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Box-Behnken Response Surface Method와 결합된 CRITIC 기반 Tiebangchui with Zanba의 처리 기술 최적화

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65139
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 2, 2
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

본 프로토콜은 Box-Behnken 반응 표면 방법과 결합된 CRITIC을 사용하여 잔바 볶음 Tiebangchui에 대한 효율적이고 표준적인 해독 처리 방법을 설명합니다.

Abstract

중국어로 Tiebangchui(TBC)라고 불리는 Aconitum pendulum Busch.의 말린 뿌리는 가장 유명한 티베트 의약품 중 하나입니다. 중국 북서부에서 널리 사용되는 허브입니다. 그러나 TBC의 강렬한 독성과 치료 및 독성 용량이 유사하기 때문에 많은 중독 사례가 발생했습니다. 따라서 독성을 줄이기위한 안전하고 효과적인 방법을 찾는 것이 시급한 과제입니다. 티베트 의학 고전을 검색하면 잔바 볶음 TBC의 가공 방법이 "칭하이 성 티베트 의학 가공 사양 (2010)"에 기록되어 있음을 알 수 있습니다. 그러나 특정 처리 매개 변수는 아직 명확하지 않습니다. 따라서 본 연구는 잔바 볶음 TBC의 가공 기술을 최적화하고 표준화하는 것을 목표로 한다.

먼저, TBC의 슬라이스 두께, 잔바의 양, 가공 온도 및 시간의 4가지 요인에 대해 단일 요인 실험을 수행했습니다. 잔바 볶음 TBC의 모노에스테르 및 디에스테르 알칼로이드 함량을 지표로 하여 Box-Behnken 반응 표면 방법과 결합된 CRITIC을 사용하여 잔바 볶음 TBC의 가공 기술을 최적화했습니다. 잔바 볶음 TBC의 최적화된 가공 조건은 TBC 슬라이스 두께 2cm, TBC보다 3배 더 많은 잔바, 처리 온도 125°C, 볶음 60분이었다. 본 연구는 잔바 볶음 TBC의 사용을 위한 최적화된 표준 처리 조건을 결정하여 잔바 볶음 TBC의 안전한 임상 사용 및 산업 생산을 위한 실험 기반을 제공했습니다.

Introduction

가장 유명한 티베트 의약품 중 하나인 Aconitum pendulum Busch와 A. flavum Hand.-Mazz.의 말린 뿌리는 중국어 1,2로 Tiebangchui(TBC)라고 합니다. TBC의 말린 뿌리는 추위와 바람을 쫓아내고 통증을 줄이며 충격을 진정시키는 데 도움이 됩니다. TBC의 말린 뿌리가 류마티스 관절염, 타박상 및 기타 감기 질환 치료에 일반적으로 사용된다는 내용의 "중화 인민 공화국 보건부 의약품 기준 (티베트 의학)"의 첫 번째 권에 기록되어 있습니다3. 그러나 TBC의 임상적 치료 용량은 독성 용량과 유사하며, 부적절한 사용으로 인한 중독 또는 사망 사고가 빈번하게 보고되고 있다4. 따라서 TBC의 독성을 줄이고 효능을 보존하는 것은 수년에 걸쳐 연구 핫스팟이 되었습니다.

티베트 의학에서 가공은 TBC의 독성을 약화시키는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다. "칭하이 성 티베트 의학의 가공 사양 (2010)"에 따르면, 원래 허브 (TBC)는 철 냄비에 넣고 잔바가 노랗게 변할 때까지 잔바와 함께 볶은 다음 잔바를 제거하고 허브를 공기 중에서 건조시켜야합니다 5,6. 그러나 특정 공정 매개변수가 문서화되지 않아 잔바 볶음 TBC의 가공 기술과 품질을 제어하기가 어렵습니다. CRITIC 방법은 퍼지화와 주관성을 피하고 계량7의 객관성을 향상시킬 수 있는 객관적인 중량 방법입니다. Box-Behnken 반응 곡면 방법은 다항식 피팅(8)을 통해 각 요인 간의 교호작용을 직접 반영할 수 있다. Box-Behnken 응답 표면과 CRITIC 방법의 조합은 최적화된 처리 프로토콜(9, 10)을 획득하기 위해 처리 기술을 최적화하는 데 일반적으로 사용됩니다. 본 논문에서는 모노에스테르-디테르페노이드 알칼로이드(MDA)(벤조일아코니틴)와 2개의 디에스테르-디테르페노이드 알칼로이드(DDA)(아코니틴, 3-데옥시아코니틴)를 평가 지표로 사용하였다. Box-Behnken 반응 표면 분석법과 결합된 CRITIC을 적용하여 잔바 볶음 TBC의 처리 기술을 최적화하고 임상적으로 안전한 사용을 위한 표준 처리 방법을 확립했습니다.

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Protocol

잔바 볶음 TBC 처리 방법은 Box-Behnken 응답 표면 방법과 결합된 CRITIC에 의해 최적화되고 표준화되었습니다. 벤조일라코니틴, 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴을 이 과정에서 평가 지표로 사용했습니다.

1. 시료 용액 준비

  1. 표준물질 원액을 준비한다. 전자 분석 저울에서 벤조일라코니틴 9.94mg, 아코니틴 8.49mg 및 3-데옥시아코니틴 6.25mg(재료 표)의 무게를 정확히 측정하여 10mL 용량 플라스크에 넣습니다. 그런 다음 0.05% 염산 메탄올 용액을 첨가하여 고형물을 용해시키고 부피를 10mL로 구성합니다. 마지막으로 혼합물을 잘 흔들어 질량 농도가 0.9940mg/mL 벤조일아코니틴, 0.8490mg/mL 아코니틴 및 0.6250mg/mL의 3-데옥시아코니틴인 표준물질 원액을 얻습니다.
    주의: 염산은 부식성이 강한 물질입니다11. 장갑, 실험복, 고글 및 흄 후드와 같은 적절한 보호 장치를 사용하십시오.
  2. 테스트 샘플 용액을 준비합니다.
    1. 원뿔형 플라스크에 잔바 볶음 TBC 분말 2g의 무게를 잰다.
      1. TBC 30g(2cm)과 잔바 90g의 무게를 달아 예열된 볶음 기계에 넣어 잔바 볶음 TBC를 준비합니다. 볶음기의 시간과 온도를 각각 40분 과 140°C로 설정합니다. 기기가 처리를 완료하도록 설정합니다.
      2. 고속 분쇄기를 사용하여 잔바 볶음 TBC를 50메쉬(0.355mm) 체를 통과할 수 있는 분말 샘플로 별도로 분쇄합니다.
    2. 암모니아 용액 3mL와 이소프로필 알코올과 에틸 아세테이트 혼합 용액 50mL(1:1 v/v 비율)를 이전 연구12,13을 기반으로 위의 원추형 플라스크에 추가합니다.
      알림: 암모니아 용액을 준비하려면 40mL의 농축 암모니아 용액을 100mL 용량 플라스크에 넣고 측정 라인에 정제수를 채웁니다. 농축 암모니아 용액을 사용할 때는 냄새가 강하므로 적절한 보호 조치를 취하십시오.
    3. 위의 샘플과 원추형 플라스크의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다. 30 분 동안 초음파를 사용합니다 (전압 : 220V, 주파수 : 40kHz).
      참고: 아코니틴 알칼로이드는 열에 의해 쉽게 분해됩니다. 따라서 초음파 추출 온도는 25 °C 미만이어야합니다.
    4. 초음파 추출 후 샘플과 원추형 플라스크의 무게를 잰다.
    5. 이소프로필 알코올과 에틸 아세테이트(1:1 v/v 비율)의 혼합물을 추가하여 손실된 체중을 보충합니다.
    6. 샘플 용액을 필터링합니다. 여과액 25 mL를 40°C에서 회전 증발기를 사용하여 건조시켜 증발시킨다.
    7. 잔류물을 0.05% 염산 메탄올 용액 5mL를 가하여 용해시키고, 용액을 0.2μm 주사기 필터로 여과한 후, 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 분석하였다.
  3. 0.1988mg/mL 벤조일아코니틴, 0.0509mg/mL 아코니틴 및 0.0938mg/mL 3-데옥시아코니틴을 포함하는 혼합 참조 용액을 준비합니다.
    참고: 각 표준물질(벤조일아코니틴 0.9940mg, 아코니틴 0.2545mg, 3-데옥시아코니틴 0.4690mg)을 용해 매질로 0.05% 염산 메탄올에 5mL 부피 플라스크에 용해합니다.
  4. 초순수 2L(이동상 A)에 아세트산암모늄 6.16g(재료 표)을 용해시켜 0.04M 아세트산암모늄 완충액을 준비합니다. 암모니아를 사용하여 pH를 8.50으로 조정합니다.
    주의 : 암모니아는 유해 물질입니다. 장갑, 실험복, 고글 및 흄 후드와 같은 적절한 보호 장치를 사용하십시오.
  5. 초순수 100% 아세토니트릴(이동상 B) 2L를 여과하고 탈기합니다.
    주의 : 아세토니트릴은 유해 물질입니다13. 장갑, 실험복, 고글 및 흄 후드와 같은 적절한 보호 장치를 사용하십시오.

2. 크로마토그래피 조건

  1. 전처리된 샘플 용액 10μL을 바이너리 펌프가 있는 HPLC 시스템에 주입합니다. MDA 및 DDA 분리를 위해 이동상 A 및 B가 있는 ODS-3 컬럼(5μm x 4.6mm x 250mm, 30°C에서 작동)을 사용하는 HPLC 시스템을 사용합니다. 기술 복제를 위해 각 샘플을 세 번 주입합니다.
  2. ODS-3 컬럼에 대해 표 1 과 같이 방법을 프로그래밍합니다. 유속 을 1.0mL/분 으로, 검출 파장 을 235nm로 설정합니다.
  3. 모든 표적 화합물의 피크 면적을 기록합니다.
    알림: 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 찾을 수 있습니다.

3. 시스템 적응성 테스트

참고: 크로마토그래피 조건에 대해서는 섹션 2를 참조하여 3.1-3.5단계를 수행하십시오.

  1. 농도와 피크 면적 사이의 선형 관계를 조사합니다.
    1. 다양한 농도(19.88, 39.76, 59.64, 159.04, 198.80 및 497.00μg/mL)의 벤조일아코니틴 용액을 준비합니다.
    2. 다양한 농도(8.49, 16.98, 25.47, 33.96, 50.94 및 169.80μg/mL)의 아코니틴 용액을 준비합니다.
    3. 1.875, 12.50, 37.50, 62.50, 93.75 및 125.00μg/mL의 다양한 농도의 3-데옥시아코니틴 용액을 준비합니다.
    4. 낮은 질량 농도에서 높은 질량 농도까지 위의 기준 용액을 주입하고 피크 면적을 기록합니다.
    5. 피크 면적에 대한 기준 용액 농도(μg/L)의 플롯에서 3개의 선형 회귀 방정식을 구합니다.
      알림: 벤조일아코니틴, 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴의 농도가 이 표준 곡선의 선형 범위 내에 있는지 확인하십시오.
  2. 샘플 용액 10μL을 6회 반복 주입하여 정밀 테스트를 수행하고 섹션 2에 설명된 것과 동일한 HPLC 조건에서 샘플을 실행합니다. 벤조일아코니틴, 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴의 피크 면적을 기록합니다.
  3. 제조된 시료 용액 10μL를 주입하여 안정성 시험 실험을 수행하고 0시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 후의 피크 면적을 확인합니다.
    참고: 피크 영역은 참조된 HPLC 시스템에 의해 자동으로 기록됩니다. 이러한 시점은 관련 문헌15,16,17에 기초하였다.
  4. 재현성 시험을 수행하여, 동일한 배치의 잔바 볶음 TBC를 취하여 1.2 단계의 방법에 따라 6개의 시험 시료 용액을 병렬로 제조하였다. 각 샘플 10μL을 HPLC 시스템에 주입하고 섹션 2에 설명된 대로 샘플을 실행합니다.
    참고: 재현성은 6개 샘플 간의 농도 차이를 비교하여 평가되었습니다.
  5. 테스트 용액을 위해 동일한 배치의 Zanba 볶음 TBC의 6개 부분을 준비하여 회수 실험을 수행합니다. 그런 다음 각 인덱스 성분의 기준 물질의 ~100%를 테스트 용액의 6개 부분에 추가하여 회수율을 계산합니다. 이 샘플(10μL)을 섹션 2에 설명된 것과 동일한 조건에서 HPLC 시스템에 주입하고 식 (1)을 사용하여 회수율을 계산합니다.
    Equation 1(1개)
    참고: 식 (1)에서, A는 시험액에서 측정할 성분의 양, B는 첨가된 표준물질의 양, C는 표준물질 및 잔바볶음 TBC 샘플이 포함된 용액의 측정값이다.

4. 단일 요인 실험

  1. 슬라이스 두께 비교
    1. TBC의 두께가 각각 0.5, 1, 2, 3 및 4cm 인 30g의 TBC로 5 개의 테스트 그룹을 준비하십시오. TBC (90g)의 3 배에 달하는 잔바의 무게를 잰다.
      참고: TBC는 독성이 있습니다. 장갑, 실험복, 고글, 흄 후드와 같은 적절한 보호 장치를 사용하고 절단 과정에서 주의하십시오. 사전 실험을 통해 TBC와 잔바의 완전한 접촉을 위해 잔바의 3 배의 양이 필요하다는 것을 알 수있었습니다. 따라서 공식적인 실험 설계에서 연구는 슬라이스 두께를 검사 할 때 잔바의 양을 3 배로 선택했습니다.
    2. 자동 볶음 기계의 온도와 시간을 각각 140°C 와 40분으로 설정합니다.
    3. 자동 볶음 기계가 설정 온도까지 가열된 후 ~30g의 TBC와 90g의 Zanba를 기계에 추가합니다.
    4. 1.2단계에 따라 샘플 솔루션을 준비합니다. 표준 곡선에 따라 서로 다른 가공 제품에서 MDA 및 DDA의 함량을 계산합니다(표 2). 섹션 6의 CRITIC 방법을 통해 결과를 기반으로 종합 점수를 계산합니다.
    5. 이러한 방식으로 조건 최적화를 위해 잔바의 양과 처리 온도 및 시간을 비교합니다.
  2. 잔바의 양 비교
    1. 잔바의 양은 각각 TBC의 1, 2, 3, 4 및 5 배인 30g의 TBC (2cm)로 5 개의 테스트 그룹을 수행합니다.
    2. 처리를 위해 볶음 기계를 켭니다. 볶음기의 시간과 온도를 40분 및 140°C로 설정합니다.
    3. 1.2단계에 따라 샘플 솔루션을 준비합니다. 표준 곡선에 따라 서로 다른 가공 제품에서 MDA 및 DDA의 함량을 계산합니다(표 2). 섹션 6의 CRITIC 방법을 통해 결과를 기반으로 종합 점수를 계산합니다.
  3. 가공 온도 비교
    1. 각각 30g의 TBC(2cm)와 90g의 잔바를 사용하여 5개의 테스트 그룹을 수행합니다.
    2. 처리를 위해 볶음 기계를 켭니다. 처리 온도를 100°C, 120°C, 140°C, 160°C, 180°C로 설정합니다. 처리 시간을 40분으로 설정합니다.
      참고 : 사전 실험을 통해 처리 온도가 100 °C 미만일 때 잔바 황변 속도가 매우 낮고 온도가 너무 높으면 잔바가 타서 검게 변하기 쉽다는 것을 발견했습니다 (180 °C 이상). 따라서, 100°C와 180°C를 각각 가공시 온도의 최소값과 최대값으로 설정하였다.
    3. 1.2단계에 따라 샘플 솔루션을 준비합니다. MDA 및 DDA의 피크 영역을 기록합니다. 표준 곡선에 따라 서로 다른 가공 제품에서 MDA 및 DDA의 함량을 계산합니다(표 2). 섹션 6의 CRITIC 방법을 통해 결과를 기반으로 종합 점수를 계산합니다.
      참고: 실험은 160°C 및 180°C의 고온을 포함합니다. 실험실의 안전 코드에 따라 실험 중 안전에주의하십시오.
  4. 처리 시간 비교
    1. 각각 30g의 TBC(2cm)와 90g의 잔바를 사용하여 5개의 테스트 그룹을 수행합니다.
    2. 처리를 위해 볶음 기계를 켭니다. 처리 시간을 20분, 40분, 60분, 80분, 100분으로 설정합니다. 온도를 140°C로 설정합니다.
    3. 샘플 용액을 준비하려면 1.2단계의 설명에 따라 사용하십시오. MDA 및 DDA의 피크 영역을 기록합니다. 표준 곡선에 따라 다양한 가공 제품에서 MDA 및 DDA의 품질을 계산합니다(표 2). 섹션 6의 CRITIC 방법을 통해 결과를 기반으로 종합 점수를 계산합니다.

5. 반응 표면 방법론(RSM)을 이용한 잔바 볶음 TBC의 가공 기술 최적화

  1. Box-Behnken 반응 표면 설계
    1. 슬라이스 두께의 범위(A, 1-3 cm), 잔바의 양(B, 2-4x), 처리 온도(C, 100-140°C) 및 처리 시간(D, 40-80분)을 단일 요인 테스트(단계 4.1-4.4)를 사용한 예비 실험으로 결정합니다.
      참고: 4개 변수의 코드화된 값과 해당 수준은 표 3에 나와 있습니다. 각 변수의 세 가지 수준은 -1, 0 및 1로 코딩되었습니다.
  2. 소프트웨어를 사용하여 행렬을 생성하고 반응 표면 모델을 분석합니다.
    참고: 소프트웨어 사용에 대한 스크린샷은 보충 파일 1에 나와 있습니다.
    1. 24개의 실험으로 구성된 3-수준 4-요인 Box-Behnken 설계를 사용하고(이 연구에서와 같이) 5번의 반복실험(런 순서 1, 9, 14, 16, 25)을 측정하여 제곱의 순수 오차합을 계산합니다(표 4). 종합 점수(Y)를 응답으로 설정합니다(1-4단계, 보충 파일 1).
      1. 홈 페이지에서 새 설계(1단계, 보충 파일 1)를 클릭하고 설계 페이지의 왼쪽 패널에서 응답 표면 | Box-Behnken 및 표에 있는 네 가지 요소의 매개 변수를 설정합니다(2단계, 보충 파일 1).
      2. 다음(2단계, 보충 파일 1)을 클릭하고 응답 이름을 설정한 후 마침(3단계, 보충 파일 1)을 클릭합니다.
      3. 위의 작업을 통해 반응 표면 설계를 생성합니다(4단계, 보충 파일 1).
  3. 반응 표면에 대해 설계된 29개의 시나리오를 기반으로 실험을 완료합니다.
  4. 1.2단계에 따라 샘플 솔루션을 준비합니다.
  5. MDA 및 DDA의 피크 영역을 기록합니다.
    참고: 피크 영역은 참조된 HPLC 시스템에 의해 자동으로 기록됩니다.
  6. 다양한 가공 제품에서 MDA 및 DDA의 품질을 계산합니다.
  7. 6단계의 CRITIC 방법을 통해 결과를 기반으로 종합 점수를 계산합니다.
    참고: 특정 방법은 6단계에 설명되어 있습니다.
  8. 29번의 시도에서 얻은 종합 점수를 컴퓨터에 입력하고 참조된 소프트웨어를 사용하여 분석합니다(5단계, 보충 파일 1).
  9. 소프트웨어를 통해 다항식 방정식의 통계적 검증과 3D 모델 그래프에 표시된 반응 표면 해석을 수행합니다(6-8단계, 보충 파일 1).
    1. 왼쪽 탐색 창의 분석(+)에서 Y를 클릭한 다음 구성 창에서 분석 시작을 클릭합니다(6단계, 추가 파일 1).
    2. 상단 메뉴에서 ANOVA 를 클릭하고 분산 분석을 표시하는 결과 테이블을 관찰합니다(7단계, 보충 파일 1).
    3. 상단 메뉴에서 모델 그래프를 클릭한 다음 3D 표면을 클릭하여 합성 점수에 대한 처리 매개변수의 효과를 반영하는 응답 표면 플롯을 얻습니다(8단계, 보충 파일 1).
  10. 예측 된 최적 조건 (단계 9, 보충 파일 1) 하에서 반응 표면 모델의 검증을 3 회 수행하여 처리 기술의 안정성을 검증합니다. 왼쪽 Navigation( 탐색 ) 창의 Optimization( 최적화)에서 Numerical(숫자 )을 클릭한 다음 상단 메뉴에서 Solutions(솔루션)를 클릭합니다. 예측된 최적 조건을 관찰합니다.

6. 모델 평가

참고: 이 단계는 각 단일 요인 실험 또는 반응 표면 실험이 완료된 후에 수행해야 합니다. 각 실험(예: 슬라이스 두께 비교)이 완료된 후 1.2단계 및 섹션 2에 따라 서로 다른 샘플의 MDA 및 DDA 함량을 측정하여 5개의 데이터 세트를 얻습니다. 데이터는 보충표 S1에 나와 있습니다.

  1. 인덱스의 무차원 처리
    참고: 이 단계에서는 측정값(XIJ)을 무차원 상대 값으로 변환하여 각 지수의 값이 동일한 수량 수준에 있도록 합니다. 이 작업은 다른 단위 또는 크기18의 지표를 포괄적으로 분석하고 비교하는 것을 용이하게 할 수 있습니다. 설명을 위해 슬라이스 두께 값이 아래 표시된 계산에 사용되었습니다(보충 표 S1).
    1. MDA의 내용을 표준화합니다 ( yMDA 획득; MDA는 벤조일아코니틴)을 수식 2의 화학식을 사용하여 의미한다.
      참고: 인덱스 "i"는 네 가지 요소 중 하나를 나타내며 슬라이스 두께는 조사된 첫 번째 요소입니다. 따라서 i의 값은 1과 같습니다. 지수 "j"는 각 요인 수준을 나타냅니다. 따라서 슬라이스 두께가 첫 번째 수준(0.5cm)일 때 j는 1과 같습니다. 슬라이스 두께가 다섯 번째 수준(4cm)인 경우 j는 5와 같습니다. 두께가 0.5, 1, 2, 3 및 4 cm인 처리된 TBC에서 MDA(XIJ)의 함량은 각각 0.9693, 1.0876, 1.3940, 1.4185 및 1.3614 mg/g이었다. 따라서, xj,max는 1.4185이고xj,min은 0.9693이다.
      Equation 2(2개)
      따라서 Equation 3
      여기서,Xij 는 i번째 인자 및 j번째 수준에서 실험의 MDA의 측정된 함량이고; xj, min 은 이 실험 군에서 MDA의 최소 함량이고; xj, max 는 이러한 실험군에서 MDA의 최대 함량이다. 따라서 i = 1, 2, ..., m 및 j = 1, 2, ..., n입니다.
      참고: 따라서 식 (2)를 사용하여 MDA의 표준화된 값은 0.0000, 0.2634, 0.9455, 1.0000 및 0.8729입니다.
    2. DDA의 총 함량을 표준화합니다 (yDDA를 얻습니다. DDAs는 식 (3)의 화학식을 사용하여 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴을 지칭한다.
      참고: i는 네 가지 요인 중 하나이고 j는 요인의 각 수준입니다. Xij는 i번째 인자 및 j번째 수준에서 실험의 DDA의 측정된 함량입니다. xj, min은 이 데이터 그룹 실험에서 DDA의 최소 함량입니다. xj, max는 이 데이터 그룹 실험에서 DDA의 최대 함량입니다. 이런 식으로 i = 1, 2, ..., m 및 j = 1, 2, ..., n입니다. 두께가 0.5, 1, 2, 3 및 4 cm인 처리된 TBC에서 DDA(XIJ)의 함량은 각각 0.3492, 0.2692, 0.2962, 0.5354, 0.5124 mg/g이었다. 따라서, xj,max는 0.5354이고xj,min은 0.2692이다.
      Equation 4(3)
      Equation 5
      참고: 식 (3)을 사용하는 표준화된 값은 0.6995, 1.0000, 0.8986, 0.0000 및 0.0864입니다.
  2. Eqs에 따라 대응하는 콘트라스트 강도(Si), 충돌(δi), 정보(Ci) 및 인덱스 가중치(Wi)를 계산한다. (4) 내지 (7)은 각각19,20이다.
    참고: i = 1, 2, ..., m.yij는 i번째 인자 및 j번째 수준에서 실험의 MDA 또는 DDA 함량의 표준화된 데이터입니다.
    1. 대비 강도를 추정하려면 먼저 평균 MDA 값을 계산합니다.
      Equation 6
      Equation 7 여기서 는 MDA의 평균값입니다.
      Equation 8(4개)
      Equation 21
    2. 충돌 값을 계산하려면 먼저 Excel21의 CORREL 함수를 사용하여 상관 계수γ ij를 추정합니다.
      Equation 9(5개)
      Equation 10
    3. 다음과 같이 정보 값을 계산합니다.
      Equation 11(6개)
      Equation 12
      참고: 유사하게, C1, DDAS = 0.7210
    4. 인덱스 가중치를 다음과 같이 계산합니다.
      Equation 13(7)
      Equation 14
      참고: 따라서 슬라이스 두께와 비교한 MDA 및 DDA의 중량 계수는 각각 0.4945 및 0.5055로 설정되었습니다.
  3. 슬라이스 두께의 종합 점수를 계산합니다.
    Equation 15
    Equation 16
    Equation 17
    Equation 18
    Equation 19
    참고: Y13 은 최대값입니다. 따라서 슬라이싱 두께의 가장 좋은 매개 변수는 세 번째 수준 인 2cm입니다.

   

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Representative Results

이 연구에서 사용된 용출 그래디언트는 반복 디버깅 후 결정된 바와 같이 잔바 볶음 TBC의 세 가지 인덱스 성분에 대해 우수한 분해능을 보였습니다(그림 1). 잔바 볶음 TBC의 세 가지 지표 성분은 특정 농도 범위 내에서 양호한 선형 관계를 가졌다(표 2). 잔바 볶음 TBC의 정밀도(표 5), 안정성(표 6), 반복성(표 7) 및 시료 회수율(표 8)은 모두 중국 약전(Volume 4, 2020)22에 명시된 방법론적 범위 내에 있었으며, 이는 이 방법이 실현 가능함을 나타냅니다. 따라서, HPLC 방법은 잔바 볶음 TBC의 분석을 실시하여 신뢰성이 있었다.

처리 기술에 대한 각 요인의 영향은 단일 요인 테스트를 사용하여 설명되었으며 그 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 다양한 조건에서 잔바 볶음 TBC의 종합 점수 추세를 시각화했습니다. 슬라이스 두께 (A, 1-3 cm), 잔바의 양 (B, 2-4x), 가공 온도 (C, 100-140 °C) 및 처리 시간 (D, 40-80 분)의 범위는 단일 요인 테스트를 사용하여 결정되었습니다 (그림 2).

CRITIC 방법은 측정 데이터19,20을 활용하는 객관적인 평가 방법입니다. 각 지수의 수준이 매우 다른 경우 원래 지수 값을 분석에 직접 사용하면 종합 분석에서 더 높은 값을 가진 지수의 역할이 더 커지고 값이 낮은 지수의 역할이 작아집니다. 따라서 본 연구의 실험값에 적용된 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 원래의 지표 데이터를 표준화해야 합니다. 반응 표면 시험 결과와 CRITIC 방법에 따라 반응 표면 실험에서 MDA와 DDA의 중량 계수는 각각 0.5295와 0.4705로 설정되었다. 종합 점수(Y)는 식 (8)에 따라 계산될 수 있다.

Equation 20(8개)

Box-Behnken 실험 설계의 결과를 표 4에 나타내고 , 표 9 는 분산 분석과 회귀 계수의 결과를 나타낸다. 종합 점수의 다항식 방정식도 소프트웨어 분석 후에 얻었습니다. 0.05 미만의 확률 값은 모델이 유의하다는 것을 시사합니다(p < 0.0001)23; 실제 요인으로 환산한 방정식은 식 (9)에서 구하였다(Y: 종합점수; A: 슬라이싱 두께; B: 잔바의 양; C: 처리 온도; 및 D: 처리 시간). 방정식은 종합 점수에 대한 영향의 강도가 처리 시간 > 처리 온도 > 슬라이스 두께 > 잔바의 양을 네 가지 다른 요인으로 따른다는 것을 나타냅니다.

Y = 89.05 + 4.57 A + 2.88 B + 4.63 C - 4.83 D + 5.19AB + 4.91AC + 6.97AD + 6.69BC - 7.05BD - 1.17CD - 22.80A 2 - 21.93 B 2 - 19.58 C 2 - 27.19D 2 (9)

반응 표면과 등고선도는 그림 3에 나와 있으며, 4개 변수의 함수로 종합 점수의 변화를 보여줍니다. 실험 결과에 기초하여, 잔바 볶음 TBC의 최적 가공 파라미터는 다음과 같이 결정되었다: 슬라이스 두께 2.117cm, TBC보다 잔바의 3.118배 더 많음, 가공 온도 123.106°C, 가공 시간 58.156분. 작업의 타당성에 따라 잔바의 최적 가공 기술을 조정하여 TBC의 최적 슬라이스 두께는 2cm, 잔바의 양은 3배, 가공 온도는 125°C, 처리 시간은 60분이었습니다. 모델의 신뢰성은 얻어진 처리 파라미터에 따라 수행된 세 가지 테스트를 통해 입증되었다(표 10).

Figure 1
그림 1: 크로마토그램. 시료 용액 (A)와 혼합 표준액 (B)의 크로마토그램 (1: 벤조일아코니틴; 2: 아코니틴; 3: 3-데옥시아코니틴). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 모든 단일 요인의 종합 점수. (a) 슬라이스 두께; (b) 잔바의 양; (c) 처리 온도; 및 (D) 처리 시간. 그 결과 잔바 볶음 TBC의 종합 점수는 슬라이스 두께가 2cm, 잔바의 양이 3배, 처리 온도가 120°C, 처리 시간이 60분일 때 가장 높은 것으로 나타났습니다. 따라서 다음 실험을 설계하는 데 사용할 슬라이싱 두께(A, 1-3 cm), 잔바의 양(B, 2-4x), 처리 온도(C, 100-140°C) 및 처리 시간(D, 40-80분)의 범위를 보여주었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 처리 매개변수가 종합 점수에 미치는 영향을 반영하는 반응 표면 플롯(3D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: HPLC 구배. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 잔바 볶음 TBC에서 지수 성분의 선형 관계. 결과는 잔바 볶음 TBC의 세 가지 지수 성분이 특정 농도 범위 내에서 좋은 선형 관계를 가졌음을 시사했습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3: 실험 설계에 대한 변수 수준. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 반응이 있는 Box-Behnken 실험 설계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 정밀 측정 결과. 벤조일라코니틴, 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴의 피크 면적의 상대 표준 편차(RSD) 값은 각각 0.42%, 0.71% 및 2.95%였습니다(n=6). 약어: RSD = 상대 표준 편차. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 6: 안정성 테스트 결과. 벤조일라코니틴, 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴의 피크 면적의 RSD 값은 각각 1.86%, 0.54% 및 2.81%였다(n=6). 약어: RSD = 상대 표준 편차. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 7: 재현성 테스트 결과. 벤조일라코니틴, 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴의 피크 면적의 RSD 값은 각각 1.99%, 1.84% 및 2.41%였다(n=6). 약어: RSD = 상대 표준 편차. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 8: 샘플 회수율 측정. 벤조일라코니틴, 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴의 회수율의 RSD 값은 각각 2.47%, 1.88% 및 2.33%였다. 약어: RSD = 상대 표준 편차. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 9: 실험 모델의 분산 분석(ANOVA) 결과. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 10: 테스트 검증 결과. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: Box-Behnken 디자인 소프트웨어의 지침 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충표 S1: 슬라이스 두께의 계산 결과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

TBC는 감기를 쫓아내고 통증을 완화시키는 효과가 있는 중요한 티베트 약입니다. 그것은 주로 수천 년 동안 중국에서 외상성 부상과 류마티스 관절염을 치료하는 데 사용되었습니다24,25,26. 디테르페노이드 알칼로이드는 TBC27,28,29의 활성 및 독성 성분입니다. TBC의 아코 니툼 알칼로이드의 주요 독성 효과는 신경 독성, 심장 독성 및 위장 독성입니다30,31. TBC는 일반적으로 독성 위험을 완화하기 위해 경구 사용 전에 처리됩니다. 찜, 달인, 모래 튀김과 같은 다양한 가공 방법과 Hezi 달인, Qingke 와인 및 Zanba를 사용한 가공은 TBC의 효능을 유지하면서 독성을 줄이는 데 유용했습니다1. 그 중에서도 잔바 볶음은 중요한 가공 방법입니다. 잔바는 고원 보리 (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f)에서 생산되며, 이는 칭하이 - 티베트 고원32,33에 사는 사람들에게 중요한 곡물입니다. 그러나 잔바 볶음 TBC를 공식화하는 정확한 매개변수는 아직 불분명하기 때문에 품질 관리와 안전한 적용을 보장하기 위해 이 가공 기술을 표준화해야 합니다.

이 방법의 가장 중요한 측면은 평가 지수가 CRITIC 방법으로 결정되었다는 것입니다. 최근 연구에 따르면, 독성이 강한 DDA는 가열 과정에서 중간 정도의 독성을 갖는 MDA로 가수 분해되거나 열분해 될 수 있습니다34,35. 연구에 따르면 벤조일라코닌으로의 아코니틴 가수분해가 전형적인 실시예36이다. 따라서, 가공 공정에서의 조성 변화는 공정 기술 최적화에 대한 평가 지표로 삼았다. CRITIC 방법은 지표의 변동과 지표 간의 충돌을 주로 고려하는 객관적 가중치 방법으로, 각각 표준편차와 상관계수로 표현됩니다. 그것은 중국 전통 의학37,38의 가공에 널리 적용되었습니다. 이 프로토콜에서는 벤조일아코니틴, 아코니틴 및 3-데옥시아코니틴을 포함한 잔바 볶음 TBC의 주성분의 중량을 Zanba-stir-fried TBC의 평가 표준으로 사용한 객관적 할당의 CRITIC 칭량 방법을 사용하여 계산했습니다.

주요 실험 절차 중 하나는 처리 온도가 DDA의 분해에 큰 영향을 미치기 때문에 처리 중에 일정한 처리 온도를 보장하는 것입니다. 그러므로, 사전 실험에는 많은 종류의 가열 장치의 사용이 포함되었습니다., 인덕션 밥솥과 같은, 전기 세라믹 스토브, 다기능 볶음 기계. 다기능 볶음 기계는 일정한 온도를 유지하고 가공 된 제품의 품질을 안정화시킬 수 있습니다.

최적화된 처리 기술이 TBC의 독성을 효과적으로 줄일 수 있지만 여전히 한계가 있습니다. 첫째, 잔바 볶음 TBC의 활성 성분 중 일부는 아직 알려지지 않았습니다. 따라서 관련 참조 제품을 사용할 수 없기 때문에 정성 및 정량 분석을 수행 할 수 없습니다. 목표 품질 관리 구성 요소를 얻기 위해 식물 화학 조사에 더 많은주의를 기울여야합니다. 또한, 생과 잔바 볶음 TBC의 약리학적 비교는 불분명하다. 동물모델에서 해독 및 효능 예약 효과의 평가가 다음 목표가 될 것입니다.

한의학 가공 문화는 주로 마스터에서 견습생으로 전승되며, 가공의 종점은 일반적으로 사람들의 주관적 의식에 의해 판단되며 이는 표준화 된 가공 방법의 수립에 도움이되지 않습니다. 이 연구에서는 디지털 프로세스 매개변수를 사용하여 처리 끝점을 지정하여 현대 기술의 조합을 어느 정도 실현할 수 있습니다. 요약하면, 이 연구는 TBC의 독성 감쇠 및 효능 예약을 위한 잔바 볶음 가공 기술을 표준화했습니다. 이 접근법은 다른 독성 민족 의약품의 가공 기술에 대한 유용한 정보와 지침을 제공 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 82130113), 중국 박사후 과학 재단 (No. 2021MD703800), 쓰촨성 과학 기술부 청소년 과학 재단 (No. 2022NSFSC1449) 및 청두 중국 전통 의학 대학의 "Xinglin Scholars"연구 진흥 프로그램 (No. BSH2021009).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Deoxyaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DST221109-033
Aconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDW000602
Ammonium acetate Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd Chromatographic grade
Benzoylaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDB005502
Design-Expert software Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA version 13.0
Electronic analytical balance Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. FA1004
High performance liquid chromatography SHIMADZU Co., Ltd. LC-20A
High-speed smashing machine Beijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd. FW-100
Millipore filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd φ13 0.22 Nylon66
stir-Fry machine Changzhou Maisi Machinery Co., Ltd Type 5
Tiebangchui Gannan Baicao Biotechnology Development Co., Ltd 20211012
Ultra pure water systemic RephiLe Bioscience, Ltd. Genie G
Ultrasonic cleansing machine Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd SB2200
Zanba 27 Chuanzang Road, Ganzi County -

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References

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의학 제 195 호 Aconitum pendulum Busch. 가공 기술 잔바 볶음 Tiebangchui CRITIC 방법 응답 표면 방법
Box-Behnken Response Surface Method와 결합된 CRITIC 기반 Tiebangchui with Zanba의 처리 기술 최적화
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Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N., Lai, X., Liu, Y., Zhang, Y. Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method. J. Vis. Exp. (195), e65139, doi:10.3791/65139 (2023).

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