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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

このプロトコルでは、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)の軸種培養からの天然マイコバクテリア細胞外小胞(mEV)の濃縮と、mCherry(赤色蛍光レポーター)含有組換えMsmEVsの設計と濃縮方法について詳しく説明します。最後に、結核菌のEsxAタンパク質を含むMsmEVを濃縮することで、新しいアプローチを検証します。

Abstract

マイコバクテリアを含むほとんどの細菌は、細胞外小胞(EV)を生成します。細菌EV(bEV)には、代謝物、脂質、タンパク質、核酸などの細胞成分のサブセットが含まれているため、いくつかのグループが、サブユニットワクチン候補としての防御力について、bEVのネイティブバージョンまたは組換えバージョンのいずれかを評価しています。ネイティブEVとは異なり、組換えEVは、目的の免疫原を1つ以上含むように分子操作されています。過去10年間、さまざまなグループが組換え型bEVを生成するための多様なアプローチを模索してきました。しかし、ここでは、マイコバクテリアにおける組換えマイコバクテリアEV(mEV)の設計、構築、および濃縮について報告します。そのために、菌性土壌マイコバクテリウムである マイコバクテリウム・スメグマティス (Msm)をモデルシステムとして用いています。まず、MsmのネイティブEVの生成とエンリッチメントについて説明します。次に、赤色蛍光レポータータンパク質であるmCherry、または 結核菌の代表的な免疫原であるEsxA(Esat-6)のいずれかを含む組換えmEVの設計と構築について説明します。これは、mCherryとEsxAのN末端を、小さなMsmタンパク質Cfp-29のC末端と別々に融合させることで実現しています。 Cfp-29は、MsmEVに豊富に存在する数少ないタンパク質の1つです。Msm から組換え mEV を生成して濃縮するプロトコルは、Msm のネイティブ EV の生成と濃縮と同じままです。

Introduction

感染症に対する幅広いワクチンが開発・投与されているにもかかわらず、今日でも全死亡の~30%が伝染病によるものです1。結核(TB)ワクチンであるカルメット・ゲラン菌(BCG)が登場する前は、結核が死因の第1位でした(人口10万人あたり10,000~15,000人)2。BCGの投与と第一選択薬と第二選択薬の入手の容易さにより、2022年までに結核関連の死亡は劇的に減少し、2022年までに年間~100万人(すなわち、人口10万人あたり~15-20人)になりました1。しかし、世界の結核流行集団では、結核関連の死亡者数は人口10万人あたり100~550人にとどまっています1。専門家は、これらの数値の歪みにつながるいくつかの理由を認識していますが、BCGを介した保護が生後10年間も持続しないことが、3,4,5,6,7の顕著な理由のようです。その結果、国連の「持続可能な開発目標」とWHOの「結核撲滅戦略」が新たに採択されたことから、BCGに代わる、結核を生涯にわたって防ぐことができる、はるかに優れたワクチンを開発するための世界的な取り組みが世界的に協力して行われています。

その目的に向けて、いくつかのグループが現在、修飾/組換えBCG株、BCG以外の非病原性および弱毒化マイコバクテリア種、およびサブユニット候補8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18を評価しています.典型的には、サブユニットワクチンは、病原体の精製された(~1-6)完全長または切断された免疫原性タンパク質を数個選択的にロードしたリポソームである。しかし、非天然のコンフォメーションへの偽の折り畳みや、ロードされたタンパク質間のランダムな非機能的相互作用のために、サブユニットはしばしば天然およびゲルマンエピトープを欠いており、したがって、免疫系を十分に呼び起こすことができません14,19,20。

その結果、細菌の細胞外小胞(EV)は、有望な代替手段としてペースを上げています21,22,23,24,25,26。典型的には、細菌のEV(bEV)には、核酸、脂質の一部、数百の代謝物やタンパク質など、細胞成分のサブセットが含まれています27,28。少数の精製タンパク質が人工的にロードされるリポソームとは異なり、bEVには、特にアジュバントやToll様受容体(TLR)アゴニストのブースト/補助なしに、免疫系をプライミングする傾向が優れた、自然にロードされたネイティブフォールドタンパク質が何百個も含まれています27,28,29。この研究ラインにおいて、私たちや他の研究者は、BCG30のサブユニットブースターとしてのマイコバクテリアEVの有用性を探ってきました。bEVは均一な抗原負荷を欠いているという懸念にもかかわらず、弱毒化髄膜炎菌由来のEVは、血清型B髄膜炎菌からヒトを保護することに成功しています31,32。

少なくとも理論的には、BCGをうまく高めることができる最高のEVは、病原菌を豊富に含むEVです。しかし、病原性マイコバクテリウムによって生成されたEVを濃縮するには、費用と時間がかかり、リスクが伴います。さらに、病原体が生成するEVは、防御よりも毒性が強い可能性があります。潜在的なリスクを考慮して、ここでは、アキセンで増殖したマイコバクテリウムであるMsmによって生成されたEVを濃縮するための十分にテストされたプロトコルを報告します。

しかし、いくつかの病原体タンパク質オルソログをコードしているにもかかわらず、ウイルス性マイコバクテリアは、免疫系を防御に向けて十分にプライミングするために必要ないくつかのワクチン抗原/病原性タンパク質エピトープを欠いています33。そこで、分子工学を通じて、Msmで発現・翻訳された病原性タンパク質のかなりの部分がEVに到達するように、Msmの組換えEVを構築し、濃縮することも検討しました。我々は、Msm EVの上位10個の豊富なタンパク質のうちの1つ以上が、目的のタンパク質に融合すると、そのような転座を助けるという仮説を立てました。

2011年、Prados-Rosalesらは、マイコバクテリアEV(mEV)の濃縮を研究室で標準化し始めていましたが、in vitro30で初めてmEVの可視化と濃縮を報告しました。その後、2014年に同じグループが2011年のメソッド34の修正版を発表しました。2015年、Leeらは、マイコバクテリアの軸培養物からmEVを濃縮するための独立して標準化された方法も報告しました35。両方のプロトコル34,35を組み合わせ、徹底的な標準化の後にいくつかの変更を組み込んで、マイコバクテリア36の軸培養物からのmEVを日常的に濃縮するのに役立つプロトコルをここで説明します。

ここでは、マイコバクテリアEV全般の濃縮のために公開されているプロトコル36の拡張である、Msm特異的EVの濃縮について特に詳しく説明します。また、mCherryタンパク質(赤色蛍光レポーターとして)と、結核菌の主要な免疫原であり、サブユニットワクチンの候補であるEsxA(Esat-6)37,38,39を含む組換えmEV(R-mEV)の構築方法についても詳しく説明します。R-mEVを濃縮するためのプロトコルは、MsmのネイティブEVを濃縮するために説明したものと同じです。

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Protocol

1. マイコバクテリウム・スメグマティス、 大腸菌およびその誘導体の生育条件

  1. メディア
    1. ミドルブルック7H9液体スープ
      1. ガラスビーカー内の必要量の二重蒸留水(ddw)を電子レンジで~45-50 °Cに予熱して20%Tween-80ストック溶液を調製し、適切なメスシリンダーを使用して必要量のTween-80を加え、小型のマグネチックスターラーで連続的に攪拌して20%Tween-80を均一な溶液にします。20% Tween-80 を 0.22 um 廃棄フィルターでろ過し、淡黄色の原液を 4 °C で保存します。
        注:正確な最終濃度を得るには、メスシリンダー内のTween-80のすべての痕跡をビーカーに移す必要があります。準備したTween-80ストックをオートクレーブにかけないでください。フィルター(0.22μMを使用)を滅菌し、4 °Cで保存します。
      2. 7H9ブロスの調製については、製造元の指示に従ってください。4.7gの7H9粉末を900mLの重水素減少水に懸濁する。2 mLのグリセロールを加え、内容物を混合し、121 °C、15psiで20分間オートクレーブします。
        注:オートクレーブする前に、Middlebrook ADC enrichment(ADC)とTween-80を添加しないでください。
      3. オートクレーブ処理した培地を室温(室温、すなわち~25 °C)まで冷却した後、標準的なA2タイプのバイオセーフティキャビネットに、100 mLのADC(最終1x)のストックを10倍、20%Tween-80のストックを2.5 mL(最終0.05%)無菌的に添加します。混合物を0.22 μmの使い捨てフィルターユニットでろ過し、非常に薄い黄緑色の透明なストック溶液を4 °Cで保存します。
        注:培地のpHは~6.6〜6.8でなければなりません(<6.4または>7.0の場合は、廃棄して新鮮にしてください)。4 °Cで保管してください(3〜4週間安定)。7H9培地(ADCとTween-80を添加後)を2つの独立した0.22 μmディスポーザブルフィルターユニットで2回ろ過することを強くお勧めします。
    2. Sauton(ミニマルメディア)リキッドブロス
      1. L-アスパラギン(0.4%w/v)とクエン酸(0.2%w/v)を950mLの重水素減少水に溶解する。調製したばかりの1,000倍ストック(重水素減少重量)の二塩基性リン酸カリウム(無色、原液10 g/20 mL、最終1x 0.5 g/L)をそれぞれ1 mL加えます。硫酸マグネシウム七水和物(無色、在庫10 g/20 mL、最終1x 0.5 g/L);クエン酸第二鉄アンモニウム(非常に薄茶色、ストック1.6 g / 40 mL、最終1x 0.04 g / L)をマグネチックスターラーでよく攪拌します。
        注:せいぜい、1,000倍の在庫は2週間前である可能性があります。それより古い場合は、新鮮な在庫を準備します。暗闇の中(キャビネット/棚の中など)でRTに保管してください。クエン酸第二鉄アンモニウムが暗褐色の場合は、廃棄して新鮮にしてください。ステップ1.1.2.1で説明した順序で3つの塩を追加するのが最善です。各塩溶液を加える前に、毎回溶液を渦巻かせます。
      2. pHメーターを使用してpHを測定して記録します。3.1〜3.2程度であることを確認してください。pHが3.7を超える場合は、ストックを捨てて新しく準備します。pH を 7.4 に調整するには、10 N の水酸化ナトリウムを必要な数滴だけ使用してください。マグネチックスターラーで溶液/培地を連続的に攪拌しながら、最終pHを監視します。
      3. 4.76 mLのグリセロール、0.25 mLの20%Tween-80(最終0.005%、ステップ2.2.1.3の注も参照)を加え、容量を1 Lにします。次に、2つの別々の0.22 μmディスポーザルフィルターで1 Lの培地を2回ろ過滅菌します。無色透明の培地を4 °Cで保存します(2週間安定)。
        注:pHが7.4に調整された後にのみ、グリセロールを追加します。そうしないと、メディアが白く曇ります。曇っている場合は廃棄し(加熱しないでください)、新鮮な状態で調理してください。すべてのmEVの準備には、新しく準備されたSautonを使用してください。
    3. ミドルブルック7H11寒天ベース
      1. 製造元の指示に従って準備してください。19 gの7H11粉末を900 mLの重水素減少水に懸濁します。5 mLのグリセロールを加え、マグネチックスターラー上で旋回させて均一な懸濁液(淡緑色;pH 6.6〜6.8、>7.2の場合は廃棄して新たに調製)を得て、121 °C、15psi、20分間オートクレーブします。
        注意: オートクレーブする前に、ADCと0.05% Tween-80を添加しないでください。
      2. 培地が~50 °Cまで冷却されたら、A2タイプのバイオセーフティキャビネットで無菌的に、100 mLのADC(室温に持たせる)と2.5 mLの20%(最終0.05%)Tween-80(室温に持たせる)を加えます。直ちにペトリ皿に無菌的に分注する。
        注:プレートは少なくとも4〜6週間、4 °Cで安定しています。プレートを包んで4 °Cで保管する前に、プレートが一晩室温にあることを確認してください。そうしないと、37 °Cでのインキュベーション中に水分がプレートに閉じ込められます。
    4. Miller Luria Bertani (LB) ブロスと寒天ベース
      1. 製造元の指示に従って準備してください。LBブロスを調製するには、25gの粉末を1,000mLの重水素減少水に懸濁し、マグネチックスターラーのガラスビーカーで5分間静かに攪拌します。均一に懸濁したら、必要な容量を培地ボトル(例:500 mL培地ボトルに300 mL)とオートクレーブに分注します。LB寒天培地を調製するには、40 gの粉末を1,000 mLの重量水素とオートクレーブに懸濁します(500 mLのガラス培地ボトルに300 mLの重量水素中の粉末12 g)。
  2. 生育条件
    注:細菌培養作業のすべてのステップは、バイオセーフティキャビネット(A2タイプ)で実行する必要があります。すべての培養物は、滅菌チューブ、フラスコ、ピペットチップで処理する必要があります。
    1. 1日目
      1. Msmのグリセロールストック(-80°C冷凍庫から)をそれぞれ1 mLずつ、オートクレーブ滅菌し、冷却し、予熱した(~37°C)7H9ブロス2 x 10 mL(50 mL滅菌円錐遠心チューブ中)に加え、3回渦巻きさせ、蓋を閉じ、チューブを37°Cおよび200〜220rpm(インキュベーターシェーカー)で一晩インキュベートします。
        注: 結核菌 (Mtb)を増殖させるには、同様の手順に従いますが、BSL4設定で50 mLチューブを37 °Cおよび120〜150 rpm(インキュベーターシェーカー)で3〜3日間インキュベートします。BSL3およびリスクグループ3の病原体に関するすべての国際ガイドラインとバイオセーフティの慣行に従い、Mtbとその培養物を取り扱い、廃棄してください。Mtbとその培養物の取り扱いには、B2タイプのバイオセーフティキャビネットを使用してください。
    2. 2日目
      1. OD600 (A 600 nm;細胞密度計)が~1.0に達したら、Msm培養物を3,200 × g およびRT(卓上遠心分離機)で10分間遠心分離します。滅菌済み 1 mL ピペットチップを使用して上清を廃棄します。
        注:上記のステップは、日数が4〜7であることを除いて、Mtb培養でも同じです。ピペットチップでバクテリアペレットに触れないように注意してください。
      2. 洗浄:各Msmペレットに、予熱したSauton's(at RT)培地1 mLを加え(ステップ1.1.2)、1 mLのピペットチップで静かに再懸濁して、均一な懸濁液を得ます。滅菌ピペットチップを使用して、同じ培地で容量を10 mL(それぞれ)に構成します。懸濁液を 3,200 × g および RT で 10 分間遠心分離し、上清を廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。
        注:上記の手順は、Mtb培養でも同じです。
      3. 2回洗浄したMsm細胞を、予熱したSauton(プレートまたはシェーカーインキュベーターで予熱)20 mL(それぞれ)に再懸濁し、細胞の光学密度を600 nmで測定します。~330 mL の滅菌ソートンを含む滅菌 1 L 三角フラスコに、最終 OD600 が ~0.05 になるように、必要な量の Msm 培養物を接種します。
        注:再懸濁は常に少量で開始する必要があります。最終容量をシングルステップとしてペレットに直接添加すると、細胞は拡散ペレットとして残ります(再懸濁不良の指標)。この問題を解決する唯一の方法は、培養液をスピンダウンし、推奨されているように再懸濁をやり直すことです。上記のステップは、Mtb培養でも同じです。
    3. 2/3日目
      1. 培養液 OD 600 が ~0.3 に達するまで、インキュベーターシェーカーで200 rpm および 37 °C で 330 mL 培養液をインキュベートします。次に、細胞を一度洗浄し(ステップ1.2.2.2と同様ですが、同じ容量で)、同じ容量でペレットを再懸濁します。再懸濁した培養物50 mLを、それぞれ6つの滅菌済み1 L滅菌三角フラスコに分配し、それぞれに280 mLの滅菌予熱ソートンを通常使用される(0.05%)Tween-80の1/10、つまり0.005%(なぜ1/10分の1であるかを理解するには、ステップ2.2.1.3.の注も参照)。最終的なOD600は約0.05でなければなりません。
        注:Mtb培養の場合は、三角フラスコの代わりにローラーボトル(容量1/2/4 L)を使用してください。ローラー装置に保管したときに培養液がボトルの 口に届かない ように、ボトルあたりの培養量を調整してください。ローラーボトルの実際の容量は、ローラーボトルの容量によって異なります。
      2. 330 mLの培養物をそれぞれインキュベーターシェーカーで200rpmおよび37 °Cで、OD600 が2.0〜2.5(~15〜18時間)に達するまでインキュベートします。
        注:Mtb培養の場合、最終的なOD600 が~1.0-1.2(~5-8日かかる)であることを確認してください。

2. 密度勾配遠心分離法によるMsm mEVの濃縮

  1. 4日目
    1. ~2 L の中期指数関数的段階の Msm 培養を 6 x 400 mL の滅菌遠心分離ボトルに入れ、4 °C で ~8,000 × g で 20 分間遠心分離します (フロアモデル遠心分離機)。使用済みの培地/培養上清を、事前に冷却し、オートクレーブ処理した2つの1 L三角フラスコに回収し、分析手順(SDS-PAGEやウェスタンブロッティングなど)のためにペレットのアリコートを保管します(ここでは詳しく説明しません)。
      注:mEVの完全性をよりよく維持するために、以降のすべてのステップは低温(~4°C)で実行する必要があります。mEVはRTではかなり安定していますが、長期安定のためには冷蔵が必須です(冷凍解凍を繰り返すことはお勧めしません)。軸培養増殖中、mEVはMsm/Mtbの表面から解離し、培養上清/使用済み培地に蓄積します。
    2. まず、Msm培養上清を0.45 μmの廃棄フィルターユニットでろ過し、次に0.22 μmの廃棄フィルターユニットでろ過して、微量のバクテリアをすべて除去します。
      注:0.22 μmフィルターによる直接ろ過は、フィルターユニットを窒息させることがよくあります(ステップ2.1.1の実行中にバクテリアペレットが乱れる可能性があるため)。Mtb培養上清を生成するには、培養濾液をBSL-2設定に移す前に、Mtb培養物を3回ろ過(すなわち、0.45 μmの使い捨てフィルターユニットによる最初のろ過ステップ、0.22 μmの使い捨てフィルターユニットによる2つの連続したろ過ステップ)を実行します。
  2. 4/5日目
    1. 30 kDaのメンブレン濃縮装置を使用して、培養ろ液を4 °C、20分、3,200 × gで遠心分離することにより、Msm培養ろ液(~2 L)を~38 mLまで濃縮します。
      1. まず、濃縮器を滅菌した冷たい重水素減少水(~15 mL)で予洗します(4 °C、5分、3,200 × gで洗浄)。
      2. ~15 mLのろ過済み低温ソートン(水(2.2.1.1.)と同じ条件)で洗浄し、微量の化学物質(製造時に使用)をすべて除去します。
      3. ~2 L の培養濾液を濃縮するには、~130 セントリコーン (1 回のみの使用の場合) が技術的に必要であるため、必要に応じてセントリコンを少なくとも 3 回から 4 回再利用します。以下の手順に従ってください:15 mL〜0.5〜1.0 mLの濃縮液(ステップ2.2.1に従ってください)、濃縮液を清潔でオートクレーブ滅菌した冷たい38 mL超遠心チューブに移し、残りの未濃縮培養ろ液を使用済みのセントリコーンに再移して繰り返し濃縮します。
        注:24、30 kDaの濃縮器を使用して2 Lの培養濾液を濃縮するには、最大6時間かかります。培養濾液を濃縮すると、Tween-80も濃縮され、濃縮器を詰まらせる可能性があります。Sautonの培地でTween-80を(0.05%ではなく)0.005%ファイナルに使用すると、この閉塞を防ぐのに役立ちます。Tween-80の濃度低下は、増殖中のMsmの均一な懸濁液に影響を与えず、Msm細胞の凝集を引き起こさない。ただし、Mtb細胞は0.005%Tween-80で凝集するため、Mtb固有のEVには0.05%Tween-80を使用します。
    2. 濃縮されたMsm培養濾液(~38 mL)を、清潔で洗浄(重水素減少水を含む)および予冷した40-50 mLポリプロピレン遠心分離管に移し、最初に4,000 × g で、次に15,000 × gで、両方のステップで4 °Cで20分間遠心分離します(すべての破片を除去するため)。同じことに床型遠心分離機を使用してください。
  3. 5/6日目
    1. 培養上清を予冷した38.5 mLポリプロピレン製超遠心チューブに移し、100,000 × g の超遠心機で4 °Cで4時間回転させます。
      注意: スイングバケットは、この速度で最適に機能します。超遠心チューブを縁まで満たし、同等の重量の超遠心チューブをバランスしてください。遠心分離後(結露が原因で発生する)にいずれかのチューブがスイングバケットに詰まっている場合は、鉗子を使用してローターからそっと取り外します。超遠心分離前に超遠心機の外表面に存在する凝縮した水分を拭き取ると、固着を防ぎます。
    2. 上清を50 mLのプレチルドチューブに保存します(注を参照)。糸くずの出ない新しい吸収紙の上で超遠心チューブを裏返して、上清の痕跡を取り除きます。ペレットを600 μLのHEPES緩衝液(50 mM HEPESおよび150 mM NaCl、pH 7.4、使用前にフィルター滅菌)に再懸濁します。
      メモ: 上澄みはバックアップとしてのみ保存してください。天然のmEVペレットは、直径5〜7 mmのゼリー状で、鈍い灰色がかった黄色から半透明の斑点として現れます。ペレットが表示されない場合は、保存した上清を再利用して手順2.3.1を繰り返します。手順2.3.1を繰り返してもペレットが表示されない場合は、廃棄して手順1.2からやり直してください。ペレットは再懸濁に時間がかかります。HEPES緩衝液を添加し、再懸濁を容易にするために4 °Cで一晩放置することをお勧めします。均一な再懸濁になるまで、静かに、しかしピペッティングを繰り返して再懸濁します(より良い再懸濁のためにP200チップを使用)。
  4. 6日目
    1. 再懸濁したペレットを「イオジキサノール」ベースの密度勾配遠心分離にかけます。
      1. 再懸濁したペレットを13 mLの洗浄、洗浄(重水)、および事前に冷却した超透明ポリプロピレン超遠心チューブの底に重ね、~4 mLの不活性密度勾配「イオジキサノール」溶液(~60%w/v溶液として市販)と穏やかに混合します(1 mLピペットを使用)。再懸濁したペレットをチューブの底部に重ねた後(最大5 mL)、40%、30%、20%、10%のサブストックをそれぞれ1 mL(w/v)の順に重ね合わせます(60%のストックからサブストック(HEPESバッファーを使用)を調製します)。次に、上部に4 mLの6%サブストック(HEPESバッファーで60%ストックから調製)を加えてチューブを満たします。
        注意: グラジエントは使用直前に準備してください。保管して使用しないでください。
      2. 慎重に(振らずに)ガラスビーカーでチューブの重さを量り、スイングバケットローターにそっと移します。
        注意: ダミーチューブ(これも計量)でバランスをとるには、計量が必要です。
      3. 141,000 × g で4 °Cで16時間超遠心分離します。
  5. 7日目
    1. チューブを慎重に取り外し(ステップ2.3.1の注を参照)、1 mLのフラクションをオートクレーブ滅菌したばかりの微量遠心チューブに回収します。4番目 から6番目の フラクションには、通常、Msm mEVが含まれています。
      注:これらのフラクションからのmEVは、通常、鈍い白色の3つまたは4つのmEVバンド(1つはメジャーバンド)に分画されます。mCherryを含むR-mEVは、5〜 7番目の フラクションで分画し、濃い紫色からマゼンタ色に見えます。Mtb EVは通常、5〜 7番目の フラクションでフラクショニングされます。グラジエント中の mEV の分離は、使用するグラジエント濃度とグラジエントの層状化の程度によって異なります。mEVが部分的に破裂した場合、初期の分割で分割される可能性があります。あるいは、ステップ2.3.2の後に得られたペレットが十分に再懸濁されない場合、小胞は高密度のマイクロペレットを形成し、後のフラクションとしてフラクションアウトします。フラクションの正確な回収は、1 mL フラクションのどれに mEV が含まれているかを評価したい場合にのみお勧めします。ユーザーは、都合に応じて、より小さな分数または大きな分数に分注することを好む場合があります。BCGのサブユニットワクチンブースターとして試験するなど、特定の用途に使用する場合、mEVの収集を250μL未満(mEVが分画する部分)に制限し、2.7.5に示すようにmEVバンドとプロセスのみを特別に収集できるようにします。これにより、下流の実験の邪魔になる可能性のあるヨウジキサノールの痕跡をより効果的に除去することができます。
  6. 8日目
    1. mEVs含有画分をプールし、HEPESバッファーで38 mLに希釈し、100,000 × gで4°C、16時間超遠心分離を繰り返します。ペレットをHEPESバッファー、またはタンパク質推定、ナノトラッキング分析、ネガティブ染色、透過型電子顕微鏡、ウェスタンブロッティング、免疫金標識などの下流の実験(ここでは詳しく説明しません)のいずれかに再懸濁します(ステップ2.3.2と同じ注意が必要です)。
      注:より良い再懸濁のために、超音波水浴超音波処理装置を使用してmEV含有チューブを10分間超音波処理します。長時間超音波処理を行うと、破裂や無傷のmEVの喪失が発生する可能性があります。よく吊り下げられていれば、超音波処理は不要である。2.1 から 2.6 までのすべてのステップは同じで、MTB で生成された EV を充実させます。

3. 組換え型mEVの構築と濃縮

注:Msm EVの最も存在量の多い10種類のタンパク質(質量分析法で同定)の1つがCfp-2930です。その小さなサイズ(29 kDa)、単純な二次構造40、膜41への局在、および軸性培養の使用済み培地に分泌される傾向(例えば、培養濾液タンパク質として;MsmとMtbの両方によって分泌される42,43)を考えると、ここでは、赤色蛍光レポーターと目的タンパク質(EsxAMtb)をmEVに送達するために利用されている。これを実現するには、

  1. Msmからcfp-29を増幅するために、適切なフォワードプライマーとリバースプライマー(表1;pMV261などのシャトルベクターに直接クローニング可能)を使用します。 ~50 ngの高分子量(~>20 kb)のMsmゲノムDNAを鋳型として使用し、高忠実度のプルーフリーディングDNAポリメラーゼ(PhusionやQ5など)でcfp-29遺伝子断片をPCR増幅します。PCRに関するメーカーの推奨事項に従ってください。
    注:必要な制限部位をプライマーに設計して、目的の代替シャトルベクターに簡単にクローニングできるようにします。PCRの条件と量は、使用するプルーフリーディングDNAポリメラーゼの種類とブランドによって異なります。反応混合物の量は、DNAテンプレートの量と校正DNAポリメラーゼの量によって異なります。PCR条件、増幅の成功、およびプライマーの非特異的アニーリングの排除については、メーカーの推奨事項に従ってください。
  2. PCRは、市販のPCR精製キットで溶出したアンプリコンを精製し、標準的なアガロースゲル電気泳動でアンプリコンの長さを検証します。精製したアンプリコンを消化します。
    1. 分光光度計で精製されたアンプリコンの量を推定します。消化には、少なくとも2 μgの cfp-29 アンプリコンを使用してください。
    2. 最初にBstB1で65 °Cで1時間消化し(バッファーと酵素の種類と量-メーカーの推奨に従って)、反応温度を室温まで下げてから、HindIIIで37 °Cで1時間消化します(バッファーと酵素の種類と量-メーカーの推奨に従って)。
    3. PCRは、消化されたアンプリコンを精製し、50 μLのオートクレーブ処理したヌクレアーゼフリーの重水素減少水素中で溶出します。
    4. 分光光度計を使用して、消化されたアンプリコンの濃度と収量を推定します。ライゲーションがセットアップされるまで-20 °Cで保管してください。注:PCR後、1%アガロースゲル上で10 μLのPCR反応ミックスを電気泳動して、アンプリコン長(~798 + 50 bp)と収量を確認します。この酵素の組み合わせでは二重消化は不可能ですが、適合性のあるバッファーは、PCR精製の繰り返しとその後の消化されたアンプリコンの損失を防ぎます。消化されたアンプリコンの濃度は、PCR精製に使用するキットによって異なります。また、選択した代替ベクトルの長さ(bp)によっても異なります。
  3. フォワードプライマーとリバースプライマー(表1)、プルーフリーディングDNAポリメラーゼ、~50 ngのMtbゲノムDNAを用いて、PCRはesxA-またはesxA-3X FLAGタグ特異的アンプリコンを増幅します。~5 ng の適切なプラスミド DNA を使用して mCherry を PCR 増幅します。プラスミドおよび配列の詳細は、補足ファイル1にあります。
    注:cfp-4とmCherry / esxA / esxA-3X FLAGの間にグリシン、グリシン、グリシン、グリシン、セリン44,45(G3S)リンカーを使用します。mCherryが始まる前に、G4SリンカーはmCherryが偽の非機能的フォールド(Cfp-29によって駆動されるフォールドを含む)を受けないように助けます。補足ファイル1のcfp-29、hsp60プロモーター、mCherry、およびesxA配列を参照してください。mCherryのテンプレートとして機能するプラスミドは、さまざまなプラスミドリポジトリ/バンクで入手できます。mCherryには、順方向および逆方向のプライマー配列の変更を必要とする異なるバージョン(配列をわずかに変更したもの)があります。プライマー(表1)は、補足ファイル1に記載されているmCherryの増幅に役立ちます。mCherry/esxA/esxA::3XFLAGのN末端とCfp-29のC末端の融合はうまく機能します。
  4. mCherry/esxA/esxA::3XFLAGアンプリコンのDNA1 μgを消化し、消化したDNAを精製します。
    1. 各アンプリコンをHindIIIおよびHpaIで37 °Cで1時間(またはメーカーの推奨に従って)二重消化します。
    2. 市販のPCR精製キットと、消化されたアンプリコンを精製するためのメーカーの推奨事項を使用してください。消化したアンプリコンをオートクレーブ処理したヌクレアーゼフリーの重水素減少水50 μLに溶出します。
    3. 分光光度計を使用して、消化されたアンプリコンの濃度と収量を推定します。ライゲーションがセットアップされるまで-20 °Cで保管してください。
  5. 2 μgのpMV261-KanR (補足ファイル1)または適切なクローニングベクターを、選択した酵素で消化します。
    1. 最初にBstB1で65 °Cで1時間消化し(バッファーと酵素の種類と量-メーカーの推奨に従って)、反応温度を室温まで下げてから、HindIIIで37 °Cで1時間消化します(バッファーと酵素の種類と量-メーカーの推奨に従って)。
    2. ゲルを精製し、オートクレーブ処理したヌクレアーゼフリーの重水素添加水 50 μL で溶出します。
    3. 分光光度計を使用して、消化されたベクターの濃度と収量を推定します。ライゲーションがセットアップされるまで-20 °Cで保管してください。
      注:上記のpMV261用プライマーでは、ワンステップ2フラグメントクローニングが可能です。エピソームとして生き残る代替シャトルベクターは機能します。統合プラスミドも機能しますが、組換えタンパク質の収量は細胞ベースで比較的少なくなります。
  6. ライゲーションし、互換性のある 大腸菌株に形質転換します。
    1. ライゲーションには、125 ng のベクターを使用します。適切に消化した mCherry/esxA/esxA::3XFLAGアンプリコンを1:3のモル比で使用します。T4 DNAリガーゼ(メーカー推奨量)を用いて、冷蔵循環水槽中で16°Cで一晩ライゲーションを行います。
      注:消化効率を評価し、クローニングの成功効率を予測するために、T4 DNAリガーゼの有無にかかわらず、ベクターのみなどの適切なコントロールを使用してください。
    2. 変換
      1. NEB5α ケミカルコンピテントセルのアリコート(形質転換あたり ~100 μL)を氷上で 15 分間解凍します。滅菌ピペットチップで2回静かに混合します。ライゲーションミックス(最大20 μL)をコールドコンピテントセルに加えます。
      2. ピペット細胞+ライゲーションしたDNAを穏やかに混合します。氷上でさらに30分間インキュベートします。
      3. 42°C(循環水浴中)で60秒間ヒートショックを与え、すぐに氷に戻してさらに15分間加熱します。
      4. 1 mLのSOCブロス(2%トリプトン、0.5%酵母抽出物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、および20 mMグルコース)を添加して形質転換細胞を回収し、37°C、200 rpmで1時間インキュベートします。
      5. 回収した細菌を1.5 mLの微量遠心チューブ(3000 × g、室温、10分)でスピンダウンし、上清を廃棄し、ペレットを200 μLの滅菌済み予熱した新しく調製したLB培地に再懸濁し、必要な抗生物質を適切な濃度で含む新しく注いだLB Miller寒天プレートに懸濁液を広げます。
      6. ペトリ皿を37 °Cにプリセットされたプレートインキュベーターでインキュベートします。
  7. クローン候補をスクリーニングし(ここでは詳述しません)、(コロニーPCR/制限酵素ベースで)検証し46 、それらを配列決定(サンガーシーケンシング)して融合を確認します。
  8. 確認されたクローン(大腸菌 バックグラウンド)のプラスミドDNA(~200 ng/1-2 μL、市販のキット)を抽出し、それを新たに作られたMsmのエレクトロコンピテントセルに変換します。
  9. Msmエレクトロコンピテントセルの作製
    1. 新しく Msm を成長させます (手順 1.2.1 および 1.2.2 と同様)。ステップ1.3.3および1.3.4のように、新しく成長したMsmを洗浄します(ただし、Sautonの代わりに7H9 + ADC + Tween-80(リッチ)を使用します)。
    2. 150 mLのリッチ培地を含む滅菌500 mL三角フラスコに、洗浄したMsm細胞のアリコートを最終OD600 ~0.05に加えます。
    3. 培養OD 600が~0.8〜1.0(~12〜14時間)に達するまで、200rpmおよび37°Cでインキュベーターシェーカーでインキュベートします。
    4. 培養液を予冷した400 mL遠心分離機ボトルに移し、氷上で60〜90分間インキュベートします。次に、細胞を4 °Cで4,000 × gで15分間ペレット化します。
    5. 細胞を氷冷滅(オートクレーブ)10%グリセロールで2回洗浄します(各洗浄は150mL、4,000× g、4 °C、15分)。
      注意: 洗うたびに、ペレットが緩みます。上澄み液全体を廃棄するときは注意してください(毎回の洗浄後)。そうしないと、廃棄された上清で細胞の大部分が失われます。
    6. 0.005% Tween-80を含む75 mLの氷冷した滅菌10%グリセロールで細胞をもう一度洗浄します。
    7. 細胞ペレットを 7.5 mL の 10% グリセロールと 0.005% Tween-80 に再懸濁し、400 μL のアリコートに分注します。
      注:Msmエレクトロコンピテントセルは少なくとも4か月間はコンピテントですが、新しく調製されたエレクトロコンピテントセルが最良の結果をもたらします。古いコンピテントセルを使用すると、ピンク色以外のコロニー(白)が偽形質転換体として現れます。コンピテントセルが古いほど、白いコロニーが多くなります。
  10. Msm の変換
    1. Msmコンピテントセル分注を氷上で解凍します。
      注:室温で融解し、このような細胞を形質転換すると、効率が低下します。
    2. 1-2 μLのプラスミドDNA(合計~200 ng)をコールドコンピテントセルに加え、1 mLの滅菌ピペットチップで穏やかに混合し、事前に冷却した滅菌済みの2 mmエレクトロポレーションキュベットに移します。
    3. Msmコンピテントセル+プラスミドDNAミックスのクローズドキュベットをエレクトロポレーターのマウスに移し、蓋を静かに閉め、2.5 kV(電圧)、25 μF(静電容量)、1000 Ω(抵抗)のパルス(指数関数減衰タイプ)を印加します。
    4. ただちに予熱した滅菌リッチ(7H9 + ADC + Tween-80)培地1 mLをキュベットに加え、1 mLの滅菌ピペットチップで穏やかに混合し、内容物全体を10 mLの滅菌チューブに移します。
    5. 内容物を37 °C、200rpmに設定されたインキュベーターシェーカーで3時間インキュベートします。内容物を微量遠心チューブ(4,000 × g、室温、10分)でスピンダウンし、上清を廃棄し、ペレットを200 μLの滅菌予熱した濃厚培地に再懸濁し、ADC、Tween-80、および必要な抗生物質を適切な濃度で含む、新たに注いだ7H11寒天プレートに懸濁液を広げます。
      注:Msmの場合、必要に応じて、ハイグロマイシン、カナマイシン、およびアプラマイシンをそれぞれ最終濃度50 μg/mL、25 μg/mL、および50 μg/mLで使用します。Msm 自体 はこれらの抗生物質に耐性がありません。これらの抗生物質は、形質転換体/組換えMsmコロニーの選択/増殖に適切な耐性遺伝子を持つプラスミドを使用する場合にのみ使用してください。
    6. ペトリ皿を37 °Cにプリセットされたプレートインキュベーターでインキュベートします。 通常、形質転換体は3〜5日の間に現れます。
      注:目的のタンパク質がMsmに対して毒性がある場合、形質転換体は後で出現するか、出現しない可能性があります。このような場合は、全長の切り捨てられたバージョンを複製します。
    7. 陽性クローンを確認した後、創発したMsmコロニーのグリセロールストックを作製します(ステップ3.7と同じ)
  11. mCherryまたはEsxAタンパク質のいずれかを含むR-mEVを濃縮するには、まずステップ1.2.1〜1.2.3に従ってmCherryまたはexsAまたはesxA::3X FLAGのいずれかを発現するR-Msmを増殖させ、次にステップ2.1〜2.6に従います。R-mEVを充実させる。R-mEVは、密度勾配スピン後の4番目から7番目のフラクションに溶出します(ステップ2.5)。最初の超遠心分離ステップ(2.3.1)後のR-mEVsペレット。ステップ2.3.1と同じ実行を行った後、R-mEVが超遠心分離機の下部中央に直径5〜7mmの濃い紫色からマゼンタ色のペレットとして見えることを確認します。
  12. ウェスタン分析47 (ここでは詳細を省略) を実行して、濃縮された R-mEV 内の目的のタンパク質を検出します。

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Representative Results

我々は、 M. smegmatis (Msm) をモデルマイコバクテリウムとして使用し、天然および組換え mEV (R-mEV) の両方の濃縮を実証しました。この模式的にまとめたmEVエンリッチメントプロトコル(図1)は、MsmのR-mEVとMtbのネイティブEVのエンリッチメントにも有効です(プロトコルノート1.2のように若干の変更が加えられています)。濃縮されたmEVを可視化するには、透過型電子顕微鏡36 でネガティブ染色する必要があります(図2A)。典型的には、Msm特異的EVは、13 mLの6〜60%密度勾配の4〜6分の 1 mLのフラクションで分離します(図2B)。約80〜100μgのEV相当のタンパク質が、Msmの2Lの中央対数軸培養物から日常的に得られます。それらの直径は通常、20 nmから250 nmの範囲です(図2C)。

私たちの研究室の長期的な目標の1つは、異なる抗酸菌のmEVが既存のワクチンであるBCGのサブユニットブースターとして作用する可能性があるかどうかを評価することです。病原菌が産生するmEVの濃縮には時間とリスクと費用がかかるため、病原性マイコバクテリア由来の天然EVや組換えEVを利用することが、適切な代替手段として機能する可能性があります。そこで、プロトコルを標準化してMsmのmEVを充実させるだけでなく、R-mEVの構築と充実を目指します。

R-mEVを構築するために、まずMsm EVの上位10種類のタンパク質を選定した(表1;Msm EVの詳細な質量分析から同定した)30。我々は、目的の外来タンパク質がそれらのいずれかに翻訳融合されれば、mEVに局在できるはずであるという仮説を立てました。次に、Cfp-29は、その中で最も小さく(~29 kDa)、膜局在性があり、比較的単純な二次構造を持つ培養濾液タンパク質であるため、10種類の中から最終候補に挙げました40,41,42,43。我々は、mCherry(蛍光タンパク質)のN末端とCfp-29のC末端を翻訳融合させ、mEVへの負荷/送達を評価した。Msmの濃縮mEVの一部がピンク色に変色しており(図3)、Cfp-29が目的の外来タンパク質をMsm EVに運ぶ能力を示しています。

Cfp-29のこの能力(図3)を考慮し、Msm EVに導入される主要な免疫原性タンパク質37,38,39であるEsxA(Esat-6)を評価しました。ここでも、Cfp-29のみのEsxAとEsxA + 3X FLAGタグ(EsxAのC末端に融合した3X FLAG)のC末端への2つの独立した翻訳融合を生成しました。予想通り、少量ではあるが、Msm EVのMtbのEsxA(レーン5、6、10、図4A、B)が観測された。興味深いことに、Cfp-29::EsxA::3XFLAGははるかに安定していました(レーン3と4、および8と9;図4A)そして、mEVでより高いレベルで蓄積されます(レーン3と4、および8と9;図4B)。要約すると、目的とする外来タンパク質を含むR-mEVの設計、構築、および濃縮を実証します(図3および図4)。

Figure 1
図1:マイコバクテリアの細胞外小胞濃縮の模式図。 「日数」(図の上部の赤いフォント)は、Msm からの mEV を充実させるために必要な日数を指します (特にプロトコル ステップ 1 と 2)。「ステップ」(黒字、図の下部)は、プロトコルの項で説明されているプロトコルのステップを指します。MtbからmEVを濃縮する場合、すべてのステップは似ていますが、培養のステップ(ステップ1)から遠心分離の最初のステップ(ステップ2)まで、さまざまなステップに少なくとも10日かかります。後続のステップでは、同じ期間が必要です (赤いフォントで示されています)。密度勾配の前は、天然のmEVとR-mEVの両方を濃縮すると、mEVペレット+細胞外複合体は無色に見えます。ただし、mCherryを含むmEVを濃縮すると、ピンクがかった青色に見えます( 図3を参照)。密度勾配の後、mEVは密度勾配チューブ内で白(ネイティブおよびR-mEV)またはピンク(mCherryを含む場合)で表示されます。図中のmEVの色は明瞭さを示すためのものであり、正確な色を表すものではありません。詳細については、 図 3 を参照してください。略語: Msm = M. smegmatis;Mtb = 結核菌;0.45 および 0.22 μm = 廃棄フィルターユニットの孔径。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:マイコバクテリアEVは円形で、密度勾配で濃縮され、寸法が異なります 。 (A)Msm EVをネガティブ染色で可視化し、透過型電子顕微鏡で観察したときの代表画像。スケールバー = 200 nm。(B)6〜60%の密度勾配を行ったときに超遠心管内でmEVがどのように現れるかを示す代表的な画像。6〜60%のグラジエントが正確に層状化されていない場合、mEVのメジャーバンド(上開き矢印)とマイナーバンド(下開き矢印)の位置が大きく変化し、1 mLのフラクション数が変化する可能性があります。(C)Msmの濃縮mEVのナノトラッキング解析による代表的な画像 ナノトラッキング解析により、異なるサイズのmEVの割合と濃度、および調製物中のmEVの総数が明らかになります。平均して、ここに詳述されているプロトコルでは、1~3 ×10 10 EVが2LのMsmとMtbから濃縮されています。 この 図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:mCherryを発現するmEVの濃縮を示すさまざまなステップ 。 (A)Cfp-29::mCherryを発現するMsm軸培養を示す代表画像。(B)Cfp-29::mCherryを発現するMsmアキセン培養物の遠心分離後の細菌ペレットの代表画像。(C)Cfp-29::mCherryをセントリコン濃縮装置で発現するMsmアキセニック培養の使用済み培地を濃縮した後に得られた培養濾液濃縮物の代表画像。(D)Cfp-29::mCherryを発現するMsmアキセン培養液から得られた培養濾液濃縮液の超遠心分離後のmEVs+細胞外複合体ペレットの代表画像。ただし、mEVがmCherry以外の外来タンパク質に対して未変性または組換え体(Cfp-29への融合時)である場合、ペレットは無色のままです。(E)mEVを含むmCherryの代表画像。すべてのmEVがピンク色であるわけではなく、すべてのmEVにCfp-29が含まれているわけではないことを示しています。 Good: Cfp-29::mCherry EVを濃縮した後に通常得られるmEVのさまざまなバンドを示す代表的な画像。mCherryを含むEVは密度が高いため、後の画分に分離します。不良:分離不良を示す代表的な画像(白色のmEVは1番目/2番目のフラクションで分離し、mCherryを含むmEVは10番目の フラクションで分離します(おそらくmEVペレットの再懸濁が不十分なため、つまりプロトコルステップ2.3.2)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:Msm総細胞溶解物およびMsmで生成されたEV中のMtbコード免疫原であるEsxA(ESAT-6)を含む組換えmEV。 (A)クマシーゲルおよび(B)ウェスタン分析(ESAT6特異的ポリクローナル抗体で検出)画像は、Msm総細胞ライセートおよびcfp-29::esxA::3XFLAG(+ 3XFLAG、レーン3および4(総ライセート)およびレーン8および9(mEVs))またはcfp-29のいずれかを発現するmEVの両方に融合ExsAの蓄積を示す。esxA(-3XFLAG、レーン5および6(全ライセート)およびレーン10(mEV))。開いた矢印と塗りつぶされた矢印は、それぞれ累積された Cfp-29::ExsA::3XFLAG と Cfp-29::ExsA を示します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

プライマー：
SLの# 遺伝子 入門 シーケンス (5' から 3') 源 クローン先
1 CFP-29 フォワード CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC MsmゲノムDNA pMV261型
逆 GAAAAGCTT(ヒンディーIII.)GGGGGTCAGCGCGACAG MsmゲノムDNA pMV261型
2 mチェリー フォワード GAAAAGCTT(ヒンドIII) ggcggcggtggctcg (G4Sリンカー)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG ラボ コレクション pMV261型
逆 TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC ラボ コレクション pMV261型
3 esxAの フォワード GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4Sリンカー) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG MtbゲノムDNA pMV261型
逆 TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 MtbゲノムDNA pMV261型
4 exsA-3Xフラグ フォワード GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4Sリンカー) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG MtbゲノムDNA pMV261型
逆 TGTGTTAAC(HpaI)TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc(3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 MtbゲノムDNA pMV261型

表1:プライマー配列。 cfp-29、mCherry、esxA、およびesxA::3X FLAGを増幅し、シャトルベクターpMV261にクローニングするためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーがリストされています。

補足ファイル1:A:pMV261、その円形マップ、主な特徴、および完全な塩基配列。黄色のハイライト-hsp60プロモーターヌクレオチド配列;mCherry、esxA、およびesxA::3X FLAGアンプリコンがクローニングされた緑色およびシアンのハイライト制限部位。B、C、 D:それぞれcfp-29、mCherry、esxAの塩基配列。cfp-29、mCherry、およびesxAの緑色のハイライト終止コドン。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

BCGよりも優れており、BCGに取って代わることができる新しい結核ワクチンの開発は依然として手ごわい課題であるため、代替案として、いくつかのグループは、BCGの効力を高め、その保護期間を延長できるさまざまなサブユニット結核ワクチンの発見を追求しています48,49。潜在的なサブユニットとして、また天然アジュバントとしての細菌EV(bEV)への注目が高まっていることを考えると50,51、下流の試験/分析に十分な量のmEVを一貫して濃縮することが重要なステップになっています。これらの研究課題を考慮して、このプロトコルは、アキセニック培養物とその組換えバージョンからのmEVを濃縮することを目的としています。

Msm EVの詳細な質量分析プロテオーム解析中に、Prados-Rosalesらは、最も存在量の多い10のタンパク質を同定した30。さらに、十分な分子工学を行えば、そのうちの1つが目的の外来タンパク質をmEVに運ぶのに十分であるという仮説を立てました。興味深いことに、Cfp-29は、そのさまざまな機能39,40,41,42のために、可能な限り最良の選択肢として際立っていました。私たちのデータは、mCherryとEsxAを運び(EsxAはより安定するためにC末端に小さなタグを必要としましたが)、mEVに蓄積するのに十分であることを示しています。最近、2021年に、Tangらは、Cfp-29が色素脱色ペルオキシダーゼ(DyP)型ペルオキシダーゼを運ぶ能力を持つカプセル化剤であることを実証しました40。おそらく、Cfp-29は他の外来タンパク質も運ぶことができます。

EsxAは、著名なMtb免疫原37,38,39であり、動物モデル37,38,39のサブユニットワクチンとして保護することができ、サイズが小さいため、EsxAを調査しました。そして、そのオルソログ(MSMEG_0066)は、興味深いことにMsm EVには存在しません。ここでは説明しませんが、抗原85B(Rv 1886c)を含む他のいくつかのMtbタンパク質(Mtbに一意に存在し、Msmによってコードされていない)のR-mEVの生成に成功しました。同時に、興味深いことに、完全長のRv2660cやRv0288など、他のいくつかのタンパク質についてもR-mEVを生成できませんでしたが、これはおそらくタンパク質がMsmに毒性があるためです。正しいヌクレオチド配列をクローニングし、形質転換を繰り返したにもかかわらず、Msmのトランスホルマントが出現しなかったため、そのように結論付けました。EsxAは、mEVの蓄積を改善するためにC末端に3XFLAGタグを必要としたため、評価した他のすべてのMtbコードタンパク質に3XFLAGタグを追加しました。タグにもかかわらず、Msmは生き残らず、タグが融合したにもかかわらず、一部のMtbタンパク質が毒性のままであることを示しています。このようなケースでは、予測されたエピトープ領域だけをクローニングするか、複数のエピトープをつなぎ合わせることで効果が得られる可能性があると推測しています(現在、私たちの研究室で評価中)。Cfp-29とmCherry/EsxAの間に小さな5アミノ酸(4つのグリシンと1つのセリン)リンカーを使用して、目的のタンパク質のフォールディングへの悪影響を最小限に抑えました44,45。このリンカーがなければ、目的タンパク質のフォールディングはCfp-29のフォールディングに強く影響されると予測しています。

このエンリッチメントプロトコルは、MTBで生成されたEVのエンリッチメントに簡単に拡張できます。また、環境マイコバクテリアからのmEVの濃縮も、このプロトコルで実現可能であると推測しています。プロトコルは単純明快ですが、Msmで生成されたEVとR-mEVを充実させるには7〜8日かかります。対照的に、Mtbで生成されたEVの濃縮には15〜20日かかります。EVを小容量に集中させるには時間とコストがかかるため、現在、「時間」の問題を解決するために、タンジェンシャルフローフィルターやその他のアプローチを模索しています。

最後に、「ADC」サプリメントにはウシ血清アルブミンが大量に含まれており、mEVの下流での使用を妨げる可能性があるため、mEVの濃縮には7H9ではなくSautonを使用しています。このプロトコルは、mEVの組成を評価するために使用しなければならない他の特定の媒体(低鉄媒体など)に簡単に拡張できます。あるいは、特定のアプリケーションでは、最後のステップ(プロトコルステップ2.7.5)で、HEPES緩衝液の代わりに、マウスまたはモルモットに注射する際に滅菌生理食塩水を使用して、さまざまな in vivoベースの分析を行うことができます。

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Disclosures

すべての著者は、この研究作業が、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係/利益がない状態で実施されたことを宣言します。

Acknowledgments

著者らは、 M. smegmatis mc2155 株を親切に共有してくださった Sarah M. Fortune 教授に心から感謝します。また、Servier Medical Art (smart.servier.com) が 図 1 にいくつかの基本要素を提供してくれたことも評価されています。彼らは、mEV濃縮のためのインキュベーターシェーカー、遠心分離機、超遠心分離機の長期使用中に忍耐強く調整してくれた他のラボメンバーのサポートに心から感謝しています。また、研究室助手のSurjeet Yadav氏には、必要なガラス器具や消耗品が常に手元にあることを常に確認していたことに感謝しています。最後に、THSTIの管理、購買、財務の各チームには、プロジェクトのシームレスな実行を継続的にサポートし、支援していただいたことに感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

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Tags

免疫学と感染症、第202号、細胞外小胞、組換え小胞、Esat-6、マイコバクテリア、ExsA、mCherry、Cfp-29、細菌

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮
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Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

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