Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

רוב החיידקים, כולל מיקובקטריה, מייצרים בועיות חוץ-תאיות (EV). מאחר שרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של רכיבים תאיים, כולל מטבוליטים, שומנים, חלבונים וחומצות גרעין, מספר קבוצות העריכו את הגרסאות המקוריות או הרקומביננטיות של bEV על עוצמת ההגנה שלהן כמועמדים לחיסון תת-יחידתי. שלא כמו כלי רכב חשמליים מקומיים, כלי רכב חשמליים רקומביננטיים מהונדסים מולקולרית כך שיכילו אימונוגן אחד או יותר בעלי עניין. במהלך העשור האחרון, קבוצות שונות בחנו גישות מגוונות ליצירת bEV רקומביננטי. עם זאת, כאן אנו מדווחים על תכנון, בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים רקומביננטיים (mEVs) במיקובקטריה. לשם כך, אנו משתמשים ב-Mycobacterium smegmatis (Msm), מיקובקטריום אדמה אלים כמערכת המודל. תחילה נתאר את היצירה וההעשרה של כלי רכב חשמליים מקומיים של Msm. לאחר מכן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של mEV רקומביננטי המכיל mCherry, חלבון כתב פלואורסצנטי אדום, או EsxA (Esat-6), אימונוגן בולט של Mycobacterium tuberculosis. אנו משיגים זאת על ידי מיזוג נפרד של mCherry ו- EsxA N-termini עם C-terminus של חלבון Msm קטן Cfp-29. Cfp-29 הוא אחד החלבונים הבודדים שנמצאים בשפע של MsmEVs. הפרוטוקול ליצירה והעשרה של mEV רקומביננטי מ-Msm נותר זהה ליצירה ולהעשרה של כלי רכב חשמליים מקוריים של Msm.

Introduction

למרות הפיתוח והניהול של מגוון רחב של חיסונים נגד מחלות זיהומיות, אפילו עד עצם היום הזה, ~ 30% מכלל מקרי המוות האנושיים עדיין מתרחשים ממחלות מידבקות1. לפני הופעת החיסון נגד שחפת - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - שחפת הייתה גורם התמותה מספר אחת (~10,000 עד 15,000/100,000 תושבים)2. עם מתן BCG וגישה קלה לתרופות קו ראשון ושני נגד שחפת, עד 2022, מקרי מוות הקשורים לשחפת ירדו באופן דרמטי ל~1 מיליון לשנה עד 2022 (כלומר, ~ 15-20/100,000 אוכלוסייה1). עם זאת, באוכלוסיות אנדמיות לשחפת בעולם, מקרי מוות הקשורים לשחפת ממשיכים לעמוד על ~ 100-550/100,000 אוכלוסייה1. בעוד מומחים מכירים במספר סיבות שהובילו למספרים מוטים אלה, נראה כי הגנה בתיווך BCG שאינה נמשכת אפילו בעשור הראשון לחיים היא הסיבה הבולטת 3,4,5,6,7. כתוצאה מכך, בהתחשב ב"יעדי פיתוח בר-קיימא" המחודשים של האו"ם וב"אסטרטגיית סוף השחפת" של ארגון הבריאות העולמי, ישנו מאמץ עולמי מרוכז לפתח חלופה חיסונית עדיפה בהרבה ל-BCG, שאולי מספקת הגנה לכל החיים מפני שחפת.

לקראת מטרה זו, מספר קבוצות מעריכות כעת זני BCG מותאמים/רקומביננטיים, זנים מיקובקטריאליים לא פתוגניים ומוחלשים שאינם BCG, ומועמדים לתת-יחידות 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . בדרך כלל, חיסונים תת-יחידות הם ליפוזומים הנטענים באופן סלקטיבי עם מעט חלבונים אימונוגניים מטוהרים (~1-6) באורך מלא או קטועים של הפתוגן. עם זאת, בגלל הקיפול המזויף שלהם לקונפורמציות לא ילידיות ו / או אינטראקציות אקראיות לא פונקציונליות בין החלבונים הטעונים, תת-יחידות חסרות לעתים קרובות אפיטופים מקומיים וגרמניים ולכן אינן מצליחות להכשיר מספיק את מערכת החיסון14,19,20.

כתוצאה מכך, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) של חיידקים תפסו תאוצה כחלופה מבטיחה 21,22,23,24,25,26. בדרך כלל, כלי רכב חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של המרכיבים התאיים שלהם, כולל חלקים מסוימים של חומצות גרעין, שומנים ומאות מטבוליטים וחלבונים27,28. שלא כמו ליפוזומים שבהם כמה חלבונים מטוהרים נטענים באופן מלאכותי, bEV מכילים מאות חלבונים טעונים באופן טבעי, מקופלים באופן טבעי עם נטייה טובה יותר להפעיל את מערכת החיסון, במיוחד ללא דחיפה/סיוע של אדג'ובנטים ואגוניסטים לקולטן דמוי אגרה (TLR)27,28,29. בקו מחקר זה אנו ואחרים בחנו את התועלת של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים כמאיצי תת-יחידות פוטנציאליים ל-BCG30. למרות החששות כי bEVs חסרים עומסי אנטיגן אחידים, EVs מ Neisseria meningitidis מוחלש הגנו בהצלחה על בני אדם מפני מנינגוקוק serogroup B31,32.

לפחות תיאורטית, כלי הרכב החשמליים הטובים ביותר שיכולים להגביר היטב את BCG הם כלי הרכב החשמליים המועשרים מחיידקים פתוגניים. עם זאת, העשרת כלי רכב חשמליים הנוצרים על ידי מיקובקטריום פתוגני היא יקרה, גוזלת זמן ומסוכנת. בנוסף, כלי רכב חשמליים שנוצרו על ידי פתוגן עשויים להיות אלימים יותר מאשר מגנים. בהתחשב בסיכונים הפוטנציאליים, כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול בדוק היטב להעשרת כלי רכב חשמליים שנוצר על ידי Msm שגדל באופן אקסני, מיקובקטריום אלים.

עם זאת, למרות קידוד מספר אורתולוגים של חלבונים פתוגניים, מיקובקטריה אלימים חסרים מספר אנטיגנים חיסוניים / אפיטופים של חלבון פתוגני הדרושים כדי להכין מספיק את מערכת החיסון לקראת הגנה33. לכן, בחנו גם בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים רקומביננטיים של MSM באמצעות הנדסה מולקולרית, כך שחלק משמעותי מכל חלבון פתוגני בעל עניין המובע ומתורגם ב-MSM, חייב להגיע לרכבים החשמליים שלו. שיערנו כי אחד או יותר מ-10 החלבונים הנפוצים ביותר של Msm EVs כאשר הם מאוחים לחלבון המעניין יסייעו בטרנסלוקציה כזו.

בזמן שהתחלנו לתקנן את ההעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים (mEVs) במעבדה שלנו, בשנת 2011, Prados-Rosales ועמיתיו דיווחו לראשונה על הדמיה והעשרה של mEV במבחנה30. מאוחר יותר, בשנת 2014, אותה קבוצה פרסמה גרסה שונה של שיטת2011 34. בשנת 2015, Lee et al. דיווחו גם על שיטה סטנדרטית עצמאית להעשרת mEV שוב מתרביות אקסניות של מיקובקטריה35. בשילוב שני הפרוטוקולים34,35 ושילוב כמה מהשינויים שלנו לאחר סטנדרטיזציה יסודית, אנו מתארים כאן פרוטוקול המסייע להעשיר באופן שגרתי mEV מתרביות אקסניות של מיקובקטריה 36.

כאן אנו מפרטים במיוחד את ההעשרה של כלי רכב חשמליים ספציפיים ל-Msm, שהיא הרחבה של פרוטוקול36 שפורסם להעשרת רכבים חשמליים מיקובקטריאליים בכלל. אנו גם מפרטים כיצד לבנות mEV רקומביננטי (R-mEVs) המכילים את חלבון mCherry (ככתב פלואורסצנטי אדום) ואת EsxA (Esat-6)37,38,39, אימונוגן דומיננטי ותת-יחידה פוטנציאלית מחוסנת של Mycobacterium tuberculosis. הפרוטוקול להעשרת ה-R-mEV נותר זהה לזה שתיארנו להעשרת כלי רכב חשמליים מקומיים מ-Msm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תנאי גדילה של Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, ונגזרותיהם

  1. מדיה
    1. Middlebrook 7H9 מרק נוזלי
      1. הכינו תמיסת מלאי 20% Tween-80 על ידי חימום מראש של הנפח הנדרש של מים מזוקקים פעמיים (ddw) בכוס זכוכית ל~45-50 מעלותצלזיוס במיקרוגל, הוסיפו את הנפח הנדרש של Tween-80 באמצעות גליל מדידה מתאים, וערבבו ברציפות על מערבל מגנטי קטן כדי להביא את 20% Tween-80 לתמיסה אחידה. סנן את 20% Tween-80 דרך מסנן סילוק 0.22 אום ואחסן את תמיסת המניות בצבע צהוב בהיר בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס.
        הערה: יש להעביר את כל עקבות Tween-80 בגליל המדידה לתוך הכד לקבלת ריכוז סופי מדויק. אין לבצע autoclave את מלאי Tween-80 מוכן. יש לסנן (להשתמש ב-0.22 מיקרומטר) לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. בצע את הוראות היצרן להכנת מרק 7H9. להשעות 4.7 גרם של אבקת 7H9 ב 900 מ"ל של ddw. מוסיפים 2 מ"ל גליצרול, מערבבים את התכולה ואוטקלוב בטמפרטורה של 121 מעלותצלזיוס, 15 psi למשך 20 דקות.
        הערה: אל תוסיף את Middlebrook ADC enrichment (ADC) ואת Tween-80 לפני autoclaving.
      3. לאחר שהמדיה האוטומטית מתקררת לטמפרטורת החדר (RT, כלומר, ~ 25 oC), בארון בטיחות ביולוגית סטנדרטי מסוג A2, הוסף מלאי של 10x של 100 מ"ל ADC (1x סופי) ו- 2.5 מ"ל (0.05% סופי) של 20% Tween-80. סננו את התערובת דרך יחידת מסנן חד פעמית של 0.22 מיקרומטר ואחסנו את תמיסת הציר השקופה בצבע ירוק צהבהב בהיר מאוד בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס.
        הערה: ה- pH של המדיה חייב להיות ~ 6.6 עד 6.8 (אם <6.4 או >7.0, יש להשליך וליצור טרי). יש לאחסן ב 4 oC (יציב במשך 3-4 שבועות). מומלץ מאוד לסנן את חומרי ההדפסה 7H9 (לאחר הוספת ADC ו-Tween-80) פעמיים באמצעות שתי יחידות סינון חד-פעמיות עצמאיות של 0.22 מיקרומטר.
    2. מרק נוזלי של סאוטון (מדיה מינימלית)
      1. ממיסים L-אספרגין (0.4% w/v) וחומצת לימון (0.2% w/v) ב-950 מ"ל של ddw. הוסף 1 מ"ל כל אחד ממלאי 1,000x טרי מוכן (ב- ddw) של אשלגן פוספט דו-בסיסי (חסר צבע; מלאי 10 גרם/20 מ"ל; סופי 1x 0.5 גרם/ליטר); מגנזיום גופרתי heptahydrate (חסר צבע; מלאי 10 גרם/20 מ"ל; סופי 1x 0.5 גרם/ליטר); וברזל אמוניום ציטראט (חום בהיר מאוד; ציר 1.6 גרם/40 מ"ל; סופי 1x 0.04 גרם/ליטר) ומערבבים היטב על בחש מגנטי.
        הערה: במקרה הטוב, מניות פי 1,000 יכולות להיות בנות שבועיים; אם ישן מזה, להכין מלאי טרי; אחסנו אותם ב-RT בחושך (למשל, בתוך ארון/מדף). אם ברזל אמוניום ציטראט הוא חום כהה, להשליך אותו ולעשות אותו טרי. עדיף להוסיף את שלושת המלחים בסדר המוזכר בשלב 1.1.2.1. מערבלים את התמיסה בכל פעם לפני הוספת כל תמיסת מלח.
      2. למדוד ולציין את ה- pH באמצעות מד pH; ודא שזה סביב 3.1 עד 3.2. אם ה- pH הוא יותר מ 3.7, להשליך את המניות ולהכין טרי. כדי להתאים את ה- pH ל -7.4, השתמש בטיפות רבות של 10 N נתרן הידרוקסידי לפי הצורך. יש לעקוב אחר רמת החומציות הסופית תוך ערבוב מתמשך של התמיסה/המדיה על בוחש מגנטי.
      3. הוסף 4.76 מ"ל של גליצרול, 0.25 מ"ל של 20% Tween-80 (סופי 0.005%, ראה גם הערה לשלב 2.2.1.3), ורק אז, לפצות את נפח ל 1 L. לאחר מכן, יש לעקר את המסנן פי שניים מ-1 ליטר של מדיום באמצעות שני מסנני סילוק נפרדים של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את המדיום השקוף וחסר הצבע בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס (יציב למשך שבועיים).
        הערה: רק לאחר התאמת ה- pH ל- 7.4, הוסף גליצרול. אחרת, התקשורת תהפוך לבנה מעוננת. אם מעונן, השליכו אותו (אל תנסו לחמם אותו) והכינו אותו טרי. עבור כל ההכנות mEVs, השתמשו ב-Sauton's טריים.
    3. בסיס אגר מידלברוק 7H11
      1. בצע את הוראות היצרן להכנה. להשעות 19 גרם של אבקת 7H11 ב 900 מ"ל של ddw. מוסיפים 5 מ"ל גליצרול, מערבלים על מערבל מגנטי לקבלת מתלה אחיד (ירוק בהיר; pH 6.6 עד 6.8; אם >7.2, יש להשליך ולהכין טריים), ולבצע autoclave בטמפרטורה של 121 oC, 15 psi ולמשך 20 דקות.
        הערה: אין להוסיף ADC ו- 0.05% Tween-80 לפני autoclaving.
      2. כאשר המדיום מתקרר ל~50 oC, באופן אספטי בארון בטיחות ביולוגית מסוג A2, הוסף 100 מ"ל של ADC (שהובא ל- RT) ו- 2.5 מ"ל של 20% (0.05% סופי) Tween-80 (הובא ל- RT). יש לזרוק מיד לתוך צלחות פטרי.
        הערה: הצלחות יציבות בטמפרטורה של 4 מעלותצלזיוס למשך 4-6 שבועות לפחות. ודא שהצלחות נמצאות ב- RT למשך הלילה לפני שאתה עוטף את הצלחות לאחסון של 4 oC. אחרת, לחות תילכד בצלחות במהלך הדגירה ב 37 oC.
    4. מרק מילר לוריא ברטאני (LB) ובסיס אגר
      1. בצע את הוראות היצרן להכנה. להכנת ציר LB יש להשהות 25 גרם אבקה ב-1,000 מ"ל של ddw ולערבב בעדינות במשך 5 דקות בכוס זכוכית על מערבל מגנטי. עם השעיה אחידה, יש להכניס את הנפחים הנדרשים לבקבוקי מדיה (למשל, 300 מ"ל בבקבוק מדיה של 500 מ"ל) ולאוטוקלאב. כדי להכין LB אגר, להשהות 40 גרם של אבקה ב 1,000 מ"ל של ddw ו autoclave (12 גרם של אבקה ב 300 מ"ל ddw בבקבוק מדיה זכוכית 500 מ"ל).
  2. תנאי גידול
    הערה: כל השלבים של עבודת תרבית חיידקים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית (סוג A2). כל התרביות חייבות להיות מעובדות עם צינורות סטריליים, צלוחיות וקצוות פיפטה.
    1. יום 1
      1. הוסף 1 מ"ל כל אחד של מלאי גליצרול של Msm (מ -80 o C מקפיא) ל 2 x 10 מ"ל (ב 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות סטריליות) של אוטוקלאבל טרי, מקורר, מחומם מראש (~ 37 o C) 7H9 מרק, מערבלים שלוש פעמים, לסגור את המכסים ולדגור את הצינורות לילה ב 37 oC ו 200-220 סל"ד (שייקר אינקובטור).
        הערה: כדי לגדל Mycobacterium tuberculosis (Mtb), בצע צעדים דומים אך דגור על צינורות 50 מ"ל במשך 4-6 ימים ב 37 oC ו 120-150 סל"ד (שייקר אינקובטור) בהגדרות BSL3. עקוב אחר כל ההנחיות הבינלאומיות ונוהלי הבטיחות הביולוגית של פתוגנים BSL3 וקבוצת סיכון 3 תוך טיפול והשלכת Mtb ותרביותיו. השתמש בארון בטיחות ביולוגית מסוג B2 לטיפול ב- Mtb ובתרביותיו.
    2. יום 2
      1. כאשר OD 600 (A600nm; צפיפות תאים) מגיע ~ 1.0, צנטריפוגה את תרביות Msm במשך 10 דקות ב3,200 × גרם ו- RT (צנטריפוגת benchtop). השליכו את הסופרנאטנטים בעזרת קצוות פיפטה סטריליים של 1 מ"ל.
        הערה: השלב לעיל נשאר זהה עבור תרבויות Mtb, אלא שמספר הימים הוא 4-7. הקפידו לא לגעת בכדורית החיידקים עם קצה הפיפטה.
      2. שטיפה: לכל גלולת Msm, יש להוסיף 1 מ"ל של מדיית Sauton שחוממה מראש (בשלב RT) (שלב 1.1.2) ולהשהות מחדש בעדינות עם קצות פיפטה 1 מ"ל לקבלת מתלה אחיד. באמצעות קצות פיפטה סטריליים, לפצות את נפחים עד 10 מ"ל (בכל אחד) עם אותה מדיה. צנטריפוגו את המתלים למשך 10 דקות ב-3,200 × גרם ו-RT והשליכו את הסופרנאטנטים. חזור על שלב זה פעם נוספת.
        הערה: השלב לעיל נשאר זהה עבור תרבויות Mtb.
      3. יש להשהות מחדש את תאי ה-Msm שנשטפו פעמיים ב-20 מ"ל (כל אחד) של סאוטון שחומם מראש (שחומם מראש בצלחת או באינקובטור שייקר) ולמדוד את הצפיפות האופטית של התאים ב-600 ננומטר. חסן את הנפח הנדרש של תרביות Msm לצלוחיות סטריליות של 1 L Erlenmeyer המכילות ~330 מ"ל של Sauton סטרילי כך שה- OD600 הסופי הוא ~0.05.
        הערה: המתלים חייבים להתחיל תמיד בנפח קטן. אם הנפח הסופי מתווסף ישירות לגלולה כצעד אחד, התאים יישארו ככדורים מפוזרים (אינדיקטור להשעיה גרועה). הדרך היחידה לפתור את הבעיה היא לסובב את התרביות ולבצע מחדש את ההשעיה כפי שהומלץ. הצעד הנ"ל נשאר זהה עבור תרבויות Mtb.
    3. יום 2/3
      1. דוגרים על תרבית 330 מ"ל בשייקר האינקובטור ב 200 סל"ד ו 37 oC עד שהתרבות OD600 מגיע ~ 0.3. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעם אחת (בדומה לשלב 1.2.2.2 אבל עם נפח שווה) ולאחר מכן, להשעות מחדש את הגלולה באותו נפח. חלק 50 מ"ל של התרביות המושעות כל אחת לשש צלוחיות סטריליות של 1 ליטר Erlenmeyer, שכל אחת מהן מכילה 280 מ"ל של Sauton's סטריליים שחוממו מראש עם 1/10עשירית מהשימוש הרגיל (0.05%) Tween-80 כלומר 0.005% (ראה גם הערה של שלב 2.2.1.3. כדי להבין מדוע 1/10th). OD600 הסופי חייב להיות כ- 0.05.
        הערה: עבור תרביות Mtb, במקום צלוחיות Erlenmeyer, השתמש בבקבוקי רולר (בקיבולת של 1/2/4 ליטר). התאימו את נפח התרבית לבקבוק כך שכאשר שומרים אותו על מכשיר הגלילה, התרבית לא תגיע לפה של הבקבוק. הנפח בפועל בבקבוק הרולר יהיה תלוי בקיבולת של בקבוק הרולר.
      2. לדגור על כל אחת מתרביות 330 מ"ל בשייקר האינקובטור ב 200 סל"ד ו 37 oC עד OD600 מגיע 2.0 עד 2.5 (~ 15-18 שעות).
        הערה: עבור תרביות Mtb, ודא כי OD600 הסופי הוא ~ 1.0-1.2 (לוקח ~ 5-8 ימים).

2. העשרת Msm mEV על ידי שימוש בצנטריפוגות שיפוע צפיפות

  1. יום 4
    1. צנטריפוגה ~ 2 L של תרביות Msm בשלב מעריכי ביניים בבקבוקי צנטריפוגות סטריליות 6 x 400 מ"ל ב 4 oC למשך 20 דקות ב ~ 8,000 × גרם (צנטריפוגת מודל הרצפה). אספו את הסופרנאטנט התקשורתי/תרבותי המשומש בשתי צלוחיות 1 L Erlenmeyer מקוררות מראש ואחסנו אליציטוט של הגלולה לכל הליך אנליטי (כגון SDS-PAGE ו-Western Blotting - לא מפורט כאן).
      הערה: כל השלבים הבאים חייבים להתבצע בקור (~ 4 ° C) כדי לשמור טוב יותר על שלמות mEVs. ה-mEV יציבים למדי ב-RT אך קירור הוא הכרחי ליציבות לטווח ארוך (הקפאה והפשרה חוזרות אינן מומלצות). במהלך צמיחת התרבות האקסנית, mEV מתנתקים מפני השטח של Msm/Mtb ומצטברים במדיה התרבותית/מבוזבזת.
    2. סנן את הסופרנאטנט של תרבית Msm תחילה דרך יחידות מסנן הסילוק של 0.45 מיקרומטר ולאחר מכן, דרך יחידות מסנן הסילוק של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר את כל עקבות החיידקים.
      הערה: סינון ישיר דרך מסנני 0.22 מיקרומטר חונק לעתים קרובות את יחידות המסנן (מכיוון שכדורית החיידקים עלולה להיות מופרעת בעת ביצוע שלב 2.1.1). כדי ליצור סופרנאטנטים של תרביות Mtb, בצע שלושה סינון של תרביות Mtb (כלומר, שלב סינון ראשון עם יחידת מסנן חד פעמית של 0.45 מיקרומטר; שני שלבי סינון רצופים עם יחידות מסנן חד פעמיות של 0.22 מיקרומטר) לפני העברת תסנין התרבית להגדרות BSL-2.
  2. יום 4/5
    1. השתמש ברכזי הממברנה של 30 kDa כדי לרכז את תסנין תרבית Msm (~ 2 L) עד ~ 38 מ"ל על ידי צנטריפוגה של תסנין התרבית ב 4 oC, 20 דקות וב 3,200 × גרם.
      1. שטפו תחילה את הרכזים ב-ddw סטרילי וקר (~15 מ"ל) (שטפו ב-4 מעלותצלזיוס, 5 דקות וב-3,200 × גרם).
      2. יש לשטוף עם ~15 מ"ל של Sauton's מסוננים מראש וקרים (אותם תנאים כמו מים (2.2.1.1.)) כדי להסיר את כל עקבות הכימיקלים (המשמשים במהלך הייצור).
      3. מכיוון ש~130 צנטריקונים (אם משתמשים בהם בלבד) נדרשים טכנית כדי לרכז ~2 ליטר של תסנין תרבית, עשו שימוש חוזר בצנטריקונים לפחות 3-4 פעמים במידת הצורך. בצע את השלבים הבאים: רכז 15 מ"ל עד 0.5 עד 1.0 מ"ל (בצע את שלב 2.2.1), העבר את התרכיז לצינור אולטרה-צנטריפוגה נקי, אוטוקלאבי וקר של 38 מ"ל, ולאחר מכן העבר מחדש את סינון התרבית הלא מרוכז שנותר לצנטריקונים המשומשים לריכוז חוזר.
        הערה: שימוש ברכזי 24, 30 kDa לריכוז 2 ליטר של תסנין תרבית ייקח עד 6 שעות. עם ריכוז תסנין התרבית, Tween-80 גם מתרכז ויכול לחסום את המרכז. שימוש ב-Tween-80 עד 0.005% סופי (במקום 0.05%) במדיה של סאוטון מסייע למנוע חסימה זו. הריכוז המופחת של Tween-80 אינו משפיע על התרחיף האחיד של Msm במהלך הגדילה ואינו גורם להתגבשות של תאי Msm. עם זאת, מכיוון שתאי Mtb מתגבשים ב-0.005% Tween-80, השתמש ב-0.05% Tween-80 עבור כלי רכב חשמליים ספציפיים ל-Mtb.
    2. מעבירים את תסנין תרבית ה-Msm המרוכז (~38 מ"ל) לצינור צנטריפוגה פוליפרופילן נקי, שטוף (עם ddw) ומקורר מראש בנפח 40-50 מ"ל ומעבירים אותו לצנטריפוגה דו-שלבית, תחילה ב-4,000 × גרם ולאחר מכן ב-15,000 × גרם, שני השלבים ב-4 מעלותצלזיוס למשך 20 דקות (כדי להסיר את כל הפסולת). השתמש בצנטריפוגה מסוג רצפה עבור אותו הדבר.
  3. יום 5/6
    1. מעבירים את הסופרנאטנט של התרבית לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה פוליפרופילן בנפח 38.5 מ"ל ומסובבים אותו באולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך 4 שעות ב-4 מעלותצלזיוס.
      הערה: דלי נדנדה פועל בצורה הטובה ביותר במהירות זו. יש להקפיד למלא את צינור האולטרה-צנטריפוגה עד שוליו ושיהיה לו צינור אולטרה-צנטריפוגה מאוזן במשקל שווה. אם אחד הצינור נדבק לדלי הנדנדה לאחר צנטריפוגה (מה שקורה עקב עיבוי), באמצעות מלקחיים, הסר אותו בעדינות מהרוטור. ניגוב הלחות המעובה הקיימת על פני השטח החיצוניים של האולטרה-צנטריפוגה לפני אולטרה-צנטריפוגה מונע הידבקות.
    2. שמור את supernatant בצינור precooled 50 מ"ל (ראה הערה). הפוך את צינור האולטרה-צנטריפוגה על נייר סופג טרי ללא סיבים כדי להסיר עקבות של הסופר-נטנט. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-600 מיקרוליטר של תמיסת חיץ HEPES (50 mM HEPES ו-150 mM NaCl, pH 7.4; יש לסנן-לעקר לפני השימוש).
      הערה: שמור את supernatant רק כגיבוי. גלולת mEV המקומית מופיעה ככתם דמוי ג'לי, קוטר 5-7 מ"מ, צהוב אפרפר עמום עד כתם שקוף. אם אף כדור אינו גלוי, חזור על שלב 2.3.1 על-ידי שימוש חוזר בסופרנטנט שנשמר. אם לא מופיעה גלולה לאחר חזרה על שלב 2.3.1, מחק והפעל מחדש משלב 1.2. לוקח זמן להתלות את הגלולה מחדש. מומלץ להוסיף את חיץ HEPES ולהשאיר אותו לילה על 4 מעלותצלזיוס למתלים קלים. יש להשהות בעדינות אך עם צנרת חוזרת ונשנית (השתמשו בקצוות P200 למתלים טובים יותר) עד להשעיה אחידה.
  4. יום 6
    1. יש להעביר את הגלולה המרחפת לצנטריפוגה הדרגתית מבוססת יודיקסנול.
      1. שכב את הגלולה המרחפת בתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה פוליפרופילן אולטרה-צלול נקי 13 מ"ל 13 מ"ל וערבב בעדינות (השתמש בפיפט 1 מ"ל) עם ~ 4 מ"ל של תמיסת 'יודיקסנול' הדרגתית בצפיפות אינרטית (זמין מסחרית כתמיסת ~ 60% w/v). לאחר שכבות הגלולה המרחפת בתחתית הצינור (עד למקסימום של 5 מ"ל), לאחר מכן כיסוי עם 1 מ"ל (w/v) כל אחד של 40%, 30%, 20% ו 10% מלאי משנה של 'יודיקסנול' בסדר המתאים (להכין מלאי משנה (עם מאגר HEPES) מ 60% מלאי). לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל של 6% תת מלאי (מוכן מ 60% מלאי עם חיץ HEPES) בחלק העליון כדי למלא את הצינור.
        הערה: יש להכין את שיפוע הצבע ממש לפני השימוש; לעולם אל תאחסן ותשתמש.
      2. בזהירות (ללא טלטול), לשקול את הצינור בתוך זכוכית, ולהעביר אותו בעדינות לתוך רוטור דלי מתנדנד.
        הערה: שקילה נחוצה כדי לאזן עם צינור דמה (גם נשקל).
      3. נושא אותו אולטרה צנטריפוגה ב 141,000 × גרם במשך 16 שעות ב 4 oC.
  5. יום 7
    1. בזהירות להסיר את הצינור (ראה הערה של שלב 2.3.1) ולאסוף 1 מ"ל שברים לתוך צינורות microcentrifuge autoclaved טרי; שימו לב לשבריםה-4 עד ה-6, שבדרך כלל מכילים אתה-Msm mEVs.
      הערה: ה-mEVs משברים אלה מתחלקים בדרך כלל לשלושה או ארבעה תחומי תדרים של mEV (אחד מהם הוא הפס הראשי) שצבעם לבן עמום. ה-R-mEV המכילים mCherry מתחלקים בשבריםה-5 עדה-7 ונראים סגולים כהים עד מגנטה. כלי הרכב החשמליים Mtb מתחלקים בדרך כלל בשברים ה-5 עדה-7. ההפרדה של mEV במעבר הצבע תלויה בריכוז השיפוע שבו נעשה שימוש ובאיזו מידה השיפוע הוא שכבתי. אם mEV נקרעים באופן חלקי, הם עשויים להיפרד בשברים מוקדמים יותר. לחלופין, אם הגלולה המתקבלת לאחר שלב 2.3.2 אינה תלויה היטב, השלפוחיות יוצרות מיקרו-כדוריות צפופות המתחלקות כשברים מאוחרים יותר. אנו ממליצים על איסוף מדויק של השברים רק כאשר המשתמש רוצה להעריך איזה מהשברים של 1 מ"ל מכיל את ה- mEVs. משתמשים עשויים לרצות aliquot לשברים קטנים או גדולים יותר בהתבסס על הנוחות שלהם. כאשר אנו משתמשים בהם עבור יישומים מסוימים, לדוגמה, ובודקים אותם כמאיץ חיסוני פוטנציאלי לתת-יחידה ל-BCG, אנו מגבילים את איסוף ה-mEV שלנו לפחות מ-250 מיקרוליטר מהשברים (כאשר mEV מתחלקים) כך שנוכל לאסוף באופן ספציפי רק את רצועות ה-mEV ואת התהליכים כפי שמצוין ב-2.7.5. זה עוזר להסיר בצורה יעילה יותר את כל עקבות היודיקסנול שעלולים להפריע לניסויים שלנו במורד הזרם.
  6. יום 8
    1. אגרו את השברים המכילים mEVs, דללו עם חיץ HEPES ל-38 מ"ל, וחזרו על האולטרה-צנטריפוגה ב-4 oC במשך 16 שעות ב-100,000 × גרם. יש להשהות מחדש את הגלולה (כמו בשלב 2.3.2 עם אותן אזהרות) במאגר HEPES או בכל חיץ שניסויים במורד הזרם (לא מפורט כאן) כגון הערכת חלבונים, ניתוחי ננו-מעקב, צביעה שלילית, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, כתמים מערביים ותיוג חיסון-זהב.
      הערה: למתלים טובים יותר, סוניק את הצינור המכיל mEV למשך 10 דקות באמצעות סוניק אמבט מים על-קולי. סוניקציה למשך זמן רב יותר עלולה לגרום לקרע ולאובדן של mEV שלמים. אם מושעה היטב, סוניקציה היא מיותרת. כל השלבים מ-2.1 עד 2.6 זהים תוך העשרת כלי רכב חשמליים שנוצרו על ידי Mtb.

3. בנייה והעשרה של mEV רקומביננטי.

הערה: אחד מ-10 החלבונים הנפוצים ביותר (המזוהים על ידי ספקטרומטריית מסות) של Msm EV הוא Cfp-2930. בהתחשב בגודלו הקטן (29 kDa), מבנה משני פשוט 40, לוקליזציה לממברנה 41, ונטייתו להיות מופרש למדיה משומשת בתרביות אקסניות (למשל, כחלבון תסנין תרבית; מופרש הן על ידי Msm והן על ידי Mtb42,43, כאן, הוא נוצל כדי לספק כתב פלואורסצנטי אדום וחלבון מעניין (EsxAMtb) לתוך mEVs. כדי להשיג זאת,

  1. השתמש בפריימרים מתאימים קדימה ואחורה (טבלה 1; תואם לשיבוט ישיר לווקטור מעבורת כגון pMV261) להגברת cfp-29 מ- Msm. באמצעות ~ 50 ng של משקל מולקולרי גבוה (~>20 kb) Msm DNA גנומי כתבנית, PCR מגביר את מקטע הגן cfp-29 עם הגהה גבוהה DNA פולימראז (כגון Phusion או Q5). פעל בהתאם להמלצות היצרן עבור PCR.
    הערה: עצבו את אתרי ההגבלה הנחוצים לפריימרים לשכפול קל לכל וקטור מעבורת חלופי שמעניין אתכם. תנאי ה-PCR והנפח ישתנו בהתאם לסוג ולמותג של DNA פולימראז לקריאת הגהה הנמצא בשימוש. נפח תמהיל התגובה ישתנה בהתאם לכמות תבנית ה- DNA וכמות ההגהה של DNA פולימראז. עקוב אחר המלצות היצרן לתנאי PCR, הצלחת הגברה וביטול חישול לא ספציפי של פריימרים.
  2. PCR מטהרים את האמפליקון המדולל עם כל ערכת טיהור PCR זמינה מסחרית ומוודאים את אורך האמפליקון על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל אגרוז. לעכל את המגבר מטוהר.
    1. הערך את כמות האמפליקון המטוהר על ספקטרופוטומטר. יש להשתמש לפחות ב-2 מיקרוגרם של אמפליקון cfp-29 לעיכול.
    2. יש לעכל תחילה עם BstB1 בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוסלמשך שעה אחת (סוג וכמות החיץ והאנזים - בהתאם להמלצות היצרן), להוריד את טמפרטורת התגובה ל-RT, ולאחר מכן לעכל עם HindIII למשך שעה אחת ב-37 מעלותצלזיוס (סוג וכמות החיץ והאנזים - בהתאם להמלצות היצרן).
    3. PCR לטהר ולנטרל את האמפליקון המעוכל ב 50 μL של ddw נטול nuclease autoclaved.
    4. להעריך את הריכוז ואת התפוקה של אמפליקון מעוכל באמצעות ספקטרופוטומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 oC עד להגדרת הקשירה. הערה: לאחר PCR, אמת את אורך האמפליקון (~ 798 + 50 bp) ותשואה על ידי אלקטרופורזה של 10 μL של תערובת תגובת PCR על ג'ל אגרוז 1%. למרות שעיכול כפול אינו אפשרי עם שילוב זה של אנזימים, חיץ תואם ימנע טיהור PCR חוזר ולאחר מכן אובדן של אמפליקון מעוכל. ריכוז האמפליקון המעוכל משתנה בהתאם לערכה המשמשת לטיהור PCR. זה גם משתנה עם האורך (ב bp) של כל וקטורים חלופיים של בחירה.
  3. השתמש בפריימרים קדימה ואחורה (טבלה 1), הגהה DNA פולימראז, ו~ 50 ng של DNA גנומי Mtb, PCR להגביר esxA או esxA-3X FLAG-tag ספציפי אמפליקון. השתמש ~ 5 ng של DNA פלסמיד מתאים כדי PCR להגביר mCherry. פרטי פלסמיד ורצף נמצאים בקובץ משלים 1.
    הערה: השתמש במקשר גליצין, גליצין, גליצין, גליצין, סרין44,45(G4S) בין cfp-29 לבין mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; לפני תחילת mCherry, מקשר G4S מסייע ל- mCherry לא לעבור קפלים מזויפים שאינם פונקציונליים (כולל אלה המונעים על ידי Cfp-29). עיין ברצפי cfp-29, hsp60 promoter, mCherry ו-esxA בקובץ משלים 1. פלסמידים המשמשים כתבניות עבור mCherry זמינים במאגרים / בנקים שונים של פלסמיד. קיימות גרסאות שונות (רצפים שהשתנו מעט) של mCherry שידרשו שינוי רצפי פריימר קדימה ואחורה. הפריימרים (טבלה 1) מסייעים בהגברת הדובדבן המוזכר בקובץ משלים 1. מיזוג של N-terminus של mCherry/esxA/esxA::3XFLAG לקצה מסוף C של Cfp-29 עובד היטב.
  4. לעכל 1 מיקרוגרם של DNA של mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplicons ולטהר DNA מעוכל.
    1. יש לעכל פעמיים כל אמפליקון עם HindIII ו-HpaI למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלותצלזיוס (או לפי המלצות היצרן).
    2. השתמש בערכת טיהור PCR זמינה מסחרית ובהמלצות היצרן לטיהור המגבר המעוכל. יש להצדיע לאמפליקון המעוכל ב-50 מיקרוליטר של ddw נטול נוקלאז אוטוקלאבי.
    3. להעריך את הריכוז ואת התפוקה של אמפליקון מעוכל באמצעות ספקטרופוטומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 oC עד להגדרת הקשירה.
  5. תקעול 2 מיקרוגרם של pMV261-KanR (קובץ משלים 1) או וקטור שיבוט מתאים עם האנזים (ים) לבחירה.
    1. יש לעכל תחילה עם BstB1 בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוסלמשך שעה אחת (סוג וכמות החיץ והאנזים - בהתאם להמלצות היצרן), להוריד את טמפרטורת התגובה ל-RT, ולאחר מכן לעכל עם HindIII למשך שעה אחת ב-37 מעלותצלזיוס (סוג וכמות החיץ והאנזים - בהתאם להמלצות היצרן).
    2. ג'ל לטהר ו elute ב 50 μL של ddw autoclaved nuclease חינם.
    3. להעריך את הריכוז והתשואה של הווקטור המעוכל באמצעות ספקטרופוטומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 oC עד להגדרת הקשירה.
      הערה: שכפול חד-שלבי של שני מקטעים אפשרי עם הפריימרים לעיל עבור pMV261. כל וקטור מעבורת חלופי שישרוד כאפיזום יעבוד. פלסמידים אינטגרטיביים יעבדו גם הם, אך תפוקת החלבון הרקומביננטי תהיה נמוכה יחסית לכל בסיס תא.
  6. לקשור ולהפוך לזן תואם של E. coli.
    1. עבור קשירה, השתמש 125 ng של הווקטור. יש להשתמש באמפליקונים mCherry/esxA/esxA::3XFLAG מעוכלים כראוי ביחס מולארי של 1:3. יש לבצע קשירה למשך הלילה באמצעות T4 DNA Ligase (כמות בהתאם להמלצות היצרן) בטמפרטורה של 16°C באמבט מים במחזור קירור.
      הערה: השתמש בפקדים מתאימים כגון וקטור רק עם וללא ליגאז דנ"א T4 להערכת יעילות העיכול וחיזוי יעילות הצלחת השיבוט.
    2. שינוי
      1. הפשיר NEB5α תאים מוכשרים כימית aliquots (~ 100 μL לכל טרנספורמציה) על קרח במשך 15 דקות. מערבבים בעדינות פעמיים עם קצה פיפטה סטרילי. הוסף תערובת קשירה (עד 20 μL) לתאים המוכשרים הקרים.
      2. מערבבים בעדינות תאי פיפטה + DNA קשור. דוגרים על התערובת על קרח למשך 30 דקות נוספות.
      3. ספק הלם חום ב 42 ° C (באמבט מים במחזור) במשך 60 שניות ומיד להעביר בחזרה לקרח למשך 15 דקות נוספות.
      4. לשחזר את התאים מותמרים על ידי הוספת 1 מ"ל של מרק SOC (2% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, ו 20 mM גלוקוז) ולדגור ב 37 ° C במשך 1 שעה ב 200 סל"ד.
      5. סחררו את החיידקים שנמצאו בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (3000 × גרם, RT ו-10 דקות), השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מצעי LB סטריליים, מחוממים מראש וטריים, ופרשו את התרחיף על צלחות אגר LB Miller שזה עתה נמזגו המכילות אנטיביוטיקה נדרשת בריכוזים מתאימים.
      6. דוגרים על צלחות הפטרי באינקובטור צלחות שנקבע מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
  7. מסך (לא מפורט כאן) עבור שיבוטים פוטנציאליים, לאמת (על ידי מושבה PCR-/אנזימי הגבלה מבוססים)46 ולרצף (ריצוף Sanger) אותם כדי לאשר איחוי.
  8. חלץ DNA פלסמיד (~ 200 ng/1-2 μL; כל ערכה זמינה מסחרית) של השיבוט המאושר (רקע E. coli ) והפוך אותו לתאים אלקטרו-מוכשרים טריים של Msm.
  9. הכנת תאים אלקטרו-כשירים של Msm
    1. Msm טרי לגדל (כמו בשלבים 1.2.1 ו 1.2.2). שטפו את ה-Msm הטרי כמו בשלבים 1.3.3 ו-1.3.4 (למעט, השתמשו ב-7H9 + ADC + Tween-80 (עשיר) במקום בזה של Sauton).
    2. הוסף aliquot של תאי Msm שטופים OD 600 סופי של ~0.05 בבקבוק Erlenmeyer סטרילי500 מ"ל המכיל 150 מ"ל של מדיה עשירה.
    3. דגירה בשייקר האינקובטור ב 200 סל"ד ו 37 oC עד התרבית OD600 מגיע ~ 0.8 ל 1.0 (~ 12-14 שעות).
    4. מעבירים את התרבית לבקבוק צנטריפוגה מצונן של 400 מ"ל ודגרים על קרח למשך 60-90 דקות. לאחר מכן, כדורו את התאים למטה ב 4 oC במשך 15 דקות ב 4,000 × גרם.
    5. שטפו את התאים פעמיים (כל שטיפה עם 150 מ"ל, בטמפרטורה של 4,000 × גרם, 4 מעלותצלזיוס ו-15 דקות) עם גליצרול 10% סטרילי וקר כקרח.
      הערה: עם כל כביסה, הגלולה הופכת רופפת. יש לנקוט משנה זהירות בעת השלכת כל הסופרנאטנט (לאחר כל שטיפה). אחרת, רוב התאים יאבדו בסופרנטנט שהושלכ.
    6. לשטוף את התאים פעם נוספת עם 75 מ"ל של קר כקרח, סטרילי 10% גליצרול המכיל 0.005% Tween-80.
    7. להשעות מחדש את גלולת התא ב 7.5 מ"ל של 10% גליצרול עם 0.005% Tween-80 ו aliquot לתוך 400 μL aliquots.
      הערה: למרות שתאי Msm electrocompetent מוכשרים לפחות 4 חודשים, תאים אלקטרו-מוכשרים טריים נותנים את התוצאות הטובות ביותר. בעת שימוש בתאים מוכשרים ישנים, כמה מושבות שאינן ורודות (לבנים) מופיעות כטרנספורמציות מזויפות. ככל שהתאים המוכשרים ישנים יותר, כך המושבות הלבנות גדולות יותר.
  10. טרנספורמציה של Msm
    1. הפשירו את התאים המוכשרים של Msm על קרח.
      הערה: הפשרה ב-RT והפיכת תאים כאלה מניבה פחות יעילות.
    2. הוסף 1-2 μL של DNA פלסמיד (~ 200 ng סה"כ) לתאים המוכשרים קרים, לערבב בעדינות עם קצה פיפטה סטרילי 1 מ"ל, ולהעביר לקובט אלקטרופורציה סטרילי 2 מ"מ מקורר מראש.
    3. מעבירים את הקובטה הסגורה עם תאים מוכשרים Msm + תערובת DNA פלסמיד לעכבר של האלקטרופורטור, סוגרים את המכסה בעדינות ומורחים פולס (סוג דעיכה מעריכית) ב 2.5 קילו וולט (מתח), 25 מיקרו F (קיבול) ו 1000 Ω (התנגדות).
    4. מוסיפים מיד 1 מ"ל של חומר סטרילי עשיר שחומם מראש (7H9 + ADC + Tween-80) בינוני לקובט, מערבבים בעדינות עם קצה פיפטה סטרילי 1 מ"ל, ומעבירים את כל התוכן לצינור סטרילי 10 מ"ל.
    5. לדגור את התוכן במשך 3 שעות בשייקר אינקובטור להגדיר 37 oC ו 200 סל"ד. יש לסובב את התכולה בצינור מיקרוצנטריפוגה (4,000 × גרם, RT ו-10 דקות), להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של תווך עשיר סטרילי שחומם מראש, ולמרוח את התרחיף על צלחות אגר 7H11 שזה עתה נמזגו המכילות ADC, Tween-80 והאנטיביוטיקה הנדרשת בריכוזים מתאימים.
      הערה: עבור Msm, בעת הצורך, השתמש Hygromycin, Kanamycin, ו Apramycin בריכוזים הסופיים של 50 מיקרוגרם / מ"ל, 25 מיקרוגרם / מ"ל ו 50 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה. Msm כשלעצמה אינה עמידה לאנטיביוטיקה זו. השתמש באנטיביוטיקה זו רק בעת שימוש בפלסמידים עם הגנים העמידים המתאימים לבחירה/צמיחה של מושבות טרנספורמטים/רקומביננטיות MSM.
    6. לדגור את צלחות פטרי באינקובטור צלחת מוגדר מראש ל 37 oC. בדרך כלל, טרנספורמנטים מופיעים בין 3-5 ימים.
      הערה: אם חלבון מעניין רעיל ל-Msm, הטרנספורמטורים עשויים להופיע מאוחר יותר או לא לצאת. במקרים כאלה, שכפל גרסאות חתוכות באורך מלא.
    7. צור מלאי גליצרול של מושבות MSM המתהוות לאחר אימות לשיבוטים חיוביים (זהה לשלב 3.7)
  11. כדי להעשיר חלבוני R-mEV המכילים חלבוני mCherry או EsxA, יש לגדל תחילה R-Msm המבטא mCherry או exsA או esxA::3X FLAG על ידי ביצוע שלבים 1.2.1 עד 1.2.3 ולאחר מכן בצע את שלבים 2.1 עד 2.6. להעשיר R-mEVs. ה-R-mEVs נפלטים לתוךהשברים ה-4-7 לאחר ספין שיפוע הצפיפות (שלב 2.5). כדורי R-mEV לאחר שלב האולטרה-צנטריפוגה הראשון (2.3.1). לאחר ביצוע זהה לשלב 2.3.1, ודא כי R-mEV נראים כגלולה סגולה כהה עד מגנטה בקוטר 5-7 מ"מ במרכז התחתון של אולטרה צנטריפוגה.
  12. בצע ניתוחים מערביים47 (לא מפורט כאן) כדי לזהות חלבונים בעלי עניין בתוך R-mEV מועשר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו משתמשים ב-M. smegmatis (Msm) כמודל מיקובקטריום כדי להדגים את ההעשרה של mEV מקומיים ורקומביננטיים (R-mEVs). פרוטוקול העשרה סכמטי זה של mEVs (איור 1) פועל גם להעשרה של R-mEV של Msm ושל כלי רכב חשמליים מקומיים של Mtb (עם שינויים קלים כמו בהערות פרוטוקול של 1.2). הדמיה של כלי רכב חשמליים מועשרים דורשת צביעה שלילית שלהם תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת36 (איור 2A). בדרך כלל, כלי רכב חשמליים ספציפיים ל-Msm נפרדים בשברים ה-4-61 מ"ל של שיפוע הצפיפות של 13 מ"ל 6-60% (איור 2B). כ-80-100 מיקרוגרם חלבון שווה ערך לכלי רכב חשמליים מתקבלים באופן שגרתי מ-2 ליטר של תרביות אקסניות לוגריתמיות אמצעיות של Msm. הקטרים שלהם נעים בדרך כלל בין 20 ננומטר ל-250 ננומטר (איור 2C).

אחת המטרות ארוכות הטווח של המעבדה שלנו היא להעריך אם mEVs של מיקובקטריה שונים יכולים לשמש כמאיץ תת-יחידה לחיסון הקיים, BCG. מאחר שהעשרת mEV המיוצר על ידי חיידקים פתוגניים גוזלת זמן, מסוכנת ויקרה, ניצול כלי רכב חשמליים מקומיים ורקומביננטיים ממיקובקטריה אלימים עשוי לעבוד כחלופה מתאימה. לפיכך, אנו שואפים לא רק לתקנן את הפרוטוקול כדי להעשיר את mEVs של Msm, אלא גם לבנות ולהעשיר את R-mEV שלה.

כדי לבנות R-mEVs, בחרנו תחילה את 10 החלבונים הנפוצים ביותר של Msm EV (טבלה 1; זיהינו אותם מניתוח ספקטרומטריית מסה מפורט של Msm EVs)30. שיערנו שאם חלבון זר בעל עניין מאוחה באופן תרגומי לאחד מהם, הוא אמור להיות מסוגל להתמקם לכלי רכב חשמליים. לאחר מכן, רשמנו את Cfp-29 בין 10 מכיוון שהוא הקטן ביותר ביניהם (~ 29 kDa), הוא מקומי בקרום, והוא חלבון תסנין תרבית עם מבנה משני פשוט יחסית40,41,42,43. התיך באופן תרגומי את קצה N-terminal של mCherry (חלבון פלואורסצנטי) לקצה מסוף C של Cfp-29 והערכנו את ההעמסה/מסירה שלו לתוך mEVs. חלק מה-mEV המועשר של Msm הפך ורוד (איור 3), מה שמצביע על היכולת של Cfp-29 לשאת חלבון זר בעל עניין לתוך Msm EVs.

בהינתן היכולת הזו של Cfp-29 (איור 3), הערכנו את EsxA (Esat-6), חלבון אימונוגני עיקרי37,38,39 שמועבר ל-MSM EVs. שוב, יצרנו שני מיזוגים תרגומיים תרגומיים עצמאיים למסוף C של Cfp-29 בלבד EsxA ולתג EsxA + 3X FLAG (3X FLAG מאוחה למסוף C של EsxA. כצפוי, צפינו ב-EsxA של Mtb בכלי רכב חשמליים מסוג Msm (נתיבים 5, 6 ו-10, איור 4A,B), אם כי בכמויות נמוכות. מעניין, Cfp-29::EsxA::3XFLAG היה הרבה יותר יציב (נתיבים 3 ו 4 ועוד 8 ו 9; איור 4A) והצטברו ברמות גבוהות יותר ברכבים חשמליים (נתיבים 3 ו-4 ועוד 8 ו-9; איור 4B). לסיכום, אנו מדגימים את התכנון, הבנייה וההעשרה של R-mEV המכילים חלבון זר בעל עניין (איור 3 ואיור 4).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של העשרת שלפוחית חוץ-תאית מיקובקטריאלית. המונח 'ימים' (בגופן אדום, בראש האיור) מתייחס לימים הדרושים להעשרת ה-mEV מ-Msm (במיוחד עבור שלבי פרוטוקול 1 ו-2). "שלבים" (בגופן שחור, תחתית האיור) מתייחסים לשלבי הפרוטוקול כמתואר בסעיף הפרוטוקול. להעשרת mEV מ-Mtb, למרות שכל השלבים דומים, לוקח לפחות 10 ימים מהשלבים השונים של הטיפוח (שלב 1) לשלב הראשון של הצנטריפוגה (שלב 2). השלבים הבאים דורשים משך זמן זהה (כפי שמצוין בגופן אדום). לפני שיפוע הצפיפות, כדורי mEV + קומפלקסים חוץ-תאיים נראים חסרי צבע כאשר הם מעשירים הן mEV מקומי והן R-mEVs. אולם הוא ייראה ורדרד עד כחול (ראו איור 3) בעת העשרת mEV המכילים mCherry. לאחר שיפוע הצפיפות, mEV יופיעו לבנים (מקוריים ו-R-mEVs) או ורודים (אם הם מכילים mCherry) בצינור שיפוע הצפיפות. הצבעים של mEVs באיור נועדו רק לציון בהירות ואינם מייצגים את הצבעים המדויקים. ראו איור 3 לקבלת בהירות רבה יותר. קיצורים: Msm = M. smegmatis; Mtb = M. שחפת; 0.45 ו- 0.22 מיקרומטר = גודל הנקבוביות של יחידות מסנן הסילוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים הם מעגליים, מרוכזים עם שיפועי צפיפות ומשתנים במימדים . (A) תמונה מייצגת של Msm EV בהדמיה שלהם עם צביעה שלילית וצפייה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר. (B) תמונה מייצגת של האופן שבו mEV מופיעים בצינור האולטרה-צנטריפוגה בעת ביצוע שיפוע צפיפות של 6-60%. אם השיפוע של 6-60% אינו שכבתי במדויק, המיקום של הפסים הראשיים (חץ פתוח עליון) ומינוריים (חץ פתוח תחתון) של mEV יכול להשתנות באופן משמעותי, ובכך לשנות את מספר השבר של 1 מ"ל. (C) תמונה מייצגת על ניתוח ננו-מעקב של mEV מועשר של Msm. ניתוחי ננו-מעקב חושפים את הפרופורציות והריכוזים של mEV בגדלים שונים ואת המספר הכולל של mEV בתוך ההכנה. בממוצע, עם הפרוטוקול המפורט כאן, ~ 1-3 × 1010 EV מועשרים מ 2 L של Msm ו Mtb. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: צעדים שונים המעידים על העשרה של mEV המבטאים mCherry. (A) תמונה מייצגת המציגה את התרבות האקסנית של Msm המבטאת Cfp-29::mCherry. (B) תמונה מייצגת של כדורית החיידקים לאחר צנטריפוגה של תרבית אקסנית Msm המבטאת Cfp-29::mCherry. (C) תמונה מייצגת של תרכיז תסנין התרבות המתקבלת לאחר ריכוז המדיה המבוזבזת של התרבות האקסנית של Msm המבטא Cfp-29::mCherry באמצעות רכזי צנטריקון. (D) תמונה מייצגת של mEVs + קומפלקסים חוץ-תאיים גלולה לאחר אולטרה-צנטריפוגה של תרכיז תסנין תרבית המתקבלת מתרבית אקסנית Msm המבטא Cfp-29::mCherry. עם זאת, הגלולה תישאר חסרת צבע אם ה-mEV יהיו מקוריים או רקומביננטיים (עם איחוי ל-Cfp-29) עבור כל חלבון/ים זר למעט mCherry. (E) תמונות מייצגות של mCherry המכילות mEVs. שימו לב שלא כל ה-mEV הם ורודים, מה שמצביע על כך שלא כל ה-mEV מכילים Cfp-29. טוב: תמונה מייצגת המציינת רצועות שונות של mEV המתקבלות בדרך כלל לאחר העשרה עבור Cfp-29::mCherry EVs. מכיוון שכלי רכב חשמליים המכילים mCherry צפופים יותר, הם נפרדים לשברים מאוחרים יותר. גרוע: תמונה מייצגת המעידה על הפרדה גרועה (ה-mEV הלבנים נפרדים בשבר הראשון/השני וה-mEV המכילים mCherry נפרדים בשברה-10 (אולי בגלל השעיה לקויה של כדורי mEV, כלומר שלב פרוטוקול 2.3.2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: mEV רקומביננטי המכיל EsxA (ESAT-6), אימונוגן מקודד Mtb ב-Msm Total Cell Lysate ו-Msm שנוצר EVs. (A) ג'ל קומאסי ו-(B) ניתוח מערבי (זוהה עם נוגדן רב-שבטי ספציפי ל-ESAT6) תמונות המראות הצטברות של ExsA מאוחה הן בליזט התא הכולל והן ב-mEV המבטאים cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, נתיבים 3 ו-4 (סה"כ ליזט) ונתיבים 8 ו-9 (mEVs)) או cfp-29:: esxA (- 3XFLAG, נתיבים 5 ו-6 (סה"כ ליזט) ונתיב 10 (mEVs)). חצים פתוחים וחצים מלאים מציינים Cfp-29::ExsA::3XFLAG ו- Cfp-29::ExsA מצטברים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פריימרים:
Sl # גן תחל רצף (5' עד 3') מקור כדי לשכפל לתוך
1 CFP-29 קדימה CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC MSM DNA גנומי pMV261
הפוך GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG MSM DNA גנומי pMV261
2 mדובדבן קדימה GAAAAGCTT(HindIII) ggcggcggtggctcg (G4S linker)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGAGAGG אוסף מעבדה pMV261
הפוך TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC אוסף מעבדה pMV261
3 esxA קדימה GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (מקשר G4S) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG DNA גנומי Mtb pMV261
הפוך TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 DNA גנומי Mtb pMV261
4 דגל exsA-3X קדימה GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (מקשר G4S) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG DNA גנומי Mtb pMV261
הפוך TGTGTTAAC(HpaI)TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtgtccttgtagtc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 DNA גנומי Mtb pMV261

טבלה 1: רצפי פריימר. מופיעים פריימרים קדימה ואחורה להגברת cfp-29, mCherry, esxA ו-esxA::3X FLAG ושכפול לווקטור מעבורת pMV261.

קובץ משלים 1: A: pMV261, המפה המעגלית שלו, התכונות העיקריות ורצף הנוקלאוטידים המלא. צהוב הדגשה-hsp60 מקדם נוקלאוטיד רצף; אתרי הגבלת הדגשה ירוקים וציאנים שלתוכם שוכפלו אמפליקונים mCherry, esxA ו-esxA::3X FLAG. B, C ו-D: רצפי נוקלאוטידים של cfp-29, mCherry ו-esxA, בהתאמה. קודון הדגשה-עצירה ירוק של cfp-29, mCherry ו-esxA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאחר שפיתוח חיסון חדשני לשחפת שעדיף על BCG ויכול להחליף אותו נותר אתגר עצום, כחלופה, מספר קבוצות מחפשות גילוי של חיסוני שחפת תת-יחידות שונות שיכולים להגביר את עוצמתו של BCG ולהאריך את משך ההגנה שלו48,49. בהתחשב בתשומת הלב הגוברת לרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) כתת-יחידות פוטנציאליות וכאדג'ובנטים טבעיים50,51, העשרה עקבית של כמויות מספיקות של mEV לבדיקה/ניתוח במורד הזרם הפכה לצעד חשוב. בהתחשב בשאלות מחקר אלה, פרוטוקול זה נועד להעשיר mEV מתרביות אקסניות ומהגרסאות הרקומביננטיות שלהם.

במהלך ניתוח פרוטאום ספקטרומטרי מסה מפורט של Msm EVs, Prados-Rosales et al. זיהו את 10 החלבונים הנפוצים ביותר30. עוד שיערנו כי עם הנדסה מולקולרית מספקת, אחד מהם אמור להספיק כדי לשאת חלבון זר בעל עניין לתוך mEVs. מעניין, Cfp-29 בלט כאפשרות הטובה ביותר האפשרית בגלל התכונות השונות שלה 39,40,41,42. הנתונים שלנו אכן מראים שהוא מספיק כדי לשאת mCherry ו-EsxA (אם כי EsxA דרש תג קטן במסוף C שלו כדי להיות יציב יותר) ולצבור אותם ב-mEVs. לאחרונה, בשנת 2021, טאנג ועמיתיו הדגימו כי Cfp-29 הוא אנקפסולין עם היכולת לשאת פרוקסידאז decolorizing (DyP) מסוג peroxidases40. אולי, Cfp-29 יכול לשאת גם חלבונים זרים אחרים.

חקרנו את EsxA מכיוון שהוא אימונוגן Mtb בולט 37,38,39, יכול להיות מגן כחיסון תת-יחידה במודל בעלי חיים37,38,39, הוא קטן בגודלו; והאורתולוג שלה (MSMEG_0066) נעדר באופן מעניין ב- Msm EVs. למרות שאיננו דנים בכך כאן, יצרנו בהצלחה R-mEV עבור כמה חלבוני Mtb אחרים (קיימים באופן ייחודי ב- Mtb ולא מקודדים על ידי Msm), כולל אנטיגן 85B (Rv 1886c). באותו הזמן, באופן מעניין, נכשלנו גם בייצור R-mEV עבור כמה אחרים, כולל Rv2660c באורך מלא ו-Rv0288, אולי בגלל שהחלבונים רעילים ל-Msm. אנו מסיקים זאת מכיוון שלמרות שיבוט רצפי הנוקלאוטידים הנכונים וביצוע טרנספורמציות חוזרות ונשנות, לא הופיעו טרנספורמנטים של Msm. מכיוון ש-EsxA דרש תג 3XFLAG בקצה C-terminus שלו כדי לצבור טוב יותר ב-mEVs, הוספנו תג 3XFLAG לכל החלבונים האחרים המקודדים ב-Mtb שהערכנו. למרות התגית, Msm לא שרדה, מה שמצביע על כך שחלק מחלבוני Mtb נותרו רעילים למרות מיזוג התגים. אנו משערים כי במקרים אלה, שיבוט רק של אזורי האפיטופים החזויים או תפירת מספר אפיטופים יחד עשויים להשתלם (כרגע בהערכה במעבדה שלנו). השתמשנו במקשר קטן של חמש חומצות אמינו (ארבעה גליצין וסרין אחד) בין Cfp-29 ו-mCherry/EsxA כדי למזער את ההשפעה השלילית על קיפול החלבון המעניין44,45. אנו צופים כי ללא מקשר זה, חלבון קיפול הריבית יושפע מאוד מקיפול Cfp-29.

פרוטוקול העשרה זה ניתן להרחבה בקלות להעשרה של כלי רכב חשמליים המופקים על ידי Mtb. אנו גם משערים כי העשרת mEV ממיקובקטריה סביבתית צריכה להיות אפשרית גם באמצעות פרוטוקול זה. למרות שהפרוטוקול פשוט ופשוט, עדיין נדרשים 7-8 ימים כדי להעשיר רכבים חשמליים ו-R-mEV שנוצרו על ידי MSM. לעומת זאת, זה דורש 15-20 יום להעשרה של כלי רכב חשמליים מתוצרת Mtb. ריכוז כלי רכב חשמליים לנפח קטן יותר גוזל זמן ויקר, ואנו בוחנים כעת סינון זרימה משיק וגישות אחרות לפתרון בעיית ה"זמן".

לבסוף, אנו משתמשים ב- Sauton ולא ב- 7H9 כדי להעשיר mEV מכיוון שתוסף 'ADC' מכיל כמויות גבוהות של אלבומין בסרום בקר שעלול להפריע לכל שימוש במורד הזרם של mEVs. פרוטוקול זה עשוי להיות ניתן להרחבה בקלות לכל מדיה ספציפית אחרת (למשל, מדיה דלת ברזל) שיש להשתמש בה כדי להעריך את הרכב mEVs. לחלופין, עבור יישומים מסוימים, בשלב האחרון (כלומר שלב פרוטוקול 2.7.5), במקום חיץ HEPES, ניתן להשתמש במי מלח סטריליים בעת הזרקת אותו הדבר לעכברים או שרקנים עבור ניתוחים שונים מבוססי vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי עבודת מחקר זו נערכה בהיעדר קשרים/אינטרסים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

Acknowledgments

המחברים מודים מקרב לב לפרופ' שרה מ. פורצ'ן על שיתוף המניות של M. smegmatis mc2155. הם גם מכירים ב-Servier Medical Art (smart.servier.com) על כך שהוא מספק כמה אלמנטים בסיסיים עבור איור 1. הם מודים בכנות על תמיכתם של שאר חברי המעבדה בהתאמות המטופלים שלהם במהלך השימוש הממושך בשייקרים של האינקובטור, הצנטריפוגות והאולטרה-צנטריפוגות להעשרת mEV. הם גם מודים למר סורג'יט יאדאב, עוזר המעבדה, על כך שתמיד דאג שכלי הזכוכית והחומרים המתכלים הדרושים יהיו תמיד זמינים ושימושיים. לבסוף, הם מודים לצוותי הניהול, הרכישה והכספים של THSTI על תמיכתם המתמדת ועזרתם בביצוע חלק של הפרויקט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium - Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 202 שלפוחיות חוץ-תאיות שלפוחיות רקומביננטיות Esat-6 מיקובקטריה ExsA mCherry Cfp-29 חיידקים

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter