Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anrikning av naturliga och rekombinanta extracellulära vesiklar av mykobakterier

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll beskriver anrikningen av inhemska mykobakteriella extracellulära vesiklar (mEV) från axeniska kulturer av Mycobacterium smegmatis (Msm) och hur mCherry (en röd fluorescerande reporter)-innehållande rekombinanta MsmEVs kan designas och anrikas. Slutligen verifieras det nya tillvägagångssättet genom anrikning av MsmEVs som innehåller EsxA-proteinet Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

De flesta bakterier, inklusive mykobakterier, genererar extracellulära vesiklar (EV). Eftersom bakteriella EV (bEV) innehåller en delmängd av cellulära komponenter, inklusive metaboliter, lipider, proteiner och nukleinsyror, har flera grupper utvärderat antingen de ursprungliga eller rekombinanta versionerna av bEV för deras skyddande styrka som subenhetsvaccinkandidater. Till skillnad från inhemska elfordon är rekombinanta elfordon molekylärt konstruerade för att innehålla en eller flera immunogener av intresse. Under det senaste decenniet har olika grupper utforskat olika metoder för att generera rekombinanta bEV. Men här rapporterar vi design, konstruktion och anrikning av rekombinanta mykobakteriella EV (mEV) i mykobakterier. För att göra det använder vi Mycobacterium smegmatis (Msm), en fågelmykobakterie i jorden som modellsystem. Vi beskriver först generering och berikning av inhemska elbilar av MSM. Därefter beskriver vi design och konstruktion av rekombinanta mEV som innehåller antingen mCherry, ett rött fluorescerande reporterprotein, eller EsxA (Esat-6), en framträdande immunogen av Mycobacterium tuberculosis. Vi uppnår detta genom att separat smälta samman mCherry och EsxA N-termini med C-terminalen av ett litet Msm-protein Cfp-29. Cfp-29 är ett av de få rikligt förekommande proteinerna i MsmEV. Protokollet för att generera och anrika rekombinanta mEV från Msm förblir identiskt med generering och anrikning av inhemska EV av Msm.

Introduction

Trots utveckling och administrering av ett brett utbud av vacciner mot infektionssjukdomar sker än i dag ~30 % av alla dödsfall på grund av smittsamma sjukdomar. Före tillkomsten av tuberkulosvaccinet (TBC) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - var tuberkulos den främsta dödsorsaken (~10 000 till 15 000/100 000 invånare)2. Med administrering av BCG och enkel tillgång till första och andra linjens läkemedel mot tuberkulos har antalet tuberkulosrelaterade dödsfall dramatiskt minskat till ~1 miljon/år år 2022 (dvs. ~15-20/100 000 invånare1). I tuberkulosendemiska populationer i världen fortsätter dock tuberkulosrelaterade dödsfall att ligga på ~100-550/100 000 invånare1. Även om experter känner till flera orsaker som leder till dessa skeva siffror, verkar BCG-medierat skydd som inte varar ens under det första decenniet av livet vara denframträdande orsaken 3,4,5,6,7. Med tanke på FN:s förnyade "mål för hållbar utveckling" och WHO:s strategi för att utrota tuberkulos finns det följaktligen en samlad global ansträngning för att utveckla ett mycket överlägset vaccinalternativ till BCG som kanske ger livslångt skydd mot tuberkulos.

För att uppnå detta mål utvärderar flera grupper för närvarande modifierade/rekombinanta BCG-stammar, icke-patogena och försvagade mykobakteriearter andra än BCG, och subenhetskandidater 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Vanligtvis är subenhetsvacciner liposomer som selektivt laddas med få renade (~1-6) fullängds- eller trunkerade immunogena proteiner av patogenen. Men på grund av deras falska veckning till icke-nativa konformationer och/eller slumpmässiga icke-funktionella interaktioner mellan de laddade proteinerna, saknar subenheter ofta nativa och germanska epitoper och misslyckas därför med att tillräckligt förbereda immunsystemet14,19,20.

Följaktligen har extracellulära vesiklar (EV) av bakterier tagit fart som ett lovande alternativ 21,22,23,24,25,26. Vanligtvis innehåller bakteriella EV (bEV) en delmängd av deras cellulära komponenter, inklusive vissa delar av nukleinsyror, lipider och hundratals metaboliter och proteiner27,28. Till skillnad från liposomer där ett fåtal renade proteiner är artificiellt laddade, innehåller bEVs hundratals naturligt laddade, naturligt veckade proteiner med en bättre benägenhet att förbereda immunsystemet, särskilt utan förstärkning/hjälp av adjuvans och Toll-like receptor (TLR) agonister27,28,29. Det är inom denna forskningslinje som vi och andra har undersökt användbarheten av mykobakteriella EV som potentiella subenhetsförstärkare till BCG30. Trots farhågor om att bEV saknar enhetliga antigenbelastningar har EV från försvagad Neisseria meningitidis framgångsrikt skyddat människor mot serogrupp B-meningokocker31,32.

Åtminstone teoretiskt sett är de bästa elbilarna som kan öka BCG väl de elbilar som är berikade med patogena bakterier. Att berika EV som genereras av patogen mykobakterie är dock dyrt, tidskrävande och riskabelt. Dessutom kan patogengenererade EV vara mer virulenta än skyddande. Med tanke på de potentiella riskerna rapporterar vi här ett väl beprövat protokoll för anrikning av elbilar som genereras av axeniskt odlad Msm, en avirulent mycobacterium.

Trots att avirulenta mykobakterier kodar för flera patogena proteinortologer saknar de dock flera vaccinantigener/patogena proteinepitoper som är nödvändiga för att förbereda immunsystemet tillräckligt för skydd33. Därför utforskade vi också att konstruera och berika rekombinanta EV av Msm genom molekylär ingenjörskonst, så att en betydande del av alla patogena proteiner av intresse som uttrycks och översätts i Msm, måste nå sina EVs. Vår hypotes var att ett eller flera av de 10 vanligaste proteinerna i Msm EV när de smälts samman med proteinet av intresse kommer att hjälpa till med en sådan translokation.

Medan vi började standardisera anrikningen av mykobakteriella EV (mEV) i vårt laboratorium, rapporterade Prados-Rosales et al. 2011 först visualisering och anrikning av mEV in vitro30. Senare, 2014, publicerade samma grupp en modifierad version av sin metod34 från 2011. År 2015 rapporterade Lee et al. också en oberoende standardiserad metod för mEV-anrikning igen från axeniska kulturer av mykobakterier35. Genom att kombinera båda protokollen 34,35 och införliva några av våra modifieringar efter grundlig standardisering, beskriver vi här ett protokoll som hjälper till att rutinmässigt berika mEV från axeniska kulturer av mykobakterier36.

Här beskriver vi särskilt anrikningen av MSM-specifika EVs, vilket är en förlängning av ett publicerat protokoll36 för anrikning av mykobakteriella EVs i allmänhet. Vi beskriver också hur man konstruerar rekombinanta mEVs (R-mEVs) som innehåller mCherry-proteinet (som en röd fluorescerande reporter) och EsxA (Esat-6)37,38,39, en dominerande immunogen och en potentiell subenhetsvaccinogen av Mycobacterium tuberculosis. Protokollet för att berika R-mEV:erna förblir identiskt med det vi har beskrivit för att berika inhemska EV:er från Msm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillväxtbetingelser för Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli och deras derivat

  1. Media
    1. Middlebrook 7H9 flytande buljong
      1. Bered 20 % Tween-80 stamlösning genom att förvärma erforderlig volym dubbeldestillerat vatten (ddw) i en glasbägare till ~45-50 oC i mikrovågsugn, tillsätt erforderlig volym Tween-80 med hjälp av en lämplig mätcylinder och rör om kontinuerligt på en liten magnetomrörare för att få 20 % Tween-80 till en jämn lösning. Filtrera 20 % Tween-80 genom ett 0,22 um avfallsfilter och förvara den blekgula stamlösningen vid 4 °C.
        OBS: Alla spår av Tween-80 i mätcylindern måste överföras till bägaren för korrekt slutkoncentration. Autoklavera inte det förberedda Tween-80-materialet. Filter (använd 0,22 μM), sterilisera och förvara vid 4 °C.
      2. Följ tillverkarens instruktioner för beredning av 7H9-buljongen. Slamma upp 4,7 g 7H9-pulver i 900 ml ddw. Tillsätt 2 ml glycerol, blanda innehållet och autoklav vid 121 °C, 15 psi i 20 minuter.
        OBS: Tillsätt inte Middlebrook ADC-berikning (ADC) och Tween-80 före autoklavering.
      3. När det autoklaverade mediet har svalnat till rumstemperatur (RT, dvs. ~25 oC) tillsätts aseptiskt 10x 10x original med 100 ml ADC (slutlig 1x) och 2,5 ml (slutlig 0,05 %) av 20 % Tween-80 i ett standardbiosäkerhetsskåp av A2-typ. Filtrera blandningen genom en 0,22 μm engångsfilterenhet och förvara den mycket ljust gulgröna, genomskinliga stamlösningen vid 4 °C.
        OBS: Mediets pH måste vara ~6.6 till 6.8 (om <6.4 eller >7.0, kassera och gör nytt). Förvaras vid 4 °C (stabilt i 3-4 veckor). Vi rekommenderar starkt att du filtrerar 7H9-mediet (efter tillsats av ADC och Tween-80) två gånger genom två oberoende 0,22 μm engångsfilterenheter.
    2. Sautons flytande buljong (minimala medier)
      1. Lös upp L-asparagin (0,4 % vikt/volym) och citronsyra (0,2 % vikt/volym) i 950 ml ddw. Tillsätt 1 ml vardera av nyberedda 1 000 x buljonger (i ddw) av dibasiskt kaliumfosfat (färglöst; buljong 10 g/20 ml; slutlig 1x 0,5 g/L); magnesiumsulfatheptahydrat (färglös; stam 10 g/20 ml; slutlig 1x 0,5 g/l); och järn(III)ammoniumcitrat (mycket ljusbrunt; buljong 1,6 g/40 ml; slutlig 1x 0,04 g/l) och rör om väl i en magnetomrörare.
        OBS: I bästa fall kan 1 000x aktierna vara 2 veckor gamla; Om du är äldre än så, förbered färska lager; förvara dem på RT i mörker (t.ex. i ett skåp/hylla). Om järnammoniumcitratet är mörkbrunt, kassera det och gör det färskt. Det är bäst att tillsätta de tre salterna i den ordning som nämns i steg 1.1.2.1. Snurra lösningen varje gång innan du tillsätter varje saltlösning.
      2. Mät och notera pH med hjälp av en pH-mätare; Se till att det är runt 3.1 till 3.2. Om pH-värdet är högre än 3,7, kassera buljongen och förbered den på nytt. För att justera pH-värdet till 7,4, använd så många droppar 10 N natriumhydroxid som krävs. Övervaka det slutliga pH-värdet under kontinuerlig omrörning av lösningen/mediet på en magnetomrörare.
      3. Tillsätt 4,76 ml glycerol, 0,25 ml 20 % Tween-80 (slutlig 0,005 %, se även anmärkning för steg 2.2.1.3) och fyll sedan på volymen till 1 l. Sterilisera sedan två gånger 1 L medium med två separata 0.22 μm avfallsfilter. Förvara det klara, färglösa mediet vid 4 °C (stabilt i 2 veckor).
        OBS: Först efter att pH har justerats till 7.4, tillsätt glycerol. Annars blir materialet grumligt vitt. Om det är grumligt, kassera det (försök inte värma det) och förbered det färskt. För alla mEV-preparat, använd nyberedda Sauton's.
    3. Middlebrook 7H11 agarbas
      1. Följ tillverkarens instruktioner för förberedelser. Suspend 19 g 7H11-pulver i 900 ml ddw. Tillsätt 5 ml glycerol, snurra på en magnetomrörare för att få en jämn suspension (ljusgrön; pH 6,6 till 6,8; om >7.2, kassera och bered ny) och autoklav vid 121 °C, 15 psi och i 20 minuter.
        Lägg inte till ADC och 0,05 % interpolering av 80 före autoklavering.
      2. När mediet svalnar till ~50 °C, aseptiskt i ett biosäkerhetsskåp av A2-typ, tillsätt 100 ml ADC (bringat till RT) och 2,5 ml 20 % (slutlig 0,05 %) Tween-80 (bringat till RT). Fördela omedelbart aseptiskt i petriskålar.
        OBS: Plattorna är stabila vid 4 oC i minst 4-6 veckor. Se till att plattorna är på RT över natten innan du slår in plattorna för förvaring i 4 oC. Annars kommer fukt att fastna i plattorna under inkubationen vid 37 °C.
    4. Mjölnare Luria Bertani (LB) buljong och agarbas
      1. Följ tillverkarens instruktioner för förberedelser. För att förbereda LB-buljong, suspendera 25 g pulver i 1 000 ml ddw och rör försiktigt i 5 minuter i en glasbägare på en magnetomrörare. Vid jämn suspension, fördela de erforderliga volymerna i mediaflaskor (t.ex. 300 ml i en 500 ml mediaflaska) och autoklav. För att bereda LB Agar, suspendera 40 g pulver i 1 000 ml ddw och autoklav (12 g pulver i 300 ml ddw i en 500 ml glasmediaflaska).
  2. Förutsättningar för tillväxt
    OBS: Alla steg i bakterieodlingsarbetet måste utföras i ett biosäkerhetsskåp (typ A2). Alla kulturer måste bearbetas med sterila rör, kolvar och pipettspetsar.
    1. Dag 1
      1. Tillsätt 1 ml vardera av glycerolbuljongen av Msm (från -80 o C frys) till 2 x 10 ml (i 50 ml sterila koniska centrifugerade rör) av nyligen autoklaverade, kylda och förvärmda (~37 o C) 7H9 buljong, snurra tre gånger, stäng locken och inkubera rören över natten vid 37 oC och 200-220 rpm (inkubatorskak).
        OBS: För att odla Mycobacterium tuberculosis (Mtb), följ liknande steg men inkubera 50 ml-rören i 4-6 dagar vid 37 oC och 120-150 rpm (inkubatorskakare) i BSL3-inställningar. Följ ALLA internationella riktlinjer och biosäkerhetspraxis för BSL3- och riskgrupp 3-patogener vid hantering och kassering av Mtb och dess kulturer. Använd biosäkerhetsskåp av B2-typ för hantering av Mtb och dess kulturer.
    2. Dag 2
      1. När OD 600 (A600 nm; celldensitetsmätare) når ~1,0, centrifugera MSM-kulturerna i 10 minuter vid 3200 × g och RT (bänkcentrifug). Kassera supernatanterna med sterila 1 ml pipettspetsar.
        OBS: Ovanstående steg förblir detsamma för Mtb-kulturer, förutom att antalet dagar är 4-7. Var noga med att inte röra vid bakteriepelleten med pipettspetsen.
      2. Tvätta: Tillsätt 1 ml förvärmd Sautons (vid RT) media till varje Msm-pellets (vid RT) (steg 1.1.2) och återsuspendera försiktigt med 1 ml pipettspetsar för att få en jämn suspension. Använd sterila pipettspetsar och fyll volymerna till 10 ml (i varje) med samma media. Centrifugera suspensionerna i 10 minuter vid 3 200 × g och RT och kassera supernatanterna. Upprepa detta steg en gång till.
        OBS: Ovanstående steg förblir detsamma för Mtb-kulturer.
      3. Återsuspendera de två gånger tvättade MSM-cellerna i 20 ml (vardera) förvärmda Sautons (förvärmda i en platt- eller skakinkubator) och mät cellernas optiska densitet vid 600 nm. Inokulera erforderlig volym MSM-kulturer i sterila 1 l Erlenmeyerkolvar som innehåller ~330 ml sterila Sauton, så att den slutliga OD600 är ~0,05.
        OBS: Omblandningar måste alltid börja i en liten volym. Om den slutliga volymen tillsätts direkt till pelleten som ett enda steg, cellerna kommer att förbli som diffusa pellets (en indikator på dålig omblandning). Det enda sättet att lösa problemet är att skruva ner kulturerna och göra om omsuspensionen enligt rekommendationerna. Ovanstående steg är detsamma för MTB-kulturer.
    3. Dag 2/3
      1. Inkubera 330 ml kulturen i inkubatorns skakapparat vid 200 varv per minut och 37 °C tills odlingen OD600 når ~0,3. Tvätta sedan cellerna en gång (liknande steg 1.2.2.2 men med samma volym) och återsuspendera sedan pelleten i samma volym. Fördela 50 ml av de återsuspenderade kulturerna i sex sterila 1 l sterila Erlenmeyerkolvar, som var och en innehåller 280 ml sterila förvärmda Sauton's med 1/10av normalt använda (0,05 %) Tween-80, dvs. 0,005 % (se även anmärkning till steg 2.2.1.3. för att förstå varför 1/10th). Slutvärdet för OD600 måste vara ca 0,05.
        OBS: För Mtb-kulturer, istället för Erlenmeyer-kolvar, använd rullflaskor (med 1/2/4 L kapacitet). Justera odlingsvolymen per flaska så att kulturen inte når flaskans mynning när den förvaras på rullapparaten. Den faktiska volymen i rullflaskan beror på rullflaskans kapacitet.
      2. Inkubera var och en av de 330 ml kulturerna i inkubatorns skakapparat vid 200 varv per minut och 37 °C tills OD600 når 2,0 till 2,5 (~15–18 timmar).
        OBS: För Mtb-kulturer, se till att den slutliga OD600 är ~1.0-1.2 (tar ~5-8 dagar).

2. Anrikning av MSM-mEV genom användning av densitetsgradientcentrifugering

  1. Dag 4
    1. Centrifugera ~2 L av MSM-kulturer i mitten av exponentialstadiet i 6 x 400 ml sterila centrifugflaskor vid 4 °C i 20 minuter vid ~8 000 × g (golvcentrifug). Samla upp den förbrukade supernatanten i två förkylda, autoklaverade 1 l Erlenmeyerkolvar och lagra en alikvot av pelleten för eventuella analysmetoder (t.ex. SDS-PAGE och western blotting – beskrivs inte här).
      OBS: Alla efterföljande steg måste utföras i kyla (~ 4 °C) för att bättre bibehålla integriteten hos mEV:erna. MEV:erna är ganska stabila vid RT men kylning är ett måste för långsiktig stabilitet (upprepad frysning och upptining rekommenderas inte). Under axenisk kulturtillväxt disassocieras mEVs från ytan av Msm/Mtb och ackumuleras i kulturens supernatant/förbrukade media.
    2. Filtrera Msm-kulturens supernatant först genom 0,45 μm bortskaffningsfilterenheter och sedan genom 0,22 μm bortskaffningsfilterenheter för att avlägsna alla spår av bakterier.
      OBS: Direkt filtrering genom 0.22 μm-filtren kväver ofta filterenheterna (eftersom bakteriepelleten kan störas när du utför steg 2.1.1.). För att generera supernatanter från Mtb-kulturer, utför tre filtreringar av Mtb-kulturer (dvs. det första filtreringssteget med en 0,45 μm engångsfilterenhet; två på varandra följande filtreringssteg med 0,22 μm engångsfilterenheter) innan odlingsfiltraten flyttas till BSL-2-inställningar.
  2. Dag 4/5
    1. Använd 30 kDa membrankoncentratorer för att koncentrera Msm-kulturfiltratet (~2 L) ner till ~ 38 ml genom att centrifugera odlingsfiltratet vid 4 °C, 20 minuter och vid 3 200 × g.
      1. Förtvätta koncentratorerna först med steril, kall ddw (~15 ml) (tvätta vid 4 oC, 5 min och vid 3 200 × g).
      2. Tvätta med ~15 ml förfiltrerad, kall Sauton's (samma förhållanden som för vatten (2.2.1.1.)) för att ta bort alla spår av kemikalier (som används under tillverkningen).
      3. Eftersom ~130 centricons (om endast en användning) tekniskt krävs för att koncentrera ~2 L kulturfiltrat, återanvänd centricons minst 3-4 gånger om det behövs. Följ dessa steg: koncentrera 15 ml till 0,5 till 1,0 ml (följ steg 2.2.1), överför koncentratet till ett rent, autoklaverat och kallt 38 ml ultracentrifugrör och överför sedan det återstående okoncentrerade kulturfiltratet till de använda centrikonerna för upprepad koncentration.
        OBS: Att använda 24, 30 kDa koncentratorer för att koncentrera 2 L odlingsfiltrat tar upp till 6 timmar. När kulturfiltratet koncentreras koncentreras även Tween-80 och kan blockera koncentratorn. Att använda Tween-80 till 0,005 % final (i stället för 0,05 %) i Sautons media hjälper till att förhindra denna blockering. Den minskade koncentrationen av Tween-80 påverkar inte den enhetliga suspensionen av Msm under tillväxten och orsakar inte klumpning av Msm-celler. Men eftersom Mtb-celler klumpar ihop sig vid 0,005 % Tween-80 ska du använda 0,05 % Tween-80 för Mtb-specifika elbilar.
    2. Överför det koncentrerade Msm-kulturfiltratet (~38 ml) till ett rent, tvättat (med ddw) och förkylt 40–50 ml polypropencentrifugrör och utsätt det för en tvåstegscentrifugering, först vid 4 000 × g och sedan vid 15 000 × g, båda stegen vid 4 °C i 20 minuter (för att avlägsna allt skräp). Använd en centrifug av golvtyp för detsamma.
  3. Dag 5/6
    1. Överför supernatanten till en förkyld 38,5 ml ultracentrifugrör av polypropen och centrifugera den i en ultracentrifug vid 100 000 × g i 4 timmar vid 4 °C.
      OBS: En svängskopa fungerar bäst vid denna hastighet. Se till att fylla ultracentrifugröret till brädden och ha ett balansultracentrifugrör med motsvarande vikt. Om något av rören har fastnat på svängskopan efter centrifugering (vilket händer på grund av kondens), ta försiktigt bort det från rotorn med en pincett. Att torka bort den kondenserade fukten som finns på ultracentrifugens yttre yta före ultracentrifugering förhindrar att den fastnar.
    2. Spara supernatanten i en 50 ml förkyld tub (se anmärkning). Vänd upp och ner på ultracentrifugröret på ett nytt luddfritt absorberande papper för att ta bort spår av supernatanten. Återsuspendera pelleten i 600 μl HEPES-buffertlösning (50 mM HEPES och 150 mM NaCl, pH 7,4; filtersterilisera före användning).
      OBS: Spara supernatanten endast som en säkerhetskopia. Den inhemska mEV-pelleten ser ut som en geléliknande, 5-7 mm diameter, matt grågul till genomskinlig fläck. Om ingen pellet är synlig, upprepa steg 2.3.1 genom att återanvända den sparade supernatanten. Om ingen pellet visas efter att ha upprepat steg 2.3.1, kassera och starta om från steg 1.2. Pelleten tar tid att återuppta. Det rekommenderas att tillsätta HEPES-bufferten och lämna den över natten vid 4 °C för enkel omblandning. Blanda försiktigt men med upprepad pipettering (använd P200-spetsar för bättre omblandning) tills den är jämnt omblandad.
  4. Dag 6
    1. Utsätt den återsuspenderade pelleten för "jodixanol"-baserad densitetsgradientcentrifugering.
      1. Lägg den återsuspenderade pelleten i botten av 13 ml ren, tvättad (med ddw) och förkyld ultraklar ultracentrifugrör av polypropen och blanda försiktigt (använd 1 ml pipett) med ~4 ml inert densitetsgradient "jodixanol"-lösning (kommersiellt tillgänglig som en ~60 % w/v lösning). Efter skiktning av den återsuspenderade pelleten i botten av röret (till maximalt 5 ml), täck sedan med 1 ml (vikt/volym) vardera av 40 %, 30 %, 20 % och 10 % understammar av "jodixanol" i respektive ordning (förbered delstockar (med HEPES-buffert) från 60 % lager). Tillsätt sedan 4 ml 6 % undermaterial (framställt av 60 % buljong med HEPES-buffert) i toppen för att fylla röret.
        OBS: Förbered gradienten strax före användning; Förvara och använd aldrig.
      2. Väg försiktigt (utan att skaka), rör i en glasbägare och överför det försiktigt till den svängande skoprotorn.
        OBS: Vägning är nödvändig för att balansera med ett dummyrör (även vägt).
      3. Utsätt den för ultracentrifugering vid 141 000 × g i 16 timmar vid 4 °C.
  5. Dag 7
    1. Ta försiktigt bort röret (se anmärkning till steg 2.3.1) och samla upp 1 ml fraktioner i nyautoklaverade mikrocentrifugrör. var uppmärksam på de 4:e till 6:e fraktionerna, som vanligtvis innehåller Msm mEVs.
      OBS: MEV:erna från dessa fraktioner fraktioneras normalt i tre eller fyra mEV-band (ett är huvudbandet) som är matt vita till färgen. R-mEV:erna som innehåller mCherry-fraktioner ut i 5:e till 7:e fraktionerna och ser mörklila till magentafärgade ut. Mtb EVs fraktioneras vanligtvis i 5:e till 7:e fraktionerna. Separationen av mEV:erna i gradienten beror på vilken gradientkoncentration som används och hur väl gradienten är skiktad. Om mEV spricker delvis kan de fraktioneras ut i tidigare fraktioner. Alternativt, om pelleten som erhålls efter steg 2.3.2 inte återsuspenderas väl, bildar vesiklarna täta mikropellets som fraktioneras ut som senare fraktioner. Vi rekommenderar exakt insamling av fraktionerna endast när användaren vill utvärdera vilken av 1 ml-fraktionerna som innehåller mEV. Användare kanske vill dela upp i mindre eller större fraktioner beroende på deras bekvämlighet. När vi använder dem för vissa tillämpningar, till exempel testar dem som en potentiell subenhetsvaccinbooster till BCG, begränsar vi vår insamling av mEV till mindre än 250 μL av fraktionerna (där mEV fraktionerar) så att vi specifikt kan samla in endast mEV-banden och bearbeta enligt 2.7.5. Detta hjälper till att mer effektivt ta bort alla spår av jodixanol som kan störa vägen för våra nedströmsexperiment.
  6. Dag 8
    1. Slå samman de fraktioner som innehåller mEVs, späd med HEPES-buffert till 38 ml och upprepa ultracentrifugeringen vid 4 °C i 16 timmar vid 100 000 × g. Återsuspendera pelleten (som i steg 2.3.2 med samma försiktighetsåtgärder) antingen i HEPES-buffert eller i någon buffert som nedströmsexperiment (inte detaljerad här) såsom proteinuppskattning, nanospårningsanalyser, negativ färgning, transmissionselektronmikroskopi, western blotting och immun-guldmärkning kräver.
      OBS: För bättre resuspension, sonikera mEV-innehållande röret i 10 minuter med hjälp av en ultraljudsvattenbad sonikator. Ultraljudsbehandling under en längre tid kan initiera bristning och förlust av intakta mEV. Om den är väl upphängd är ultraljudsbehandling onödig. Alla steg från 2,1 till 2,6 är identiska samtidigt som de berikar Mtb-genererade elbilar.

3. Konstruktion och anrikning av rekombinanta mEV.

OBS: Ett av de 10 vanligaste proteinerna (identifierat med masspektrometri) i Msm EV är Cfp-2930. Med tanke på dess ringa storlek (29 kDa), enkla sekundära struktur 40, lokalisering till membranet41 och benägenhet att utsöndras i förbrukade medier i axenkulturer (t.ex. som ett odlingsfiltratprotein; utsöndrat av både Msm och Mtb42,43, har det här utnyttjats för att leverera en röd fluorescerande reporter och ett protein av intresse (EsxAMtb) till mEVs. För att uppnå detta

  1. Använd lämpliga framåt- och bakåtprimrar (tabell 1; kompatibla för att klonas direkt till en skyttelvektor såsom pMV261) för att amplifiera cfp-29 från Msm. Med ~50 ng högmolekylvikt (~>20 kb) Msm genomiskt DNA som mall, PCR-amplifierar cfp-29-genfragmentet med ett högupplöst korrekturläsnings-DNA-polymeras (som Phusion eller Q5). Följ tillverkarens rekommendationer för PCR.
    OBS: Designa nödvändiga restriktionsställen i primers för enkel kloning till någon alternativ skyttelvektor av intresse. PCR-förhållanden och volym kommer att variera beroende på vilken typ och märke av korrekturläsning av DNA-polymeras som används. Reaktionsmixens volym kommer att variera beroende på mängden DNA-mall och mängden korrekturläsning av DNA-polymeras. Följ tillverkarens rekommendationer för PCR-förhållanden, framgång med amplifiering och eliminering av icke-specifik glödgning av primers.
  2. PCR: rena den eluerade ampliconen med valfri kommersiellt tillgänglig PCR-reningssats och verifiera amplicons längd med standardagarosgelelektrofores. Smält den renade amplikonen.
    1. Uppskatta mängden renat amplikon på en spektrofotometer. Använd minst 2 μg cfp-29 amplikon för matsmältning.
    2. Smält först med BstB1 vid 65 °C i 1 timme (typ och mängd av buffert och enzym enligt tillverkarens rekommendationer), sänk reaktionstemperaturen till RT och smält sedan med HindIII i 1 timme vid 37 °C (typ och mängd av buffert och enzym enligt tillverkarens rekommendationer).
    3. PCR renar och eluerar det upplösta amplikonet i 50 μl autoklaverad nukleasfri ddw.
    4. Uppskatta koncentrationen och utbytet av den upplösta amplikonen med hjälp av en spektrofotometer. Förvaras vid -20 °C tills ligeringen är inställd. OBS: Efter PCR, kontrollera amplikonlängden (~798 + 50 bp) och utbytet genom elektrofores 10 μL av PCR-reaktionsblandningen på en 1% agarosgel. Även om dubbel nedbrytning inte är möjlig med denna kombination av enzymer, kommer en kompatibel buffert att förhindra upprepad PCR-rening och efterföljande förlust av smält amplicon. Koncentrationen av uppspjälkad amplikon varierar med det kit som används för PCR-rening. Det varierar också med längden (i bp) på eventuella alternativa vektorer.
  3. Använd de framåt- och bakåtriktade primrarna (tabell 1), ett korrekturläsande DNA-polymeras och ~50 ng av Mtb genomiskt DNA, PCR amplifierar esxA- eller esxA-3X FLAG-taggspecifik amplikon. Använd ~5 ng lämpligt plasmid-DNA för att PCR-amplifiera mCherry. Plasmid- och sekvensinformation finns i tilläggsfil 1.
    OBS: Använd en glycin-, glycin-, glycin-, glycin-, serin-44,45(G4S)-länk mellan cfp-29 och mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; innan starten av mCherry hjälper G4S-länkaren mCherry att inte genomgå falska icke-funktionella veck (inklusive de som drivs av Cfp-29). Se cfp-29, hsp60-promotor, mCherry och esxA-sekvenser i kompletterande File 1. Plasmider som fungerar som mallar för mCherry finns tillgängliga på olika plasmidförråd/banker. Olika versioner (något förändrade sekvenser) av mCherry finns tillgängliga som kommer att kräva ändrade framåt- och bakåtsekvenser. Primers (tabell 1) hjälper till att förstärka mCherry som nämns i tilläggsfil 1. Fusion av N-terminalen av mCherry/esxA/esxA::3XFLAG till C-terminaländen av Cfp-29 fungerar bra.
  4. Smält 1 μg DNA från mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-amplikonerna och rena smält DNA.
    1. Dubbelsmält varje amplikon med HindIII och HpaI i 1 timme vid 37 °C (eller enligt tillverkarens rekommendationer).
    2. Använd en kommersiellt tillgänglig PCR-reningssats och tillverkarens rekommendationer för rening av den uppklarade amplikonen. Eluera den upplösta amplikonen i 50 μl autoklaverad nukleasfri ddw.
    3. Uppskatta koncentrationen och utbytet av den upplösta amplikonen med hjälp av en spektrofotometer. Förvaras vid -20 °C tills ligeringen är inställd.
  5. Digest 2 μg pMV261-KanR (tilläggsfil 1) eller en lämplig kloningsvektor med valfritt enzym.
    1. Smält först med BstB1 vid 65 °C i 1 timme (typ och mängd av buffert och enzym enligt tillverkarens rekommendationer), sänk reaktionstemperaturen till RT och smält sedan med HindIII i 1 timme vid 37 °C (typ och mängd av buffert och enzym enligt tillverkarens rekommendationer).
    2. Gelen renas och elueras i 50 μL autoklaverad nukleasfri ddw.
    3. Uppskatta koncentrationen och utbytet av den upplösta vektorn med hjälp av en spektrofotometer. Förvaras vid -20 °C tills ligeringen är inställd.
      OBS: Enstegs kloning med två fragment är möjlig med ovanstående primers för pMV261. Alla alternativa skyttelvektorer som överlever som en episom kommer att fungera. Integrativa plasmider kommer också att fungera, men utbytet av rekombinanta proteiner kommer att vara relativt mindre per cellbas.
  6. Ligate och omvandla till en kompatibel stam av E. coli.
    1. För ligering, använd 125 ng av vektorn. Använd lämpligt smälta mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-amplikoner vid ett molförhållande på 1:3. Utför ligering över natten med T4 DNA-ligas (mängd enligt tillverkarens rekommendationer) vid 16 °C i ett kylt cirkulerande vattenbad.
      OBS: Använd lämpliga kontroller, t.ex. vektor, endast med och utan T4 DNA-ligas för att utvärdera matsmältningens effektivitet och förutsäga effektiviteten av kloningsframgång.
    2. Omvandling
      1. Tina upp NEB5α kemiskt kompetenta cellalikvoter (~100 μL per omvandling) på is i 15 min. Blanda försiktigt två gånger med en steril pipettspets. Tillsätt ligeringsblandningen (upp till 20 μL) till de kalla kompetenta cellerna.
      2. Blanda försiktigt pipettceller + ligerat DNA. Inkubera blandningen på is i ytterligare 30 minuter.
      3. Ge värmechock vid 42 °C (i ett cirkulerande vattenbad) i 60 sekunder och överför omedelbart tillbaka till is i ytterligare 15 minuter.
      4. Återvinn de transformerade cellerna genom att tillsätta 1 ml av SOC-buljongen (2 % trypton, 0,5 % jästextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 och 20 mM glukos) och inkubera vid 37 °C i 1 timme vid 200 rpm.
      5. Snurra ner de återvunna bakterierna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör (3000 × g, RT och 10 min), kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 200 μL sterilt, förvärmt, nyberett LB-media och sprid suspensionen på nyhällda LB Miller-agarplattor som innehåller erforderlig antibiotika i lämpliga koncentrationer.
      6. Inkubera petriskålarna i en tallriksinkubator som är förinställd på 37 °C.
  7. Screena (ej detaljerat här) för potentiella kloner, verifiera (med koloni-PCR-/restriktionsenzymer-baserade)46 och sekvensera (Sanger-sekvensering) dem för att bekräfta fusion.
  8. Extrahera plasmid-DNA (~200 ng/1-2 μL; alla kommersiellt tillgängliga kit) från den bekräftade klonen (E. coli-bakgrund ) och omvandla det till nybildade elektrokompetenta celler av Msm.
  9. Beredning av MSM elektrokompetenta celler
    1. Nyodla Msm (som i steg 1.2.1 och 1.2.2). Tvätta den nyodlade Msm på samma sätt som i steg 1.3.3 och 1.3.4 (förutom att använda 7H9 + ADC + Tween-80 (fyllig) i stället för Sauton's).
    2. Tillsätt en alikvot av de tvättade MSM-cellerna till en slutlig OD 600 på ~0,05 i en steril500 ml Erlenmeyerkolv innehållande 150 ml rikt media.
    3. Inkubera i inkubatorskak vid 200 varv per minut och 37 °C tills kulturen OD600 når ~0,8 till 1,0 (~12-14 timmar).
    4. Överför kulturen till en förkyld 400 ml centrifugflaska och inkubera på is i 60-90 min. Pelletera sedan cellerna vid 4 °C i 15 minuter vid 4 000 × g.
    5. Tvätta cellerna två gånger (tvätta med 150 ml vardera, vid 4 000 × g, 4 °C och 15 minuter) med iskall steril (autoklaverad) 10 % glycerol.
      OBS: Vid varje tvätt lossnar pelletsen. Var försiktig när du kasserar hela supernatanten (efter varje tvätt). Annars kommer majoriteten av cellerna att gå förlorade i den kasserade supernatanten.
    6. Tvätta cellerna en gång till med 75 ml iskall steril 10 % glycerol som innehåller 0,005 % Tween-80.
    7. Återsuspendera cellpelleten i 7,5 ml 10 % glycerol med 0,005 % Tween-80 och alikvot i 400 μL alikvoter
      OBS: Även om Msm elektrokompetenta celler är kompetenta i minst 4 månader, ger nyberedda elektrokompetenta celler de bästa resultaten. När man använder gamla kompetenta celler visas några icke-rosa kolonier (vita) som falska transformanter. Ju äldre de kompetenta cellerna är, desto fler är de vita kolonierna.
  10. Omvandling av Msm
    1. Tina upp MSM-kompetenta celler alikvot på is.
      OBS: Upptining vid RT och omvandling av sådana celler ger mindre effektivitet.
    2. Tillsätt 1-2 μL plasmid-DNA (~200 ng totalt) till de kalla kompetenta cellerna, blanda försiktigt med en 1 ml steril pipettspets och överför till en förkyld steril 2 mm elektroporeringskyvett.
    3. Överför den stängda kyvetten med Msm-kompetenta celler + plasmid-DNA-blandning till elctroporatorns mus, stäng locket försiktigt och applicera en puls (exponentiell sönderfallstyp) vid 2,5 kV (spänning), 25 μF (kapacitans) och 1000 Ω (resistans).
    4. Tillsätt omedelbart 1 ml förvärmt sterilt rikt (7H9 + ADC + Tween-80) medium till kyvetten, blanda försiktigt med en 1 ml steril pipettspets och överför hela innehållet till ett 10 ml sterilt rör.
    5. Inkubera innehållet i 3 timmar i en inkubatorskakapparat inställd på 37 °C och 200 varv per minut. Centrifugera innehållet i ett mikrocentrifugrör (4 000 × g, RT och 10 min), kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 200 μl sterilt förvärmt riktmedium och sprid suspensionen på nyhällda 7H11 agarplattor innehållande ADC, Tween-80 och erforderlig antibiotika i lämpliga koncentrationer.
      OBS: För Msm, vid behov, använd hygromycin, kanamycin och apramycin i de slutliga koncentrationerna 50 μg/ml, 25 μg/ml respektive 50 μg/ml. Msm i sig är INTE resistent mot dessa antibiotika. Använd endast dessa antibiotika när du använder plasmider med lämpliga resistenta gener för selektion/tillväxt av transformanter/rekombinanta MSM-kolonier.
    6. Inkubera petriskålarna i en tallriksinkubator som är förinställd på 37 °C. Vanligtvis uppträder transformanter mellan 3-5 dagar.
      OBS: Om ett protein av intresse är giftigt för Msm kan transformanterna dyka upp senare eller utebli. I sådana fall klonar du trunkerade versioner av hela längden.
    7. Gör glycerollager av de framväxande MSM-kolonierna efter att ha verifierat om det finns positiva kloner (samma som steg 3.7)
  11. För att berika R-mEVs som innehåller antingen mCherry- eller EsxA-proteiner, odla först R-Msm som uttrycker antingen mCherry eller exsA eller esxA::3X FLAG genom att följa steg 1.2.1 till 1.2.3 och följ sedan steg 2.1 till 2.6. för att berika R-mEV:er. R-mEV:erna eluerar till 4:e-7:e fraktionerna efter densitetsgradientspinn (steg 2.5). R-mEVs-pelleten efter det första ultracentrifugeringssteget (2.3.1). Efter att ha utfört identiskt med steg 2.3.1, kontrollera att R-mEV:erna är synliga som en mörklila till magenta 5-7 mm diameter pellet längst ner i mitten av ultracentrifugen.
  12. Utför västerländska analyser47 (ej detaljerat här) för att detektera protein(er) av intresse inom de anrikade R-mEV:erna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi använder M. smegmatis (Msm) som modell mykobakterie för att demonstrera anrikning av både nativa och rekombinanta mEV (R-mEV). Detta schematiskt sammanfattade mEV-anrikningsprotokoll (figur 1) fungerar också för anrikning av R-mEV av Msm och nativa EV av Mtb (med mindre modifieringar som i protokollanteckningar från 1.2). Visualisering av de anrikade mEV:erna kräver negativ färgning av dem under ett transmissionselektronmikroskop36 (figur 2A). Vanligtvis separeras Msm-specifika EV:er i 4:e-6:e 1 ml-fraktionerna av 13 ml 6-60 % densitetsgradient (figur 2B). Cirka 80-100 μg proteinekvivalenter av EV erhålls rutinmässigt från 2 L mellanlogaritmiska axenkulturer av Msm. Deras diametrar varierar vanligtvis mellan 20 nm och 250 nm (figur 2C).

Ett långsiktigt mål för vårt laboratorium är att utvärdera om mEV från olika mykobakterier potentiellt skulle kunna fungera som en subenhetsbooster till det befintliga vaccinet, BCG. Eftersom anrikning av mEV som genereras av patogena bakterier är tidskrävande, riskabelt och dyrt, kan det fungera som ett lämpligt alternativ att utnyttja nativa och rekombinanta EV från avirulenta mykobakterier. Därför strävar vi efter att inte bara standardisera protokollet för att berika mEV:erna för Msm utan också att konstruera och berika dess R-mEV:er.

För att konstruera R-mEVs valde vi först ut de 10 vanligaste proteinerna i Msm EVs (tabell 1; vi identifierade dem från detaljerade masspektrometrianalyser av Msm EVs)30. Vår hypotes var att om ett främmande protein av intresse är translationellt sammansmält med något av dem, borde det kunna lokaliseras till mEV. Sedan listade vi Cfp-29 bland de 10 eftersom det är det minsta av dem (~29 kDa), är membranlokaliserat och är ett odlingsfiltratprotein med en relativt enkel sekundärstruktur40,41,42,43. Vi fusionerade translationellt mCherrys (fluorescerande protein) N-terminala ände till C-terminaländen av Cfp-29 och utvärderade dess laddning/leverans till mEVs. En del av de berikade mEV:erna av Msm blev rosa (Figur 3), vilket indikerar Cfp-29:s förmåga att bära ett främmande protein av intresse till Msm EVs.

Med tanke på denna förmåga hos Cfp-29 (figur 3) utvärderade vi sedan EsxA (Esat-6), ett viktigt immunogent protein37,38,39 som levereras till MSM EVs. Återigen genererade vi två oberoende translationella fusioner till C-terminalen för Cfp-29-endast EsxA och EsxA + 3X FLAG-taggen (3X FLAG smält till C-terminalen av EsxA. Som förväntat observerade vi Mtb:s EsxA i MSM-elbilar (körfält 5, 6 och 10, figur 4A,B), om än i små mängder. Intressant nog var Cfp-29::EsxA::3XFLAG mycket stabilare (banorna 3 och 4 plus 8 och 9; Figur 4A) och ackumuleras på högre nivåer i mEV (körfält 3 och 4 plus 8 och 9; Figur 4B). Sammanfattningsvis demonstrerar vi design, konstruktion och anrikning av R-mEVs som innehåller ett främmande protein av intresse (Figur 3 och Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av mykobakteriell extracellulär vesikelberikning. "Dagar" (i rött teckensnitt, överst i figuren) avser de dagar som krävs för att berika mEV:erna från Msm (specifikt för protokollsteg 1 och 2). "Steg" (i svart teckensnitt, längst ner i figuren) hänvisar till protokollstegen som beskrivs i protokollavsnittet. För anrikning av mEV från Mtb, även om alla steg är likartade, tar det minst 10 dagar för de olika stegen i odlingen (steg 1) till det första steget i centrifugeringen (steg 2). Efterföljande steg kräver identisk varaktighet (som anges i rött teckensnitt). Före densitetsgradienten ser mEVs pellet + extracellulära komplex färglösa ut när de berikar både inhemska mEVs och R-mEVs. Det skulle dock se rosa till blått ut (se figur 3) vid anrikning av mEV som innehåller mCherry. Efter densitetsgradienten skulle mEV:erna visas vita (native och R-mEVs) eller rosa (om de innehåller mCherry) i densitetsgradientröret. Färgerna på mEV:er i figuren är endast till för att indikera tydlighet och representerar inte de exakta färgerna. Se figur 3 för mer klarhet. Förkortningar: Msm = M. smegmatis; Mtb = M. tuberculosis; 0,45 och 0,22 μm = avfallsfilterenheternas porstorlek. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Mykobakteriella EV är cirkulära, koncentrerade med densitetsgradienter och varierar i dimensioner . (A) En representativ bild av MSM EV vid visualisering med negativ färgning och visning under ett transmissionselektronmikroskop. Skalstapel = 200 nm. (B) En representativ bild av hur mEV uppträder i ultracentrifugröret vid utförande av en gradient på 6-60 % densitet. Om gradienten på 6-60 % inte är korrekt skiktad, kan placeringen av de större (övre öppna pilarna) och mindre (nedre öppna pilen) banden för mEV ändras avsevärt, vilket ändrar 1 ml bråktal. (C) En representativ bild vid nanospårningsanalys av anrikade mEV av Msm. Nanotracking-analyser avslöjar proportionerna och koncentrationerna av mEV av olika storlek och det totala antalet mEV i preparatet. I genomsnitt, med protokollet som beskrivs här, är ~1-3 × 1010 elbilar berikade från 2 L Msm och Mtb. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Olika steg som indikerar anrikning av mEV som uttrycker mCherry. (A) Representativ bild som visar Msm axenisk kultur som uttrycker Cfp-29::mCherry. (B) Representativ bild av den bakteriella pelleten efter centrifugering av axenodling av Msm som uttrycker Cfp-29::mCherry. (C) Representativ bild av kulturfiltratkoncentrat erhållet efter koncentration av förbrukade medier av Msm axenisk kultur som uttrycker Cfp-29::mCherry genom centricon-koncentratorer. (D) Representativ bild av mEV + extracellulära komplex pellet efter ultracentrifugering av odlingsfiltratkoncentrat erhållet från Msm axenisk kultur som uttrycker Cfp-29::mCherry. Pelleten skulle dock förbli färglös om mEV skulle vara antingen naturligt eller rekombinant (vid fusion till Cfp-29) för något främmande protein utom mCherry. (E) Representativa bilder av mCherry som innehåller mEV. Observera att inte alla mEV:er är rosa, vilket indikerar att inte alla mEV:er innehåller Cfp-29. Bra: En representativ bild som indikerar olika band av mEV:er som vanligtvis erhålls efter anrikning för Cfp-29::mCherry EVs. Eftersom elbilar som innehåller mCherry är tätare separeras de i senare fraktioner. Dålig: En representativ bild som indikerar dålig separation (de vita mEV:erna separeras ut i den första/andra fraktionen och de mCherry-innehållande mEV:erna separeras ut i den 10:e fraktionen (möjligen på grund av dålig resuspension av mEV-pellets, dvs. protokollsteg 2.3.2). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Rekombinanta mEV innehållande EsxA (ESAT-6), en Mtb-kodad immunogen i Msm totalcelllysat och Msm-genererade EVs. (A) Coomassie gel och (B) västerländska analysbilder (påvisade med ESAT6-specifik polyklonal antikropp) som visar ackumuleringen av fusionerade ExsA i både Msm totalt celllysat och mEV som uttrycker antingen cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, banorna 3 och 4 (totalt lysat) och banorna 8 och 9 (mEVs)) eller cfp-29:: esxA (- 3XFLAG, körfält 5 och 6 (totalt lysat) och körfält 10 (mEV)). Öppna och fyllda pilar anger ackumulerad Cfp-29::ExsA::3XFLAG respektive Cfp-29::ExsA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Grundfärger:
Sl # Gen Abc-bok Sekvens (5' till 3') Källa Att klona till
1 GFP-29 Framåt CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC Msm genomiskt DNA pMV261
Omvända GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG Msm genomiskt DNA pMV261
2 mCherry Framåt GAAAAGCTT(HindIII) ggcggcggtgtctcg (G4S linker)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG Labb samling pMV261
Omvända TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC Labb samling pMV261
3 esxA Framåt GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcgggtctcg (G4S-länkare) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb genomiskt DNA pMV261
Omvända TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 Mtb genomiskt DNA pMV261
4 exsA-3X FLAGGA Framåt GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcgggtctcg (G4S-länkare) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb genomiskt DNA pMV261
Omvända TGTGTTAAC(HpaI)TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 Mtb genomiskt DNA pMV261

Tabell 1: Primersekvenser. Framåt- och bakåtprimers för att förstärka cfp-29, mCherry, esxA och esxA::3X FLAG och kloning till skyttelvektorn pMV261 är listade.

Tilläggsfil 1: A: pMV261, dess cirkulära karta, huvuddrag och kompletta nukleotidsekvens. Gul highlight-hsp60 promotornukleotidsekvens; Gröna och cyan högdagerbegränsningsplatser till vilka mCherry, esxA och esxA::3X FLAG-amplikoner klonades. B, C och D: Nukleotidsekvenser av cfp-29, mCherry respektive esxA. Grön highlight-stop-kodon av cfp-29, mCherry och esxA. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom det fortfarande är en formidabel utmaning att utveckla ett nytt tuberkulosvaccin som är överlägset och kan ersätta BCG, strävar flera grupper som ett alternativ efter upptäckten av olika subenhetsvacciner mot tuberkulos som kan öka BCG:s styrka och förlänga dess skyddstid48,49. Med tanke på den ökande uppmärksamheten på bakteriella EV (bEVs) som potentiella subenheter och som naturliga adjuvans50,51, har konsekvent anrikning av tillräckliga mängder mEV för deras nedströmstestning/analys blivit ett viktigt steg. Det är med hänsyn till dessa forskningsfrågor som detta protokoll syftar till att berika mEV från axeniska kulturer och deras rekombinanta versioner.

Under detaljerade masspektrometriska proteomanalyser av MSM EV identifierade Prados-Rosales et al. de 10 vanligaste proteinerna30. Vi antog vidare att vid tillräcklig molekylär ingenjörskonst borde en av dem vara tillräcklig för att bära ett främmande protein av intresse in i mEV. Intressant nog framstod Cfp-29 som det bästa möjliga alternativet på grund av dess olika funktioner 39,40,41,42. Våra data visar verkligen att det är tillräckligt för att bära mCherry och EsxA (även om EsxA krävde en liten tagg vid sin C-terminal för att vara mer stabil) och ackumulera dem i mEV:erna. Nyligen, 2021, visade Tang et al. att Cfp-29 är ett inkapslingsmedel med förmågan att bära peroxidaser av färgämnesavfärgningsperoxidas (DyP)-typ40. Kanske kan Cfp-29 också bära på andra främmande proteiner.

Vi utforskade EsxA eftersom det är en framträdande Mtb-immunogen 37,38,39, kan vara skyddande som ett subenhetsvaccin i djurmodell37,38,39, är liten i storlek; och dess ortolog (MSMEG_0066) är intressant nog frånvarande i Msm EVs. Även om vi inte diskuterar detta här, har vi framgångsrikt genererat R-mEVs för några andra Mtb-proteiner (unikt närvarande i Mtb och inte kodade av Msm), inklusive Antigen 85B (Rv 1886c). Samtidigt, intressant nog, misslyckades vi också med att generera R-mEV för några andra, inklusive fullängds-Rv2660c och Rv0288, möjligen för att proteinerna är giftiga för Msm. Vi drar slutsatsen att det beror på att inga transformanter av Msm uppstod, trots att de klonade de korrekta nukleotidsekvenserna och utförde upprepade transformationer. Eftersom EsxA krävde en 3XFLAG-tagg vid dess C-ände, för bättre ackumulering i mEVs, lade vi till en 3XFLAG-tagg till alla andra Mtb-kodade proteiner som vi utvärderade. Trots taggen överlevde inte Msm, vilket tyder på att vissa Mtb-proteiner förblir giftiga trots taggfusionen. Vi spekulerar i att det i dessa fall kan löna sig att klona bara de förutspådda epitopregionerna eller sy ihop flera epitoper (för närvarande under utvärdering i vårt laboratorium). Vi använde en liten länk mellan Cfp-29 och mCherry/EsxA för att minimera den negativa påverkan på veckningen av proteinet av intresse44,45. Vi förutspår att utan denna länkare skulle proteinet av intresse veckning vara starkt påverkat av Cfp-29-veckning.

Detta anrikningsprotokoll kan enkelt utökas till berikning av Mtb-genererade elbilar. Vi spekulerar också i att det också borde vara möjligt att berika mEV från mykobakterier i miljön med detta protokoll. Trots att protokollet är enkelt och okomplicerat tar det fortfarande 7-8 dagar att berika Msm-genererade elbilar och R-mEV:er. Däremot tar det 15-20 dagar för berikning av Mtb-genererade elbilar. Att koncentrera elbilar till en mindre volym är tidskrävande och dyrt, och vi undersöker för närvarande tangentiell flödesfiltrering och andra metoder för att lösa "tidsproblemet".

Slutligen använder vi Sautons och inte 7H9 för att anrika mEV eftersom "ADC"-tillskottet innehåller stora mängder bovint serumalbumin som kan störa eventuell nedströms användning av mEV. Detta protokoll kan enkelt utökas till alla andra specifika medier (t.ex. media med låg järnhalt) som måste användas för att utvärdera mEV:s sammansättning. Alternativt, för vissa tillämpningar, i det sista steget (dvs. protokollsteg 2.7.5), kan man i stället för HEPES-buffert använda steril koksaltlösning vid injektion av denna i möss eller marsvin för olika in vivo-baserade analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare förklarar att detta forskningsarbete utfördes i avsaknad av några kommersiella eller finansiella relationer/intressen som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Författarna tackar uppriktigt Prof. Sarah M. Fortune för att hon vänligen delade med sig av M. smegmatis mc2155 lager. De tackar också Servier Medical Art (smart.servier.com) för att ha tillhandahållit några grundläggande element för figur 1. De tackar uppriktigt för stödet från resten av laboratoriemedlemmarna för deras patientjusteringar under den långa användningen av inkubatorskakarna, centrifugerna och ultracentrifugerna för mEV-anrikning. De tackar också Surjeet Yadav, laboratorieassistenten, för att han alltid såg till att de nödvändiga glasen och förbrukningsvarorna alltid var tillgängliga och till hands. Slutligen tackar de THSTI:s administrativa, inköps- och ekonomiteam för deras ständiga stöd och hjälp med ett smidigt genomförande av projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium - Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 202 Extracellulära vesiklar rekombinanta vesiklar Esat-6 mykobakterier ExsA mCherry Cfp-29 bakterier

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

Anrikning av naturliga och rekombinanta extracellulära vesiklar av mykobakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter