Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anrikning av innfødte og rekombinante ekstracellulære vesikler av mykobakterier

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen beskriver anrikningen av native mykobakterielle ekstracellulære vesikler (mEVs) fra akseniske kulturer av Mycobacterium smegmatis (Msm) og hvordan mCherry (en rød fluorescerende reporter) som inneholder rekombinante MsmEVs kan utformes og berikes. Til slutt verifiserer den den nye tilnærmingen med anrikning av MsmEVs som inneholder EsxA-proteinet av Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

De fleste bakterier, inkludert mykobakterier, genererer ekstracellulære vesikler (EV). Siden bakterielle EVs (bEVs) inneholder en delmengde av cellulære komponenter, inkludert metabolitter, lipider, proteiner og nukleinsyrer, har flere grupper evaluert enten de opprinnelige eller rekombinante versjonene av bEVs for deres beskyttende styrke som subenhetsvaksinekandidater. I motsetning til innfødte EV-er, er rekombinante EV-er molekylært konstruert for å inneholde ett eller flere immunogener av interesse. I løpet av det siste tiåret har ulike grupper utforsket ulike tilnærminger for å generere rekombinante bEVs. Her rapporterer vi imidlertid design, konstruksjon og anrikning av rekombinante mykobakterielle EV (mEV) i mykobakterier. Mot det bruker vi Mycobacterium smegmatis (Msm), en avirulent jordmykobakterie som modellsystem. Vi beskriver først generering og berikelse av innfødte elbiler av Msm. Deretter beskriver vi design og konstruksjon av rekombinante mEVs som inneholder enten mCherry, et rødt fluorescerende reporterprotein, eller EsxA (Esat-6), et fremtredende immunogen av Mycobacterium tuberculosis. Dette oppnår vi ved å smelte sammen mCherry og EsxA N-terminalen separat med C-terminalen av et lite Msm-protein Cfp-29. Cfp-29 er et av de få rikelig tilstedeværende proteinene til MsmEVs. Protokollen for å generere og berike rekombinante mEV-er fra Msm forblir identisk med generering og anrikning av innfødte EV-er av Msm.

Introduction

Til tross for utvikling og administrasjon av et bredt spekter av vaksiner mot smittsomme sykdommer, til og med i dag, ~ 30% av alle menneskelige dødsfall forekommer fortsatt fra smittsomme sykdommer1. Før adventen av tuberkulose (TB) vaksine - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - TB var nummer én morder (~ 10.000 til 15.000 / 100.000 befolkning)2. Med administrering av BCG og enkel tilgang til første- og andrelinje anti-TB-legemidler, innen 2022, har TB-relaterte dødsfall dramatisk falt til ~ 1 million / år innen 2022 (dvs. ~ 15-20 / 100,000 befolkning1). Men i TB-endemiske populasjoner i verden fortsetter TB-relaterte dødsfall å stå på ~ 100-550 / 100,000 befolkning1. Mens eksperter anerkjenner flere årsaker som fører til disse skjeve tallene, synes BCG-mediert beskyttelse som ikke varer selv i det første tiåret av livet, å være den fremtredende årsaken 3,4,5,6,7. Følgelig, gitt de fornyede "bærekraftige utviklingsmålene" til FN og "End TB Strategy" fra WHO, er det en samordnet global innsats for å utvikle et mye bedre vaksinealternativ til BCG som kanskje gir livslang beskyttelse mot TB.

Mot dette målet evaluerer flere grupper for tiden modifiserte/rekombinante BCG-stammer, ikke-patogene og svekkede mykobakteriearter annet enn BCG, og subenhetskandidater 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Vanligvis er subenhetsvaksiner liposomer selektivt lastet med få rensede (~ 1-6) fulllengde eller avkortede immunogene proteiner av patogenet. Men på grunn av deres falske folding i ikke-innfødte konformasjoner og / eller tilfeldige ikke-funksjonelle interaksjoner mellom de lastede proteiner, mangler underenheter ofte innfødte og germane epitoper og dermed ikke klarer å tilstrekkelig prime immunsystemet14,19,20.

Følgelig har ekstracellulære vesikler (EV) av bakterier tatt opp tempo som et lovende alternativ 21,22,23,24,25,26. Vanligvis inneholder bakterielle EVs (bEVs) en delmengde av deres cellulære komponenter, inkludert noen deler av nukleinsyrer, lipider og hundrevis av metabolitter og proteiner27,28. I motsetning til liposomer hvor noen få rensede proteiner er kunstig lastet, inneholder bEVs hundrevis av naturlig ladede, naturlig foldede proteiner med en bedre tilbøyelighet til å prime immunsystemet, spesielt uten boost/hjelp av adjuvans og Toll-lignende reseptoragonister (TLR)27,28,29. Det er i denne forskningen at vi og andre har undersøkt nytten av mykobakterielle EV som potensielle subenhetsforsterkere til BCG30. Til tross for bekymringer om at bEV mangler ensartede antigenbelastninger, har EV fra dempede Neisseria meningitidis vellykket beskyttet mennesker mot serogruppe B meningokokker31,32.

I det minste teoretisk er de beste elbilene som kan øke BCG godt, elbilene som er beriket med sykdomsfremkallende bakterier. Imidlertid er berikende elbiler generert av patogen mykobakterie dyrt, tidkrevende og risikabelt. I tillegg kan patogengenererte elbiler være mer virulente enn beskyttende. Gitt de potensielle risikoene, rapporterer vi her en velprøvd protokoll for anrikning av elbiler generert av aksenisk dyrket Msm, en avirulent mykobakterie.

Til tross for koding av flere patogenproteinortologer, mangler imidlertid avirulent mykobakterier flere vaksineantigener/patogene proteinepitoper som er nødvendige for å klargjøre immunsystemet tilstrekkelig mot beskyttelse33. Derfor utforsket vi også å konstruere og berike rekombinante EVer av Msm gjennom molekylærteknikk, slik at en betydelig del av ethvert patogent protein av interesse uttrykt og oversatt i Msm, må nå sine EVer. Vi antydet at en eller flere av de 10 rikelige proteinene i Msm EV når de smeltes sammen med proteinet av interesse, vil hjelpe til med en slik translokasjon.

Mens vi begynte å standardisere anrikningen av mykobakterielle EV (mEVs) i laboratoriet vårt, rapporterte Prados-Rosales et al. først visualisering og anrikning av mEVs in vitro30 i 2011. Senere, i 2014, publiserte den samme gruppen en modifisert versjon av sin 2011-metode34. I 2015 rapporterte Lee et al. også en uavhengig standardisert metode for mEV-anrikning igjen fra akseniske kulturer av mykobakterier35. Ved å kombinere begge protokollene 34,35 og inkorporere noen av våre modifikasjoner etter grundig standardisering, beskriver vi her en protokoll som hjelper rutinemessig å berike mEVs fra akseniske kulturer av mykobakterier36.

Her beskriver vi spesielt anrikningen av MSM-spesifikke elbiler, som er en utvidelse av en publisert protokoll36 for anrikning av mykobakterielle elbiler generelt. Vi beskriver også hvordan man konstruerer rekombinante mEVs (R-mEVs) som inneholder mCherry-proteinet (som en rød fluorescerende reporter) og EsxA (Esat-6) 37,38,39, et dominerende immunogen og et potensielt subenhetsvaksinogen av Mycobacterium tuberculosis. Protokollen for å berike R-mEV-ene forblir identisk med den vi har beskrevet for å berike innfødte elbiler fra Msm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vekstbetingelser for Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli og deres derivater

  1. Media
    1. Middlebrook 7H9 flytende buljong
      1. Forbered 20% Tween-80 stamløsning ved å forvarme det nødvendige volumet av dobbeltdestillert vann (ddw) i et glassbeger til ~ 45-50 oC i en mikrobølgeovn, tilsett det nødvendige volumet av Tween-80 ved hjelp av en passende målesylinder, og rør kontinuerlig på en liten magnetisk omrører for å bringe 20% Tween-80 til jevn løsning. Filtrer 20% Tween-80 gjennom et 0,22 um avfallsfilter og oppbevar den svakt gule stamoppløsningen ved 4 oC.
        MERK: Alle spor av Tween-80 i målesylinderen må overføres til begeret for nøyaktig sluttkonsentrasjon. Ikke autoklav den tilberedte Tween-80-stammen. Filter (bruk 0,22 μM) steriliser og oppbevar ved 4 oC.
      2. Følg produsentens instruksjoner for fremstilling av 7H9-buljongen. Stopp 4,7 g 7H9 pulver i 900 ml ddw. Tilsett 2 ml glyserol, bland innholdet og autoklav ved 121 oC, 15 psi i 20 minutter.
        MERK: Ikke legg til Middlebrook ADC-berikelse (ADC) og Tween-80 før autoklavering.
      3. Etter at det autoklavede mediet er avkjølt til romtemperatur (RT, dvs. ~ 25 oC), i et standard A2-type biosikkerhetsskap, tilsettes aseptisk 10x lager av 100 ml ADC (endelig 1x) og 2,5 ml (endelig 0,05%) av 20% Tween-80. Filtrer blandingen gjennom en 0,22 μm engangsfilterenhet og oppbevar den meget lysegulgrønne, gjennomsiktige stamløsningen ved 4 oC.
        MERK: pH-verdien i mediet må være ~6,6 til 6,8 (hvis <6,4 eller >7,0, kast og lag ny). Oppbevares ved 4 oC (stabil i 3-4 uker). Det anbefales sterkt å filtrere 7H9-mediene (etter tilsetning av ADC og Tween-80) to ganger gjennom to uavhengige 0,22 μm engangsfilterenheter.
    2. Sautons (minimal media) flytende buljong
      1. Løs opp L-asparagin (0,4 % w/v) og sitronsyre (0,2 % w/v) i 950 ml ddw. Tilsett 1 ml hver av de tilberedte 1000x lagrene (i ddw) dibasisk kaliumfosfat (fargeløst; lager 10 g / 20 ml; endelig 1x 0,5 g / l); magnesiumsulfatheptahydrat (fargeløs; lager 10 g / 20 ml; endelig 1x 0,5 g / l); og jernammoniumsitrat (veldig lysebrunt; lager 1,6 g / 40 ml; endelig 1x 0,04 g / L) og rør godt på en magnetisk omrører.
        MERK: I beste fall kan 1,000x aksjene være 2 uker gamle; Hvis eldre enn det, tilbered ferske aksjer; lagre dem på RT i mørket (f.eks. inne i et skap / hylle). Hvis jernammoniumcitratet er mørkebrunt, kast det og gjør det friskt. Det er best å legge til de tre saltene i den rekkefølgen som er nevnt i trinn 1.1.2.1. Roter oppløsningen hver gang før du tilsetter hver saltløsning.
      2. Mål og noter pH ved hjelp av en pH-måler; Sørg for at den er rundt 3,1 til 3,2. Hvis pH er over 3,7, kast aksjene og tilbered friske. For å justere pH til 7,4, bruk så mange dråper 10 N natriumhydroksid som nødvendig. Overvåk den endelige pH-verdien mens du kontinuerlig rører oppløsningen/mediet på en magnetomrører.
      3. Tilsett 4,76 ml glyserol, 0,25 ml 20% Tween-80 (endelig 0,005%, se også note for trinn 2.2.1.3), og bare da, utgjør volumet til 1 L. Deretter filtrersteriliser du to ganger 1 liter medium med to separate 0,22 μm avfallsfiltre. Oppbevar det klare, fargeløse mediet ved 4 oC (stabilt i 2 uker).
        MERK: Først etter at pH er justert til 7,4, tilsett glyserol. Ellers blir mediene overskyet hvite. Hvis det er overskyet, kast det (ikke prøv å varme det opp) og klargjør det friskt. For alle mEVs preparater, bruk nylagde Sauton's.
    3. Middlebrook 7H11 agar base
      1. Følg produsentens instruksjoner for forberedelse. Suspender 19 g 7H11 pulver i 900 ml ddw. Tilsett 5 ml glyserol, virvle på en magnetomrører for å oppnå en jevn suspensjon (lysegrønn, pH 6,6 til 6,8, hvis >7,2, kast og tilbered fersk), og autoklav ved 121 oC, 15 psi og i 20 minutter.
        MERK: Ikke legg til ADC og 0,05 % Tween-80 før autoklavering.
      2. Når mediet avkjøles til ~ 50 oC, aseptisk i et A2-type biosikkerhetsskap, tilsett 100 ml ADC (brakt til RT) og 2,5 ml 20% (endelig 0,05%) Tween-80 (brakt til RT). Dispenser umiddelbart aseptisk i petriskåler.
        MERK: Platene er stabile ved 4 oC i minst 4-6 uker. Forsikre deg om at platene er på RT over natten før du pakker platene opp for 4 oC lagring. Ellers vil fuktighet bli fanget i platene under inkubasjonen ved 37 oC.
    4. Miller Luria Bertani (LB) buljong og Agar base
      1. Følg produsentens instruksjoner for forberedelse. For å tilberede LB-buljong, oppsett 25 g pulver i 1000 ml ddw og rør forsiktig i 5 minutter i et glassbeger på en magnetomrører. Ved jevn suspensjon, alikot de nødvendige volumene i medieflasker (f.eks. 300 ml i en 500 ml medieflaske) og autoklav. For å tilberede LB Agar, oppbevar 40 g pulver i 1000 ml ddw og autoklav (12 g pulver i 300 ml ddw i en 500 ml glassmedieflaske).
  2. Vekstforhold
    MERK: Alle trinn i bakteriekulturarbeid må utføres i et biosikkerhetsskap (A2 type). Alle kulturer må behandles med sterile rør, kolber og pipettespisser.
    1. Dag 1
      1. Tilsett 1 ml hver av glyserollager av Msm (fra -80 o C fryser) til 2 x 10 ml (i 50 ml sterile koniske sentrifugerte rør) av ferskt autoklavert, avkjølt og forvarmet (~ 37 o C) 7H9 buljong, virvle tre ganger, lukk lokkene og inkuber rørene over natten ved 37 oC og 200-220 rpm (inkubator shaker).
        MERK: For å vokse Mycobacterium tuberculosis (Mtb), følg lignende trinn, men inkuber 50 ml rørene i 4-6 dager ved 37 oC og 120-150 rpm (inkubator shaker) i BSL3-innstillinger. Følg ALLE internasjonale retningslinjer og biosikkerhetspraksis for BSL3- og risikogruppe 3-patogener mens du håndterer og kasserer Mtb og dets kulturer. Bruk B2 type biosafety skap for håndtering av Mtb og dets kulturer.
    2. Dag 2
      1. Når OD 600 (A600nm; celledensitometer) når ~ 1,0, sentrifugerer Msm-kulturene i 10 minutter ved3,200 × g og RT (benchtop sentrifuge). Kast supernatantene med sterile 1 ml pipettespisser.
        MERK: Trinnet ovenfor forblir det samme for Mtb-kulturer, bortsett fra at antall dager er 4-7. Pass på at du ikke berører bakteriepelleten med pipettespissen.
      2. Vask: Tilsett 1 ml forvarmede Sautons (ved RT) medier (trinn 1.1.2) til hver Msm-pellet og heng forsiktig opp igjen med 1 ml pipettespisser for å oppnå en jevn suspensjon. Bruk sterile pipettespisser til å utjevne volumene til 10 ml (i hver) med samme medier. Sentrifuger suspensjonene i 10 minutter ved 3 200 × g og RT og kast supernatantene. Gjenta dette trinnet en gang til.
        MERK: Trinnet ovenfor forblir det samme for Mtb-kulturer.
      3. Resuspender de to ganger vasket Msm-cellene i 20 ml (hver) av forvarmede Sautons (forvarmet i en plate- eller shakerinkubator) og måle den optiske tettheten til cellene ved 600 nm. Inokuler det nødvendige volumet av Msm-kulturer i sterile 1 L Erlenmeyer-kolber som inneholder ~ 330 ml sterile Sauton-er slik at den endelige OD600 er ~ 0,05.
        MERK: Resuspensjoner må alltid begynne i et lite volum. Hvis det endelige volumet tilsettes pelleten direkte som et enkelt trinn, vil cellene forbli som diffuse pellets (en indikator på dårlig resuspensjon). Den eneste måten å løse problemet på er å spinne kulturene ned og gjøre om resuspensjonen som anbefalt. Trinnet ovenfor forblir det samme for Mtb-kulturer.
    3. Dag 2/3
      1. Inkubere 330 ml kulturen i inkubatoren shaker ved 200 rpm og 37 oC til kulturen OD600 når ~ 0,3. Deretter vasker du cellene én gang (ligner på trinn 1.2.2.2, men med samme volum) og deretter resuspenderer pelleten i samme volum. Fordel 50 ml av de resuspenderte kulturene hver i seks sterile 1 l sterile Erlenmeyer-kolber, hver inneholdende 280 ml sterile forvarmede Sauton-er med 1/10 th av normalt brukte (0,05%) Tween-80, dvs. 0,005% (se også merknad til trinn 2.2.1.3. for å forstå hvorfor 1/10th). Den endelige OD600 må være ca. 0,05.
        MERK: For Mtb kulturer, I stedet for Erlenmeyer kolber, bruk rulleflasker (av 1/2/4 L kapasitet). Juster kulturvolumet per flaske slik at kulturen ikke når flasken når den oppbevares på rulleapparatet. Det faktiske volumet i rulleflasken vil avhenge av kapasiteten til rulleflasken.
      2. Inkuber hver av de 330 ml kulturer i inkubator shaker ved 200 rpm og 37 oC til OD600 når 2,0 til 2,5 (~ 15-18 h).
        MERK: For Mtb-kulturer, sørg for at den endelige OD600 er ~ 1,0-1,2 (tar ~ 5-8 dager).

2. Anrikning av Msm mEVs ved bruk av sentrifugering av tetthetsgradient

  1. Dag 4
    1. Sentrifuge ~2 L av middels eksponentielle stadium MSM-kulturer i 6 x 400 ml sterile sentrifugeflasker ved 4 oC i 20 minutter ved ~ 8,000 × g (gulvmodellsentrifuge). Samle brukt media / kultur supernatant i to pre-kjølt, autoklavert 1 L Erlenmeyer flasker og lagre en aliquot av pellet for eventuelle analytiske prosedyrer (for eksempel SDS-PAGE og vestlige blotting-ikke detaljert her).
      MERK: Alle påfølgende trinn må utføres i kulde (~ 4 °C) for bedre å opprettholde integriteten til mEVene. mEV-ene er ganske stabile ved RT, men kjøling er et must for langsiktig stabilitet (gjentatt frysing og tining anbefales ikke). Under aksenisk kulturvekst løsriver mEVer seg fra overflaten av Msm/Mtb og akkumuleres i kultursupernatant/brukte medier.
    2. Filtrer Msm-dyrkningssupernatanten først gjennom 0,45 μm avfallsfilterenhet(er) og deretter gjennom 0,22 μm avfallsfilterenhet(er) for å fjerne alle spor av bakterier.
      MERK: Direkte filtrering gjennom 0,22 μm filtrene kveler ofte filterenhetene (da bakteriepelleten kan bli forstyrret mens du utfører trinn 2.1.1.). For å generere Mtb-kultursupernatanter, utfør tre filtreringer av Mtb-kulturer (dvs. første filtreringstrinn med en 0,45 μm engangsfilterenhet; to påfølgende filtreringstrinn med 0,22 μm engangsfilterenheter) før du flytter kulturfiltratene til BSL-2-innstillinger.
  2. Dag 4/5
    1. Bruk 30 kDa membrankonsentratorer til å konsentrere Msm-kulturfiltratet (~2 L) ned til ~ 38 ml ved å sentrifugere kulturfiltratet ved 4 oC, 20 minutter og ved 3 200 × g.
      1. Forvask konsentratorene først med steril, kald ddw (~15 ml) (vask ved 4 oC, 5 min og ved 3 200 × g).
      2. Vask med ~15 ml forfiltrert, kald Sauton's (samme forhold som for vann (2.2.1.1.)) for å fjerne alle spor av kjemikalier (brukt under produksjon).
      3. Siden ~ 130 sentrimoner (hvis man bare bruker) er teknisk nødvendig for å konsentrere ~ 2 L kulturfiltrat, gjenbruk sentrionene minst 3-4 ganger om nødvendig. Følg disse trinnene: konsentrer 15 ml til 0,5 til 1,0 ml (følg trinn 2.2.1), overfør konsentratet til et rent, autoklavert og kaldt 38 ml ultrasentrifugerør, og overfør deretter det gjenværende ukonsentrerte kulturfiltratet til de brukte sentrikonene for gjentatt konsentrasjon.
        MERK: Bruk av 24, 30 kDa konsentratorer for å konsentrere 2 liter kulturfiltrat vil ta opptil 6 timer. Ved konsentrasjon av kulturfiltratet blir Tween-80 også konsentrert og kan blokkere konsentratoren. Bruk av Tween-80 til 0.005% final (i stedet for 0.05%) i Sautons medier bidrar til å forhindre denne blokkeringen. Den reduserte konsentrasjonen av Tween-80 påvirker ikke den ensartede suspensjonen av Msm under vekst og forårsaker ikke klumping av MSM-celler. Imidlertid, som Mtb-celler klumper seg ved 0,005% Tween-80, bruk 0,05% Tween-80 for Mtb-spesifikke EVer.
    2. Overfør det konsentrerte Msm-kulturfiltratet (~38 ml) til et rent, vasket (med ddw) og forkjølt 40-50 ml polypropylensentrifugerør og utsett det for en to-trinns sentrifugering, først ved 4000 × g og deretter ved 15 000 × g, begge trinn ved 4 oC i 20 minutter (for å fjerne alt rusk). Bruk en sentrifuge av gulvtype til det samme.
  3. Dag 5/6
    1. Overfør kultursupernatanten til et forkjølt 38,5 ml polypropylen ultrasentrifugerør og spinn det i en ultrasentrifuge ved 100 000 × g i 4 timer ved 4 oC.
      MERK: En svingbøtte fungerer best i denne hastigheten. Sørg for å fylle ultrasentrifugerøret til randen og ha et balansert ultrasentrifugerør med tilsvarende vekt. Hvis et av rørene sitter fast i svingbøtta etter sentrifugering (som skjer på grunn av kondens), bruk tang, fjern den forsiktig fra rotoren. Tørk av kondensert fuktighet tilstede på den ytre overflaten av ultrasentrifugen før ultrasentrifugering forhindrer klistring.
    2. Lagre supernatanten i en 50 ml forkjølt slange (se notat). Inverter ultrasentrifugerøret på et friskt lofritt absorberende papir for å fjerne spor av supernatanten. Resuspender pelleten i 600 μL HEPES-bufferløsning (50 mM HEPES og 150 mM NaCl, pH 7,4; filtrer steriliser før bruk).
      MERK: Lagre supernatanten kun som en sikkerhetskopi. Den opprinnelige mEV-pelleten fremstår som en geléaktig, 5-7 mm diameter, kjedelig grågul til gjennomsiktig flekk. Hvis ingen pellet er synlig, gjenta trinn 2.3.1 ved å bruke den lagrede supernatanten på nytt. Hvis ingen pellet kommer til syne etter å ha gjentatt trinn 2.3.1, kast den og start den på nytt fra trinn 1.2. Pelleten tar tid å resuspendere. Det anbefales å legge til HEPES-bufferen og la den ligge over natten ved 4 oC for enkel resuspensjon. Heng forsiktig opp, men med gjentatte pipetteringer (bruk P200-spissene for bedre resuspensjon) til jevn resuspensjon.
  4. Dag 6
    1. Utsett den resuspenderte pelleten for "jodixanol"-basert sentrifugering av tetthetsgradient.
      1. Legg den resuspenderte pelleten lagvis i bunnen av den 13 ml rene, vaskede (med ddw) og forkjølte ultrasentrifugerøret av polypropylen, og bland forsiktig (bruk 1 ml pipette) med ~4 ml iodixanol-løsning med inert tetthet (kommersielt tilgjengelig som en ~60 % w/v-løsning). Etter lagdeling av den resuspenderte pelleten i bunnen av røret (til maksimalt 5 ml), overlegg deretter med 1 ml (w/v) hver på 40%, 30%, 20% og 10% underlagre av 'iodixanol' i den respektive rekkefølgen (klargjør underlagre (med HEPES-buffer) fra 60% lager). Deretter legger du til 4 ml 6% underlager (fremstilt fra 60% lager med HEPES-buffer) øverst for å fylle røret.
        MERK: Forbered gradienten like før bruk; Oppbevar og bruk aldri.
      2. Forsiktig (uten å riste), vei røret i et glassbeger, og overfør det forsiktig inn i den svingende bøtterotoren.
        MERK: Veiing er nødvendig for å balansere med et dummyrør (også veid).
      3. Utsett den for ultrasentrifugering ved 141 000 × g i 16 timer ved 4 oC.
  5. Dag 7
    1. Fjern tuben forsiktig (se note til trinn 2.3.1) og samle 1 ml fraksjoner i nyautoklaverte mikrosentrifugerør; Vær oppmerksom på 4. til 6. fraksjoner, som vanligvis inneholder Msm mEVs.
      MERK: mEV-ene fra disse fraksjonene fraksjonerer normalt i tre eller fire mEV-bånd (ett er hovedbåndet) som er kjedelige hvite i fargen. R-mEVene som inneholder mCherry fraksjonerer ut i 5til 7 fraksjoner og virker mørk lilla til magenta. Mtb EV-ene fraksjonerer vanligvis uti 5. til 7. fraksjon. Separasjon av mEVene i gradienten avhenger av gradientkonsentrasjonen som brukes og hvor godt gradienten er lagdelt. Hvis mEV sprekker delvis, kan de fraksjonere ut i tidligere fraksjoner. Alternativt, hvis pelleten oppnådd etter trinn 2.3.2 ikke resuspenderes godt, danner vesiklene tette mikropellets som fraksjonerer ut som senere fraksjoner. Vi anbefaler presis innsamling av fraksjonene bare når brukeren ønsker å vurdere hvilken av 1 ml-fraksjonene som inneholder mEVene. Brukere kan gjerne aliquot i mindre eller større fraksjoner basert på deres bekvemmelighet. Når vi bruker dem til visse applikasjoner, for eksempel ved å teste dem som en potensiell subenhetsvaksine-booster til BCG, begrenser vi innsamlingen av mEV-ene til mindre enn 250 μL av fraksjonene (der mEV-er fraksjonerer) slik at vi spesifikt bare kan samle inn mEV-båndene og prosessen som angitt i 2.7.5. Dette bidrar til å fjerne alle spor av jodixanol som kan forstyrre i veien for våre nedstrøms eksperimenter.
  6. Dag 8
    1. Slå sammen de mEVs-holdige fraksjonene, fortynn med HEPES-buffer til 38 ml, og gjenta ultrasentrifugeringen ved 4 oC i 16 timer ved 100 000 × g. Resuspender pelleten (som i trinn 2.3.2 med samme forsiktighet) enten i HEPES-buffer eller i en buffer som nedstrømseksperimenter (ikke detaljert her) som proteinestimering, nanosporingsanalyser, negativ farging, transmisjonselektronmikroskopi, vestlig blotting og immungullmerking krever.
      MERK: For bedre resuspensjon, sonicate det mEV-holdige røret i 10 minutter ved hjelp av en ultralyd vannbad sonikator. Sonikering i lengre tid kan initiere brudd og tap av intakte mEVs. Hvis suspendert godt, er sonikering unødvendig. Alle trinnene fra 2.1 til 2.6 er identiske mens de beriker Mtb-genererte elbiler.

3. Konstruksjon og anrikning av rekombinante mEVs.

MERK: Et av de 10 mest tallrike proteinene (identifisert ved massespektrometri) av Msm EV er Cfp-2930. Gitt sin lille størrelse (29 kDa), enkel sekundærstruktur 40, lokalisering til membranen 41, og tilbøyelighet til å bli utskilt i brukte medier i akseniske kulturer (f.eks. som et kulturfiltratprotein; utskilt av både Msm og Mtb42,43, har det her blitt utnyttet til å levere en rød fluorescerende reporter og et protein av interesse (EsxAMtb) til mEVs. For å oppnå dette,

  1. Bruk passende forover- og bakoverprimere (tabell 1; kompatibel for å klones direkte til en skyttelvektor som pMV261) for å forsterke cfp-29 fra Msm. Ved å bruke ~50 ng høymolekylvekt (~>20 kb) Msm-genomisk DNA som mal, forsterker PCR-cfp-29-genfragmentet med en høykvalitets korrekturlesing DNA-polymerase (som Phusion eller Q5). Følg produsentens anbefalinger for PCR.
    MERK: Design nødvendige begrensningssteder til primere for enkel kloning i en hvilken som helst alternativ skyttelvektor av interesse. PCR-forhold og volum vil variere med type og merke av korrekturlesing av DNA-polymerase som brukes. Volumet av reaksjonsblandingen vil variere avhengig av mengden DNA-mal og mengden korrekturlesing av DNA-polymerase. Følg produsentens anbefalinger for PCR-forhold, vellykket forsterkning og eliminering av ikke-spesifikk glødning av primere.
  2. PCR renser den eluerte amplikonen med et kommersielt tilgjengelig PCR-rensesett og verifiserer ampliconlengden ved standard agarosegelelektroforese. Fordøy den rensede forsterkeren.
    1. Beregn mengden renset amplikon på et spektrofotometer. Bruk minst 2 μg cfp-29 amplikon for fordøyelsen.
    2. Fordøy først med BstB1 ved 65 o C i 1 time (type og mengde buffer og enzym - i henhold til produsentens anbefalinger), bring reaksjonstemperaturen ned til RT, og fordøy deretter med HindIII i 1 time ved 37 oC (type og mengde buffer og enzym - i henhold til produsentens anbefalinger).
    3. PCR renser og eluerer fordøyd amplikon i 50 μL autoklavert nukleasefri ddw.
    4. Beregn konsentrasjonen og utbyttet av den fordøyde amplikonen ved hjelp av et spektrofotometer. Oppbevares ved -20 oC til ligeringsoppsett. MERK: Post PCR, kontroller amplikonlengden (~ 798 + 50 bp) og utbytte ved elektroforese 10 μL av PCR-reaksjonsblandingen på en 1% agarosegel. Selv om dobbel fordøyelse ikke er mulig med denne kombinasjonen av enzymer, vil en kompatibel buffer forhindre gjentatt PCR-rensing og påfølgende tap av fordøyd amplicon. Konsentrasjonen av fordøyd amplikon varierer med settet som brukes til PCR-rensing. Det varierer også med lengden (i bp) av eventuelle alternative vektorer av valget.
  3. Bruk fremre og bakre primere (tabell 1), en korrekturlesing av DNA-polymerase og ~ 50 ng Mtb-genomisk DNA, PCR forsterker esxA- eller esxA-3X FLAG-tag spesifikk forsterker. Bruk ~5 ng egnet plasmid-DNA til PCR-amplifisere mCherry. Plasmid- og sekvensdetaljer finnes i tilleggsfil 1.
    MERK: Bruk en glycin, glycin, glycin, glycin, serin 44,45 (G4S) linker mellom cfp-29 og mCherry / esxA / esxA-3X FLAG; før starten av mCherry, hjelper G4S-linkeren mCherry til ikke å gjennomgå falske ikke-funksjonelle folder (inkludert de som drives av Cfp-29). Se cfp-29-, hsp60-promoter-, mCherry- og esxA-sekvenser i tilleggsfil 1. Plasmider som fungerer som maler for mCherry er tilgjengelige på forskjellige plasmidlagre / banker. Ulike versjoner (litt endrede sekvenser) av mCherry er tilgjengelige som vil kreve endrede fremover og bakover primer sekvenser. Primerne (tabell 1) bidrar til å forsterke mCherry nevnt i tilleggsfil 1. Fusjon av N-terminalen til mCherry/esxA/esxA::3XFLAG til den C-terminale enden av Cfp-29 fungerer bra.
  4. Fordøy 1 μg DNA fra mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplicons og rens fordøyd DNA.
    1. Fordøy hver amplikon dobbelt med HindIII og HpaI i 1 time ved 37 oC (eller i henhold til produsentens anbefalinger).
    2. Bruk et kommersielt tilgjengelig PCR-rensesett og produsentens anbefalinger for rensing av det fordøyede forsterkeren. Elute den fordøyde amplikonen i 50 μL autoklavert nukleasefri ddw.
    3. Beregn konsentrasjonen og utbyttet av den fordøyde amplikonen ved hjelp av et spektrofotometer. Oppbevares ved -20 oC til ligeringsoppsett.
  5. Fordøy 2 μg pMV261-KanR (tilleggsfil 1) eller en egnet kloningsvektor med enzymet (e) du velger.
    1. Fordøy først med BstB1 ved 65 o C i 1 time (type og mengde buffer og enzym - i henhold til produsentens anbefalinger), bring reaksjonstemperaturen ned til RT, og fordøy deretter med HindIII i 1 time ved 37 oC (type og mengde buffer og enzym - i henhold til produsentens anbefalinger).
    2. Gel renser og eluere i 50 μL autoklavert nukleasefri ddw.
    3. Beregn konsentrasjonen og utbyttet av den fordøyede vektoren ved hjelp av et spektrofotometer. Oppbevares ved -20 oC til ligeringsoppsett.
      MERK: En-trinns to-fragment kloning er mulig med ovennevnte primere for pMV261. Enhver alternativ skyttelvektor som overlever som et episom vil fungere. Integrative plasmider vil også fungere, men rekombinant proteinutbytte vil være relativt mindre per cellebasis.
  6. Ligate og transformere til en kompatibel stamme av E. coli.
    1. For ligering, bruk 125 ng av vektoren. Bruk riktig fordøyde mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-forsterkere i et molforhold på 1:3. Utfør ligering over natten ved bruk av T4 DNA Ligase (mengde i henhold til produsentens anbefalinger) ved 16 ° C i et kjølt sirkulerende vannbad.
      MERK: Bruk passende kontroller som vektor bare med og uten T4 DNA Ligase for å evaluere effektiviteten av fordøyelsen og forutsi effektiviteten av kloningssuksess.
    2. Transformasjon
      1. Tine NEB5α kjemisk kompetente celler alikoter (~100 μL per transformasjon) på is i 15 minutter. Bland forsiktig to ganger med en steril pipettespiss. Tilsett ligeringsblanding (opptil 20 μL) til de kalde, kompetente cellene.
      2. Bland forsiktig pipetteceller + ligert DNA. Inkuber blandingen på is i ytterligere 30 minutter.
      3. Gi varmesjokk ved 42 °C (i et sirkulerende vannbad) i 60 sekunder og overfør umiddelbart tilbake til isen i ytterligere 15 minutter.
      4. Gjenopprett de transformerte cellene ved å tilsette 1 ml av SOC-buljongen (2% tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 og 20 mM glukose) og inkuber ved 37 °C i 1 time ved 200 o / min.
      5. Spinn ned de gjenvunnede bakteriene i et 1,5 ml mikrosentrifugerør (3000 × g, RT og 10 min), kast supernatanten, resuspender pelleten i 200 mikroliter sterilt, forvarmet, nytilberedt LB-medium og fordel suspensjonen på nyhelte LB Miller-agarplater som inneholder nødvendig antibiotika i passende konsentrasjoner.
      6. Inkubere petriskålene i en plateinkubator forhåndsinnstilt til 37 oC.
  7. Skjerm (ikke detaljert her) for potensielle kloner, verifiser (ved koloni PCR-/restriksjonsenzymer-basert)46 og sekvenser (Sanger-sekvensering) dem for å bekrefte fusjon.
  8. Trekk ut plasmid-DNA (~ 200 ng / 1-2 μL, noe kommersielt tilgjengelig sett) av den bekreftede klonen (E. coli-bakgrunn ) og transformer den til nyopprettede elektrokompetente celler av Msm.
  9. Fremstilling av Msm elektrokompetente celler
    1. Nyvokse Msm (som i trinn 1.2.1 og 1.2.2). Vask den nydyrkede MSM som i trinn 1.3.3 og 1.3.4 (bortsett fra, bruk 7H9 + ADC + Tween-80 (rik) i stedet for Sauton).
    2. Tilsett en alikot av de vaskede Msm-cellene til en endelig OD600 på ~0,05 i en steril 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 150 ml rike medier.
    3. Inkubere i inkubatorristeren ved 200 rpm og 37 oC til kulturen OD600 når ~ 0,8 til 1,0 (~ 12-14 h).
    4. Overfør dyrkningen til en ferdigkjølt 400 ml sentrifugeflaske og rug på is i 60-90 min. Deretter pellet cellene ned ved 4 oC i 15 min ved 4000 × g.
    5. Vask cellene to ganger (hver vask med 150 ml, ved 4000 × g, 4 oC og 15 min) med iskald, steril (autoklavert) 10% glyserol.
      NOTAT: Ved hver vask blir pelleten løs. Vær forsiktig når du kaster hele supernatanten (etter hver vask). Ellers vil flertallet av cellene gå tapt i den kasserte supernatanten.
    6. Vask cellene en gang til med 75 ml iskald, steril 10% glyserol inneholdende 0,005% Tween-80.
    7. Resuspender cellepelleten i 7,5 ml 10% glyserol med 0,005% Tween-80 og alikot til 400 μL alikoter.
      MERK: Selv om Msm elektrokompetente celler er kompetente i minst 4 måneder, gir nytilberedte elektrokompetente celler de beste resultatene. Når du bruker gamle kompetente celler, vises noen ikke-rosa kolonier (hvite) som falske transformanter. Jo eldre de kompetente cellene, mer de hvite koloniene.
  10. Transformasjon av MSM
    1. Tine Msm-kompetente celler på is.
      MERK: Tining ved RT og transformasjon av slike celler gir mindre effektivitet.
    2. Tilsett 1-2 μL plasmid-DNA (~200 ng totalt) til de kalde kompetente cellene, bland forsiktig med en 1 ml steril pipettespiss og overfør til en forkjølt steril 2 mm elektroporasjonskuvette.
    3. Overfør den lukkede kyvetten med Msm-kompetente celler + plasmid-DNA-blanding inn i elctroporatorens mus, lukk lokket forsiktig og påfør en puls (eksponentiell henfallstype) ved 2,5 kV (spenning), 25 μF (kapasitans) og 1000 Ω (motstand).
    4. Tilsett umiddelbart 1 ml forvarmet sterilt rikt (7H9 + ADC + Tween-80) medium til kyvetten, bland forsiktig med en 1 ml steril pipettespiss og overfør hele innholdet til en 10 ml steril slange.
    5. Inkuber innholdet i 3 timer i en inkubator shaker satt til 37 oC og 200 rpm. Spinn ned innholdet i et mikrosentrifugerør (4000 × g, RT og 10 min), kast supernatanten, resuspender pelleten i 200 μL sterilt forvarmet rikt medium, og fordel suspensjonen på nyhelte 7H11-agarplater som inneholder ADC, Tween-80 og de nødvendige antibiotika ved passende konsentrasjoner.
      MERK: For Msm, når det er nødvendig, bruk Hygromycin, Kanamycin og Apramycin i de endelige konsentrasjonene på henholdsvis 50 μg / ml, 25 μg / ml og 50 μg / ml. MSM i seg selv er IKKE resistent mot disse antibiotika. Bruk disse antibiotika bare når du bruker plasmider med passende resistente gener for valg / vekst av transformanter / rekombinante Msm-kolonier.
    6. Inkuber petriskålene i en plateinkubator forhåndsinnstilt til 37 oC. Vanligvis vises transformanter mellom 3-5 dager.
      MERK: Hvis et protein av interesse er giftig for Msm, kan transformantene dukke opp senere eller ikke dukke opp. I slike tilfeller klone avkortede versjoner av full lengde.
    7. Lag glyserollagre av de fremvoksende MSM-koloniene etter å ha verifisert for positive kloner (samme som trinn 3.7)
  11. For å berike R-mEVs som inneholder enten mCherry- eller EsxA-proteiner, dyrk først R-Msm som uttrykker enten mCherry eller exsA eller esxA::3X FLAG ved å følge trinn 1.2.1 til 1.2.3 og følg deretter trinn 2.1 til 2.6. for å berike R-mEV. R-mEVene eluerer inn i 4 th-7th fraksjoner etter tetthet gradient spinn (trinn 2.5). R-mEVs pellet etter første ultrasentrifugeringstrinn (2.3.1). Etter å ha utført identisk med trinn 2.3.1, bekreft at R-mEV er synlig som en mørk lilla til magenta 5-7 mm diameter pellet nederst i midten av ultrasentrifugen.
  12. Utfør vestlige analyser47 (ikke beskrevet her) for å oppdage protein(er) av interesse innenfor de berikede R-mEVene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi bruker M. smegmatis (Msm) som modell mycobacterium for å demonstrere anrikning av både native og rekombinante mEVs (R-mEVs). Denne skjematisk oppsummerte mEVs berikelsesprotokoll (figur 1) fungerer også for anrikning av R-mEVs av Msm og native EVs av Mtb (med mindre modifikasjoner som i protokollnotater på 1.2). Visualisering av de berikede mEVene krever negativ farging av dem under et transmisjonselektronmikroskop36 (figur 2A). Vanligvis skiller MSM-spesifikke EVer seg ut i 4 th-6th 1 ml fraksjoner av 13 ml 6-60% tetthetsgradient (figur 2B). Omtrent 80-100 μg proteinekvivalenter av EV oppnås rutinemessig fra 2 l mid-logaritmiske akseniske kulturer av Msm. Diametrene varierer vanligvis mellom 20 nm og 250 nm (figur 2C).

Et langsiktig mål for laboratoriet vårt er å evaluere om mEVs av forskjellige mykobakterier potensielt kan fungere som en subenhetsforsterker til den eksisterende vaksinen, BCG. Siden berikelse av mEV generert av patogene bakterier er tidkrevende, risikabelt og dyrt, kan utnyttelse av innfødte og rekombinante elbiler fra avirulent mykobakterier fungere som et passende alternativ. Derfor tar vi sikte på ikke bare å standardisere protokollen for å berike mEV-ene til Msm, men også å konstruere og berike R-mEV-ene.

For å konstruere R-mEV valgte vi først de 10 rikelige proteinene til Msm EVs (tabell 1; vi identifiserte dem fra detaljerte massespektrometrianalyser av Msm EVs)30. Vi antydet at hvis et fremmed protein av interesse er translasjonelt smeltet til noen av dem, bør det kunne lokaliseres til mEVs. Deretter nominerte vi Cfp-29 blant de 10 fordi den er den minste blant dem (~29 kDa), er membranlokalisert og er et kulturfiltratprotein med en relativt enkel sekundærstruktur40,41,42,43. Vi smeltet translasjonelt sammen mCherrys (fluorescerende protein) N-terminale ende til den C-terminale enden av Cfp-29 og evaluerte lasting/levering i mEVs. En del av de berikede mEV-ene til Msm ble rosa (figur 3), noe som indikerer Cfp-29s evne til å bære et fremmed protein av interesse inn i Msm EV.

Gitt denne evnen til Cfp-29 (figur 3), evaluerte vi deretter EsxA (Esat-6), et viktig immunogent protein37,38,39 levering til Msm EV. Igjen genererte vi to uavhengige translasjonsfusjoner til C-terminalen av Cfp-29-only EsxA og EsxA + 3X FLAG-tag (3X FLAG smeltet til C-terminalen til EsxA. Som forventet observerte vi Mtbs EsxA i Msm EV (baner 5, 6 og 10, figur 4A, B), om enn i lave mengder. Interessant nok var Cfp-29::EsxA::3XFLAG mye mer stabil (bane 3 og 4 pluss 8 og 9; Figur 4A) og akkumulert på høyere nivåer i mEVs (bane 3 og 4 pluss 8 og 9; Figur 4B). Oppsummert demonstrerer vi design, konstruksjon og anrikning av R-mEVs som inneholder et fremmedprotein av interesse (figur 3 og figur 4).

Figure 1
Figur 1 Skjematisk fremstilling av mykobakteriell ekstracellulær vesikkelanrikning. 'Dager' (med rød skrift, øverst på figuren) refererer til dagene som er nødvendige for å berike mEV-ene fra Msm (spesielt for protokolltrinn 1 og 2). "Trinn" (med svart skrift, nederst på figuren) refererer til protokolltrinnene som beskrevet i protokolldelen. For å berike mEV fra Mtb, selv om alle trinnene er like, tar det minst 10 dager for de forskjellige dyrkingstrinnene (trinn 1) til det første trinnet med sentrifugering (trinn 2). Påfølgende trinn krever identisk varighet (som angitt med rød skrift). Før tetthetsgradienten ser mEVs pellet + ekstracellulære komplekser fargeløse ut når de beriker både innfødte mEVs og R-mEVs. Den vil imidlertid se rosa til blå ut (se figur 3) når den beriker mEV som inneholder mCherry. Etter tetthetsgradienten vil mEV-ene vises hvite (innfødte og R-mEVs) eller rosa (hvis de inneholder mCherry) i tetthetsgradientrøret. Fargene på mEVs i figuren er bare for å indikere klarhet og representerer ikke de eksakte fargene. Se figur 3 for mer klarhet. Forkortelser: Msm = M. smegmatis; Mtb = M. tuberkulose; 0,45 og 0,22 μm = porestørrelse på avfallsfilterenheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Mykobakterielle elbiler er sirkulære, konsentrerer seg med tetthetsgradienter og varierer i dimensjoner . (A) Et representativt bilde av Msm EVs ved visualisering med negativ farging og visning under et transmisjonselektronmikroskop. Skala bar = 200 nm. (B) Et representativt bilde av hvordan mEV vises i ultrasentrifugerøret når de utfører en 6-60% tetthetsgradient. Hvis 6-60% gradienten ikke er nøyaktig lagdelt, kan plasseringen av de store (øverste åpne pil) og mindre (nederste åpne pil) båndene til mEVs endres betydelig, og dermed endre 1 ml brøknummer. (C) Et representativt bilde ved nanotracking analyse av berikede mEVs av Msm. Nanotracking analyser avslører proporsjoner og konsentrasjoner av forskjellige størrelser mEVs og det totale antall mEVs i preparatet. I gjennomsnitt, med protokollen beskrevet her, er ~ 1-3 × 1010 EV beriket fra 2 L Msm og Mtb. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ulike trinn som indikerer anrikning av mEVs som uttrykker mCherry. (A) Representativt bilde som viser Msm aksenisk kultur som uttrykker Cfp-29::mCherry. (B) Representativt bilde av bakteriell pelletspost sentrifugering av Msm aksenisk kultur som uttrykker Cfp-29::mCherry. (C) Representativt bilde av kulturfiltratkonsentrat oppnådd etter konsentrasjon av brukte medier av Msm aksenisk kultur som uttrykker Cfp-29::mCherry gjennom sentrikonsentratorer. (D) Representativt bilde av mEVs + ekstracellulære komplekser pellet post ultracentrifugation av kulturfiltrat konsentrat oppnådd fra Msm aksenisk kultur som uttrykker Cfp-29::mCherry. Pelleten ville imidlertid forbli fargeløs hvis mEVene skulle være enten innfødte eller rekombinante (ved fusjon til Cfp-29) for fremmede proteiner unntatt mCherry. (E) Representative bilder av mCherry som inneholder mEVs. Merk at ikke alle mEV-er er rosa, noe som indikerer at ikke alle mEV-er inneholder Cfp-29. Bra: Et representativt bilde som indikerer forskjellige bånd av mEV-er som vanligvis oppnås etter berikelse for Cfp-29::mCherry EV-er. Siden mCherry-holdige elbiler er tettere, skiller de seg i senere fraksjoner. Dårlig: Et representativt bilde som indikerer dårlig separasjon (de hvite mEVene skiller seg ut i første/andre fraksjon og mCherry-holdige mEVs skiller seg ut i 10. fraksjon (muligens på grunn av dårlig resuspensjon av mEVs pellet, dvs. protokolltrinn 2.3.2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Rekombinante mEVer som inneholder EsxA (ESAT-6), et Mtb-kodet immunogen i Msm totalcellelysat og Msm-genererte EVer. (A) Coomassie gel og (B) vestlige analyser (påvist med ESAT6-spesifikt polyklonalt antistoff) bilder som viser akkumulering av smeltet ExsA i både Msm total cellelysat og mEVs som uttrykker enten cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, bane 3 og 4 (total lysat) og banene 8 og 9 (mEVs)) eller cfp-29:: esxA (- 3XFLAG, felt 5 og 6 (total lysat) og bane 10 (mEVs)). Åpne og fylte piler indikerer akkumulert Cfp-29::ExsA::3XFLAG og Cfp-29::ExsA, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Primere:
Sl # Gen Grunning Sekvens (5' til 3') Kilde Å klone inn
1 CFP-29 Fremover CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC MSM genomisk DNA pMV261
Omvendt GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG MSM genomisk DNA pMV261
2 mKirsebær Fremover GAAAAGCTT(HindIII) ggcggcggtggctcg (G4S linker)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG Lab samling pMV261
Omvendt TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC Lab samling pMV261
3 esxA Fremover GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb genomisk DNA pMV261
Omvendt TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 Mtb genomisk DNA pMV261
4 exsA-3X FLAGG Fremover GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb genomisk DNA pMV261
Omvendt TGTGTTAAC(HpaI)TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 Mtb genomisk DNA pMV261

Tabell 1: Primersekvenser. Forover- og bakoverprimere for forsterkning av cfp-29, mCherry, esxA og esxA::3X FLAG og kloning til skyttelvektor pMV261 er oppført.

Tilleggsfil 1: A: pMV261, dets sirkulære kart, hovedtrekk og fullstendig nukleotidsekvens. Gul highlight-hsp60 promoter nukleotidsekvens; Grønne og cyan highlight-begrensningssteder der mCherry, esxA og esxA::3X FLAG-forsterkere ble klonet. B, C og D: Nukleotidsekvenser av henholdsvis cfp-29, mCherry og esxA . Grønt highlight-stop-kodon av cfp-29, mCherry og esxA. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden utviklingen av en ny TB-vaksine som er overlegen og kan erstatte BCG, forblir en formidabel utfordring, som et alternativ, forfølger flere grupper oppdagelsen av forskjellige subenhet TB-vaksiner som kan øke BCGs styrke og forlenge beskyttelsesvarigheten48,49. Gitt den økende oppmerksomheten mot bakterielle EV (bEV) som potensielle underenheter og som naturlige hjelpestoffer50,51, har konsekvent anrikning av tilstrekkelige mengder mEV for nedstrøms testing/analyse blitt et viktig skritt. Det er i betraktning av disse forskningsspørsmålene at denne protokollen tar sikte på å berike mEVs fra akseniske kulturer og deres rekombinante versjoner.

Under detaljerte massespektrometriske proteomanalyser av Msm EV identifiserte Prados-Rosales et al. de 10 mest tallrike proteinene30. Vi antydet videre at ved tilstrekkelig molekylærteknikk skulle en av dem være tilstrekkelig til å bære et fremmed protein av interesse i mEVs. Interessant nok skilte Cfp-29 seg ut som det best mulige alternativet på grunn av sine forskjellige funksjoner 39,40,41,42. Våre data viser faktisk at det er tilstrekkelig nok til å bære mCherry og EsxA (selv om EsxA krevde en liten tag på C-terminalen for å være mer stabil) og akkumulere dem i mEVs. Nylig, i 2021, demonstrerte Tang et al. at Cfp-29 er et innkapslet med evnen til å bære farge-avfargingsperoksidase (DyP)-type peroksidaser40. Kanskje kan Cfp-29 også bære andre fremmede proteiner.

Vi utforsket EsxA fordi det er en fremtredende Mtb immunogen 37,38,39, kan være beskyttende som en subenhetsvaksine i dyremodell37,38,39, er liten i størrelse; og ortologen (MSMEG_0066) er interessant fraværende i MSM EV. Selv om vi ikke diskuterer dette her, har vi med hell generert R-mEVs for noen få andre Mtb-proteiner (unikt tilstede i Mtb og ikke kodet av Msm), inkludert Antigen 85B (Rv 1886c). Samtidig, interessant nok, klarte vi heller ikke å generere R-mEVs for noen få andre, inkludert full lengde Rv2660c og Rv0288, muligens fordi proteinene er giftige for Msm. Vi konkluderer med det fordi, til tross for kloning av de riktige nukleotidsekvensene og utførelse av gjentatte transformasjoner, oppsto ingen tranformanter av MSM. Siden EsxA krevde en 3XFLAG-tag ved enden av C-terminalen for bedre akkumulering i mEV, la vi til en 3XFLAG-tag til alle andre Mtb-kodede proteiner som vi evaluerte. Til tross for taggen overlevde ikke MSM, noe som indikerer at noen Mtb-proteiner forblir giftige til tross for merkefusjonen. Vi spekulerer i at i disse tilfellene kan kloning av bare de forutsagte epitopområdene eller sy flere epitoper sammen lønne seg (for tiden under evaluering i vårt laboratorium). Vi brukte en liten fem aminosyre (fire glycin og en serin) linker mellom Cfp-29 og mCherry / EsxA for å minimere den negative innflytelsen på foldingen av proteinet av interesse44,45. Vi forutsier at uten denne linkeren vil proteinet av interessefolding bli sterkt påvirket av Cfp-29-folding.

Denne anrikningsprotokollen kan enkelt utvides til anrikning av Mtb-genererte elbiler. Vi spekulerer også i at berikelse av mEV fra miljømykobakterier også bør være mulig med denne protokollen. Til tross for at protokollen er enkel og grei, krever den fortsatt 7-8 dager å berike MSM-genererte elbiler og R-mEV-er. Derimot krever det 15-20 dager for anrikning av Mtb-genererte elbiler. Å konsentrere elbiler til et mindre volum er tidkrevende og dyrt, og vi utforsker for tiden tangentiell strømningsfiltrering og andre tilnærminger for å løse tidsproblemet.

Til slutt bruker vi Sautons og ikke 7H9 for å berike mEVs fordi ADC-tilskuddet inneholder høye mengder bovint serumalbumin som kan forstyrre enhver nedstrøms bruk av mEVs. Denne protokollen kan enkelt utvides til andre spesifikke medier (f.eks. lavjernsmedier) som må brukes til å evaluere mEVs sammensetning. Alternativt, for visse applikasjoner, i det siste trinnet (dvs. protokolltrinn 2.7.5), i stedet for HEPES-buffer, kan man bruke sterilt saltvann når man injiserer det samme i mus eller marsvin for ulike in vivo-baserte analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer at dette forskningsarbeidet ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold / interesser som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne takker Prof. Sarah M. Fortune for vennlig deling M. smegmatis mc2155 lager. De anerkjenner også Servier Medical Art (smart.servier.com) for å gi noen grunnleggende elementer for figur 1. De anerkjenner oppriktig støtten fra resten av laboratoriemedlemmene for deres pasientjusteringer under lang bruk av inkubatorristere, sentrifuger og ultrasentrifuger for mEV-anrikning. De anerkjenner også Mr. Surjeet Yadav, laboratorieassistenten, for alltid å sørge for at de nødvendige glassene og forbruksvarene alltid var tilgjengelige og hendige. Til slutt anerkjenner de de administrative, innkjøps- og økonomiteamene til THSTI for deres konstante støtte og hjelp i den sømløse gjennomføringen av prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium - Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 202 ekstracellulære vesikler rekombinante vesikler Esat-6 mykobakterier ExsA mCherry Cfp-29 bakterier

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

Anrikning av innfødte og rekombinante ekstracellulære vesikler av mykobakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter