfp-29 باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (مثل Phusion أو Q5). اتبع توصيات الشركة المصنعة ل PCR.
    ملاحظة: صمم مواقع التقييد اللازمة في مواد أولية لسهولة الاستنساخ في أي ناقل مكوك بديل مهم. ستختلف ظروف وحجم تفاعل البوليميراز المتسلسل باختلاف نوع وعلامة بوليميراز الحمض النووي المستخدم في قراءة التدقيق. يختلف حجم مزيج التفاعل اعتمادا على كمية قالب الحمض النووي وكمية بوليميراز الحمض النووي المصحح. اتبع توصيات الشركة المصنعة لظروف PCR ، ونجاح التضخيم ، والقضاء على التلدين غير المحدد للبادئات.
  2. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتنقية الأمبليكون المستخلص بأي مجموعة تنقية PCR متاحة تجاريا والتحقق من طول الأمبليكون عن طريق الرحلان الكهربائي القياسي لهلام الأغاروز. هضم amplicon المنقى.
    1. تقدير كمية amplicon المنقى على مقياس الطيف الضوئي. استخدم ما لا يقل عن 2 ميكروغرام من أمبليكون cfp-29 للهضم.
    2. هضم أولا مع BstB1 عند 65 درجة مئويةلمدة 1 ساعة (نوع وكمية المخزن المؤقت والإنزيم - وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) ، وخفض درجة حرارة التفاعل إلى RT ، ثم هضم مع HindIII لمدة 1 ساعة عند 37 درجةمئوية (نوع وكمية المخزن المؤقت والإنزيم - وفقا لتوصيات الشركة المصنعة).
    3. يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتنقية والتخلص من الأمبليكون المهضوم في 50 ميكرولتر من DDW الخالي من النيوكلياز المعقم.
    4. تقدير تركيز وإنتاجية الأمبليكون المهضوم باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يخزن في -20 درجةمئوية حتى إعداد الربط. ملاحظة: بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تحقق من طول amplicon (~ 798 + 50 bp) والعائد عن طريق الرحلان الكهربائي 10 ميكرولتر من مزيج تفاعل تفاعل PCR على هلام أغاروز 1٪. على الرغم من أن الهضم المزدوج غير ممكن مع هذا المزيج من الإنزيمات ، إلا أن المخزن المؤقت المتوافق سيمنع تنقية PCR المتكررة وفقدان الأمبليكون المهضوم لاحقا. يختلف تركيز الأمبليكون المهضوم باختلاف المجموعة المستخدمة لتنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل. كما أنه يختلف باختلاف الطول (في bp) لأي متجهات بديلة من اختيارك.
  3. استخدم البادئات الأمامية والخلفية (الجدول 1) ، وبوليميراز الحمض النووي للتدقيق اللغوي ، و ~ 50 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي Mtb ، يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل بتضخيم esxA- أو esxA-3X FLAG-tag amplicon المحدد. استخدم ~ 5 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد المناسب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل mCherry. تفاصيل البلازميد والتسلسل موجودة في الملف التكميلي 1.
    ملاحظة: استخدم رابط جليكاين ، جليكاين ، جليكاين ، جليكاين ، سيرين44،45 (G4S) بين cfp-29 و mCherry / esxA / esxA-3X FLAG ؛ قبل بدء mCherry ، يساعد رابط G4S mCherry على عدم الخضوع لطيات زائفة غير وظيفية (بما في ذلك تلك التي يقودها Cfp-29). ارجع إلى تسلسلات cfp-29 و hsp60 و mCherry و esxA في الملف التكميلي 1. تتوفر البلازميدات التي تعمل كقوالب ل mCherry في مستودعات / بنوك بلازميد مختلفة. تتوفر إصدارات مختلفة (تسلسلات معدلة قليلا) من mCherry والتي تتطلب تسلسلات أولية أمامية وخلفية متغيرة. تساعد البادئات (الجدول 1) في تضخيم mCherry المذكور في الملف التكميلي 1. يعمل اندماج المحطة N ل mCherry / esxA / esxA :: 3XFLAG إلى الطرف C من Cfp-29 بشكل جيد.
  4. هضم 1 ميكروغرام من الحمض النووي ل mCherry / esxA / esxA :: 3XFLAG amplicons وتنقية الحمض النووي المهضوم.
    1. هضم مزدوج كل amplicon مع HindIII و HpaI لمدة 1 ساعة عند 37 درجةمئوية (أو حسب توصيات الشركة المصنعة).
    2. استخدم مجموعة تنقية PCR المتاحة تجاريا وتوصيات الشركة المصنعة لتنقية الأمبليكون المهضوم. تخلص من الأمبليكون المهضوم في 50 ميكرولتر من DDW الخالي من النيوكلياز المعقم.
    3. تقدير تركيز وإنتاجية الأمبليكون المهضوم باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يخزن في -20 درجةمئوية حتى إعداد الربط.
  5. هضم 2 ميكروغرام من pMV261-KanR (الملف التكميلي 1) أو ناقل استنساخ مناسب مع الإنزيم (الإنزيمات) المختار.
    1. هضم أولا مع BstB1 عند 65 درجة مئويةلمدة 1 ساعة (نوع وكمية المخزن المؤقت والإنزيم - وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) ، وخفض درجة حرارة التفاعل إلى RT ، ثم هضم مع HindIII لمدة 1 ساعة عند 37 درجةمئوية (نوع وكمية المخزن المؤقت والإنزيم - وفقا لتوصيات الشركة المصنعة).
    2. جل تنقية و elute في 50 ميكرولتر من DDW خالية من النيوكلياز المعقم.
    3. تقدير تركيز وإنتاجية المتجه المهضوم باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يخزن في -20 درجةمئوية حتى إعداد الربط.
      ملاحظة: يمكن الاستنساخ المكون من جزأين بخطوة واحدة باستخدام البادئات المذكورة أعلاه ل pMV261. أي ناقل مكوك بديل يبقى على قيد الحياة كحلقة سيعمل. ستعمل البلازميدات التكاملية أيضا ، لكن إنتاج البروتين المؤتلف سيكون أقل نسبيا لكل خلية.
  6. ربط وتحويلها إلى سلالة متوافقة من الإشريكية القولونية.
    1. للربط ، استخدم 125 نانوغرام من المتجه. استخدم مضخمات mCherry / esxA / esxA :: 3XFLAG المهضومة بشكل مناسب بنسبة 1: 3 مولاري. قم بإجراء الربط طوال الليل باستخدام T4 DNA Ligase (الكمية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) عند 16 درجة مئوية في حمام مائي دائري مبرد.
      ملاحظة: استخدم الضوابط المناسبة مثل المتجه فقط مع وبدون T4 DNA Ligase لتقييم كفاءة الهضم والتنبؤ بكفاءة نجاح الاستنساخ.
    2. التحول
      1. قم بإذابة نقسام الخلايا المختصة كيميائيا NEB5α (~ 100 ميكرولتر لكل تحول) على الجليد لمدة 15 دقيقة. تخلط بلطف مرتين مع طرف ماصة معقمة. أضف مزيج الربط (حتى 20 ميكرولتر) إلى الخلايا المختصة الباردة.
      2. امزج خلايا الماصة برفق + الحمض النووي المربوط. احتضن المزيج على الثلج لمدة 30 دقيقة إضافية.
      3. قم بتوفير صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية (في حمام مائي دائري) لمدة 60 ثانية وانقلها على الفور إلى الجليد لمدة 15 دقيقة إضافية.
      4. استرجع الخلايا المحولة بإضافة 1 مل من مرق SOC (2٪ تريبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، 10 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2.5 مللي مول KCl ، 10 مللي مول MgCl2 ، 10 mM MgSO4 ، و 20 mM Glucose) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة.
      5. قم بتدوير البكتيريا المستعادة في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل (3000 × جم ، RT ، و 10 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من وسائط LB المعقمة والمسخنة مسبقا والمحضرة حديثا ، وانشر التعليق على ألواح أجار LB Miller المصبوبة حديثا والتي تحتوي على المضادات الحيوية المطلوبة بتركيزات مناسبة.
      6. احتضان أطباق بتري في حاضنة لوحة محددة مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  7. الشاشة (غير مفصلة هنا) للاستنساخ المحتمل ، تحقق (عن طريق مستعمرة PCR- / تقييد الإنزيمات القائمة)46 وتسلسلها (تسلسل سانجر) لتأكيد الاندماج.
  8. استخراج الحمض النووي البلازميد (~ 200 نانوغرام / 1-2 ميكرولتر ؛ أي مجموعة متاحة تجاريا) من الاستنساخ المؤكد (خلفية الإشريكية القولونية ) وتحويلها إلى خلايا حديثة الصنع ذات كفاءة كهربائية من MSM.
  9. تحضير الخلايا الكهربية MSM
    1. تنمو حديثا MSM (كما في الخطوتين 1.2.1 و 1.2.2). اغسل MSM المزروع حديثا كما في الخطوتين 1.3.3 و 1.3.4 (باستثناء استخدام 7H9 + ADC + Tween-80 (غني) بدلا من Sauton's).
    2. أضف حصة من خلايا MSM المغسولة إلى OD600 النهائي من ~ 0.05 في دورق Erlenmeyer معقم سعة 500 مل يحتوي على 150 مل من الوسائط الغنية.
    3. احتضان في شاكر الحاضنة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجةمئوية حتى تصل الثقافة OD600 ~ 0.8 إلى 1.0 (~ 12-14 ساعة).
    4. انقل المستنبتة إلى زجاجة طرد مركزي مبردة سعة 400 مل واحتضانها على الثلج لمدة 60-90 دقيقة. ثم, قم بتقطيع الخلايا عند 4 درجاتمئوية لمدة 15 دقيقة عند 4,000 × جم.
    5. اغسل الخلايا مرتين (كل غسلة ب 150 مل ، عند 4000 × جم ، 4 درجاتمئوية ، و 15 دقيقة) بجليسرول معقم (معقم) بنسبة 10٪.
      ملاحظة: مع كل غسلة ، تصبح الحبيبات فضفاضة. توخ الحذر أثناء التخلص من المادة الطافية بالكامل (بعد كل غسلة). خلاف ذلك ، سيتم فقدان غالبية الخلايا في طاف المهملة.
    6. اغسل الخلايا مرة أخرى ب 75 مل من الجلسرين المثلج والمعقم 10٪ الذي يحتوي على 0.005٪ Tween-80.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 7.5 مل من 10٪ جلسرين مع 0.005٪ توين -80 والقسمة إلى 400 ميكرولتر من القسامة.
      ملاحظة: على الرغم من أن الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية MSM مختصة لمدة 4 أشهر على الأقل ، إلا أن الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية الطازجة تعطي أفضل النتائج. عند استخدام الخلايا المختصة القديمة ، تظهر بعض المستعمرات غير الوردية (البيض) كمحولات كاذبة. كلما كبرت الخلايا المختصة ، زادت المستعمرات البيضاء.
  10. تحول MSM
    1. قم بإذابة قسامة الخلايا المختصة MSM على الجليد.
      ملاحظة: يؤدي الذوبان في RT وتحويل هذه الخلايا إلى كفاءة أقل.
    2. أضف 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (~ 200 نانوغرام إجمالي) إلى الخلايا المختصة الباردة ، واخلطها برفق مع طرف ماصة معقم سعة 1 مل ، وانقلها إلى كوفيت معقم مسبقا 2 مم.
    3. انقل الكوفيت المغلق بخلايا MSM المختصة + مزيج الحمض النووي البلازميد إلى ماوس elctroporator ، وأغلق الغطاء برفق وقم بتطبيق نبضة (نوع الاضمحلال الأسي) عند 2.5 كيلو فولت (جهد) ، 25 μF (سعة) ، و 1000 Ω (مقاومة).
    4. أضف على الفور 1 مل من الوسط الغني المعقم المسخن مسبقا (7H9 + ADC + Tween-80) إلى كوفيت ، واخلطه برفق مع طرف ماصة معقم سعة 1 مل ، وانقل المحتويات بالكامل إلى أنبوب معقم سعة 10 مل.
    5. احتضان المحتويات لمدة 3 ساعات في شاكر حاضنة مضبوط على 37 درجةمئوية و 200 دورة في الدقيقة. قم بتدوير المحتويات في أنبوب طرد مركزي دقيق (4000 × جم ، RT ، و 10 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الوسط الغني المعقم الذي تم تسخينه مسبقا ، وانشر التعليق على ألواح أجار 7H11 المصبوبة حديثا والتي تحتوي على ADC و Tween-80 والمضادات الحيوية المطلوبة بتركيزات مناسبة.
      ملاحظة: بالنسبة ل MSM ، عند الحاجة ، استخدم Hygromycin و Kanamycin و Apramycin بتركيزات نهائية تبلغ 50 ميكروغرام / مل و 25 ميكروغرام / مل و 50 ميكروغرام / مل على التوالي. MSM في حد ذاته لا يقاوم هذه المضادات الحيوية. استخدم هذه المضادات الحيوية فقط عند استخدام البلازميدات مع الجينات المقاومة المناسبة لاختيار / نمو المحولات / مستعمرات MSM المؤتلفة.
    6. احتضان أطباق بتري في حاضنة لوحة محددة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. عادة ، تظهر المحولات بين 3-5 أيام.
      ملاحظة: إذا كان البروتين محل الاهتمام ساما ل MSM ، فقد تظهر المحولات لاحقا أو تفشل في الظهور. في مثل هذه الحالات ، استنساخ إصدارات مقطوعة من الطول الكامل.
    7. اصنع مخزون الجلسرين من مستعمرات MSM الناشئة بعد التحقق من الاستنساخ الإيجابي (مثل الخطوة 3.7)
  11. لإثراء R-mEVs التي تحتوي على بروتينات mCherry أو EsxA ، قم أولا بزراعة R-Msm معبرا إما عن mCherry أو exsA أو esxA :: 3X FLAG باتباع الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.3 ثم اتبع الخطوات من 2.1 إلى 2.6. لإثراء R-mEVs. تتلاشى R-mEVsفي الكسور 4-7 بعد دوران التدرج بعد الكثافة (الخطوة 2.5). حبيبات R-mEVs بعد خطوة الطرد المركزي الفائق الأولى (2.3.1). بعد إجراء مماثل للخطوة 2.3.1 ، تأكد من أن R-mEVs مرئية كحبيبات أرجوانية داكنة إلى أرجوانية قطرها 5-7 مم في الجزء السفلي من مركز جهاز الطرد المركزي الفائق.
  12. قم بإجراء التحليلات الغربية47 (غير مفصلة هنا) للكشف عن البروتين (البروتينات) ذات الأهمية داخل R-mEVs المخصبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نستخدم M. smegmatis (Msm) كنموذج المتفطرة لإثبات إثراء كل من mEVs الأصلية والمؤتلفة (R-mEVs). يعمل بروتوكول إثراء mEVs الملخص تخطيطيا (الشكل 1) أيضا على إثراء R-mEVs من MSM والمركبات الكهربائية الأصلية ل Mtb (مع تعديلات طفيفة كما في ملاحظات البروتوكول 1.2). يتطلب تصور mEVs المخصب تلطيخها سلبا تحت المجهر الإلكترونيالنافذ 36 (الشكل 2 أ). عادة ، تنفصل المركبات الكهربائية الخاصة ب MSM في الكسور 4-6 th 1 mL من تدرج الكثافة 13 مل 6-60٪ (الشكل 2B). يتم الحصول على ما يقرب من 80-100 ميكروغرام من البروتين المكافئ من EVs بشكل روتيني من 2 لتر من الثقافات المحورية متوسطة اللوغاريتمية من MSM. تتراوح أقطارها عادة بين 20 نانومتر و 250 نانومتر (الشكل 2C).

أحد الأهداف طويلة المدى لمختبرنا هو تقييم ما إذا كانت mEVs من المتفطرات المختلفة يمكن أن تعمل كمعزز للوحدة الفرعية للقاح الحالي ، BCG. نظرا لأن إثراء المركبات الكهربائية الناتجة عن البكتيريا المسببة للأمراض يستغرق وقتا طويلا ومحفوفا بالمخاطر ومكلفا ، فإن استغلال المركبات الكهربائية الأصلية والمؤتلفة من المتفطرات الطيرية قد يعمل كبديل مناسب. ومن ثم ، فإننا لا نهدف فقط إلى توحيد البروتوكول لإثراء المركبات الكهربائية من MSM ولكن أيضا لبناء وإثراء R-mEVs.

لبناء R-mEVs ، اخترنا أولا أفضل 10 بروتينات وفيرة من MSM EVs (الجدول 1 ؛ حددناها من تحليلات قياس الطيف الكتلي التفصيلية ل MSM EVs)30. افترضنا أنه إذا تم دمج بروتين أجنبي مهم بشكل ترجمي مع أي منها ، فيجب أن يكون قادرا على التوطين في mEVs. بعد ذلك ، قمنا بإدراج Cfp-29 في القائمة المختصرة من بين 10 لأنه الأصغر بينهم (~ 29 كيلو دالتون) ، وهو موضعي بالغشاء ، وهو بروتين ترشيح ثقافي بهيكل ثانوي بسيط نسبيا40،41،42،43. قمنا بدمج الطرف الطرفي N الخاص ب mCherry (البروتين الفلوري) إلى الطرف C من Cfp-29 وتقييم تحميله / تسليمه إلى mEVs. تحول جزء من mEVs المخصب من MSM إلى اللون الوردي (الشكل 3) ، مما يشير إلى قدرة Cfp-29 على حمل بروتين أجنبي مهم إلى MSM EVs.

بالنظر إلى قدرة Cfp-29 (الشكل 3) ، قمنا بعد ذلك بتقييم EsxA (Esat-6) ، وهو بروتين مناعي رئيسي37،38،39 يتم توصيله إلى MSM EVs. مرة أخرى ، أنشأنا اندماجين متعديين مستقلين إلى المحطة C لعلامة Cfp-29 فقط EsxA و EsxA + 3X FLAG (3X FLAG مدمجة في المحطة C ل EsxA. كما هو متوقع ، لاحظنا Mtb's EsxA في MSM EVs (الممرات 5 و 6 و 10 ، الشكل 4A ، B) ، وإن كان بكميات منخفضة. ومن المثير للاهتمام ، أن Cfp-29 :: EsxA :: 3XFLAG كان أكثر استقرارا (الممرات 3 و 4 زائد 8 و 9 ؛ الشكل 4 أ) وتراكمت في مستويات أعلى في mEVs (الممرات 3 و 4 زائد 8 و 9 ؛ الشكل 4 ب). باختصار ، نوضح تصميم وبناء وإثراء R-mEVs التي تحتوي على بروتين أجنبي مهم (الشكل 3 والشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لإثراء الحويصلات خارج الخلية المتفطرة. تشير "الأيام" (بالخط الأحمر ، أعلى الشكل) إلى الأيام اللازمة لإثراء mEVs من MSM (خاصة لخطوتي البروتوكول 1 و 2). تشير "الخطوات" (بالخط الأسود ، أسفل الشكل) إلى خطوات البروتوكول كما هو موضح في قسم البروتوكول. لتخصيب mEVs من Mtb ، على الرغم من أن جميع الخطوات متشابهة ، يستغرق الأمر 10 أيام على الأقل لخطوات الزراعة المختلفة (الخطوة 1) إلى الخطوة الأولى من الطرد المركزي (الخطوة 2). تتطلب الخطوات اللاحقة مدة متطابقة (كما هو موضح بالخط الأحمر). قبل تدرج الكثافة ، تبدو حبيبات mEVs + مجمعات خارج الخلية عديمة اللون عند إثراء كل من mEVs الأصلية و R-mEVs. ومع ذلك ، قد يبدو من اللون الوردي إلى الأزرق (انظر الشكل 3) عند إثراء mEVs التي تحتوي على mCherry. بعد تدرج الكثافة ، ستظهر mEVs باللون الأبيض (الأصلي و R-mEVs) أو الوردي (إذا كانت تحتوي على mCherry) في أنبوب تدرج الكثافة. ألوان mEVs في الشكل هي فقط للإشارة إلى الوضوح ولا تمثل الألوان الدقيقة. انظر الشكل 3 لمزيد من الوضوح. الاختصارات: msm = M. smegmatis; MTB = M. السل ؛ 0.45 و 0.22 ميكرومتر = حجم المسام لوحدات مرشح التخلص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المركبات الكهربائية المتفطرة دائرية ، مركزة مع تدرجات الكثافة ، وتختلف في الأبعاد . (أ) صورة تمثيلية ل MSM EVs عند تصورها مع تلطيخ سلبي وعرض تحت المجهر الإلكتروني النافذ. شريط المقياس = 200 نانومتر. (ب) صورة تمثيلية لكيفية ظهور mEVs في أنبوب الطرد المركزي الفائق عند إجراء تدرج كثافة 6-60٪. إذا لم يتم وضع طبقات التدرج 6-60٪ بدقة ، فإن موضع النطاقات الرئيسية (السهم العلوي المفتوح) والثانوية (السهم المفتوح السفلي) ل mEVs يمكن أن يتغير بشكل كبير ، وبالتالي تغيير رقم الكسر 1 مل. (ج) صورة تمثيلية عند تحليل التتبع النانوي للمركبات الكهربائية المخصبة ل msm. تكشف تحليلات التتبع النانوي عن نسب وتركيزات المركبات الكهربائية ذات الأحجام المختلفة والعدد الإجمالي للمركبات الكهربائية داخل التحضير. في المتوسط ، مع البروتوكول المفصل هنا ، ~ 1-3 × 1010 EVs يتم تخصيبها من 2 لتر من MSM و Mtb. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: خطوات مختلفة تدل على إثراء mEVs التي تعبر عن mCherry. (أ) صورة تمثيلية تظهر ثقافة MSM axenic معبرة عن Cfp-29::mCherry. (ب) صورة تمثيلية للطرد المركزي بعد الحبيبات البكتيرية لثقافة MSM axenic معبرة عن Cfp-29::mCherry. (ج) صورة تمثيلية لمركز ترشيح الثقافة الذي تم الحصول عليه بعد تركيز الوسائط المستهلكة للثقافة المحورية MSM التي تعبر عن Cfp-29::mCherry من خلال مكثفات مركزية. (د) صورة تمثيلية ل mEVs + معقدات خارج الخلية بيليه بعد الطرد المركزي الفائق لمركز ترشيح الثقافة الذي تم الحصول عليه من ثقافة MSM المحورية التي تعبر عن Cfp-29::mCherry. ومع ذلك ، ستبقى الحبيبات عديمة اللون إذا كانت mEVs إما أصلية أو مؤتلفة (عند الاندماج إلى Cfp-29) لأي بروتين (بروتينات) أجنبي باستثناء mCherry. (ه) صور تمثيلية ل mCherry تحتوي على mEVs. لاحظ أنه ليست كل mEVs وردية اللون ، مما يشير إلى أنه لا تحتوي جميع mEVs على Cfp-29. جيد: صورة تمثيلية تشير إلى نطاقات مختلفة من mEVs يتم الحصول عليها عادة بعد الإثراء ل Cfp-29::mCherry EVs. نظرا لأن المركبات الكهربائية المحتوية على mCherry أكثر كثافة ، فإنها تنفصل إلى كسور لاحقة. ضعيف: صورة تمثيلية تشير إلى ضعف الفصل (تنفصل mEVs البيضاء في الكسر الأول / الثاني وتنفصل mEVs المحتوية على mCherry في الكسرالعاشر (ربما بسبب سوء إعادة تعليق حبيبات mEVs ، أي خطوة البروتوكول 2.3.2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: mEVs المؤتلفة التي تحتوي على EsxA (ESAT-6) ، وهو مناعي مشفر ب MTB في محللات الخلايا الكلية MSM و MSM المولدة EVs. (أ) هلام كوماسي و (ب) التحليل الغربي (تم اكتشافه باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة الخاصة ب ESAT6) تظهر الصور تراكم ExsA المنصهر في كل من محللات الخلايا الكلية MSM و mEVs معبرا إما عن cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG ، الممرات 3 و 4 (إجمالي المحللات) والممرات 8 و 9 (mEVs)) أو cfp-29:: esxA (- 3XFLAG ، الممرات 5 و 6 (إجمالي المحللات) والحارة 10 (mEVs)). تشير الأسهم المفتوحة والمملوءة إلى تراكم Cfp-29::ExsA::3XFLAG و Cfp-29::ExsA ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الاشعال:
منظمة الدرب المضيء # الجين التمهيدي التسلسل (من 5 إلى 3 بوصات) مصدر للاستنساخ
1 سي اف بي-29 أمامي CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC الحمض النووي الجينومي MSM pMV261
عكس GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG الحمض النووي الجينومي MSM pMV261
2 mCherry أمامي GAAAAGCTT(HindIII) ggcggcggtggctcg (G4S linker)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG مجموعة المختبر pMV261
عكس TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC مجموعة المختبر pMV261
3 إسكسا أمامي GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG الحمض النووي الجينومي MTB pMV261
عكس TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 الحمض النووي الجينومي MTB pMV261
4 علم exsA-3X أمامي GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG الحمض النووي الجينومي MTB pMV261
عكس TGTGTTAAC (HpaI) TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatcgtggtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 الحمض النووي الجينومي MTB pMV261

الجدول 1: تسلسل التمهيدي. يتم سرد الاشعال الأمامية والخلفية لتضخيم cfp-29 و mCherry و esxA و esxA::3X FLAG والاستنساخ في ناقل المكوك pMV261.

الملف التكميلي 1: A: pMV261 ، خريطته الدائرية ، وميزاته الرئيسية ، وتسلسل النوكليوتيدات الكامل. الأصفر تسليط الضوء على hsp60 المروج تسلسل النوكليوتيدات ؛ مواقع تقييد التمييز الأخضر والسماوي التي تم فيها استنساخ مضخمات mCherry و esxA و esxA :: 3X FLAG. B و C و D: تسلسل النوكليوتيدات ل cfp-29 و mCherry و esxA على التوالي. كودون أخضر لتمييز cfp-29 و mCherry و esxA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نظرا لأن تطوير لقاح جديد للسل يتفوق على BCG ويمكن أن يحل محله لا يزال يمثل تحديا هائلا ، كبديل ، تسعى العديد من المجموعات إلى اكتشاف لقاحات السل الفرعية المختلفة التي يمكن أن تعزز فعالية BCG وتطيل مدة الحماية48,49. نظرا للاهتمام المتزايد بالمركبات الكهربائية البكتيرية (bEVs) كوحدات فرعية محتملة وكمواد مساعدة طبيعية50,51 ، أصبح التخصيب المستمر لكميات كافية من mEVs لاختبارها / تحليلها النهائي خطوة مهمة. وبالنظر إلى هذه الأسئلة البحثية ، يهدف هذا البروتوكول إلى إثراء mEVs من الثقافات المحورية ونسخها المؤتلفة.

خلال تحليلات البروتين الطيفي الكتلي التفصيلية ل MSM EVs ، حدد Prados-Rosales et al. أكثر 10 بروتينات وفرة30. افترضنا كذلك أنه عند الهندسة الجزيئية الكافية ، يجب أن يكون واحد منها كافيا لحمل بروتين أجنبي مهم إلى mEVs. ومن المثير للاهتمام ، أن Cfp-29 برز كأفضل خيار ممكن بسبب ميزاته المختلفة39،40،41،42. تظهر بياناتنا بالفعل أنها كافية بما يكفي لحمل mCherry و EsxA (على الرغم من أن EsxA تتطلب علامة صغيرة في نهايتها C لتكون أكثر استقرارا) وتجميعها في mEVs. في الآونة الأخيرة ، في عام 2021 ، أثبت Tang et al. أن Cfp-29 عبارة عن مغلف لديه القدرة على حمل البيروكسيديز من نوع البيروكسيديز المزيل للصبغة (DyP)40. ربما ، يمكن أن يحمل Cfp-29 بروتينات أجنبية أخرى أيضا.

استكشفنا EsxA لأنه مناعي Mtb بارز 37،38،39 ، يمكن أن يكون وقائيا كلقاح وحدة فرعية في النموذج الحيواني37،38،39 ، صغير الحجم. و ortholog (MSMEG_0066) غائب بشكل مثير للاهتمام في MSM EVs. على الرغم من أننا لا نناقش هذا هنا ، فقد نجحنا في إنشاء R-mEVs لعدد قليل من بروتينات Mtb الأخرى (موجودة بشكل فريد في Mtb وغير مشفرة بواسطة Msm) ، بما في ذلك Antigen 85B (Rv 1886c). في الوقت نفسه ، من المثير للاهتمام ، أننا فشلنا أيضا في توليد R-mEVs لعدد قليل من الآخرين ، بما في ذلك Rv2660c و Rv0288 كامل الطول ، ربما لأن البروتينات سامة ل MSM. نستنتج ذلك لأنه على الرغم من استنساخ تسلسلات النوكليوتيدات الصحيحة وإجراء تحويلات متكررة ، لم تظهر أي مواد نقل لل MSM. نظرا لأن EsxA تتطلب علامة 3XFLAG في نهايتها C-terminus لتراكم أفضل في mEVs ، فقد أضفنا علامة 3XFLAG إلى جميع البروتينات الأخرى المشفرة ب MTB التي قمنا بتقييمها. على الرغم من العلامة ، لم ينجو MSM ، مما يشير إلى أن بعض بروتينات Mtb لا تزال سامة على الرغم من اندماج العلامة. نتوقع أنه في هذه الحالات ، قد يؤتي استنساخ مناطق الحواتم المتوقعة فقط أو خياطة العديد من الحواتم معا ثماره (قيد التقييم حاليا في مختبرنا). استخدمنا خمسة أحماض أمينية صغيرة (أربعة جليكاين وسيرين واحد) بين Cfp-29 و mCherry / EsxA لتقليل التأثير السلبي على طي البروتين محل الاهتمام44,45. نتوقع أنه بدون هذا الرابط ، سيتأثر البروتين محل الاهتمام القابل للطي بشدة بطي Cfp-29.

يمكن توسيع بروتوكول التخصيب هذا بسهولة لإثراء المركبات الكهربائية التي يتم إنشاؤها بواسطة MTB. نتوقع أيضا أن إثراء mEVs من المتفطرات البيئية يجب أن يكون ممكنا أيضا مع هذا البروتوكول. على الرغم من أن البروتوكول بسيط ومباشر ، إلا أنه لا يزال يتطلب 7-8 أيام لإثراء المركبات الكهربائية التي تم إنشاؤها بواسطة MSM و R-mEVs. في المقابل ، يتطلب الأمر 15-20 يوما لإثراء المركبات الكهربائية التي يتم إنشاؤها بواسطة MTB. إن تركيز المركبات الكهربائية على حجم أصغر يستغرق وقتا طويلا ومكلفا ، ونحن نستكشف حاليا ترشيح التدفق العرضي وطرق أخرى لحل مشكلة "الوقت".

أخيرا ، نستخدم Sauton's وليس 7H9 لإثراء mEVs لأن مكمل "ADC" يحتوي على كميات عالية من ألبومين مصل الأبقار الذي قد يتداخل مع أي استخدامات نهائية ل mEVs. يمكن تمديد هذا البروتوكول بسهولة إلى أي وسائط محددة أخرى (على سبيل المثال ، وسائط منخفضة الحديد) يجب استخدامها لتقييم تكوين mEVs. بدلا من ذلك ، بالنسبة لبعض التطبيقات ، في الخطوة الأخيرة (أي خطوة البروتوكول 2.7.5) ، بدلا من المخزن المؤقت HEPES ، يمكن للمرء استخدام محلول ملحي معقم عند حقنه في الفئران أو خنازير غينيا لمختلف التحليلات القائمة على الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أن هذا العمل البحثي قد تم إجراؤه في غياب أي علاقات / مصالح تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون بصدق البروفيسور سارة م. فورتشن على تفضله بمشاركة أسهم M. smegmatis mc2155. كما أنهم يعترفون ب Servier Medical Art (smart.servier.com) لتوفير بعض العناصر الأساسية للشكل 1. إنهم يعترفون بصدق بدعم بقية أعضاء المختبر لتعديلات المرضى أثناء الاستخدام الطويل لهزازات الحاضنة وأجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي الفائقة لتخصيب mEV. كما أنهم يعترفون بالسيد سورجيت ياداف ، مساعد المختبر ، للتأكد دائما من أن الأواني الزجاجية والمواد الاستهلاكية اللازمة كانت دائما متاحة وسهلة الاستخدام. أخيرا ، يعترفون بالفرق الإدارية والمشتريات والمالية في THSTI لدعمهم المستمر ومساعدتهم في التنفيذ السلس للمشروع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium - Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 202 ، الحويصلات خارج الخلية ، الحويصلات المؤتلفة ، Esat-6 ، المتفطرات ، ExsA ، mCherry ، Cfp-29 ، البكتيريا

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

إثراء الحويصلات خارج الخلية الأصلية والمؤتلفة من المتفطرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter