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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Abstract

Die meisten Bakterien, einschließlich Mykobakterien, erzeugen extrazelluläre Vesikel (EVs). Da bakterielle EVs (bEVs) eine Untergruppe zellulärer Komponenten enthalten, darunter Metaboliten, Lipide, Proteine und Nukleinsäuren, haben mehrere Gruppen entweder die native oder die rekombinante Version von bEVs auf ihre schützende Wirksamkeit als Impfstoffkandidaten für Untereinheiten untersucht. Im Gegensatz zu nativen EVs sind rekombinante EVs molekular so konstruiert, dass sie ein oder mehrere Immunogene von Interesse enthalten. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Gruppen verschiedene Ansätze zur Erzeugung rekombinanter bEVs erforscht. Hier berichten wir jedoch über das Design, die Konstruktion und die Anreicherung von rekombinanten mykobakteriellen EVs (mEVs) in Mykobakterien. Zu diesem Zweck verwenden wir Mycobacterium smegmatis (Msm), ein avirulentes Bodenmykobakterium, als Modellsystem. Wir beschreiben zunächst die Generierung und Anreicherung nativer Elektrofahrzeuge von MSM. Anschließend beschreiben wir das Design und die Konstruktion von rekombinanten mEVs, die entweder mCherry, ein rot fluoreszierendes Reporterprotein, oder EsxA (Esat-6), ein prominentes Immunogen von Mycobacterium tuberculosis, enthalten. Dies erreichen wir, indem wir mCherry- und EsxA-N-Termini separat mit dem C-Terminus eines kleinen Msm-Proteins Cfp-29 fusionieren. Cfp-29 ist eines der wenigen Proteine, die in MsmEVs reichlich vorhanden sind. Das Protokoll zur Erzeugung und Anreicherung rekombinanter mEVs aus Msm bleibt identisch mit der Generierung und Anreicherung nativer EVs von MSM.

Introduction

Trotz der Entwicklung und Verabreichung einer breiten Palette von Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten ereignen sich auch heute noch ~30% aller Todesfälle beim Menschen durch übertragbare Krankheiten1. Vor dem Aufkommen des Tuberkulose-Impfstoffs - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - war Tuberkulose die häufigste Todesursache (~10.000 bis 15.000/100.000 Einwohner)2. Mit der Verabreichung von BCG und dem einfachen Zugang zu Erst- und Zweitlinienmedikamenten gegen Tuberkulose sind die TB-bedingten Todesfälle bis 2022 dramatisch auf ~1 Million/Jahr bis 2022 gesunken (d. h. ~15-20/100.000 Einwohner1). In den TB-endemischen Populationen der Welt liegt die Zahl der TB-bedingten Todesfälle jedoch weiterhin bei ~100-550/100.000 Einwohnern1. Während Experten mehrere Gründe erkennen, die zu diesen verzerrten Zahlen führen, scheint der BCG-vermittelte Schutz, der nicht einmal im ersten Lebensjahrzehnt anhält, der Hauptgrund dafür zu sein 3,4,5,6,7. Angesichts der erneuerten "Ziele für nachhaltige Entwicklung" der Vereinten Nationen und der "Strategie zur Beendigung der Tuberkulose" der WHO gibt es daher konzertierte globale Anstrengungen, um eine viel bessere Impfstoffalternative zu BCG zu entwickeln, die möglicherweise einen lebenslangen Schutz vor Tuberkulose bietet.

Um dieses Ziel zu erreichen, evaluieren mehrere Gruppen derzeit modifizierte/rekombinante BCG-Stämme, nicht-pathogene und abgeschwächte Mykobakterienspezies außer BCG und Untereinheitenkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Typischerweise handelt es sich bei Subunit-Impfstoffen um Liposomen, die selektiv mit wenigen gereinigten (~1-6) vollständigen (~1-6) immunogenen Proteinen des Erregers beladen sind. Aufgrund ihrer unechten Faltung in nicht-native Konformationen und/oder zufälliger nicht-funktionaler Interaktionen zwischen den beladenen Proteinen fehlen den Untereinheiten jedoch oft native und germane Epitope und sie können das Immunsystem daher nicht ausreichend vorbereiten14,19,20.

Folglich haben extrazelluläre Vesikel (EVs) von Bakterien als vielversprechende Alternative an Fahrt aufgenommen 21,22,23,24,25,26. Typischerweise enthalten bakterielle EVs (bEVs) eine Teilmenge ihrer zellulären Bestandteile, darunter einige Teile von Nukleinsäuren, Lipiden und Hunderten von Metaboliten und Proteinen27,28. Im Gegensatz zu Liposomen, bei denen einige wenige gereinigte Proteine künstlich geladen werden, enthalten bEVs Hunderte von natürlich beladenen, nativ gefalteten Proteinen mit einer besseren Neigung, das Immunsystem vorzubereiten, insbesondere ohne den Schub/die Hilfe von Adjuvantien und Toll-like-Rezeptoren (TLR)-Agonisten27,28,29. In dieser Forschungsrichtung haben wir und andere den Nutzen von mykobakteriellen EVs als potenzielle Untereinheiten-Booster für BCG30 untersucht. Trotz der Befürchtungen, dass bEVs keine einheitlichen Antigenlasten aufweisen, haben EVs aus abgeschwächter Neisseria meningitidis den Menschen erfolgreich vor Meningokokken der Serogruppe B geschützt31,32.

Zumindest theoretisch sind die besten EVs, die BCG gut steigern könnten, die EVs, die mit pathogenen Bakterien angereichert sind. Die Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch pathogene Mykobakterien erzeugt werden, ist jedoch teuer, zeitaufwändig und riskant. Darüber hinaus können durch Krankheitserreger erzeugte EVs virulenter als schützend sein. Angesichts der potenziellen Risiken berichten wir hier über ein gut getestetes Protokoll zur Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch axenisch gezüchtetes MSM, ein avirulentes Mykobakterium, erzeugt werden.

Trotz der Kodierung mehrerer pathogener Proteinorthologe fehlen avirulenten Mykobakterien jedoch mehrere Impfantigene/pathogene Proteinepitope, die notwendig sind, um das Immunsystem ausreichend auf den Schutz vorzubereiten33. Daher untersuchten wir auch die Konstruktion und Anreicherung rekombinanter EVs von Msm durch molekulares Engineering, so dass ein signifikanter Teil jedes pathogenen Proteins von Interesse, das in Msm exprimiert und translatiert wird, seine EVs erreichen muss. Wir stellten die Hypothese auf, dass eines oder mehrere der 10 am häufigsten vorkommenden Proteine von MSM EVs, wenn sie mit dem interessierenden Protein fusioniert werden, bei einer solchen Translokation helfen.

Während wir 2011 begannen, die Anreicherung von mykobakteriellen EVs (mEVs) in unserem Labor zu standardisieren, berichteten Prados-Rosales et al. erstmals über die Visualisierung und Anreicherung von mEVs in vitro30. Später, im Jahr 2014, veröffentlichte dieselbe Gruppe eine modifizierte Version ihrer Methode34 aus dem Jahr 2011. Im Jahr 2015 berichteten Lee et al. auch über eine unabhängig standardisierte Methode zur mEV-Anreicherung, wiederum aus axenischen Kulturen von Mykobakterien35. Durch die Kombination beider Protokolle 34,35 und die Einbeziehung einiger unserer Modifikationen nach gründlicher Standardisierung beschreiben wir hier ein Protokoll, das bei der routinemäßigen Anreicherung von mEVs aus axenischen Kulturen von Mykobakterienhilft 36.

Hier gehen wir besonders auf die Anreicherung von MSM-spezifischen EVs ein, die eine Erweiterung eines veröffentlichten Protokolls36 für die Anreicherung von mykobakteriellen EVs im Allgemeinen darstellt. Wir beschreiben auch, wie rekombinante mEVs (R-mEVs) konstruiert werden können, die das mCherry-Protein (als rot fluoreszierender Reporter) und EsxA (Esat-6)37,38,39 enthalten, ein vorherrschendes Immunogen und eine potenzielle Untereinheit des Vaccinogens von Mycobacterium tuberculosis. Das Protokoll für die Anreicherung der R-mEVs bleibt identisch mit dem, das wir für die Anreicherung nativer EVs von MSM beschrieben haben.

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Protocol

1. Wachstumsbedingungen von Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli und ihren Derivaten

  1. Medien
    1. Middlebrook 7H9 flüssige Brühe
      1. Bereiten Sie 20%ige Tween-80-Stammlösung vor, indem Sie das erforderliche Volumen des doppelt destillierten Wassers (ddw) in einem Glasbecherglas in einer Mikrowelle auf ~45-50 °C vorwärmen, das erforderliche Volumen Tween-80 mit einem geeigneten Messzylinder hinzufügen und kontinuierlich auf einem kleinen Magnetrührer rühren, um die 20%igen Tween-80 in eine gleichmäßige Lösung zu bringen. Das 20%ige Tween-80 wird durch einen 0,22 μm Entsorgungsfilter filtriert und die blassgelbe Stammlösung bei 4 °C gelagert.
        HINWEIS: Alle Spuren von Tween-80 im Messzylinder müssen in das Becherglas übertragen werden, um eine genaue Endkonzentration zu erhalten. Autoklavieren Sie das vorbereitete Tween-80-Material nicht. Filter (0,22 μM verwenden) sterilisieren und bei 4 °C lagern.
      2. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Zubereitung der 7H9-Brühe. 4,7 g 7H9-Pulver werden in 900 ml ddw suspendiert. Fügen Sie 2 ml Glycerin hinzu, mischen Sie den Inhalt und autoklavieren Sie bei 121 °C, 15 psi für 20 Minuten.
        HINWEIS: Fügen Sie Middlebrook ADC Enrichment (ADC) und Tween-80 nicht vor dem Autoklavieren hinzu.
      3. Nachdem das autoklavierte Medium auf Raumtemperatur (RT, d. h. ~25 °C) abgekühlt ist, wird in einer Standard-Biosicherheitswerkbank vom Typ A2 aseptisch 10x 100 ml ADC (1x endgültig) und 2,5 ml (letzte 0,05 %) 20 % Tween-80 zugegeben. Filtrieren Sie das Gemisch durch eine 0,22 μm Einwegfiltereinheit und lagern Sie die sehr hell gelblich-grüne, transparente Stammlösung bei 4 °C.
        HINWEIS: Der pH-Wert des Mediums muss ~6,6 bis 6,8 betragen (bei <6,4 oder >7,0 entsorgen und frisch machen). Bei 4 °C lagern (3-4 Wochen haltbar). Es wird dringend empfohlen, das 7H9-Medium (nach Zugabe von ADC und Tween-80) zweimal durch zwei unabhängige 0,22-μm-Einwegfiltereinheiten zu filtern.
    2. Sauton's (Minimal Media) flüssige Brühe
      1. L-Asparagin (0,4 % w/v) und Zitronensäure (0,2 % w/v) in 950 ml ddw lösen. Fügen Sie je 1 ml frisch zubereitete 1.000-fache Brühe (in ddw) dibasisches Kaliumphosphat hinzu (farblos; Brühe 10 g/20 ml; endgültig 1x 0,5 g/l); Magnesiumsulfat-Heptahydrat (farblos; Stamm 10 g/20 ml; endgültig 1x 0,5 g/l); und Eisen(III.-Ammoniumcitrat) (sehr hellbraun; Stamm 1,6 g/40 ml; endgültig 1x 0,04 g/L) und auf einem Magnetrührer gut umrühren.
        HINWEIS: Im besten Fall können die 1.000-fachen Aktien 2 Wochen alt sein; wenn älter, bereiten Sie frische Vorräte vor; Lagern Sie sie bei RT im Dunkeln (z. B. in einem Schrank/Regal). Wenn das Eisen-Ammoniumcitrat dunkelbraun ist, entsorgen Sie es und machen Sie es frisch. Am besten fügen Sie die drei Salze in der in Schritt 1.1.2.1 genannten Reihenfolge hinzu. Schwenken Sie die Lösung jedes Mal, bevor Sie jede Salzlösung hinzufügen.
      2. Messen und notieren Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät; Stellen Sie sicher, dass sie zwischen 3,1 und 3,2 liegt. Wenn der pH-Wert über 3,7 liegt, die Brühen wegwerfen und frisch zubereiten. Um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, verwenden Sie so viele Tropfen 10 N Natriumhydroxid wie nötig. Überwachen Sie den endgültigen pH-Wert, während Sie die Lösung/das Medium kontinuierlich auf einem Magnetrührer umrühren.
      3. Man fügt 4,76 ml Glycerin und 0,25 ml 20 % Tween-80 (endgültige 0,005 %, siehe auch die Anmerkung zu Schritt 2.2.1.3) hinzu und füllt erst dann das Volumen auf 1 l auf. Filtersterilisieren Sie dann das Doppelte des 1-Liter-Mediums mit zwei separaten 0,22-μm-Entsorgungsfiltern. Lagern Sie das klare, farblose Medium bei 4 °C (2 Wochen haltbar).
        HINWEIS: Erst nachdem der pH-Wert auf 7,4 eingestellt ist, fügen Sie Glycerin hinzu. Andernfalls werden die Medien bewölkt weiß. Wenn es trüb ist, entsorgen Sie es (versuchen Sie nicht, es zu erhitzen) und bereiten Sie es frisch zu. Verwenden Sie für alle mEV-Zubereitungen frisch zubereitete Sauton's.
    3. Middlebrook 7H11 Agar-Basis
      1. Befolgen Sie die Zubereitungsanweisungen des Herstellers. Suspendieren Sie 19 g 7H11-Pulver in 900 ml ddw. 5 ml Glycerin hinzufügen, auf einem Magnetrührer schwenken, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten (hellgrün; pH 6,6 bis 6,8; wenn >7,2; verwerfen und frisch zubereiten) und bei 121 °C, 15 psi und 20 Minuten lang autoklavieren.
        HINWEIS: ADC und 0,05 % Tween-80 vor dem Autoklavieren nicht hinzufügen.
      2. Wenn das Medium auf ~50 °C abgekühlt ist, werden aseptisch in einer Biosicherheitswerkbank vom Typ A2 100 ml ADC (RT) und 2,5 ml 20 % (endgültige 0,05 %) Tween-80 (RT) zugegeben. Sofort aseptisch in Petrischalen dosieren.
        HINWEIS: Die Platten sind bei 4 °C für mindestens 4-6 Wochen stabil. Stellen Sie sicher, dass die Platten über Nacht auf RT sind, bevor Sie die Platten für die Lagerung bei 4 °C einwickeln. Andernfalls wird während der Inkubation bei 37 °C Feuchtigkeit in den Platten eingeschlossen.
    4. Miller Luria Bertani (LB) Brühe und Agar-Basis
      1. Befolgen Sie die Zubereitungsanweisungen des Herstellers. Zur Zubereitung von LB-Brühe 25 g Pulver in 1.000 ml ddw suspendieren und 5 Minuten lang in einem Glasbecherglas auf einem Magnetrührer vorsichtig umrühren. Nach gleichmäßiger Suspension werden die erforderlichen Volumina in Medienflaschen (z. B. 300 ml in einer 500-ml-Medienflasche) aliquotiert und autoklaviert. Zur Herstellung von LB-Agar werden 40 g Pulver in 1.000 ml ddw suspendiert und autoklaviert (12 g Pulver in 300 ml ddw in einer 500-ml-Glasmedienflasche).
  2. Wachstumsbedingungen
    HINWEIS: Alle Schritte der Bakterienkulturarbeit müssen in einer Biosicherheitswerkbank (Typ A2) durchgeführt werden. Alle Kulturen müssen mit sterilen Röhrchen, Kolben und Pipettenspitzen verarbeitet werden.
    1. Tag 1
      1. Fügen Sie je 1 ml Glycerinbrühe von Msm (aus dem Gefrierschrank von -80 °C) zu 2 x 10 ml (in sterilen konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen) frisch autoklavierter, gekühlter und vorgewärmter (~37 °C) 7H9-Brühe hinzu, schwenken Sie sie dreimal, schließen Sie die Deckel und inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 37 °C und 200-220 U/min (Inkubatorschüttler).
        HINWEIS: Um Mycobacterium tuberculosis (Mtb) zu züchten, befolgen Sie ähnliche Schritte, aber inkubieren Sie die 50-ml-Röhrchen 4-6 Tage lang bei 37 °C und 120-150 U/min (Inkubatorschüttler) in BSL3-Einstellungen. Befolgen Sie ALLE internationalen Richtlinien und Biosicherheitspraktiken für BSL3- und Risikogruppen-3-Krankheitserreger beim Umgang mit und der Entsorgung von Mtb und seinen Kulturen. Verwenden Sie die Biosicherheitswerkbank vom Typ B2 für den Umgang mit Mtb und seinen Kulturen.
    2. Tag 2
      1. Wenn OD 600 (A600 nm; Zelldensitometer) ~1,0 erreicht, zentrifugieren Sie die MSM-Kulturen 10 Minuten lang bei 3.200 × g und RT (Tischzentrifuge). Entsorgen Sie die Überstände mit sterilen 1-ml-Pipettenspitzen.
        HINWEIS: Der obige Schritt bleibt für Mtb-Kulturen gleich, mit der Ausnahme, dass die Anzahl der Tage 4-7 beträgt. Achten Sie darauf, das Bakterienpellet nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.
      2. Waschen: Zu jedem Msm-Pellet 1 ml vorgewärmtes Sauton-Medium (bei RT) geben (Schritt 1.1.2) und vorsichtig mit 1 ml Pipettenspitzen resuspendieren, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Verwenden Sie sterile Pipettenspitzen, um die Volumina mit demselben Medium auf 10 ml (in jedem) aufzufüllen. Zentrifugieren Sie die Suspensionen 10 min bei 3.200 × g und RT und verwerfen Sie die Überstände. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
        HINWEIS: Der obige Schritt bleibt für MTB-Kulturen gleich.
      3. Resuspendieren Sie die zweimal gewaschenen Msm-Zellen in jeweils 20 ml vorgewärmtem Sauton (vorgewärmt in einem Platten- oder Shaker-Inkubator) und messen Sie die optische Dichte der Zellen bei 600 nm. Das erforderliche Volumen an MSM-Kulturen wird in sterile 1-Liter-Erlenmeyerkolben mit ~330 ml sterilen Sauton-Kolben geimpft, so dass der endgültige OD600 ~0,05 beträgt.
        HINWEIS: Resuspensionen müssen immer in einem kleinen Volumen beginnen. Wenn das endgültige Volumen in einem einzigen Schritt direkt in das Pellet gegeben wird, bleiben die Zellen als diffundierte Pellets zurück (ein Indikator für eine schlechte Resuspension). Die einzige Möglichkeit, das Problem zu beheben, besteht darin, die Kulturen herunterzufahren und die erneute Sperrung wie empfohlen zu wiederholen. Der obige Schritt bleibt für MTB-Kulturen gleich.
    3. Tag 2/3
      1. Die 330-ml-Kultur wird im Inkubatorschüttler bei 200 U/min und 37 °C inkubiert, bis der Kultur-OD600 ~0,3 erreicht. Waschen Sie dann die Zellen einmal (ähnlich wie in Schritt 1.2.2.2, aber mit gleichem Volumen) und resuspendieren Sie dann das Pellet im gleichen Volumen. Verteilen Sie jeweils 50 ml der resuspendierten Kulturen auf sechs sterile 1-Liter-Erlenmeyerkolben, die jeweils 280 ml sterile, vorgewärmte Sautons mit 1/10des normalerweise verwendeten (0,05 %) Tween-80, d. h. 0,005 %, enthalten (siehe auch den Hinweis zu Schritt 2.2.1.3., um zu verstehen, warum 1/10th). Der endgültige OD600 muss ca. 0,05 betragen.
        HINWEIS: Verwenden Sie für MTB-Kulturen anstelle von Erlenmeyerkolben Rollflaschen (mit einem Fassungsvermögen von 1/2/4 l). Stellen Sie das Kulturvolumen pro Flasche so ein, dass die Kultur nicht die Mündung der Flasche erreicht, wenn sie auf dem Rollengerät aufbewahrt wird. Das tatsächliche Volumen in der Rollerflasche hängt vom Fassungsvermögen der Rollerflasche ab.
      2. Jede der 330-ml-Kulturen wird im Inkubatorschüttler bei 200 U/min und 37 °C inkubiert, bis OD600 2,0 bis 2,5 (~15-18 h) erreicht.
        HINWEIS: Stellen Sie bei Mtb-Kulturen sicher, dass der endgültige OD600 ~1,0-1,2 beträgt (dauert ~5-8 Tage).

2. Anreicherung von MSM mEVs durch Dichtegradientenzentrifugation

  1. Tag 4
    1. Zentrifugieren Sie die ~2 l MSM-Kulturen im mittleren exponentiellen Stadium in 6 x 400 ml sterilen Zentrifugenflaschen bei 4 °C für 20 Minuten bei ~8.000 × g (Bodenzentrifuge). Sammeln Sie den verbrauchten Medien-/Kulturüberstand in zwei vorgekühlten, autoklavierten 1-l-Erlenmeyerkolben und lagern Sie ein Aliquot des Pellets für alle Analyseverfahren (wie SDS-PAGE und Western Blotting - hier nicht detailliert).
      HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen bei Kälte (~ 4 °C) durchgeführt werden, um die Integrität der mEVs besser zu erhalten. Die mEVs sind bei RT recht stabil, aber die Kühlung ist ein Muss für die Langzeitstabilität (wiederholtes Einfrieren und Auftauen wird nicht empfohlen). Während des axenischen Kulturwachstums lösen sich mEVs von der Oberfläche von Msm/Mtb und reichern sich im Kulturüberstand/verbrauchten Medium an.
    2. Filtern Sie den MSM-Kulturüberstand zuerst durch die 0,45-μm-Entsorgungsfiltereinheit(en) und dann durch die 0,22-μm-Entsorgungsfiltereinheit(en), um alle Spuren von Bakterien zu entfernen.
      HINWEIS: Die direkte Filtration durch die 0,22-μm-Filter erstickt häufig die Filtereinheiten (da das Bakterienpellet bei der Durchführung von Schritt 2.1.1 gestört werden kann). Um Mtb-Kulturüberstände zu erzeugen, führen Sie drei Filtrationen von Mtb-Kulturen durch (d. h. erster Filtrationsschritt mit einer 0,45-μm-Einwegfiltereinheit; zwei aufeinanderfolgende Filtrationsschritte mit 0,22-μm-Einwegfiltereinheiten), bevor die Kulturfiltrate in BSL-2-Einstellungen verschoben werden.
  2. Tag 4/5
    1. Verwenden Sie die 30-kDa-Membrankonzentratoren, um das Msm-Kulturfiltrat (~2 l) auf ~ 38 ml zu konzentrieren, indem Sie das Kulturfiltrat bei 4 °C, 20 min und bei 3.200 × g zentrifugieren.
      1. Die Konzentratoren zuerst mit sterilem, kaltem ddw (~15 ml) vorwaschen (bei 4 °C, 5 min und bei 3.200 × g waschen).
      2. Mit ~15 ml vorgefiltertem, kaltem Sauton waschen (gleiche Bedingungen wie für Wasser (2.2.1.1.)), um alle Spuren von Chemikalien (die bei der Herstellung verwendet werden) zu entfernen.
      3. Da ~130 Zentrikonen (bei nur einmaliger Verwendung) technisch erforderlich sind, um ~2 L Kulturfiltrat zu konzentrieren, verwenden Sie die Zentrikone bei Bedarf mindestens 3-4 Mal wieder. Gehen Sie folgendermaßen vor: Konzentrat 15 ml auf 0,5 bis 1,0 ml (folgen Sie Schritt 2.2.1), überführen Sie das Konzentrat in ein sauberes, autoklaviertes und kaltes 38-ml-Ultrazentrifugenröhrchen und überführen Sie dann das verbleibende unkonzentrierte Kulturfiltrat zur wiederholten Konzentration wieder in die verwendeten Zenzentrikone.
        HINWEIS: Die Verwendung von 24, 30 kDa-Konzentratoren zur Konzentration von 2 l Kulturfiltrat dauert bis zu 6 Stunden. Bei der Konzentration des Kulturfiltrats wird auch der Tween-80 konzentriert und kann den Konzentrator blockieren. Die Verwendung von Tween-80 auf 0,005 % endgültig (statt 0,05 %) in Sautons Medien hilft, diese Blockade zu verhindern. Die reduzierte Konzentration von Tween-80 hat keinen Einfluss auf die gleichmäßige Suspension von Msm während des Wachstums und verursacht keine Verklumpung von Msm-Zellen. Da Mtb-Zellen jedoch bei 0,005 % Tween-80 verklumpen, sollten Sie 0,05 % Tween-80 für Mtb-spezifische Elektrofahrzeuge verwenden.
    2. Das konzentrierte MSM-Kulturfiltrat (~38 ml) wird in ein sauberes, gewaschenes (mit ddw) und vorgekühltes 40-50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt und einer zweistufigen Zentrifugation unterzogen, zuerst bei 4.000 × g und dann bei 15.000 × g, beide Schritte bei 4 °C für 20 Minuten (um alle Ablagerungen zu entfernen). Verwenden Sie dafür eine Bodenzentrifuge.
  3. Tag 5/6
    1. Den Kulturüberstand in ein vorgekühltes 38,5-ml-Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchen überführen und in einer Ultrazentrifuge bei 100.000 × g 4 h bei 4 °C schleudern.
      HINWEIS: Eine Schaufel funktioniert am besten bei dieser Geschwindigkeit. Stellen Sie sicher, dass Sie das Ultrazentrifugenröhrchen bis zum Rand füllen und ein Balance-Ultrazentrifugenröhrchen mit gleichem Gewicht haben. Wenn eines der Röhrchen nach dem Zentrifugieren (was aufgrund von Kondensation geschieht) am Schaufel klebt, entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette vom Rotor. Das Abwischen der kondensierten Feuchtigkeit, die sich auf der Außenfläche der Ultrazentrifuge vor der Ultrazentrifugation befindet, verhindert ein Anhaften.
    2. Bewahren Sie den Überstand in einem 50 ml vorgekühlten Röhrchen auf (siehe Hinweis). Drehen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen auf ein frisches, fusselfreies, saugfähiges Papier, um Spuren des Überstandes zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in 600 μl HEPES-Pufferlösung (50 mM HEPES und 150 mM NaCl, pH 7,4; vor Gebrauch filtrieren).
      HINWEIS: Speichern Sie den Überstand nur als Sicherungsvorlage. Das native mEV-Pellet erscheint als geleeartiger Fleck mit einem Durchmesser von 5-7 mm, stumpf graugelb bis durchscheinend. Wenn kein Pellet sichtbar ist, wiederholen Sie Schritt 2.3.1, indem Sie den gespeicherten Überstand wiederverwenden. Wenn nach der Wiederholung von Schritt 2.3.1 kein Pellet erscheint, verwerfen und mit Schritt 1.2 neu beginnen. Das Pellet braucht Zeit, um wieder zu suspendieren. Es wird empfohlen, den HEPES-Puffer hinzuzufügen und ihn über Nacht bei 4 °C stehen zu lassen, um eine einfache Resuspension zu ermöglichen. Resuspendieren Sie vorsichtig, aber mit wiederholtem Pipettieren (verwenden Sie P200-Spitzen für eine bessere Resuspension) bis zu einer gleichmäßigen Resuspension.
  4. Tag 6
    1. Das resuspendierte Pellet wird einer "Iodixanol"-basierten Dichtegradientenzentrifugation unterzogen.
      1. Schichten Sie das resuspendierte Pellet auf den Boden des 13 ml sauberen, gewaschenen (mit ddw) und vorgekühlten ultraklaren Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchens und mischen Sie es vorsichtig (verwenden Sie 1 ml Pipette) mit ~4 ml inerter Dichtegradientenlösung "Iodixanol" (im Handel erhältlich als ~60% w/v-Lösung). Nach dem Schichten des resuspendierten Pellets am Boden des Röhrchens (bis zu einem Maximum von 5 ml) wird dann mit je 1 ml (w/v) von 40 %, 30 %, 20 % und 10 % Untervorräten "Iodixanol" in der jeweiligen Reihenfolge überlagert (Untervorräte (mit HEPES-Puffer) aus 60 % Vorräten vorbereiten). Geben Sie dann 4 ml 6%igen Unterstock (hergestellt aus 60 % Stammstoff mit HEPES-Puffer) oben hinzu, um das Röhrchen zu füllen.
        HINWEIS: Bereiten Sie den Farbverlauf kurz vor dem Gebrauch vor. Niemals aufbewahren und verwenden.
      2. Wiegen Sie das Röhrchen vorsichtig (ohne zu schütteln) in einem Glasbecher und füllen Sie es vorsichtig in den Rotor mit schwingender Schaufel.
        HINWEIS: Das Wiegen ist notwendig, um mit einem Dummy-Rohr (ebenfalls gewogen) auszugleichen.
      3. Es wird 16 h lang bei 141.000 × g bei 4 °C ultrazentrifugiert.
  5. Tag 7
    1. Das Röhrchen vorsichtig entfernen (siehe Hinweis zu Schritt 2.3.1) und 1 ml Fraktionen in frisch autoklavierte Mikrozentrifugenröhrchen sammeln; Achten Sie aufdie Brüche 4 bis 6, die typischerweise die MSM mEVs enthalten.
      HINWEIS: Die mEVs aus diesen Fraktionen werden normalerweise in drei oder vier mEVs-Bänder (eines ist das Hauptband) fraktioniert, die eine mattweiße Farbe haben. Die R-mEVs, die mCherry enthalten, fraktionieren in der 5. bis 7. Fraktion und erscheinen dunkelviolett bis magenta. Die Mtb-EVs fraktionieren in der Regel in der 5. bis 7. Fraktion. Die Trennung der mEVs im Gradienten hängt von der verwendeten Gradientenkonzentration ab und davon, wie gut der Gradient geschichtet ist. Wenn mEVs teilweise reißen, können sie in früheren Fraktionen zerbrechen. Wenn das nach Schritt 2.3.2 erhaltene Pellet nicht gut resuspendiert wird, bilden die Vesikel alternativ dichte Mikropellets, die als spätere Fraktionen zerfallen. Wir empfehlen eine genaue Erfassung der Fraktionen nur dann, wenn der Benutzer auswerten möchte, welche der 1-ml-Fraktionen die mEVs enthalten. Benutzer können je nach Bequemlichkeit in kleinere oder größere Brüche aliquotieren. Wenn wir sie für bestimmte Anwendungen verwenden, z. B. um sie als potenzielle Auffrischungsimpfung für BCG zu testen, beschränken wir unsere Sammlung der mEVs auf weniger als 250 μl der Fraktionen (wobei mEVs fraktioniert werden), so dass wir spezifisch nur die mEVs-Banden sammeln und wie in 2.7.5 beschrieben verarbeiten können. Dies trägt dazu bei, alle Spuren von Iodixanol, die unsere nachgeschalteten Experimente stören könnten, effektiver zu entfernen.
  6. Tag 8
    1. Die mEVs-haltigen Fraktionen werden zusammengefasst, mit HEPES-Puffer auf 38 ml verdünnt und die Ultrazentrifugation bei 4 °C für 16 h bei 100.000 × g wiederholt. Resuspendieren Sie das Pellet (wie in Schritt 2.3.2 mit den gleichen Vorsichtsmaßnahmen) entweder in HEPES-Puffer oder in einem anderen Puffer, der für nachgeschaltete Experimente (hier nicht beschrieben) erforderlich ist, wie z. B. Proteinschätzung, Nano-Tracking-Analysen, Negativfärbung, Transmissionselektronenmikroskopie, Western Blot und Immungold-Markierung.
      HINWEIS: Für eine bessere Resuspension beschallen Sie das mEV-haltige Röhrchen 10 Minuten lang mit einem Ultraschall-Wasserbad-Ultraschallgerät. Eine längere Beschallung kann zum Reißen und Verlust intakter mEVs führen. Wenn sie gut aufgehängt wird, ist eine Beschallung unnötig. Alle Schritte von 2.1 bis 2.6 sind identisch, während MTB-generierte Elektrofahrzeuge angereichert werden.

3. Aufbau und Anreicherung von rekombinanten mEVs.

HINWEIS: Eines der 10 am häufigsten vorkommenden Proteine (identifiziert durch Massenspektrometrie) von MSM-EVs ist Cfp-2930. Aufgrund seiner geringen Größe (29 kDa), seiner einfachen Sekundärstruktur 40, seiner Lokalisation an der Membran41 und seiner Neigung, in axenische Kulturen in verbrauchte Medien sezerniert zu werden (z. B. als Kulturfiltratprotein; das sowohl von Msm als auch von Mtb42,43 sezerniert wird), wurde es hier ausgenutzt, um einen rot fluoreszierenden Reporter und ein Protein von Interesse (EsxAMtb) in mEVs zu liefern. Um dies zu erreichen,

  1. Verwenden Sie geeignete Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Tabelle 1; kompatibel für die direkte Klonierung in einen Shuttle-Vektor wie pMV261) für die Amplifikation von cfp-29 aus Msm. Unter Verwendung von ~50 ng hochmolekularer (~>20 kb) genomischer MSM-DNA als Vorlage wird das cfp-29-Genfragment mit einer High-Fidelity-DNA-Polymerase (z. B. Phusion oder Q5) PCR-amplifiziert . Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers für die PCR.
    ANMERKUNG: Entwerfen Sie die erforderlichen Restriktionsstellen in Primer, um das Klonen in jeden alternativen Shuttle-Vektor von Interesse zu erleichtern. Die PCR-Bedingungen und das PCR-Volumen variieren je nach Art und Marke der verwendeten DNA-Polymerase. Das Volumen der Reaktionsmischung variiert in Abhängigkeit von der Menge der DNA-Matrize und der Menge der DNA-Polymerase. Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers für PCR-Bedingungen, den Erfolg der Amplifikation und die Eliminierung des unspezifischen Annealings von Primern.
  2. PCR Reinigen Sie das eluierte Amplikon mit einem handelsüblichen PCR-Aufreinigungskit und überprüfen Sie die Amplikonlänge durch Standard-Agarose-Gelelektrophorese. Das gereinigte Amplikon verdauen.
    1. Schätzen Sie die Menge des gereinigten Amplikons auf einem Spektralphotometer. Verwenden Sie mindestens 2 μg cfp-29-Amplikon für die Verdauung.
    2. Zuerst mit BstB1 bei 65 °C für 1 h verdauen (Art und Menge des Puffers und Enzyms - gemäß den Empfehlungen des Herstellers), die Reaktionstemperatur auf RT senken und dann mit HindIII für 1 h bei 37 °C verdauen (Art und Menge des Puffers und Enzyms - gemäß den Empfehlungen des Herstellers).
    3. PCR reinigt und eluiert das verdaute Amplikon in 50 μl autoklaviertem nukleasefreiem ddw.
    4. Schätzen Sie die Konzentration und Ausbeute des aufgeschlossenen Amplikons mit einem Spektralphotometer. Bei -20 °C lagern, bis die Ligatur eingerichtet ist. HINWEIS: Überprüfen Sie nach der PCR die Amplikonlänge (~798 + 50 bp) und die Ausbeute, indem Sie 10 μl der PCR-Reaktionsmischung auf einem 1%igen Agarose-Gel elektrophoresieren. Obwohl ein doppelter Verdau mit dieser Kombination von Enzymen nicht möglich ist, verhindert ein kompatibler Puffer eine wiederholte PCR-Aufreinigung und den anschließenden Verlust des verdauten Amplikons. Die Konzentration des verdauten Amplikons variiert je nach Kit, das für die PCR-Aufreinigung verwendet wird. Sie variiert auch mit der Länge (in bp) alternativer Vektoren der Wahl.
  3. Verwenden Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Tabelle 1), eine DNA-Polymerase und ~50 ng genomische Mtb-DNA, PCR amplifizieren esxA- oder esxA-3X FLAG-Tag-spezifisches Amplicon. Verwenden Sie ~5 ng geeigneter Plasmid-DNA zur PCR-Amplifikation von mCherry. Plasmid- und Sequenzdetails befinden sich in der Zusatzdatei 1.
    HINWEIS: Verwenden Sie einen Glycin-, Glycin-, Glycin-,Glycin-44,45(G4S)-Linker zwischen cfp-29 und mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; Vor dem Start von mCherry hilft der G4S-Linker mCherry, keine unechten nicht-funktionalen Falten zu durchlaufen (einschließlich solcher, die von Cfp-29 angetrieben werden). Siehe cfp-29-, hsp60-Promotor-, mCherry- und esxA-Sequenzen in Ergänzungsdatei 1. Plasmide, die als Templates für mCherry dienen, sind in verschiedenen Plasmid-Repositorien/-Banken verfügbar. Es stehen verschiedene Versionen (leicht veränderte Sequenzen) von mCherry zur Verfügung, die veränderte Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen erfordern. Die Primer (Tabelle 1) helfen bei der Amplifikation der in Ergänzungsdatei 1 erwähnten mCherry. Die Fusion des N-Terminus von mCherry/esxA/esxA::3XFLAG mit dem C-terminalen Ende von Cfp-29 funktioniert gut.
  4. Verdauen Sie 1 μg DNA der mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-Amplikons und reinigen Sie die verdaute DNA.
    1. Jedes Amplikon mit HindIII und HpaI 1 h lang bei 37 °C (oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers) doppelt verdauen.
    2. Verwenden Sie ein handelsübliches PCR-Aufreinigungskit und die Empfehlungen des Herstellers für die Reinigung des verdauten Amplikons. Das verdaute Amplikon wird in 50 μl autoklaviertem nukleasefreiem ddw eluiert.
    3. Schätzen Sie die Konzentration und Ausbeute des aufgeschlossenen Amplikons mit einem Spektralphotometer. Bei -20 °C lagern, bis die Ligatur eingerichtet ist.
  5. Verdauen Sie 2 μg pMV261-KanR (Ergänzungsdatei 1) oder einen geeigneten Klonierungsvektor mit dem/den Enzym(en) Ihrer Wahl.
    1. Zuerst mit BstB1 bei 65 °C für 1 h verdauen (Art und Menge des Puffers und Enzyms - gemäß den Empfehlungen des Herstellers), die Reaktionstemperatur auf RT senken und dann mit HindIII für 1 h bei 37 °C verdauen (Art und Menge des Puffers und Enzyms - gemäß den Empfehlungen des Herstellers).
    2. Gel reinigen und eluieren in 50 μl autoklaviertem nukleasefreiem ddw.
    3. Schätzen Sie die Konzentration und Ausbeute des verdauten Vektors mit einem Spektralphotometer. Bei -20 °C lagern, bis die Ligatur eingerichtet ist.
      HINWEIS: Die Klonierung von zwei Fragmenten in einem Schritt ist mit den oben genannten Primern für pMV261 möglich. Jeder alternative Shuttle-Vektor, der als Episom überlebt, funktioniert. Integrative Plasmide funktionieren ebenfalls, aber die rekombinante Proteinausbeute wird pro Zellbasis relativ gering sein.
  6. Ligatieren und in einen kompatiblen Stamm von E. coli umwandeln.
    1. Für die Ligatur werden 125 ng des Vektors verwendet. Verwenden Sie entsprechend verdaute mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-Amplikons in einem molaren Verhältnis von 1:3. Die Ligatur über Nacht mit T4 DNA Ligase (Menge gemäß Herstellerempfehlung) bei 16 °C im gekühlten Umlaufwasserbad durchführen.
      HINWEIS: Verwenden Sie geeignete Kontrollen, wie z. B. Vektoren nur mit und ohne T4-DNA-Ligase, um die Effizienz der Verdauung zu bewerten und die Effizienz des Klonerfolgs vorherzusagen.
    2. Transformation
      1. NEB5α chemisch kompetente Zellen aliquots (~100 μl pro Transformation) 15 Minuten lang auf Eis auftauen. Zweimal vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze mischen. Geben Sie eine Ligationsmischung (bis zu 20 μl) zu den kältekompetenten Zellen.
      2. Mischen Sie vorsichtig Pipettenzellen + ligierte DNA. Die Mischung weitere 30 Minuten auf Eis inkubieren.
      3. Hitzeschock bei 42 °C (im zirkulierenden Wasserbad) für 60 s geben und sofort für weitere 15 Minuten wieder auf Eis überführen.
      4. Die transformierten Zellen werden durch Zugabe von 1 ml SOC-Bouillon (2 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 und 20 mM Glukose) gewonnen und bei 37 °C für 1 h bei 200 U/min inkubiert.
      5. Die zurückgewonnenen Bakterien werden in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (3000 × g, RT und 10 min) heruntergeschleudert, der Überstand verworfen, das Pellet in 200 μl sterilem, vorgewärmtem, frisch zubereitetem LB-Medium resuspendiert und die Suspension auf frisch gegossenen LB Miller-Agarplatten verteilt, die die erforderlichen Antibiotika in angemessener Konzentration enthalten.
      6. Inkubieren Sie die Petrischalen in einem Platteninkubator, der auf 37 °C voreingestellt ist.
  7. Screening (hier nicht detailliert) auf potentielle Klone, Verifizierung (mittels Kolonie-PCR-/Restriktionsenzymen)46 und Sequenzierung (Sanger-Sequenzierung), um die Fusion zu bestätigen.
  8. Extrahieren Sie Plasmid-DNA (~200 ng/1-2 μL; jedes kommerziell erhältliche Kit) des bestätigten Klons (E. coli-Hintergrund ) und transformieren Sie sie in frisch hergestellte elektrokompetente Zellen von Msm.
  9. Präparation von elektrokompetenten Msm-Zellen
    1. Frisch wachsendes Msm (wie in den Schritten 1.2.1 und 1.2.2). Waschen Sie das frisch gewachsene Msm wie in den Schritten 1.3.3 und 1.3.4 (außer verwenden Sie 7H9 + ADC + Tween-80 (reichhaltig) anstelle von Sauton).
    2. Man fügt ein Aliquot der gewaschenen Msm-Zellen zu einem endgültigen OD 600 von ~0,05 in einem sterilen 500-ml-Erlenmeyerkolben hinzu, der150 ml reichhaltiges Medium enthält.
    3. Im Inkubatorschüttler bei 200 U/min und 37 °C inkubieren, bis der Kultur-OD600 ~0,8 bis 1,0 (~12-14 h) erreicht.
    4. Die Kultur in eine vorgekühlte 400-ml-Zentrifugenflasche überführen und 60-90 Minuten auf Eis inkubieren. Dann werden die Zellen bei 4 °C für 15 Minuten bei 4.000 × g pelletiert.
    5. Waschen Sie die Zellen zweimal (jeweils mit 150 ml, bei 4.000 × g, 4 °C und 15 min) mit eiskaltem, sterilem (autoklaviertem) 10%igem Glycerin.
      HINWEIS: Mit jeder Wäsche löst sich das Pellet. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den gesamten Überstand (nach jeder Wäsche) entsorgen. Andernfalls geht der Großteil der Zellen im ausrangierten Überstand verloren.
    6. Waschen Sie die Zellen noch einmal mit 75 ml eiskaltem, sterilem 10%igem Glycerin, das 0,005% Tween-80 enthält.
    7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 7,5 ml 10 % Glycerin mit 0,005 % Tween-80 und aliquot in 400 μl Aliquoten.
      HINWEIS: Obwohl elektrokompetente MSM-Zellen mindestens 4 Monate lang kompetent sind, liefern frisch zubereitete elektrokompetente Zellen die besten Ergebnisse. Bei der Verwendung alter kompetenter Zellen erscheinen einige nicht-rosafarbene Kolonien (weiße) als falsche Transformanten. Je älter die kompetenten Zellen, desto mehr weiße Kolonien.
  10. Transformation von MSM
    1. Tauen Sie die MSM-kompetenten Zellen aliquot auf Eis auf.
      HINWEIS: Das Auftauen bei RT und das Umwandeln solcher Zellen führt zu einer geringeren Effizienz.
    2. Geben Sie 1-2 μl Plasmid-DNA (~200 ng insgesamt) zu den kalten kompetenten Zellen, mischen Sie vorsichtig mit einer sterilen 1-ml-Pipettenspitze und geben Sie sie in eine vorgekühlte sterile 2-mm-Elektroporationsküvette.
    3. Übertragen Sie die geschlossene Küvette mit einer Mischung aus MSM-kompetenten Zellen + Plasmid-DNA in die Maus des Elktroporators, schließen Sie den Deckel vorsichtig und legen Sie einen Impuls (exponentieller Zerfallstyp) bei 2,5 kV (Spannung), 25 μF (Kapazität) und 1000 Ω (Widerstand) an.
    4. Sofort 1 ml vorgewärmtes sterilreiches Medium (7H9 + ADC + Tween-80) in die Küvette geben, vorsichtig mit einer sterilen 1-ml-Pipettenspitze mischen und den gesamten Inhalt in ein steriles 10-ml-Röhrchen überführen.
    5. Inkubieren Sie den Inhalt 3 Stunden lang in einem Inkubatorschüttler, der auf 37 °C und 200 U/min eingestellt ist. Schleudern Sie den Inhalt in einem Mikrozentrifugenröhrchen (4.000 × g, RT und 10 min), verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl sterilem, vorgewärmtem reichhaltigem Medium und verteilen Sie die Suspension auf frisch gegossenen 7H11-Agarplatten, die ADC, Tween-80 und die erforderlichen Antibiotika in geeigneten Konzentrationen enthalten.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf Hygromycin, Kanamycin und Apramycin in den Endkonzentrationen von 50 μg/ml, 25 μg/ml bzw. 50 μg/ml. MSM an sich ist NICHT resistent gegen diese Antibiotika. Verwenden Sie diese Antibiotika nur, wenn Sie Plasmide mit den entsprechenden resistenten Genen für die Selektion/das Wachstum von Transformanten/rekombinanten MSM-Kolonien verwenden.
    6. Inkubieren Sie die Petrischalen in einem Platteninkubator, der auf 37 °C eingestellt ist. Typischerweise treten Transformanten zwischen 3 und 5 Tagen auf.
      HINWEIS: Wenn ein Protein von Interesse toxisch für MSM ist, können die Transformanten später auftreten oder nicht entstehen. Klonen Sie in solchen Fällen abgeschnittene Versionen der vollen Länge.
    7. Legen Sie Glycerinvorräte der entstehenden MSM-Kolonien an, nachdem Sie sie auf positive Klone überprüft haben (wie Schritt 3.7)
  11. Um R-mEVs anzureichern, die entweder mCherry- oder EsxA-Proteine enthalten, züchten Sie zunächst R-Msm, das entweder mCherry oder exsA oder esxA::3X FLAG exprimiert, indem Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.3 und dann die Schritte 2.1 bis 2.6 ausführen. zur Anreicherung von R-mEVs. Die R-mEVs eluieren in den Spin des 4.-7.Bruchs nach dem Dichtegradienten (Schritt2.5). Die R-mEVs pelletieren nach dem ersten Ultrazentrifugationsschritt (2.3.1). Vergewissern Sie sich nach der Ausführung wie in Schritt 2.3.1, dass die R-mEVs als dunkelviolettes bis magentafarbenes Pellet mit einem Durchmesser von 5-7 mm unten in der Mitte der Ultrazentrifuge sichtbar sind.
  12. Führen Sie westliche Analysen47 (hier nicht detailliert) durch, um Proteine von Interesse in den angereicherten R-mEVs nachzuweisen.

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Representative Results

Wir verwenden M. smegmatis (Msm) als Modellmykobakterium, um die Anreicherung sowohl von nativen als auch von rekombinanten mEVs (R-mEVs) zu demonstrieren. Dieses schematisch zusammengefasste mEVs-Anreicherungsprotokoll (Abbildung 1) funktioniert auch für die Anreicherung von R-mEVs von MSM und nativen EVs von Mtb (mit geringfügigen Modifikationen wie in den Protokollanmerkungen von 1.2). Die Visualisierung der angereicherten mEVs erfordert eine negative Färbung unter einem Transmissionselektronenmikroskop36 (Abbildung 2A). Typischerweise trennen sich MSM-spezifische EVs in den 4-6-1-ml-Fraktionen des 13-ml-Dichtegradienten von 6-60 % ab (Abbildung 2B). Etwa 80-100 μg Proteinäquivalent von EVs werden routinemäßig aus 2 l mittellogarithmischen axenischen Kulturen von Msm gewonnen. Ihre Durchmesser liegen typischerweise zwischen 20 nm und 250 nm (Abbildung 2C).

Ein langfristiges Ziel unseres Labors ist es, zu untersuchen, ob mEVs verschiedener Mykobakterien möglicherweise als Untereinheiten-Booster für den bestehenden Impfstoff BCG fungieren könnten. Da die Anreicherung von mEVs, die von pathogenen Bakterien erzeugt werden, zeitaufwändig, riskant und teuer ist, könnte die Nutzung nativer und rekombinanter EVs aus avirulenten Mykobakterien eine geeignete Alternative sein. Daher wollen wir nicht nur das Protokoll standardisieren, um die mEVs von MSM anzureichern, sondern auch seine R-mEVs zu konstruieren und anzureichern.

Um R-mEVs zu konstruieren, wählten wir zunächst die 10 am häufigsten vorkommenden Proteine von Msm EVs aus (Tabelle 1; wir identifizierten sie aus detaillierten massenspektrometrischen Analysen der Msm EVs)30. Wir stellten die Hypothese auf, dass, wenn ein fremdes Protein von Interesse translational mit einem von ihnen fusioniert wird, es in der Lage sein sollte, in mEVs zu lokalisieren. Dann haben wir Cfp-29 in die engere Wahl gezogen, weil es das kleinste unter ihnen ist (~29 kDa), membranlokalisiert ist und ein Kulturfiltratprotein mit einer relativ einfachen Sekundärstruktur40,41,42,43 ist. Wir fusionierten das N-terminale Ende von mCherry (fluoreszierendes Protein) translational mit dem C-terminalen Ende von Cfp-29 und untersuchten seine Beladung/Abgabe in mEVs. Ein Teil der angereicherten mEVs von Msm färbte sich rosa (Abbildung 3), was auf die Fähigkeit von Cfp-29 hindeutet, ein fremdes Protein von Interesse in MSM-EVs zu transportieren.

Angesichts dieser Fähigkeit von Cfp-29 (Abbildung 3) untersuchten wir dann EsxA (Esat-6), ein wichtiges immunogenes Protein37,38,39, das in MSM-EVs abgegeben wird. Auch hier haben wir zwei unabhängige translationale Fusionen zum C-Terminus von Cfp-29-only EsxA und EsxA + 3X FLAG-Tag (3X FLAG fusioniert mit dem C-Terminus von EsxA. Wie erwartet, beobachteten wir EsxA von Mtb in MSM-Elektrofahrzeugen (Spuren 5, 6 und 10, Abbildung 4A,B), wenn auch in geringen Mengen. Interessanterweise war Cfp-29::EsxA::3XFLAG viel stabiler (Spuren 3 und 4 plus 8 und 9; Abbildung 4A) und kumulierten in höheren Konzentrationen in mEVs (Spuren 3 und 4 plus 8 und 9; Abbildung 4B). Zusammenfassend demonstrieren wir das Design, die Konstruktion und die Anreicherung von R-mEVs, die ein Fremdprotein von Interesse enthalten (Abbildung 3 und Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Anreicherung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel. "Tage" (in roter Schrift, oben in der Abbildung) bezieht sich auf die Tage, die erforderlich sind, um die mEVs von Msm anzureichern (speziell für die Protokollschritte 1 und 2). "Schritte" (in schwarzer Schrift, unten in der Abbildung) beziehen sich auf die Protokollschritte, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Für die Anreicherung von mEVs aus Mtb dauert es mindestens 10 Tage, bis die verschiedenen Schritte der Kultivierung (Schritt 1) zum ersten Schritt der Zentrifugation (Schritt 2) führen, obwohl alle Schritte ähnlich sind. Nachfolgende Schritte erfordern eine identische Dauer (wie in roter Schrift angegeben). Vor dem Dichtegradienten sehen die mEVs-Pellets + extrazellulären Komplexe farblos aus, wenn sowohl native mEVs als auch R-mEVs angereichert werden. Es würde jedoch rosa bis blau erscheinen (siehe Abbildung 3), wenn mEVs angereichert werden, die mCherry enthalten. Nach dem Dichtegradienten würden die mEVs in der Dichtegradientenröhre weiß (native und R-mEVs) oder rosa (wenn sie mCherry enthalten) erscheinen. Die Farben der mEVs in der Abbildung dienen nur der Übersichtlichkeit und stellen nicht die genauen Farben dar. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 3 . Abkürzungen: Msm = M. smegmatis; Mtb = M. tuberculosis; 0,45 und 0,22 μm = Porengröße der Entsorgungsfiltereinheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Mykobakterielle EVs sind zirkulär, konzentrieren sich mit Dichtegradienten und variieren in ihren Abmessungen . (A) Ein repräsentatives Bild von MSM-EVs bei ihrer Visualisierung mit negativer Färbung und Betrachtung unter einem Transmissionselektronenmikroskop. Maßstabsleiste = 200 nm. (B) Ein repräsentatives Bild davon, wie mEVs im Ultrazentrifugenröhrchen erscheinen, wenn ein Dichtegradient von 6-60% durchgeführt wird. Wenn der Gradient von 6 bis 60 % nicht genau geschichtet ist, kann sich die Positionierung der Haupt- (oben geöffneter Pfeil) und der Nebenbänder (unten offener Pfeil) von mEVs erheblich ändern, wodurch sich die 1-ml-Bruchzahl ändert. (C) Ein repräsentatives Bild nach der Nanotracking-Analyse von angereicherten mEVs von Msm. Nanotracking-Analysen zeigen die Anteile und Konzentrationen von mEVs unterschiedlicher Größe und die Gesamtzahl der mEVs innerhalb des Präparats. Im Durchschnitt werden mit dem hier beschriebenen Protokoll ~1-3 × 1010 EVs mit 2 l Msm und Mtb angereichert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Verschiedene Schritte, die auf die Anreicherung von mEVs hinweisen, die mCherry exprimieren. (A) Repräsentatives Bild, das die axenische Kultur von Msm zeigt, die Cfp-29::mCherry exprimiert. (B) Repräsentatives Bild des bakteriellen Pellets nach der Zentrifugation einer axenischen MSM-Kultur, die Cfp-29::mCherry exprimiert. (C) Repräsentatives Bild des Kulturfiltratkonzentrats, das nach der Konzentrierung des verbrauchten Mediums der axenischen MSM-Kultur erhalten wurde, das Cfp-29::mCherry durch Zenzentronkonzentratoren exprimiert. (D) Repräsentatives Bild von mEVs + extrazellulären Komplexen nach der Ultrazentrifugation von Kulturfiltratkonzentrat, das aus einer Msm-Axenkultur gewonnen wurde, die Cfp-29::mCherry exprimiert. Das Pellet würde jedoch farblos bleiben, wenn die mEVs entweder nativ oder rekombinant (nach Fusion zu Cfp-29) für ein oder mehrere fremde Proteine außer mCherry wären. (E) Repräsentative Bilder von mCherry mit mEVs. Beachten Sie, dass nicht alle mEVs rosa sind, was darauf hindeutet, dass nicht alle mEVs Cfp-29 enthalten. Gut: Ein repräsentatives Bild, das verschiedene Bänder von mEVs zeigt, die typischerweise nach der Anreicherung für Cfp-29::mCherry-EVs erhalten werden. Da mCherry-haltige EVs dichter sind, trennen sie sich in spätere Fraktionen. Schlecht: Ein repräsentatives Bild, das auf eine schlechte Trennung hinweist (die weißen mEVs trennen sich in der ersten/zweiten Fraktion und die mCherry-haltigen mEVs trennen sich in der 10. Fraktion ab (möglicherweise aufgrund einer schlechten Resuspension des mEVs-Pellets, d. h. Protokollschritt2.3.2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Rekombinante mEVs, die EsxA (ESAT-6), ein Mtb-kodiertes Immunogen in MSM-Gesamtzelllysat, und MSM-generierte EVs enthalten. (A) Bilder von Coomassie-Gel und (B) Western-Analyse (nachgewiesen mit ESAT6-spezifischen polyklonalen Antikörpern), die die Akkumulation von fusioniertem ExsA sowohl in MSM-Gesamtzelllysat als auch in mEVs zeigen, die entweder cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, Spuren 3 und 4 (Gesamtlysat) und Spuren 8 und 9 (mEVs)) oder cfp-29 exprimieren: esxA (- 3XFLAG, Spuren 5 und 6 (Gesamtlysat) und Spur 10 (mEVs)). Offene und gefüllte Pfeile zeigen akkumuliertes Cfp-29::ExsA::3XFLAG bzw. Cfp-29::ExsA an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zündkapseln:
Sl # Gen Fibel Sequenz (5' bis 3') Quelle Zum Klonen in
1 GFP-29-KARTON Vorwärts CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC Genomische MSM-DNA pMV261-KARTON
Rückwärts GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG Genomische MSM-DNA pMV261-KARTON
2 mCherry Vorwärts GAAAAGCTT(HindIII) ggcggcggtggctcg (G4S-Linker)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG Labor-Kollektion pMV261-KARTON
Rückwärts TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC Labor-Kollektion pMV261-KARTON
3 esxA Vorwärts GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S-Linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Genomische MTB-DNA pMV261-KARTON
Rückwärts TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 Genomische MTB-DNA pMV261-KARTON
4 exsA-3X FLAGGE Vorwärts GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S-Linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Genomische MTB-DNA pMV261-KARTON
Rückwärts TGTGTTAAC(HpaI)TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 Genomische MTB-DNA pMV261-KARTON

Tabelle 1: Primer-Sequenzen. Vorwärts- und Reverse-Primer für die Amplifikation von cfp-29, mCherry, esxA und esxA::3X FLAG und das Klonen in den Shuttle-Vektor pMV261 sind aufgeführt.

Ergänzungsdatei 1: A: pMV261, seine kreisförmige Karte, Hauptmerkmale und vollständige Nukleotidsequenz. Gelbe Highlight-HSP60-Promotor-Nukleotidsequenz; Grüne und cyanfarbene Highlight-Restriktionsstellen, in die mCherry-, esxA- und esxA::3X-FLAG-Amplikons kloniert wurden. B, C und D: Nukleotidsequenzen von cfp-29, mCherry bzw. esxA. Grünes Highlight-Stop-Codon von cfp-29, mCherry und esxA. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Da die Entwicklung eines neuartigen TB-Impfstoffs, der BCG überlegen ist und ihn ersetzen kann, nach wie vor eine große Herausforderung darstellt, verfolgen mehrere Gruppen die Entdeckung verschiedener TB-Impfstoffe mit Untereinheiten, die die Wirksamkeit von BCG steigern und seine Schutzdauer verlängern können48,49. Angesichts der zunehmenden Aufmerksamkeit für bakterielle EVs (bEVs) als potentielle Untereinheiten und als natürliche Adjuvantien50,51 ist die konsequente Anreicherung ausreichender Mengen von mEVs für ihre nachgelagerte Prüfung/Analyse zu einem wichtigen Schritt geworden. Unter Berücksichtigung dieser Forschungsfragen zielt dieses Protokoll darauf ab, mEVs aus axenischen Kulturen und deren rekombinanten Versionen anzureichern.

Während detaillierter massenspektrometrischer Proteomanalysen von MSM-EVs identifizierten Prados-Rosales et al. die 10 am häufigsten vorkommenden Proteine30. Des Weiteren stellten wir die Hypothese auf, dass bei ausreichender molekularer Entwicklung eines von ihnen ausreichen sollte, um ein fremdes Protein von Interesse in mEVs zu transportieren. Interessanterweise stach Cfp-29 aufgrund seiner verschiedenen Funktionen 39,40,41,42 als bestmögliche Option hervor. Unsere Daten zeigen tatsächlich, dass es ausreicht, mCherry und EsxA zu tragen (obwohl EsxA einen kleinen Tag an seinem C-Terminus benötigte, um stabiler zu sein) und sie in den mEVs zu akkumulieren. Kürzlich, im Jahr 2021, zeigten Tang et al., dass Cfp-29 ein Verkapselungsmolekül ist, das in der Lage ist, Peroxidasen vom Typ DyP (DyP) zu transportieren40. Vielleicht kann Cfp-29 auch andere fremde Proteine tragen.

Wir haben EsxA untersucht, weil es ein prominentes Mtb-Immunogen 37,38,39 ist, als Untereinheitsimpfstoff im Tiermodell37,38,39 schützend sein kann, klein ist; und sein Ortholog (MSMEG_0066) fehlt interessanterweise in MSM-EVs. Obwohl wir dies hier nicht diskutieren, haben wir erfolgreich R-mEVs für einige andere Mtb-Proteine (die nur in Mtb vorhanden sind und nicht von Msm kodiert werden) erzeugt, einschließlich Antigen 85B (Rv 1886c). Gleichzeitig ist es uns interessanterweise auch nicht gelungen, R-mEVs für einige andere zu generieren, darunter Rv2660c und Rv0288 in voller Länge, möglicherweise weil die Proteine für MSM toxisch sind. Wir schließen daraus, dass trotz Klonierung der korrekten Nukleotidsequenzen und wiederholter Transformationen keine Transformationen von Msm auftraten. Da EsxA für eine bessere Akkumulation in mEVs einen 3XFLAG-Tag an seinem C-Terminus-Ende benötigte, fügten wir allen anderen Mtb-kodierten Proteinen, die wir evaluierten, einen 3XFLAG-Tag hinzu. Trotz der Markierung überlebte Msm nicht, was darauf hindeutet, dass einige Mtb-Proteine trotz der Markierungsfusion toxisch bleiben. Wir spekulieren, dass es sich in diesen Fällen lohnen könnte, nur die vorhergesagten Epitopregionen zu klonen oder mehrere Epitope zusammenzufügen (derzeit in unserem Labor untersucht). Wir verwendeten einen kleinen Fünf-Aminosäure-Linker (vier Glycin und ein Serin) zwischen Cfp-29 und mCherry/EsxA, um den negativen Einfluss auf die Faltung des interessierenden Proteinszu minimieren 44,45. Wir prognostizieren, dass ohne diesen Linker die Proteinfaltung des interessierenden Proteins stark von der Cfp-29-Faltung beeinflusst würde.

Dieses Anreicherungsprotokoll lässt sich leicht auf die Anreicherung von MTB-generierten Elektrofahrzeugen ausweiten. Wir spekulieren auch, dass die Anreicherung von mEVs aus Umweltmykobakterien auch mit diesem Protokoll möglich sein sollte. Obwohl das Protokoll einfach und unkompliziert ist, dauert es immer noch 7-8 Tage, um MSM-generierte EVs und R-mEVs anzureichern. Im Gegensatz dazu benötigt es 15-20 Tage für die Anreicherung von MTB-generierten Elektrofahrzeugen. Die Konzentration von Elektrofahrzeugen auf ein kleineres Volumen ist zeitaufwändig und teuer, und wir untersuchen derzeit die tangentiale Durchflussfiltration und andere Ansätze, um das Problem der "Zeit" zu lösen.

Schließlich verwenden wir Sauton's und nicht 7H9 zur Anreicherung von mEVs, da das "ADC"-Präparat hohe Mengen an Rinderserumalbumin enthält, das alle nachgelagerten Anwendungen von mEVs beeinträchtigen kann. Dieses Protokoll kann leicht auf jedes andere spezifische Medium (z. B. eisenarme Medien) erweitert werden, das zur Bewertung der Zusammensetzung der mEVs verwendet werden muss. Alternativ könnte man für bestimmte Anwendungen im letzten Schritt (d. h. Protokollschritt 2.7.5) anstelle von HEPES-Puffer sterile Kochsalzlösung verwenden, wenn man diese Mäusen oder Meerschweinchen für verschiedene In-vivo-basierte Analysen injiziert.

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Disclosures

Alle Autoren erklären, dass diese Forschungsarbeit in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen/Interessen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Prof. Sarah M. Fortune herzlich für die freundliche Zurverfügungstellung von M. smegmatis mc2155 Stock. Sie danken auch Servier Medical Art (smart.servier.com) für die Bereitstellung einiger grundlegender Elemente für Abbildung 1. Sie bedanken sich aufrichtig für die Unterstützung der übrigen Labormitglieder für ihre Patientenanpassungen während der langen Nutzung der Inkubatorschüttler, Zentrifugen und Ultrazentrifugen zur mEV-Anreicherung. Sie danken auch Herrn Surjeet Yadav, dem Laborassistenten, dafür, dass er immer dafür gesorgt hat, dass die notwendigen Glaswaren und Verbrauchsmaterialien immer verfügbar und griffbereit waren. Zu guter Letzt danken sie den Verwaltungs-, Einkaufs- und Finanzteams von THSTI für ihre ständige Unterstützung und Hilfe bei der reibungslosen Durchführung des Projekts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

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Immunologie und Infektion Ausgabe 202 Extrazelluläre Vesikel rekombinante Vesikel Esat-6 Mykobakterien ExsA mCherry Cfp-29 Bakterien

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien
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Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

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