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Immunology and Infection

माइकोबैक्टीरिया के देशी और पुनः संयोजक बाह्य पुटिकाओं का संवर्धन

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

यह प्रोटोकॉल माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस (एमएसएम) की अक्षीय संस्कृतियों से देशी माइकोबैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (एमईवी) के संवर्धन का विवरण देता है और कैसे mCherry (एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर) युक्त पुनः संयोजक MsmEVs को डिजाइन और समृद्ध किया जा सकता है। अंत में, यह माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस के एस्क्सा प्रोटीन युक्त MsmEVs के संवर्धन के साथ उपन्यास दृष्टिकोण की पुष्टि करता है।

Abstract

माइकोबैक्टीरिया सहित अधिकांश बैक्टीरिया, बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) उत्पन्न करते हैं। चूंकि बैक्टीरियल ईवीएस (बीईवी) में मेटाबोलाइट्स, लिपिड, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सहित सेलुलर घटकों का एक सबसेट होता है, इसलिए कई समूहों ने सबयूनिट वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में अपनी सुरक्षात्मक शक्ति के लिए बीईवी के मूल या पुनः संयोजक संस्करणों का मूल्यांकन किया है। देशी ईवीएस के विपरीत, पुनः संयोजक ईवीएस को आणविक रूप से ब्याज के एक या अधिक इम्युनोजेन्स को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जाता है। पिछले दशक में, विभिन्न समूहों ने पुनः संयोजक बीईवी उत्पन्न करने के लिए विविध दृष्टिकोणों का पता लगाया है। हालांकि, यहां, हम माइकोबैक्टीरिया में पुनः संयोजक माइकोबैक्टीरियल ईवीएस (एमईवी) के डिजाइन, निर्माण और संवर्धन की रिपोर्ट करते हैं। इसके लिए, हम माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस (Msm) का उपयोग करते हैं, जो मॉडल प्रणाली के रूप में एक विषैला मिट्टी माइकोबैक्टीरियम है। हम पहले एमएसएम के देशी ईवीएस की पीढ़ी और संवर्धन का वर्णन करते हैं। फिर, हम पुनः संयोजक mEVs के डिजाइन और निर्माण का वर्णन करते हैं जिसमें या तो mCherry, एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन, या EsxA (Esat-6), माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का एक प्रमुख इम्युनोजेन होता है। हम इसे एक छोटे एमएसएम प्रोटीन सीएफपी -29 के सी-टर्मिनस के साथ अलग से mCherry और EsxA N-termini को फ्यूज करके प्राप्त करते हैं। Cfp-29 MsmEVs के कुछ प्रचुर मात्रा में मौजूद प्रोटीनों में से एक है। एमएसएम से पुनः संयोजक एमईवी उत्पन्न करने और समृद्ध करने का प्रोटोकॉल एमएसएम के देशी ईवी के उत्पादन और संवर्धन के समान है।

Introduction

संक्रामक रोगों के खिलाफ टीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास और प्रशासन के बावजूद, आज भी, सभी मानव मौतों का ~ 30% अभी भी संचारी रोगों से होता है1. क्षय रोग (टीबी) के टीके के आगमन से पहले - बैसिलस कैलमेट गुएरिन (बीसीजी) - टीबी नंबर एक हत्यारा था (~ 10,000 से 15,000/100,000 जनसंख्या)2. बीसीजी के प्रशासन और पहली और दूसरी पंक्ति की टीबी रोधी दवाओं तक आसान पहुंच के साथ, 2022 तक, टीबी से संबंधित मौतें नाटकीय रूप से घटकर ~1 मिलियन/वर्ष 2022 तक आ गई हैं (यानी, ~15-20/100,000 जनसंख्या1)। हालांकि, दुनिया की टीबी स्थानिक आबादी में, टीबी से संबंधित मौतें ~ 100-550 / 100,000 जनसंख्या1 पर खड़ी हैं। जबकि विशेषज्ञ इन विषम संख्याओं के लिए कई कारणों को पहचानते हैं, बीसीजी-मध्यस्थता सुरक्षा जीवन के पहले दशक तक भी नहीं टिकती है, प्रमुख कारण 3,4,5,6,7 प्रतीत होता है। नतीजतन, संयुक्त राष्ट्र के नए सिरे से 'सतत विकास लक्ष्यों' और डब्ल्यूएचओ की 'टीबी उन्मूलन रणनीति' को देखते हुए, बीसीजी के लिए एक बेहतर टीका विकल्प विकसित करने के लिए एक ठोस वैश्विक प्रयास है जो शायद टीबी से आजीवन सुरक्षा प्रदान करता है।

उस उद्देश्य की ओर, कई समूह वर्तमान में बीसीजी के अलावा संशोधित/पुनः संयोजक उपभेदों, गैर-रोगजनक और क्षीण माइकोबैक्टीरियल प्रजातियों का मूल्यांकन कर रहे हैं, और सबयूनिट उम्मीदवार 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . आमतौर पर, सबयूनिट टीके लिपोसोम होते हैं जो चुनिंदा रूप से रोगज़नक़ के कुछ शुद्ध (~ 1-6) पूर्ण-लंबाई या काटे गए इम्युनोजेनिक प्रोटीन से भरे होते हैं। हालांकि, गैर-देशी अनुरूपताओं और/या लोड किए गए प्रोटीनों के बीच यादृच्छिक गैर-कार्यात्मक बातचीत में उनके नकली तह के कारण, सबयूनिट्स में अक्सर देशी और जर्मन एपिटोप्स की कमी होती है और इसलिए, प्रतिरक्षा प्रणाली14,19,20 को पर्याप्त रूप से प्राइम करने में विफल रहते हैं।

नतीजतन, बैक्टीरिया के बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) ने एक आशाजनक विकल्प के रूप में गति पकड़ी है 21,22,23,24,25,26. आमतौर पर, बैक्टीरियल ईवीएस (बीईवी) में उनके सेलुलर घटकों का एक सबसेट होता है, जिसमें न्यूक्लिक एसिड, लिपिड और सैकड़ों मेटाबोलाइट्स और प्रोटीन27,28के कुछ हिस्से शामिल हैं। लिपोसोम के विपरीत जहां कुछ शुद्ध प्रोटीन कृत्रिम रूप से लोड होते हैं, बीईवी में सैकड़ों स्वाभाविक रूप से भरी हुई, मूल रूप से मुड़े हुए प्रोटीन होते हैं, जो प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रमुख बनाने के लिए बेहतर प्रवृत्ति के साथ होते हैं, विशेष रूप से सहायक और टोल-जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) एगोनिस्ट27,28,29 के बूस्ट/सहायता के बिना। यह अनुसंधान की इस पंक्ति में है कि हमने और अन्य ने बीसीजी30 के लिए संभावित सबयूनिट बूस्टर के रूप में माइकोबैक्टीरियल ईवीएस की उपयोगिता का पता लगाया है। चिंताओं के बावजूद कि बीईवी में समान एंटीजन लोड की कमी है, क्षीण नेइसेरिया मेनिंगिटिडिस से ईवीएस ने सफलतापूर्वक सेरोग्रुप बी मेनिंगोकोकस31,32 के खिलाफ मनुष्यों की रक्षा की है।

कम से कम सैद्धांतिक रूप से, सबसे अच्छा ईवी जो बीसीजी को अच्छी तरह से बढ़ावा दे सकता है, वे रोगजनक बैक्टीरिया से समृद्ध ईवीएस हैं। हालांकि, रोगजनक माइकोबैक्टीरियम द्वारा उत्पन्न ईवीएस को समृद्ध करना महंगा, समय लेने वाला और जोखिम भरा है। इसके अतिरिक्त, रोगज़नक़ जनित ईवीएस सुरक्षात्मक की तुलना में अधिक विषैले हो सकते हैं। संभावित जोखिमों को देखते हुए, यहां, हम अक्षीय रूप से उगाए गए एमएसएम, एक एविरुलेंट माइकोबैक्टीरियम द्वारा उत्पन्न ईवीएस के संवर्धन के लिए एक अच्छी तरह से परीक्षण किए गए प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।

हालांकि, कई रोगज़नक़ प्रोटीन ऑर्थोलॉग एन्कोडिंग के बावजूद, एविरुलेंट माइकोबैक्टीरिया में कई वैक्सीन एंटीजन/रोगजनक प्रोटीन एपिटोप्स की कमी होती है जो प्रतिरक्षा प्रणाली को सुरक्षा33 की दिशा में पर्याप्त रूप से प्राइम करने के लिए आवश्यक होते हैं। इसलिए, हमने आणविक इंजीनियरिंग के माध्यम से एमएसएम के पुनः संयोजक ईवीएस के निर्माण और समृद्ध करने का भी पता लगाया, जैसे कि एमएसएम में व्यक्त और अनुवादित ब्याज के किसी भी रोगजनक प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा, अपने ईवीएस तक पहुंचना चाहिए। हमने अनुमान लगाया कि एमएसएम ईवीएस के शीर्ष 10 प्रचुर मात्रा में प्रोटीन में से एक या अधिक जब ब्याज के प्रोटीन से जुड़े होते हैं, तो इस तरह के अनुवाद में सहायता मिलेगी।

जबकि हम अपनी प्रयोगशाला में माइकोबैक्टीरियल ईवीएस (एमईवी) के संवर्धन को मानकीकृत करना शुरू कर रहे थे, 2011 में, प्राडोस-रोजलेस एट अल ने पहली बार इन विट्रो30 में एमईवी के विज़ुअलाइज़ेशन और संवर्धन की सूचना दी। बाद में, 2014 में, उसी समूह ने अपनी 2011 विधि34 का एक संशोधित संस्करण प्रकाशित किया। 2015 में, ली एट अल ने माइकोबैक्टीरिया35 के अक्षीय संस्कृतियों से फिर से एमईवी संवर्धन के लिए एक स्वतंत्र रूप से मानकीकृत विधि की सूचना दी। दोनों प्रोटोकॉल34,35 के संयोजन और पूरी तरह से मानकीकरण के बाद हमारे संशोधनों में से कुछ को शामिल करते हुए, हम यहां एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो माइकोबैक्टीरिया 36 की अक्षीय संस्कृतियों से नियमित रूप से समृद्ध एमईवी में मदद करता है।

यहां, हम विशेष रूप से एमएसएम-विशिष्ट ईवीएस के संवर्धन का विस्तार करते हैं, जो सामान्य रूप से माइकोबैक्टीरियल ईवीएस के संवर्धन के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल36 का विस्तार है। हम यह भी विस्तार से बताते हैं कि पुनः संयोजक mEVs (R-mEVs) का निर्माण कैसे किया जाए जिसमें mCherry प्रोटीन (लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में) और EsxA (Esat-6)37,38,39 एक प्रमुख इम्युनोजेन और माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का एक संभावित सबयूनिट वैक्सीनोजेन शामिल है। आर-एमईवी को समृद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल उसी के समान है जिसे हमने एमएसएम से देशी ईवीएस को समृद्ध करने के लिए वर्णित किया है।

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Protocol

1. माइकोबैक्टीरियम स्मेगमैटिस, एस्चेरिचिया कोलाई और उनके डेरिवेटिव की वृद्धि की स्थिति

  1. मीडिया
    1. मिडलब्रुक 7H9 तरल शोरबा
      1. एक माइक्रोवेव में ~ 45-50 ओसी के लिए एक ग्लास बीकर में डबल-डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीडब्ल्यू) की आवश्यक मात्रा को प्री-वार्मिंग करके 20% ट्वीन -80 स्टॉक समाधान तैयार करें, एक उपयुक्त मापने वाले सिलेंडर का उपयोग करके ट्वीन -80 की आवश्यक मात्रा जोड़ें, और 20% ट्वीन -80 को समान समाधान में लाने के लिए एक छोटे चुंबकीय स्टिरर पर लगातार हलचल करें। 20 um निपटान फिल्टर के माध्यम से 80% Tween-0.22 फ़िल्टर करें और हल्के पीले स्टॉक समाधान को 4 oC पर स्टोर करें।
        नोट: मापने सिलेंडर में ट्वीन -80 के सभी निशान सटीक अंतिम एकाग्रता के लिए बीकर में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। तैयार ट्वीन -80 स्टॉक को ऑटोक्लेव न करें। फ़िल्टर (0.22 माइक्रोन का उपयोग करें) बाँझ करें और 4 oC पर स्टोर करें।
      2. 7H9 शोरबा की तैयारी के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। ddw के 900 एमएल में 7H9 पाउडर के 4.7 ग्राम निलंबित करें। ग्लिसरॉल के 2 एमएल जोड़ें, सामग्री मिलाएं, और 121 ओसी, 20 मिनट के लिए 15 साई पर आटोक्लेव मिलाएं।
        नोट: आटोक्लेविंग से पहले मिडलब्रुक एडीसी संवर्धन (एडीसी) और ट्वीन -80 न जोड़ें।
      3. आटोक्लेव्ड मीडिया कमरे के तापमान (आरटी, यानी, ~ 25 ओसी) तक ठंडा होने के बाद, एक मानक ए 2-प्रकार जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एडीसी (अंतिम 1x) के 100 एमएल के 10x स्टॉक और 20% ट्वीन -80 के 2.5 एमएल (अंतिम 0.05%) को एसेप्टिक रूप से जोड़ें। 0.22 माइक्रोन डिस्पोजेबल फिल्टर यूनिट के माध्यम से मिश्रण को फ़िल्टर करें और 4 ओसी पर बहुत हल्के पीले हरे, पारदर्शी स्टॉक समाधान को स्टोर करें।
        नोट: मीडिया का पीएच ~ 6.6 से 6.8 होना चाहिए (यदि <6.4 या >7.0, त्यागें और ताजा बनाएं)। 4 oC (3-4 सप्ताह के लिए स्थिर) पर स्टोर करें। दो स्वतंत्र 0.22 माइक्रोन डिस्पोजेबल फिल्टर इकाइयों के माध्यम से दो बार 7H9 मीडिया (एडीसी और ट्वीन -80 के अलावा के बाद) को फ़िल्टर करना अत्यधिक अनुशंसित है।
    2. Sauton (न्यूनतम मीडिया) तरल शोरबा
      1. ddw के 950 एमएल में एल-शतावरी (0.4% w/v) और साइट्रिक एसिड (0.2% w/v) को घोलें। डिबासिक पोटेशियम फॉस्फेट (रंगहीन; स्टॉक 10 ग्राम / 20 एमएल; अंतिम 1x 0.5 ग्राम / एल) के ताजा तैयार 1,000x स्टॉक (डीडीडब्ल्यू में) में से प्रत्येक 1 एमएल जोड़ें; मैग्नीशियम सल्फेट हेप्टाहाइड्रेट (रंगहीन; स्टॉक 10 ग्राम / 20 एमएल; अंतिम 1x 0.5 ग्राम / एल); और फेरिक अमोनियम साइट्रेट (बहुत हल्का भूरा; स्टॉक 1.6 ग्राम / 40 एमएल; अंतिम 1x 0.04 ग्राम / एल) और एक चुंबकीय स्टिरर पर अच्छी तरह से हलचल।
        नोट: सबसे अच्छा, 1,000x स्टॉक 2 सप्ताह पुराना हो सकता है; यदि इससे अधिक पुराना है, तो ताजा स्टॉक तैयार करें; उन्हें आरटी पर अंधेरे में स्टोर करें (उदाहरण के लिए, एक कैबिनेट / यदि फेरिक अमोनियम साइट्रेट गहरे भूरे रंग का है, तो इसे त्याग दें और इसे ताजा बनाएं। चरण 1.1.2.1 में उल्लिखित क्रम में तीन लवणों को जोड़ना सबसे अच्छा है। प्रत्येक नमक के घोल को जोड़ने से पहले हर बार घोल को घुमाएं।
      2. पीएच मीटर का उपयोग करके पीएच को मापें और नोट करें; सुनिश्चित करें कि यह लगभग 3.1 से 3.2 है। यदि पीएच 3.7 से अधिक है, तो स्टॉक को त्याग दें और ताजा तैयार करें। पीएच को 7.4 तक समायोजित करने के लिए, आवश्यकतानुसार 10 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड की कई बूंदों का उपयोग करें। एक चुंबकीय उत्तेजक पर समाधान/मीडिया को लगातार हिलाते हुए अंतिम पीएच की निगरानी करें।
      3. ग्लिसरॉल के 4.76 एमएल, 20% ट्वीन -80 के 0.25 एमएल (अंतिम 0.005%, चरण 2.2.1.3 के लिए नोट भी देखें) जोड़ें, और उसके बाद ही, वॉल्यूम को 1 एल तक बनाएं। फिर, दो अलग 0.22 माइक्रोन निपटान फिल्टर के साथ मध्यम के 1 एल दो बार फिल्टर बाँझ. स्पष्ट, रंगहीन माध्यम को 4 oC (2 सप्ताह के लिए स्थिर) पर स्टोर करें।
        नोट: पीएच को 7.4 में समायोजित करने के बाद ही, ग्लिसरॉल जोड़ें। अन्यथा, मीडिया बादल सफेद हो जाएगा। यदि बादल हैं, तो इसे त्याग दें (इसे गर्म करने की कोशिश न करें) और इसे ताजा तैयार करें। सभी mEVs की तैयारी के लिए, ताज़ी तैयार Sauton का उपयोग करें।
    3. मिडलब्रुक 7H11 अगर बेस
      1. तैयारी के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। ddw के 900 एमएल में 7H11 पाउडर के 19 ग्राम को निलंबित करें। ग्लिसरॉल के 5 एमएल जोड़ें, एक समान निलंबन प्राप्त करने के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक पर घूमता है (पीला हरा; पीएच 6.6 से 6.8; यदि >7.2, त्यागें और ताजा तैयार करें), और 121 ओसी, 15 साई, और 20 मिनट के लिए आटोक्लेव।
        नोट: आटोक्लेविंग से पहले एडीसी और 0.05% ट्वीन-80 न जोड़ें।
      2. जब माध्यम ~ 50 ओसी तक ठंडा हो जाता है, तो ए2 प्रकार की जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एडीसी के 100 एमएल (आरटी में लाया गया) और 20% (अंतिम 0.05%) ट्वीन -80 (आरटी में लाया गया) के 2.5 एमएल जोड़ें। तुरंत पेट्री व्यंजन में aseptically बांटना.
        नोट: प्लेटें कम से कम 4-6 सप्ताह के लिए 4 ओसी पर स्थिर हैं। सुनिश्चित करें कि प्लेटें 4 ओसी भंडारण के लिए प्लेटों को लपेटने से पहले रात भर आरटी पर हैं। अन्यथा, नमी 37 डिग्री सेल्सियसपर इनक्यूबेशन के दौरान प्लेटों में फंस जाएगी।
    4. मिलर लुरिया बर्टानी (एलबी) शोरबा और अगर बेस
      1. तैयारी के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। एलबी शोरबा तैयार करने के लिए, डीडीडब्ल्यू के 1,000 एमएल में 25 ग्राम पाउडर को निलंबित करें और चुंबकीय उत्तेजक पर ग्लास बीकर में 5 मिन के लिए धीरे से हिलाएं। वर्दी निलंबन पर, मीडिया की बोतलों (जैसे, 500 एमएल मीडिया बोतल में 300 एमएल) और आटोक्लेव में आवश्यक मात्रा को विभाज्य करें। एलबी अगर तैयार करने के लिए, डीडीडब्ल्यू और आटोक्लेव के 1,000 एमएल में 40 ग्राम पाउडर निलंबित करें (500 एमएल ग्लास मीडिया बोतल में 300 एमएल डीडीडब्ल्यू में 12 ग्राम पाउडर)।
  2. विकास की स्थिति
    नोट: बैक्टीरियल कल्चर कार्य के सभी चरणों को जैव सुरक्षा कैबिनेट (ए 2 प्रकार) में किया जाना चाहिए। सभी संस्कृतियों बाँझ ट्यूब, फ्लास्क, और विंदुक सुझावों के साथ संसाधित किया जाना चाहिए.
    1. दिन 1
      1. एमएसएम के ग्लिसरॉल स्टॉक में से प्रत्येक 1 एमएल जोड़ें (-80 ओ सी फ्रीजर से) 2 x 10 एमएल (50 एमएल बाँझ शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज्ड ट्यूबों में) ताजा आटोक्लेव, ठंडा, और प्रीवार्म्ड (~ 37 ओ सी) 7H9 शोरबा, तीन बार घुमाएं, पलकों को बंद करें, और 37 ओ सीऔर 200-220 आरपीएम (इनक्यूबेटर शेकर) पर रात भर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
        नोट: माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) विकसित करने के लिए, इसी तरह के चरणों का पालन करें लेकिन बीएसएल3 सेटिंग्स में 37 ओसी और 120-150 आरपीएम (इनक्यूबेटर शेकर) पर 4-6 दिनों के लिए 50 एमएल ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। एमटीबी और इसकी संस्कृतियों को संभालने और त्यागने के दौरान बीएसएल3 और जोखिम समूह 3 रोगजनकों के सभी अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों और जैव सुरक्षा प्रथाओं का पालन करें। एमटीबी और इसकी संस्कृतियों को संभालने के लिए बी 2 प्रकार जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करें।
    2. दिन 2
      1. जब आयुध डिपो 600 (एक600 एनएम; सेल डेंसिटोमीटर) ~ 1.0 तक पहुंच जाता है, तो 3,200 × ग्राम और आरटी (बेंचटॉप अपकेंद्रित्र) पर 10 मिनट के लिए एमएसएम संस्कृतियों को अपकेंद्रित्र करें। बाँझ 1 एमएल विंदुक सुझावों का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
        नोट: उपरोक्त चरण एमटीबी संस्कृतियों के लिए समान रहता है, सिवाय इसके कि दिनों की संख्या 4-7 है। विंदुक टिप के साथ बैक्टीरियल गोली को छूने के लिए नहीं सुनिश्चित करें.
      2. धोना: प्रत्येक एमएसएम गोली के लिए, प्रीवार्म्ड सौटन (आरटी पर) मीडिया (चरण 1.1.2) के 1 एमएल जोड़ें और एक समान निलंबन प्राप्त करने के लिए धीरे-धीरे 1 एमएल पिपेट युक्तियों के साथ फिर से निलंबित करें। बाँझ विंदुक सुझावों का प्रयोग, एक ही मीडिया के साथ 10 एमएल (प्रत्येक में) के लिए मात्रा बनाने. 3,200 × ग्राम और आरटी पर 10 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. इस चरण को एक बार फिर दोहराएं।
        नोट: उपरोक्त चरण एमटीबी संस्कृतियों के लिए समान रहता है।
      3. प्रीवार्म्ड सौटन (प्लेट या शेकर इनक्यूबेटर में प्रीवार्म) के 20 एमएल (प्रत्येक) में दो बार धोए गए एमएसएम कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 600 एनएम पर कोशिकाओं के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। बाँझ 1 एल Erlenmeyer बोतल में एमएसएम संस्कृतियों की आवश्यक मात्रा टीका लगाना जिसमें बाँझ सौटन के ~ 330 एमएल होते हैं जैसे कि अंतिम आयुध डिपो600 ~ 0.05 है।
        नोट: Resuspensions हमेशा एक छोटी मात्रा में शुरू होना चाहिए। अंतिम मात्रा सीधे एक ही कदम के रूप में गोली करने के लिए जोड़ा जाता है, कोशिकाओं विसरित छर्रों के रूप में रहेगा (गरीब निलंबन का एक संकेतक). समस्या को हल करने का एकमात्र तरीका संस्कृतियों को स्पिन करना और अनुशंसित के रूप में पुन: निलंबन को फिर से करना है। उपरोक्त कदम एमटीबी संस्कृतियों के लिए समान रहता है।
    3. दिन 2/3
      1. इनक्यूबेटर शेकर में 330 एमएल संस्कृति को 200 आरपीएम और 37 ओसी पर इनक्यूबेट करें जब तक कि संस्कृति ओडी600 ~ 0.3 तक नहीं पहुंच जाती। फिर, कोशिकाओं को एक बार धो लें (चरण 1.2.2.2 के समान लेकिन समान मात्रा के साथ) और फिर, उसी मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें। छह बाँझ 1 एल बाँझ Erlenmeyer फ्लास्क में प्रत्येक resuspended संस्कृतियों के 50 एमएल वितरित, प्रत्येक बाँझ prewarmed Sauton के 280 एमएल सामान्य रूप से इस्तेमाल किया (0.05%) Tween-80 यानी 0.005% के 1/10 वें के साथ सौटन (यह भी 1/10वें समझने के लिए कदम 2.2.1.3 के नोट देखें). अंतिम आयुध डिपो600 लगभग 0.05 होना चाहिए।
        नोट: एमटीबी संस्कृतियों के लिए, एर्लेनमेयर फ्लास्क के बजाय, रोलर बोतलों (1/2/4 एल क्षमता का) का उपयोग करें। प्रति बोतल संस्कृति मात्रा को समायोजित करें ताकि जब रोलर तंत्र पर रखा जाए, तो संस्कृति बोतल के मुंह तक नहीं पहुंचती है । रोलर बोतल में वास्तविक मात्रा रोलर बोतल की क्षमता पर निर्भर करेगी।
      2. इनक्यूबेटर शेकर में 330 एमएल संस्कृतियों में से प्रत्येक को 200 आरपीएम और 37 ओसी पर इनक्यूबेट करें जब तक कि आयुध डिपो600 2.0 से 2.5 (~ 15-18 एच) तक नहीं पहुंच जाता।
        नोट: एमटीबी संस्कृतियों के लिए, सुनिश्चित करें कि अंतिम आयुध डिपो600 ~ 1.0-1.2 है (~ 5-8 दिन लगते हैं)।

2. घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन को नियोजित करके एमएसएम एमईवी का संवर्धन

  1. दिन 4
    1. ~ 8,000 ×ग्राम (फर्श मॉडल अपकेंद्रित्र) पर 20 मिनट के लिए 4 ओसी पर 6 x 400 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र बोतलों में मध्य-घातीय चरण एमएसएम संस्कृतियों के ~ 2 एल अपकेंद्रित्र। दो पूर्व ठंडा, autoclaved 1 एल Erlenmeyer बोतल में खर्च मीडिया / संस्कृति सतह पर तैरनेवाला लीजिए और किसी भी विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं (जैसे एसडीएस-पेज और पश्चिमी सोख्ता-विस्तृत नहीं) के लिए गोली का एक विभाज्य की दुकान.
      नोट: बाद के सभी चरणों को एमईवी की अखंडता को बेहतर बनाए रखने के लिए ठंड (~ 4 डिग्री सेल्सियस) में किया जाना चाहिए। आरटी पर एमईवी काफी स्थिर हैं लेकिन लंबे समय तक स्थिरता के लिए प्रशीतन जरूरी है (बार-बार ठंड और विगलन की सिफारिश नहीं की जाती है)। अक्षीय संस्कृति के विकास के दौरान, एमईवी एमएसएम / एमटीबी की सतह से अलग हो जाते हैं और संस्कृति सतह पर तैरनेवाला / खर्च किए गए मीडिया में जमा होते हैं।
    2. बैक्टीरिया के सभी निशान को हटाने के लिए 0.45 माइक्रोन निपटान फिल्टर इकाई (ओं) के माध्यम से पहले एमएसएम संस्कृति सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर करें और फिर, 0.22 माइक्रोन निपटान फ़िल्टर इकाई (ओं) के माध्यम से।
      नोट: 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से प्रत्यक्ष निस्पंदन अक्सर फिल्टर इकाइयों को चोक करता है (क्योंकि चरण 2.1.1 का प्रदर्शन करते समय बैक्टीरियल गोली परेशान हो सकती है)। एमटीबी संस्कृति सुपरनेटेंट उत्पन्न करने के लिए, एमटीबी संस्कृतियों के तीन निस्पंदन (यानी, 0.45 माइक्रोन डिस्पोजेबल फिल्टर यूनिट के साथ पहला निस्पंदन कदम; 0.22 माइक्रोन डिस्पोजेबल फिल्टर इकाइयों के साथ दो लगातार निस्पंदन कदम) संस्कृति को बीएसएल-2 सेटिंग्स में स्थानांतरित करने से पहले बाहर ले जाएं।
  2. दिन 4/5
    1. 4 ओसी, 20 मिनट और 3,200 × ग्राम पर संस्कृति छानना अपकेंद्रित्र द्वारा ~ 38 एमएल तक एमएसएम संस्कृति छानना (~ 2 एल) को केंद्रित करने के लिए 30 केडीए झिल्ली सांद्रता का उपयोग करें।
      1. पहले बाँझ, ठंडे ddw (~ 15 एमएल) (4 ओसी, 5 मिनट और 3,200 × ग्राम पर धो लें) के साथ पहले से ही सांद्रक को धो लें।
      2. रसायनों के सभी निशान (निर्माण के दौरान प्रयुक्त) को हटाने के लिए प्रीफ़िल्टर्ड, ठंडे सौटन (पानी के लिए समान स्थिति (2.2.1.1.) के ~ 15 एमएल से धोएं।
      3. चूंकि ~ 130 सेंट्रिकॉन (यदि केवल एक उपयोग) तकनीकी रूप से ~ 2 एल संस्कृति छानना ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक हैं, यदि आवश्यक हो तो कम से कम 3-4 बार सेंट्रिकॉन का पुन: उपयोग करें। इन चरणों का पालन करें: 15 एमएल से 0.5 से 1.0 एमएल (चरण 2.2.1 का पालन करें) पर ध्यान केंद्रित करें, ध्यान को एक साफ, आटोक्लेव और ठंडे 38 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और फिर शेष अकेंद्रित संस्कृति छानना को फिर से स्थानांतरित करें दोहराने के लिए इस्तेमाल किए गए सेंट्रिकॉन के लिए।
        नोट: संस्कृति छानना के 2 एल ध्यान केंद्रित करने के लिए 24, 30 केडीए सांद्रता का उपयोग 6 घंटे तक ले जाएगा। संस्कृति छानना ध्यान केंद्रित करने पर, Tween-80 भी ध्यान केंद्रित हो जाता है और सांद्रक ब्लॉक कर सकते हैं. सौटन के मीडिया में ट्वीन -80 से 0.005% अंतिम (0.05% के बजाय) का उपयोग करने से इस रुकावट को रोकने में मदद मिलती है। ट्वीन -80 की कम सांद्रता विकास के दौरान एमएसएम के समान निलंबन को प्रभावित नहीं करती है और एमएसएम कोशिकाओं के क्लंपिंग का कारण नहीं बनती है। हालांकि, जैसा कि एमटीबी कोशिकाएं 0.005% ट्वीन -80 पर क्लंप करती हैं, एमटीबी-विशिष्ट ईवीएस के लिए 0.05% ट्वीन -80 का उपयोग करें।
    2. केंद्रित एमएसएम संस्कृति छानना (~ 38 एमएल) को एक साफ, धोया (डीडीडब्ल्यू के साथ) और पूर्व-ठंडा 40-50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे दो-चरण सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन करें, पहले 4,000 × ग्राम और फिर 15,000 × ग्राम पर, 20 मिनट के लिए 4 ओसी पर दोनों कदम (सभी मलबे को हटाने के लिए)। उसी के लिए एक फर्श-प्रकार अपकेंद्रित्र का उपयोग करें।
  3. दिन 5/6
    1. संस्कृति सतह पर तैरनेवाला को एक प्रीचिल्ड 38.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 4 ओसी पर 4 घंटे के लिए 100,000 × ग्राम पर एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें।
      नोट: एक स्विंग बाल्टी इस गति पर सबसे अच्छा काम करती है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को ब्रिम तक भरना सुनिश्चित करें और बराबर वजन की बैलेंस अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें। या तो ट्यूब centrifugation (जो संक्षेपण के कारण होता है के कारण होता है) के बाद स्विंग बाल्टी के लिए अटक गया है, संदंश का उपयोग कर, धीरे रोटर से इसे हटा दें. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन से पहले अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज की बाहरी सतह पर मौजूद संघनित नमी को पोंछना चिपके रहने से रोकता है।
    2. एक 50 एमएल prechilled ट्यूब (नोट देखें) में सतह पर तैरनेवाला बचाओ. सतह पर तैरनेवाला के निशान को हटाने के लिए एक ताजा लिंट-फ्री शोषक कागज पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को उल्टा करें। HEPES बफर समाधान के 600 μL में गोली को फिर से निलंबित करें (50 मिमी HEPES और 150 मिमी NaCl, पीएच 7.4; उपयोग करने से पहले फ़िल्टर-निष्फल करें)।
      नोट: केवल बैकअप के रूप में सतह पर तैरनेवाला सहेजें। देशी एमईवी गोली जेली जैसी, 5-7 मिमी व्यास, सुस्त भूरे पीले से पारभासी स्थान के रूप में दिखाई देती है। यदि कोई गोली दिखाई नहीं दे रही है, तो सहेजे गए सतह पर तैरनेवाला का पुन: उपयोग करके चरण 2.3.1 दोहराएं। यदि चरण 2.3.1 दोहराने के बाद कोई गोली दिखाई नहीं देती है, तो चरण 1.2 से त्यागें और पुनरारंभ करें। गोली को पुनर्जीवित होने में समय लगता है। HEPES बफर को जोड़ने और आसान पुन: निलंबन के लिए इसे रात भर 4 oC पर छोड़ने की सिफारिश की जाती है। धीरे से फिर से निलंबित करें लेकिन बार-बार पाइपिंग के साथ (बेहतर निलंबन के लिए P200 युक्तियों का उपयोग करें) जब तक कि एक समान निलंबन न हो जाए।
  4. दिन 6
    1. पुनः निलंबित गोली को 'iodixanol'-आधारित घनत्व ढाल centrifugation के अधीन करें।
      1. 13 एमएल साफ, धोया (डीडीडब्ल्यू के साथ) और पूर्व-ठंडा अल्ट्रा-स्पष्ट पॉलीप्रोपाइलीन अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर पुन: निलंबित गोली परत करें और धीरे-धीरे निष्क्रिय घनत्व ढाल 'आयोडिक्सानोल' समाधान के ~ 4 एमएल के साथ मिश्रण (1 एमएल पिपेट का उपयोग करें) (व्यावसायिक रूप से ~ 60% डब्ल्यू / वी समाधान के रूप में उपलब्ध)। ट्यूब के तल पर (अधिकतम 5 एमएल तक) पुन: निलंबित गोली बिछाने के बाद, फिर संबंधित क्रम में 'iodixanol' के 1 एमएल (डब्ल्यू / वी) प्रत्येक 40%, 30%, 20%, और 10% उप-स्टॉक के साथ ओवरले करें (60% स्टॉक से उप-स्टॉक (HEPES बफर के साथ) तैयार करें)। फिर, ट्यूब को भरने के लिए शीर्ष पर 6% उप-स्टॉक (HEPES बफर के साथ 60% स्टॉक से तैयार) के 4 एमएल जोड़ें।
        नोट: उपयोग करने से ठीक पहले ढाल तैयार करें; कभी भी स्टोर और उपयोग न करें।
      2. ध्यान से (मिलाते हुए बिना), एक ग्लास बीकर में ट्यूब वजन, और धीरे झूलते बाल्टी रोटर में यह हस्तांतरण.
        नोट: वजन एक डमी ट्यूब (भी तौला) के साथ संतुलन के लिए आवश्यक है।
      3. इसे 4 ओसी पर 16 घंटे के लिए 141,000 × ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन करें।
  5. दिन 7
    1. ध्यान से ट्यूब को हटा दें (चरण 2.3.1 का नोट देखें) और हौसले से आटोक्लेव माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल अंश इकट्ठा करें; 4 वें से 6वें अंशों पर ध्यान दें, जिसमें आमतौर पर एमएसएम एमईवी होते हैं।
      नोट: इन अंशों से mEVs सामान्य रूप से तीन या चार mEVs बैंड (एक प्रमुख बैंड है) में विभाजित होते हैं जो रंग में सुस्त सफेद होते हैं। mCherry युक्त R-mEVs 5 वें से 7वें अंशों में भिन्न होते हैं और मैजेंटा के लिए गहरे बैंगनी दिखाई देते हैं। एमटीबी ईवी आमतौर पर 5 वें से 7वें अंशों में विभाजित होते हैं। ढाल में एमईवी का पृथक्करण उपयोग की जाने वाली ढाल एकाग्रता पर निर्भर करता है और ढाल कितनी अच्छी तरह स्तरित है। यदि एमईवी आंशिक रूप से टूटते हैं, तो वे पहले के अंशों में भिन्न हो सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, यदि चरण 2.3.2 के बाद प्राप्त गोली को अच्छी तरह से निलंबित नहीं किया जाता है, तो पुटिकाएं घने माइक्रोपेलेट्स बनाती हैं जो बाद के अंशों के रूप में भिन्न होती हैं। हम अंशों के सटीक संग्रह की सलाह केवल तभी देते हैं जब उपयोगकर्ता मूल्यांकन करना चाहता है कि 1 एमएल अंशों में से किसमें एमईवी हैं। उपयोगकर्ता अपनी सुविधा के आधार पर छोटे या बड़े अंशों में विभाज्य करना पसंद कर सकते हैं। जब हम उन्हें कुछ अनुप्रयोगों के लिए उपयोग करते हैं, उदाहरण के लिए, बीसीजी के लिए संभावित सबयूनिट वैक्सीन बूस्टर के रूप में उनका परीक्षण करते हैं, तो हम एमईवी के अपने संग्रह को अंशों के 250 माइक्रोन से कम तक सीमित करते हैं (जहां एमईवी आंशिक होते हैं) ताकि हम विशेष रूप से केवल एमईवी बैंड एकत्र कर सकें और 2.7.5 में दर्शाए अनुसार प्रक्रिया करें। यह अधिक प्रभावी ढंग से iodixanol है कि हमारे बहाव प्रयोगों के रास्ते में हस्तक्षेप कर सकते हैं के सभी निशान को दूर करने में मदद करता है.
  6. दिन 8
    1. एमईवी युक्त अंशों को पूल करें, एचईपीईएस बफर के साथ 38 एमएल तक पतला करें, और 100,000 × ग्राम पर 16 घंटे के लिए 4 ओसी पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं। गोली को फिर से निलंबित करें (एक ही सावधानी के साथ चरण 2.3.2 के रूप में) या तो HEPES बफर में या किसी भी बफर में जो डाउनस्ट्रीम प्रयोगों (यहां विस्तृत नहीं) जैसे प्रोटीन अनुमान, नैनो-ट्रैकिंग विश्लेषण, नकारात्मक धुंधला, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, पश्चिमी सोख्ता, और प्रतिरक्षा-सोना लेबलिंग की आवश्यकता होती है।
      नोट: बेहतर निलंबन के लिए, अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान सोनिकेटर का उपयोग करके 10 मिनट के लिए एमवी युक्त ट्यूब को सोनिकेट करें। लंबे समय तक सोनिकिंग करने से बरकरार एमईवी का टूटना और नुकसान शुरू हो सकता है। यदि अच्छी तरह से निलंबित कर दिया जाता है, तो सोनिकेशन अनावश्यक है। एमटीबी जनित ईवी को समृद्ध करते समय 2.1 से 2.6 तक के सभी चरण समान हैं।

3. पुनः संयोजक mEVs का निर्माण और संवर्धन।

नोट: एमएसएम ईवीएस के 10 सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन (मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना गया) में से एक सीएफपी -2930 है। अपने छोटे आकार (29 केडीए), सरल माध्यमिक संरचना 40, झिल्ली 41 के लिए स्थानीयकरण, और प्रवृत्ति अक्षीय संस्कृतियों में खर्च मीडिया में स्रावित होने के लिए (उदाहरण के लिए, एक संस्कृति छानना प्रोटीन के रूप में; दोनों एमएसएम और एमटीबी42,43 द्वारा स्रावित किया जाता है, यहां, यह एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और ब्याज की एक प्रोटीन (EsxAMtb) mEVs में देने के लिए शोषण किया गया है. इसे प्राप्त करने के लिए,

  1. एमएसएम से सीएफपी -29 को बढ़ाने के लिए उपयुक्त आगे और रिवर्स प्राइमरों (तालिका 1; पीएमवी 261 जैसे शटल वेक्टर में सीधे क्लोन किए जाने के लिए संगत) को नियोजित करें। टेम्पलेट के रूप में उच्च आणविक भार (~ >20 केबी) एमएसएम जीनोमिक डीएनए के ~ 50 एनजी का उपयोग करते हुए, पीसीआर-एक उच्च-निष्ठा प्रूफरीडिंग डीएनए पोलीमरेज़ (जैसे फुसियन या क्यू 5) के साथ सीएफपी -29 जीन टुकड़े को बढ़ाता है। पीसीआर के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें।
    नोट: ब्याज के किसी भी वैकल्पिक शटल वेक्टर में आसान क्लोनिंग के लिए प्राइमरों में आवश्यक प्रतिबंध साइटों को डिज़ाइन करें। पीसीआर की स्थिति और मात्रा प्रूफ-रीडिंग डीएनए पोलीमरेज़ के प्रकार और ब्रांड के साथ अलग-अलग होगी। प्रतिक्रिया मिश्रण की मात्रा डीएनए टेम्पलेट की मात्रा और डीएनए पोलीमरेज़ प्रूफरीडिंग की मात्रा के आधार पर अलग-अलग होगी। पीसीआर स्थितियों, प्रवर्धन की सफलता और प्राइमरों के गैर-विशिष्ट एनीलिंग के उन्मूलन के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें।
  2. पीसीआर किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर शुद्धि किट के साथ एल्यूटेड एम्प्लिकॉन को शुद्ध करता है और मानक अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा एम्प्लिकॉन लंबाई को सत्यापित करता है। शुद्ध एम्पलीकॉन को पचाएं।
    1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शुद्ध एम्प्लिकॉन की मात्रा का अनुमान लगाएं। पाचन के लिए सीएफपी -29 एम्प्लिकॉन के कम से कम 2 माइक्रोग्राम का उपयोग करें।
    2. 1 घंटे के लिए 65 o C पर BstB1 के साथ पहले डाइजेस्ट करें (निर्माता की सिफारिशों के अनुसार बफर और एंजाइम का प्रकार और मात्रा), प्रतिक्रिया तापमान को RT तक नीचे लाएं, और फिर 37 oC पर 1 घंटे के लिए HindIII के साथ पचाएं (निर्माता की सिफारिशों के अनुसार बफर और एंजाइम का प्रकार और मात्रा)।
    3. पीसीआर ऑटोक्लेव्ड न्यूक्लीज-मुक्त डीडीडब्ल्यू के 50 माइक्रोन में पचाने वाले एम्प्लिकॉन को शुद्ध और एल्यूट करता है।
    4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके पचाने वाले एम्प्लिकॉन की एकाग्रता और उपज का अनुमान लगाएं। बंधाव सेटअप तक -20 oC पर स्टोर करें। नोट: पीसीआर पोस्ट करें, एम्पलीकॉन लंबाई (~ 798 + 50 बीपी) को सत्यापित करें और 1% अगारोज जेल पर पीसीआर-प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 माइक्रोन को इलेक्ट्रोफोरसिंग करके उपज दें। हालांकि एंजाइमों के इस संयोजन के साथ डबल पाचन संभव नहीं है, एक संगत बफर बार-बार पीसीआर शुद्धि और पचने वाले एम्पलीकॉन के बाद के नुकसान को रोक देगा। पचाने वाले एम्प्लिकॉन की एकाग्रता पीसीआर शुद्धि के लिए उपयोग की जाने वाली किट के साथ भिन्न होती है। यह पसंद के किसी भी वैकल्पिक वैक्टर की लंबाई (बीपी में) के साथ भी बदलता रहता है।
  3. आगे और रिवर्स प्राइमरों (तालिका 1), एक प्रूफरीडिंग डीएनए पोलीमरेज़, और एमटीबी जीनोमिक डीएनए के ~ 50 एनजी, पीसीआर esxA- या esxA-3X FLAG-टैग विशिष्ट amplicon को बढ़ाते हैं। पीसीआर mCherry बढ़ाना करने के लिए उपयुक्त प्लाज्मिड डीएनए के ~ 5 एनजी का उपयोग करें. प्लास्मिड और अनुक्रम विवरण पूरक फ़ाइल 1 में हैं।
    नोट: cfp-44,45 और mCherry/esxA/esxA-3X FLAG के बीच ग्लाइसिन, ग्लाइसिन, ग्लाइसिन, ग्लाइसिन, सेरीन29(G3S) लिंकर का उपयोग करें;mCherry की शुरुआत से पहले, G4S लिंकर mCherry को नकली गैर-कार्यात्मक सिलवटों (Cfp-29 द्वारा संचालित सहित) से गुजरने में मदद करता है। पूरक फ़ाइल 29 में cfp-60, hsp60 प्रमोटर, mCherry और esxA अनुक्रमों का संदर्भ लें File 1. mCherry के लिए टेम्पलेट्स के रूप में सेवारत प्लास्मिड विभिन्न प्लास्मिड रिपॉजिटरी/बैंकों में उपलब्ध हैं। mCherry के विभिन्न संस्करण (थोड़ा परिवर्तित अनुक्रम) उपलब्ध हैं जिनके लिए आगे और पीछे प्राइमर अनुक्रमों को बदलने की आवश्यकता होगी। प्राइमर (तालिका 1) पूरक फ़ाइल 1 में उल्लिखित mCherry को बढ़ाने में सहायता करते हैं। mCherry/esxA/esxA::3XFLAG के N-टर्मिनस का Cfp-29 के सी-टर्मिनल छोर तक फ्यूजन अच्छी तरह से काम करता है।
  4. mCherry/esxA/esxA ::3XFLAG amplicons के डीएनए के 1 μg को डाइजेस्ट करें और पचाए गए डीएनए को शुद्ध करें।
    1. 37 oC (या निर्माता की सिफारिशों के अनुसार) पर 1 घंटे के लिए HindIII और HpaI के साथ प्रत्येक amplicon को डबल डाइजेस्ट करें।
    2. पचे हुए एम्पलीकॉन को शुद्ध करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर शुद्धि किट और निर्माता की सिफारिशों का उपयोग करें। ऑटोक्लेव्ड न्यूक्लीज-मुक्त ddw के 50 माइक्रोन में पचाने वाले amplicon को एल्यूट करें।
    3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके पचाने वाले एम्प्लिकॉन की एकाग्रता और उपज का अनुमान लगाएं। बंधाव सेटअप तक -20 oC पर स्टोर करें।
  5. pMV261-KanR (पूरक फ़ाइल 1) के 2 μg या पसंद के एंजाइम (ओं) के साथ एक उपयुक्त क्लोनिंग वेक्टर को डाइजेस्ट करें।
    1. 1 घंटे के लिए 65 o C पर BstB1 के साथ पहले डाइजेस्ट करें (निर्माता की सिफारिशों के अनुसार बफर और एंजाइम का प्रकार और मात्रा), प्रतिक्रिया तापमान को RT तक नीचे लाएं, और फिर 37 oC पर 1 घंटे के लिए HindIII के साथ पचाएं (निर्माता की सिफारिशों के अनुसार बफर और एंजाइम का प्रकार और मात्रा)।
    2. जेल शुद्ध और autoclaved nuclease मुक्त ddw के 50 μL में elute.
    3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके पचाए गए वेक्टर की एकाग्रता और उपज का अनुमान लगाएं। बंधाव सेटअप तक -20 oC पर स्टोर करें।
      नोट: pMV261 के लिए उपरोक्त प्राइमरों के साथ एक-चरणीय दो-टुकड़ा क्लोनिंग संभव है। कोई भी वैकल्पिक शटल वेक्टर जो एक एपिसोम के रूप में जीवित रहता है, काम करेगा। एकीकृत प्लास्मिड भी काम करेंगे, लेकिन पुनः संयोजक प्रोटीन उपज प्रति सेल आधार अपेक्षाकृत कम होगी।
  6. लाइगेट और ई कोलाई के एक संगत तनाव में बदलना।
    1. बंधाव के लिए, वेक्टर के 125 एनजी का उपयोग करें। उचित रूप से पचने वाले mCherry/esxA/esxA::3XFLAG का उपयोग करें amplicons 1:3 दाढ़ अनुपात पर। एक प्रशीतित परिसंचारी पानी के स्नान में 16 डिग्री सेल्सियस पर टी 4 डीएनए लिगेज (निर्माता की सिफारिशों के अनुसार मात्रा) का उपयोग करके रात भर बंधाव करें।
      नोट: पाचन की दक्षता का मूल्यांकन करने और क्लोनिंग सफलता की दक्षता की भविष्यवाणी करने के लिए केवल टी 4 डीएनए लिगेज के साथ और बिना वेक्टर जैसे उचित नियंत्रणों का उपयोग करें।
    2. परिवर्तन
      1. पिघलना NEB5α रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं aliquots (~ 100 माइक्रोन प्रति परिवर्तन) 15 मिनट के लिए बर्फ पर. धीरे एक बाँझ विंदुक टिप के साथ दो बार मिश्रण. ठंड सक्षम कोशिकाओं के लिए बंधाव मिश्रण (20 μL तक) जोड़ें।
      2. धीरे विंदुक कोशिकाओं + ligated डीएनए मिश्रण. एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं.
      3. 60 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस (एक परिसंचारी पानी के स्नान में) पर गर्मी का झटका प्रदान करें और तुरंत अतिरिक्त 15 मिनट के लिए बर्फ पर वापस स्थानांतरित करें।
      4. एसओसी शोरबा (2% ट्रिप्टोन, 0.5% खमीर निकालने, 10 एमएम एनएसीएल, 2.5 एमएम केसीएल, 10 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम एमजीएसओ4, और 20 एमएम ग्लूकोज) के 1 एमएल जोड़कर रूपांतरित कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें और 200 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      5. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब (3000 × ग्राम, आरटी, और 10 मिनट) में बरामद बैक्टीरिया नीचे स्पिन, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, बाँझ, prewarmed, ताजा तैयार एलबी मीडिया के 200 माइक्रोन में गोली resuspend, और ताजा डाला एलबी मिलर अगर प्लेटों उचित सांद्रता पर आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं युक्त पर निलंबन फैल.
      6. पेट्री व्यंजन को एक प्लेट इनक्यूबेटर में 37 ओसी के लिए पूर्व निर्धारित करें।
  7. संभावित क्लोनों के लिए स्क्रीन (यहां विस्तृत नहीं), संलयन की पुष्टि करने के लिए (कॉलोनी पीसीआर-/प्रतिबंध एंजाइम-आधारित)46 और अनुक्रम (सेंगर अनुक्रमण) उन्हें सत्यापित करें।
  8. पुष्टि क्लोन (ई कोलाई पृष्ठभूमि) के प्लाज्मिड डीएनए (~ 200 एनजी / 1-2 माइक्रोन; किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट) निकालें और इसे एमएसएम के ताजा बने इलेक्ट्रो-सक्षम कोशिकाओं में बदल दें।
  9. एमएसएम इलेक्ट्रोकंपीटेंट कोशिकाओं की तैयारी
    1. एमएसएम को ताजा उगाएं (चरण 1.2.1 और 1.2.2 के रूप में)। चरण 1.3.3 और 1.3.4 के रूप में ताजा विकसित एमएसएम धो लें (छोड़कर, सौटन के बजाय 7H9 + एडीसी + ट्वीन -80 (समृद्ध) का उपयोग करें)।
    2. धोया एमएसएम कोशिकाओं के एक अंतिम आयुध डिपो 600 के लिए ~ 0.05 के एक बाँझ500 एमएल Erlenmeyer फ्लास्क युक्त 150 एमएल अमीर मीडिया युक्त जोड़ें.
    3. इनक्यूबेटर शेकर में 200 आरपीएम और 37 ओसी पर इनक्यूबेट करें जब तक कि संस्कृति आयुध डिपो600 ~ 0.8 से 1.0 (~ 12-14 एच) तक नहीं पहुंच जाती।
    4. संस्कृति को एक पूर्व ठंडा 400 एमएल अपकेंद्रित्र बोतल में स्थानांतरित करें और 60-90 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं। फिर, 4,000 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए 4 ओसी पर कोशिकाओं को गोली दें।
    5. कोशिकाओं को दो बार धोएं (प्रत्येक 150 एमएल के साथ धोएं, 4,000 × ग्राम, 4 ओसी, और 15 मिनट) बर्फ-ठंड, बाँझ (आटोक्लेव) 10% ग्लिसरॉल के साथ।
      नोट: हर धोने के साथ, गोली ढीली हो जाती है। पूरे सतह पर तैरनेवाला (प्रत्येक धोने के बाद) को त्यागते समय सावधानी बरतें। अन्यथा, अधिकांश कोशिकाएं छोड़े गए सतह पर तैरनेवाला में खो जाएंगी।
    6. कोशिकाओं को एक बार फिर 75 एमएल बर्फ-ठंडा, बाँझ 10% ग्लिसरॉल के साथ धोएं जिसमें 0.005% ट्वीन -80 होता है।
    7. सेल गोली को 10% ग्लिसरॉल के 7.5 एमएल में 0.005% ट्वीन -80 और विभाज्य के साथ 400 माइक्रोन एलिकोट में फिर से निलंबित करें।
      नोट: हालांकि एमएसएम इलेक्ट्रोकंपीटेंट सेल कम से कम 4 महीने के लिए सक्षम हैं, ताजा तैयार इलेक्ट्रोकेम्पीटेंट सेल सर्वोत्तम परिणाम देते हैं। पुरानी सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करते समय, कुछ गैर-गुलाबी कॉलोनियां (सफेद) झूठे ट्रांसफार्मर के रूप में दिखाई देती हैं। सक्षम कोशिकाएं जितनी पुरानी होंगी, सफेद कालोनियां उतनी ही अधिक होंगी।
  10. एमएसएम का परिवर्तन
    1. बर्फ पर एमएसएम सक्षम कोशिकाओं विभाज्य पिघलना.
      नोट: आरटी पर विगलन और ऐसी कोशिकाओं को बदलने से कम दक्षता मिलती है।
    2. ठंड सक्षम कोशिकाओं के लिए प्लाज्मिड डीएनए (~ 200 एनजी कुल) के 1-2 माइक्रोन जोड़ें, एक 1 एमएल बाँझ विंदुक टिप के साथ धीरे मिश्रण, और एक पूर्व ठंडा बाँझ 2 मिमी electroporation क्यूवेट में हस्तांतरण.
    3. एमएसएम सक्षम कोशिकाओं + प्लाज्मिड डीएनए मिश्रण के साथ बंद क्युवेट को एल्ट्रोपेरेटर के माउस में स्थानांतरित करें, ढक्कन को धीरे से बंद करें और 2.5 केवी (वोल्टेज), 25 माइक्रोफ़ान (समाई), और 1000 Ω (प्रतिरोध) पर एक पल्स (घातीय क्षय प्रकार) लागू करें।
    4. तुरंत क्यूवेट में प्रीवार्म्ड बाँझ समृद्ध (7H9 + ADC + ट्वीन-80) मध्यम के 1 एमएल जोड़ें, धीरे से 1 एमएल बाँझ विंदुक टिप के साथ मिलाएं, और पूरी सामग्री को 10 एमएल बाँझ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. 37 ओसी और 200 आरपीएम पर सेट इनक्यूबेटर शेकर में 3 घंटे के लिए सामग्री को इनक्यूबेट करें। एक microcentrifuge ट्यूब (4,000 × ग्राम, आरटी, और 10 मिनट) में सामग्री नीचे स्पिन, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, बाँझ पूर्व गर्म अमीर माध्यम के 200 μL में गोली respend, और ताजा डाला अगर प्लेटों पर निलंबन फैल ADC, ट्वीन -80, और उचित सांद्रता पर आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं.
      नोट: एमएसएम के लिए, जब आवश्यक हो, क्रमशः 50 माइक्रोग्राम / एमएल, 25 माइक्रोग्राम / एमएल, और 50 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम सांद्रता पर हाइग्रोमाइसिन, कनामाइसिन और अप्रामाइसिन का उपयोग करें। एमएसएम प्रति से इन एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी नहीं है। इन एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग केवल ट्रांसफार्मेंट/पुनः संयोजक एमएसएम कालोनियों के चयन/विकास के लिए उपयुक्त प्रतिरोधी जीन के साथ प्लास्मिड का उपयोग करते समय करें।
    6. 37 ओसी के लिए पूर्व निर्धारित एक प्लेट इनक्यूबेटर में पेट्री व्यंजन सेते हैं, आमतौर पर, ट्रांसफार्मर 3-5 दिनों के बीच दिखाई देते हैं।
      नोट: यदि ब्याज का एक प्रोटीन एमएसएम के लिए विषाक्त है, तो ट्रांसफार्मर बाद में उभर सकते हैं या उभरने में विफल हो सकते हैं। ऐसे मामलों में, क्लोन पूरी लंबाई के संस्करणों को छोटा कर देता है।
    7. सकारात्मक क्लोन (चरण 3.7 के समान) के लिए सत्यापित करने के बाद आकस्मिक एमएसएम कालोनियों के ग्लिसरॉल स्टॉक बनाएं
  11. या तो mCherry या EsxA प्रोटीन युक्त R-mEVs को समृद्ध करने के लिए, पहले R-Msm या तो mCherry या exsA या esxA::3X ध्वज 1.2.1 से 1.2.3 चरणों का पालन करके व्यक्त करें और फिर 2.1 से 2.6 चरणों का पालन करें। आर-एमईवी को समृद्ध करने के लिए। आर-एमईवी घनत्व ढाल स्पिन (चरण 2.5) के बाद 4 वें -7वें अंशों में एल्यूट करते हैं। पहले अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण (2.3.1) के बाद आर-एमईवी गोली। चरण 2.3.1 के समान प्रदर्शन करने के बाद, पुष्टि करें कि आर-एमईवी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज के निचले केंद्र में गहरे बैंगनी से मैजेंटा 5-7 मिमी व्यास की गोली के रूप में दिखाई दे रहे हैं।
  12. समृद्ध आर-एमईवी के भीतर रुचि के प्रोटीन (ओं) का पता लगाने के लिए पश्चिमी विश्लेषण47 (यहां विस्तृत नहीं) करें।

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Representative Results

हम देशी और पुनः संयोजक mEVs (R-mEVs) दोनों के संवर्धन को प्रदर्शित करने के लिए मॉडल माइकोबैक्टीरियम के रूप में M. smegmatis (Msm) का उपयोग करते हैं। यह योजनाबद्ध रूप से सारांशित एमईवी संवर्धन प्रोटोकॉल(चित्रा 1)एमएसएम के आर-एमईवी और एमटीबी के देशी ईवीएस के संवर्धन के लिए भी काम करता है (1.2 के प्रोटोकॉल नोट्स के रूप में मामूली संशोधनों के साथ)। समृद्ध mEVs के दृश्य नकारात्मक उन्हें एक संचरण इलेक्ट्रॉनमाइक्रोस्कोप 36 (चित्रा 2 ए) के तहत धुंधला की आवश्यकता है. आमतौर पर, एमएसएम-विशिष्ट ईवीएस 13 एमएल 6-60% घनत्व ढाल(चित्रा 2बी)के 4 वें-6वें 1 एमएल अंशों में अलग हो जाते हैं। ईवीएस के लगभग 80-100 μg प्रोटीन समकक्ष नियमित रूप से एमएसएम के मध्य-लघुगणक अक्षीय संस्कृतियों के 2 एल से प्राप्त होते हैं। उनके व्यास आम तौर पर 20 एनएम और 250 एनएम (चित्रा 2 सी) के बीच होते हैं।

हमारी प्रयोगशाला का एक दीर्घकालिक लक्ष्य यह मूल्यांकन करना है कि क्या विभिन्न माइकोबैक्टीरिया के एमईवी संभावित रूप से मौजूदा वैक्सीन, बीसीजी के लिए सबयूनिट बूस्टर के रूप में कार्य कर सकते हैं। चूंकि रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा उत्पन्न एमईवी को समृद्ध करना समय लेने वाली, जोखिम भरा और महंगा है, इसलिए एविरुलेंट माइकोबैक्टीरिया से देशी और पुनः संयोजक ईवीएस का शोषण एक उपयुक्त विकल्प के रूप में काम कर सकता है। इसलिए, हमारा लक्ष्य न केवल एमएसएम के एमईवी को समृद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल को मानकीकृत करना है, बल्कि इसके आर-एमईवी का निर्माण और समृद्ध करना भी है।

आर-एमईवी का निर्माण करने के लिए, हमने पहले एमएसएम ईवीएस के शीर्ष 10 प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का चयन किया (तालिका 1; हमने उन्हें एमएसएम ईवीएस के विस्तृत मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहचाना)30। हमने अनुमान लगाया कि यदि ब्याज की एक विदेशी प्रोटीन उनमें से किसी के लिए अनुवादित रूप से जुड़ी हुई है, तो यह एमईवी में स्थानीयकृत करने में सक्षम होना चाहिए। फिर, हमने 10 में से सीएफपी -29 को शॉर्टलिस्ट किया क्योंकि यह उनमें से सबसे छोटा है (~ 29 केडीए), झिल्ली-स्थानीयकृत है, और अपेक्षाकृत सरल माध्यमिक संरचना40,41,42,43 के साथ एक संस्कृति छानना प्रोटीन है। हमने एमएफपी -29 के सी-टर्मिनल अंत में एमचेरी (फ्लोरोसेंट प्रोटीन) एन-टर्मिनल अंत को अनुवादित रूप से जोड़ा और इसके लोडिंग / वितरण का मूल्यांकन एमईवी में किया। एमएसएम के समृद्ध एमईवी का एक हिस्सा गुलाबी हो गया (चित्र 3), जो सीएफपी-29 की एमएसएम ईवीएस में ब्याज की विदेशी प्रोटीन ले जाने की क्षमता को दर्शाता है।

सीएफपी -29 (चित्रा 3) की इस क्षमता को देखते हुए, हमने तब ईएसएक्सए (ईएसएटी -6) का मूल्यांकन किया, जो एमएसएम ईवीएस में एक प्रमुख इम्युनोजेनिक प्रोटीन37,38,39 डिलीवरी है। फिर से, हमने Cfp-29-only EsxA और EsxA + 3X FLAG टैग (3X FLAG EsxA के C-टर्मिनस से जुड़े 3X FLAG) के C-टर्मिनस के लिए दो स्वतंत्र ट्रांसलेशनल फ्यूजन उत्पन्न किए। जैसा कि अपेक्षित था, हमने एमएसएम ईवीएस (लेन 5, 6, और 10, चित्रा 4 ए, बी) में एमटीबी के ईएसएक्सए को कम मात्रा में देखा। दिलचस्प बात यह है कि सीएफपी -29 :: ईएसएक्सए :: 3 एक्सफ्लैग बहुत अधिक स्थिर था (लेन 3 और 4 प्लस 8 और 9; चित्र 4A) और एमईवी में उच्च स्तर पर जमा (लेन 3 और 4 प्लस 8 और 9; चित्रा 4 बी)। संक्षेप में, हम आर-एमईवी के डिजाइन, निर्माण और संवर्धन का प्रदर्शन करते हैं जिसमें ब्याज की एक विदेशी प्रोटीन होती है (चित्र 3 और चित्र 4)।

Figure 1
चित्रा 1: माइकोबैक्टीरियल बाह्य पुटिका संवर्धन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। 'दिन' (लाल फ़ॉन्ट में, आंकड़े के ऊपर) एमएसएम से एमईवी को समृद्ध करने के लिए आवश्यक दिनों को संदर्भित करता है (विशेष रूप से प्रोटोकॉल चरण 1 और 2 के लिए)। "चरण" (काले फ़ॉन्ट में, चित्र के नीचे) प्रोटोकॉल चरणों को संदर्भित करता है जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है। एमटीबी से एमईवी को समृद्ध करने के लिए, हालांकि सभी चरण समान हैं, सेंट्रीफ्यूजेशन के पहले चरण (चरण 2) के संवर्धन के विभिन्न चरणों (चरण 1) के लिए कम से कम 10 दिन लगते हैं। बाद के चरणों में समान अवधि की आवश्यकता होती है (जैसा कि लाल फ़ॉन्ट में दर्शाया गया है)। घनत्व ढाल से पहले, देशी mEVs और R-mEVs दोनों को समृद्ध करते समय mEVs गोली + बाह्य परिसर रंगहीन दिखते हैं। हालांकि, यह mCherry युक्त mEVs को समृद्ध करते समय गुलाबी से नीले रंग ( चित्र 3 देखें) दिखाई देगा। घनत्व ढाल के बाद, mEVs घनत्व ढाल ट्यूब में सफेद (देशी और R-mEVs) या गुलाबी (यदि mCherry युक्त है) दिखाई देंगे। आकृति में mEVs के रंग केवल स्पष्टता इंगित करने के लिए हैं और सटीक रंगों का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। अधिक स्पष्टता के लिए चित्र 3 देखें। संक्षिप्ताक्षर: एमएसएम = एम। एमटीबी = एम. तपेदिक; 0.45 और 0.22 माइक्रोन = निपटान फिल्टर इकाइयों का ताकना आकार। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माइकोबैक्टीरियल ईवीएस गोलाकार हैं, घनत्व ग्रेडिएंट के साथ ध्यान केंद्रित करते हैं, और आयामों में भिन्न होते हैं । (ए) एमएसएम ईवीएस की एक प्रतिनिधि छवि उनके दृश्य पर नकारात्मक धुंधला हो जाना और एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत देखने के लिए। स्केल बार = 200 एनएम। (बी) 6-60% घनत्व ढाल प्रदर्शन करने पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एमईवी कैसे दिखाई देते हैं, इसकी एक प्रतिनिधि छवि। यदि 6-60% ढाल सटीक रूप से स्तरित नहीं है, तो एमईवी के प्रमुख (शीर्ष खुले तीर) और मामूली (नीचे खुले तीर) बैंड की स्थिति में काफी बदलाव हो सकता है, इस प्रकार 1 एमएल अंश संख्या में बदलाव हो सकता है। (सी) एमएसएम नैनोट्रैकिंग विश्लेषण के समृद्ध एमईवी के नैनोट्रैकिंग विश्लेषण पर एक प्रतिनिधि छवि विभिन्न आकार के एमईवी के अनुपात और सांद्रता और तैयारी के भीतर एमईवी की कुल संख्या को प्रकट करती है। औसतन, यहां विस्तृत प्रोटोकॉल के साथ, ~ 1-3 × 1010 ईवीएस एमएसएम और एमटीबी के 2 एल से समृद्ध होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एमचेरी व्यक्त करने वाले एमईवी के संवर्धन के विभिन्न चरण संकेत देते हैं। (ए) प्रतिनिधि छवि सीएफपी -29 को व्यक्त करते हुए एमएसएम अक्षीय संस्कृति दिखा रही है: एमचेरी। (बी) सीएफपी -29 को व्यक्त करते हुए एमएसएम अक्षीय संस्कृति के बैक्टीरियल गोली पोस्ट सेंट्रीफ्यूजेशन की प्रतिनिधि छवि: एमचेरी। (सी) संस्कृति छानना ध्यान केंद्रित की प्रतिनिधि छवि सीएफपी -29 व्यक्त एमएसएम अक्षीय संस्कृति के खर्च किए गए मीडिया को ध्यान केंद्रित करने के बाद प्राप्त करें: एमचेरी सेंट्रेटर के माध्यम से सेंट्रिकॉन कंसंट्रेटर। (डी) एमएफ -29 :: एमचेरी व्यक्त करने वाले एमएसएम एक्सनिक संस्कृति से प्राप्त संस्कृति छानना ध्यान केंद्रित के एमईवी + बाह्य परिसरों की प्रतिनिधि छवि गोली पोस्ट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन। हालांकि, गोली बेरंग रहेगी यदि एमईवी या तो देशी या पुनः संयोजक (सीएफपी -29 के लिए संलयन पर) एमचेरी को छोड़कर किसी भी विदेशी प्रोटीन (एस) के लिए होना था। (ई) mCherry की प्रतिनिधि छवियां जिसमें mEVs हैं। ध्यान दें कि सभी mEV गुलाबी नहीं होते हैं, यह दर्शाता है कि सभी mEVs में Cfp-29 नहीं होता है। अच्छा: एक प्रतिनिधि छवि जो आमतौर पर Cfp-29::mCherry EVs के लिए समृद्ध करने के बाद प्राप्त mEVs के विभिन्न बैंड को दर्शाती है। चूंकि mCherry युक्त EVs सघन होते हैं, इसलिए वे बाद के अंशों में अलग हो जाते हैं। खराब: खराब अलगाव का संकेत देने वाली एक प्रतिनिधि छवि (सफेद mEVs पहले/दूसरे अंश में अलग हो जाते हैं और mCherry-युक्त mEVs 10वें अंश में अलग हो जाते हैं (संभवतः mEVs गोली के खराब निलंबन के कारण, यानी, प्रोटोकॉल चरण 2.3.2)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पुनः संयोजक एमईवी जिसमें ईएसएक्सए (ईएसएटी -6), एमएसएम कुल सेल लाइसेट और एमएसएम उत्पन्न ईवीएस में एक एमटीबी-एन्कोडेड इम्यूनोजेन है। (ए) कूमासी जेल और (बी) पश्चिमी विश्लेषण (ईएसएटी 6-विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ पता चला) छवियां एमएसएम कुल सेल लाइसेट और एमएफवी दोनों में फ्यूज्ड एक्सएसए के संचय को दिखाती हैं जो या तो सीएफपी-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, लेन 3 और 4 (कुल लाइसेट) और लेन 8 और 9 (mEVs)) या cfp-29:: esxA (- 3XFLAG, लेन 5 और 6 (कुल lysate) और लेन 10 (mEVs))। खुले और भरे हुए तीर क्रमशः संचित Cfp-29::ExsA::3XFLAG और Cfp-29::ExsA को इंगित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमरों:
क्रम # जीन प्राइमर अनुक्रम (5 'से 3') मूल में क्लोन करने के लिए
1 सीएफपी-29 आगे CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC एमएसएम जीनोमिक डीएनए पीएमवी261
उल्टा GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG एमएसएम जीनोमिक डीएनए पीएमवी261
2 एमचेरी आगे GAAAAGCTT(HindIII) ggcggcggtggctcg (G4S linker)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG लैब संग्रह पीएमवी261
उल्टा टीजीटीटीटीएएसी (एचपीएआई) सीटीएसीटीजीटीएसीएजीसीटीसीजीटीसी लैब संग्रह पीएमवी261
3 esxA आगे GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG एमटीबी जीनोमिक डीएनए पीएमवी261
उल्टा TGTGTTAAC (HpaI) TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 एमटीबी जीनोमिक डीएनए पीएमवी261
4 exsA-3X ध्वज आगे GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG एमटीबी जीनोमिक डीएनए पीएमवी261
उल्टा TGTGTTAAC (HPAI) TCA
cttgtcgtcgtccttgtg
gtccttgtgttcaccgtcgtccttgttc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
सीसीटीटीसीजीजीएजीएजीसीएसीटीजीएसीसी		 एमटीबी जीनोमिक डीएनए पीएमवी261

तालिका 1: प्राइमर अनुक्रम। cfp-29, mCherry, esxA, और esxA ::3X FLAG और शटल वेक्टर pMV261 में क्लोनिंग को बढ़ाने के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर सूचीबद्ध हैं।

अनुपूरक फ़ाइल 1: ए: pMV261 , इसका गोलाकार मानचित्र, मुख्य विशेषताएं और पूर्ण न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम। पीला हाइलाइट-एचएसपी 60 प्रमोटर न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम; ग्रीन और सियान हाइलाइट-प्रतिबंध साइटें जिनमें mCherry, esxA, और esxA::3X FLAG amplicons क्लोन किए गए थे। बी, सी , और डी: क्रमशः सीएफपी -29, एमचेरी और ईएसएक्सए के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम। cfp-29, mCherry, और esxA का ग्रीन हाइलाइट-स्टॉप कोडन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

चूंकि एक नया टीबी वैक्सीन विकसित करना जो बीसीजी से बेहतर है और उसकी जगह ले सकता है, एक विकल्प के रूप में, कई समूह विभिन्न सबयूनिट टीबी टीकों की खोज का पीछा कर रहे हैं जो बीसीजी की शक्ति को बढ़ा सकते हैं और इसकी सुरक्षात्मक अवधि48,49 बढ़ा सकते हैं। बैक्टीरियल ईवीएस (बीईवी) पर संभावित सबयूनिट्स के रूप में और प्राकृतिक सहायक50,51 के रूप में बढ़ते ध्यान को देखते हुए, उनके डाउनस्ट्रीम परीक्षण/विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में एमईवी का लगातार संवर्धन एक महत्वपूर्ण कदम बन गया है। यह इन शोध प्रश्नों पर विचार कर रहा है कि इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक्सनिक संस्कृतियों और उनके पुनः संयोजक संस्करणों से एमईवी को समृद्ध करना है।

एमएसएम ईवीएस के विस्तृत मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक प्रोटिओम विश्लेषण के दौरान, प्राडोस-रोजलेस एट अल ने 10 सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन30 की पहचान की। हमने आगे परिकल्पना की कि पर्याप्त आणविक इंजीनियरिंग पर, उनमें से एक एमईवी में ब्याज की एक विदेशी प्रोटीन ले जाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। दिलचस्प बात यह है कि सीएफपी -29 अपनी विभिन्न विशेषताओं39,40,41,42 के कारण सबसे अच्छा संभव विकल्प के रूप में खड़ा था। हमारा डेटा वास्तव में दिखाता है कि यह mCherry और EsxA को ले जाने के लिए पर्याप्त है (यद्यपि EsxA को अधिक स्थिर होने के लिए अपने C-टर्मिनस पर एक छोटे टैग की आवश्यकता होती है) और उन्हें mEVs में जमा करें। हाल ही में, 2021 में, तांग एट अल ने प्रदर्शित किया कि सीएफपी -29 एक एनकैप्सुलिन है जिसमें डाई-डिकोलोराइजिंग पेरोक्सीडेज (डीवाईपी) -टाइप पेरोक्सीडेस40 ले जाने की क्षमता है। शायद, सीएफपी -29 अन्य विदेशी प्रोटीन भी ले जा सकता है।

हमने ईएसएक्सए की खोज की क्योंकि यह एक प्रमुख एमटीबी इम्यूनोजेन 37,38,39 है, पशु मॉडल 37,38,39 में एक सबयूनिट वैक्सीन के रूप में सुरक्षात्मक हो सकता है, आकार में छोटा है; और इसका ऑर्थोलॉग (MSMEG_0066) एमएसएम ईवीएस में दिलचस्प रूप से अनुपस्थित है। यद्यपि हम यहां इस पर चर्चा नहीं करते हैं, हमने एंटीजन 85 बी (आरवी 1886 सी) सहित कुछ अन्य एमटीबी प्रोटीन (विशिष्ट रूप से एमटीबी में मौजूद और एमएसएम द्वारा एन्कोड नहीं किया गया) के लिए आर-एमईवी सफलतापूर्वक उत्पन्न किया है। उसी समय, दिलचस्प बात यह है कि हम कुछ अन्य लोगों के लिए आर-एमईवी उत्पन्न करने में भी विफल रहे, जिनमें पूर्ण-लंबाई वाले Rv2660c और Rv0288 शामिल हैं, संभवतः क्योंकि प्रोटीन एमएसएम के लिए विषाक्त हैं। हम ऐसा इसलिए निष्कर्ष निकालते हैं, क्योंकि सही न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों को क्लोन करने और बार-बार परिवर्तन करने के बावजूद, एमएसएम का कोई ट्रांसफॉर्मेंट नहीं उभरा। चूंकि EsxA को mEVs में बेहतर संचय के लिए अपने C-टर्मिनस छोर पर 3XFLAG टैग की आवश्यकता थी, इसलिए हमने अन्य सभी Mtb-एन्कोडेड प्रोटीनों में 3XFLAG टैग जोड़ा, जिनका हमने मूल्यांकन किया था। टैग के बावजूद, एमएसएम जीवित नहीं रहा, यह दर्शाता है कि टैग संलयन के बावजूद कुछ एमटीबी प्रोटीन विषाक्त रहते हैं। हम अनुमान लगाते हैं कि इन मामलों में, केवल अनुमानित एपिटोप क्षेत्रों को क्लोन करना या कई एपिटोप्स को एक साथ सिलाई करना भुगतान कर सकता है (वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला में मूल्यांकन के तहत)। हमने ब्याज44,45 के प्रोटीन की तह पर नकारात्मक प्रभाव को कम करने के लिए सीएफपी -29 और एमचेरी/ईएसएक्सए के बीच एक छोटे से पांच एमिनो एसिड (चार ग्लाइसिन और एक सेरीन) लिंकर का उपयोग किया। हम भविष्यवाणी करते हैं कि इस लिंकर के बिना, ब्याज तह का प्रोटीन सीएफपी -29 तह से काफी प्रभावित होगा।

यह संवर्धन प्रोटोकॉल एमटीबी-जनित ईवीएस के संवर्धन के लिए आसानी से बढ़ाया जा सकता है। हम यह भी अनुमान लगाते हैं कि पर्यावरण माइकोबैक्टीरिया से एमईवी को समृद्ध करना भी इस प्रोटोकॉल के साथ संभव होना चाहिए। प्रोटोकॉल सरल और सीधा होने के बावजूद, Msm-जनित EVs और R-mEVs को समृद्ध करने के लिए अभी भी 7-8 दिनों की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, एमटीबी-जनित ईवी के संवर्धन के लिए 15-20 दिनों की आवश्यकता होती है। ईवीएस को कम मात्रा में केंद्रित करना समय लेने वाला और महंगा है और हम वर्तमान में 'समय' मुद्दे को हल करने के लिए स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन और अन्य तरीकों की खोज कर रहे हैं।

अंत में, हम सौटन का उपयोग करते हैं और 7H9 नहीं mEVs को समृद्ध करने के लिए क्योंकि 'एडीसी' पूरक में उच्च मात्रा में गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन होता है जो mEVs के किसी भी डाउनस्ट्रीम उपयोग में हस्तक्षेप कर सकता है। यह प्रोटोकॉल किसी भी अन्य विशिष्ट मीडिया (जैसे, कम-लौह मीडिया) के लिए आसानी से बढ़ाया जा सकता है जिसका उपयोग एमईवी संरचना का मूल्यांकन करने के लिए किया जाना है। वैकल्पिक रूप से, कुछ अनुप्रयोगों के लिए, अंतिम चरण (यानी प्रोटोकॉल चरण 2.7.5) पर, HEPES बफर के बजाय, कोई बाँझ खारा का उपयोग कर सकता है जब विवो-आधारित विश्लेषणों में विभिन्न के लिए चूहों या गिनी सूअरों में इंजेक्शन लगाया जाता है।

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Disclosures

सभी लेखकों ने घोषणा की कि यह शोध कार्य किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों / हितों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

लेखक ईमानदारी से प्रो सारा एम. फॉर्च्यून को धन्यवाद देते हैं कि कृपया एम. स्मेगमैटिस एमसी2155 स्टॉक साझा करें। वे चित्रा 1 के लिए कुछ बुनियादी तत्व प्रदान करने के लिए सर्वियर मेडिकल आर्ट (smart.servier.com) को भी स्वीकार करते हैं। वे ईमानदारी से एमईवी संवर्धन के लिए इनक्यूबेटर शेकर्स, सेंट्रीफ्यूज और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज के लंबे उपयोग के दौरान अपने रोगी समायोजन के लिए बाकी प्रयोगशाला सदस्यों के समर्थन को स्वीकार करते हैं। वे प्रयोगशाला सहायक श्री सुरजीत यादव को भी हमेशा यह सुनिश्चित करने के लिए स्वीकार करते हैं कि आवश्यक कांच के बने पदार्थ और उपभोग्य वस्तुएं हमेशा उपलब्ध और आसान हों। अंत में, वे THSTI की प्रशासनिक, खरीद और वित्त टीमों को उनके निरंतर समर्थन और परियोजना के निर्बाध निष्पादन में मदद के लिए स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

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Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

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