Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Optimalisering av prosesseringsteknologi for Tiebangchui med Zanba basert på CRITIC kombinert med Box-Behnken Response Surface Method

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65139
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 2, 2
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv og standard avgiftningsmetode for Zanba-stir-fried Tiebangchui ved bruk av CRITIC kombinert med Box-Behnken responsoverflatemetoden.

Abstract

Den tørkede roten av Aconitum pendel Busch., kalt Tiebangchui (TBC) på kinesisk, er en av de mest berømte tibetanske medisinene. Det er en mye brukt urt i Nordvest-Kina. Imidlertid har mange tilfeller av forgiftning oppstått på grunn av TBCs intense toksisitet og fordi dets terapeutiske og giftige doser er like. Derfor er det en presserende oppgave å finne en sikker og effektiv metode for å redusere toksisiteten. Et søk gjennom de tibetanske medisinklassikerne viser at behandlingsmetoden for TBC-stekt med Zanba ble registrert i "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)". Imidlertid er de spesifikke behandlingsparametrene ennå ikke klare. Dermed har denne studien som mål å optimalisere og standardisere prosesseringsteknologien til Zanba-stir-fried TBC.

Først ble det utført et enkeltfaktoreksperiment på fire faktorer: skivetykkelsen på TBC, mengden Zanba, prosesseringstemperatur og tid. Med monoester og diesteralkaloidinnhold i Zanba-stir-fried TBC som indekser, ble CRITIC kombinert med Box-Behnken-responsoverflatemetoden brukt til å optimalisere prosesseringsteknologien til Zanba-stir-fried TBC. De optimaliserte behandlingsforholdene for Zanba-wokede TBC var en TBC-skivetykkelse på 2 cm, tre ganger mer Zanba enn TBC, en behandlingstemperatur på 125 °C og 60 minutters steking. Denne studien bestemte de optimaliserte og standard behandlingsbetingelsene for bruk av Zanba-stir-fried TBC, og ga dermed et eksperimentelt grunnlag for sikker klinisk bruk og industriell produksjon av Zanba-stir-fried TBC.

Introduction

Den tørkede roten av Aconitum pendel Busch og A. flavum Hand.-Mazz., en av de mest kjente tibetanske medisinene, kalles Tiebangchui (TBC) på kinesisk 1,2. De tørkede røttene til TBC er nyttige for å fjerne kulde og vind, redusere smerte og beroligende sjokk. Det ble registrert i første volum av "Drug Standards (tibetansk medisin) av Helsedepartementet i Folkerepublikken Kina", som sier at de tørkede røttene til TBC ofte brukes til å behandle revmatoid artritt, blåmerker og andre forkjølelsessykdommer3. Imidlertid er den kliniske terapeutiske dosen av TBC lik den toksiske dosen, og tilfeller av forgiftning eller død har blitt hyppig rapportert på grunn av feil bruk4. Derfor har reduksjon av toksisiteten og bevaring av effekten av TBC blitt et forskningspunkt gjennom årene.

I tibetansk medisin er behandling en av de mest effektive metodene for å dempe toksisiteten av TBC. I henhold til "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)" skal de originale urtene (TBC) legges i en jerngryte og stekes med Zanba til Zanba blir gul, hvoretter Zanba fjernes og urtene tørkes i luft 5,6. Imidlertid er det ikke dokumentert noen spesifikke prosessparametere, noe som gjør det vanskelig å kontrollere prosesseringsteknologien og kvaliteten på Zanba-woket TBC. CRITIC-metoden er en objektiv vektmetode som kan unngå fuzzifisering og subjektivitet, og forbedre objektiviteten til veiing7. Box-Behnken-responsoverflatemetoden kan direkte reflektere samspillet mellom hver faktor gjennom polynomtilpasning8. Kombinasjonen av Box-Behnken-responsoverflaten og CRITIC-metoden brukes ofte til å optimalisere prosesseringsteknologi for å skaffe seg den optimaliserte prosesseringsprotokollen 9,10. I denne artikkelen ble et monoester-diterpenoid alkaloid (MDA) (benzoylakonitin) og to diester-diterpenoidalkaloider (DDA) (akonitin, 3-deoksyakonitin) brukt som evalueringsindekser. CRITIC kombinert med Box-Behnken responsoverflatemetoden ble brukt for å optimalisere prosesseringsteknologien til Zanba-stir-fried TBC og etablere en standard prosesseringsmetode for klinisk sikker bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zanba-wokede TBC-prosesseringsmetoden ble optimalisert og standardisert av CRITIC kombinert med Box-Behnken-responsoverflatemetoden. Benzoylakonitin, akonitin og 3-deoksyakonitin ble brukt som evalueringsindekser under denne prosedyren.

1. Klargjøring av prøveløsning

  1. Klargjør referansestoffstamløsningen. Vei nøyaktig 9,94 mg benzoylakonitin, 8,49 mg akonitin og 6,25 mg 3-deoksyakonitin (materialfortegnelse) på en elektronisk analytisk balanse og legg dem i en 10 ml volumetrisk kolbe. Deretter tilsettes 0,05% saltsyremetanoloppløsning for å oppløse de faste stoffene og utgjør volumet til 10 ml. Rist til slutt blandingen godt for å oppnå referansestoffløsningen med massekonsentrasjoner på 0,9940 mg/ml benzoylakonitin, 0,8490 mg/ml akonitin og 0,6250 mg/ml 3-deoksyakonitin.
    FORSIKTIG: Saltsyre er et sterkt etsende materiale11. Bruk riktig beskyttelse, for eksempel hansker, laboratoriefrakk, vernebriller og avtrekkshette.
  2. Forbered testprøveløsningen.
    1. Vei 2 g Zanba-stekt TBC-pulver i en konisk kolbe.
      1. Forbered Zanba-stekt TBC ved å veie 30 g TBC (2 cm) og 90 g Zanba og tilsette dem i den forvarmede stekemaskinen. Sett tid og temperatur på stekemaskinen til henholdsvis 40 min og 140 °C. Still inn maskinen til å fullføre behandlingen.
      2. Bruk en høyhastighets smashing maskin for å male Zanba-stir-fried TBC separat i pulverprøver som kan passere gjennom en 50 mesh (0,355 mm) sil.
    2. Tilsett 3 ml ammoniakkoppløsning og 50 ml av en blandet løsning av isopropylalkohol og etylacetat (et forhold på 1: 1 v / v) i ovennevnte koniske kolbe, basert på tidligere studier12,13.
      MERK: For å klargjøre ammoniakkoppløsningen, tilsett 40 ml konsentrert ammoniakkoppløsning i en 100 ml volumetrisk kolbe og fyll med renset vann til målelinjen. Ta passende beskyttelsesforanstaltninger når du bruker konsentrert ammoniakkløsning, da den har sterk lukt.
    3. Vei ovennevnte prøve og konisk kolbe og registrer vekten. Ultralyd i 30 min (spenning: 220 V, frekvens: 40 kHz).
      MERK: Aconitin alkaloider brytes lett ned ved varme. Dermed må temperaturen på ultralydutvinning være under 25 ° C.
    4. Vei prøven og konisk kolbe etter ultralydutvinning.
    5. Kompenser for den tapte vekten ved å tilsette en blanding av isopropylalkohol og etylacetat (forholdet 1: 1 v / v).
    6. Filtrere eksempelløsningen. Fordamp 25 ml av filtratet til tørrhet ved hjelp av en roterende fordamper ved 40 °C.
    7. Løs opp resten ved å tilsette 5 ml 0,05% saltsyremetanolløsning, filtrer løsningen gjennom et 0,2 μm sprøytefilter og analyser det ved å utføre væskekromatografi (HPLC) med høy ytelse.
  3. Lag en blandet referanseløsning som inneholder 0,1988 mg/ml benzoylakonitin, 0,0509 mg/ml akonitin og 0,0938 mg/ml 3-deoksyakonitin.
    MERK: Hver standard (0,9940 mg benzoylakonitin, 0,2545 mg akonitin og 0,4690 mg 3-deoksyakonitin) oppløses i en 5 ml volumetrisk kolbe i 0,05% saltsyremetanol som oppløsningsmedium.
  4. Klargjør 0,04 M ammoniumacetatbuffer ved å oppløse 6,16 g ammoniumacetat (materialfortegnelse) i 2 liter ultrarent vann (mobilfase A). Juster pH til 8,50 ved bruk av ammoniakk.
    FORSIKTIG: Ammoniakk er et farlig materiale. Bruk riktig beskyttelse, for eksempel hansker, laboratoriefrakk, vernebriller og avtrekkshette.
  5. Filter 2 L ultraren 100% acetonitril (mobil fase B) og degas det.
    FORSIKTIG: Acetonitril er et farlig materiale13. Bruk riktig beskyttelse, for eksempel hansker, laboratoriefrakk, vernebriller og avtrekkshette.

2. Kromatografisk tilstand

  1. Injiser 10 μL av de forbehandlede prøveløsningene i et HPLC-system med binære pumper. Bruk et HPLC-system som bruker en ODS-3-kolonne (5 μm x 4,6 mm x 250 mm; arbeider ved 30 ° C) med mobile faser A og B for MDA- og DDA-separasjonen. Injiser hver prøve tre ganger for teknisk replikering.
  2. Programmer metoden som vist i tabell 1 for ODS-3-kolonnen. Sett en strømningshastighet på 1,0 ml/min og deteksjonsbølgelengden til 235 nm.
  3. Registrer toppområdene for hver målforbindelse.
    MERK: Detaljer om instrumentene finner du i materialfortegnelsen.

3. Test av systemtilpasningsevne

MERK: Se avsnitt 2 for kromatografiske forhold for å utføre trinn 3.1-3.5.

  1. Undersøk det lineære forholdet mellom konsentrasjonen og toppområdet.
    1. Forbered forskjellige konsentrasjoner - 19,88, 39,76, 59,64, 159,04, 198,80 og 497,00 μg / ml - benzoylakonitinoppløsning.
    2. Forbered forskjellige konsentrasjoner - 8,49, 16,98, 25,47, 33,96, 50,94 og 169,80 μg / ml - av akonitinoppløsning.
    3. Forbered forskjellige konsentrasjoner - 1,875, 12,50, 37,50, 62,50, 93,75 og 125,00 μg / ml - av 3-deoksyakonitinoppløsning.
    4. Injiser referanseløsningene ovenfor fra lav massekonsentrasjon til høy massekonsentrasjon og registrer toppområdene.
    5. Hent tre lineære regresjonsligninger fra plottet av referanseløsningskonsentrasjonen (μg/L) mot topparealet.
      MERK: Sørg for at konsentrasjonene av benzoylakonitin, akonitin og 3-deoksyakonitin faller innenfor det lineære området for denne standardkurven.
  2. Utfør presisjonstesting ved kontinuerlig å injisere seks repetisjoner på 10 μL av prøveløsningen i HPLC-systemet og kjør prøvene under de samme HPLC-betingelsene beskrevet i avsnitt 2. Registrer toppområdene av benzoylakonitin, akonitin og 3-deoksyakonitin.
  3. Utfør stabilitetstesteksperimenter ved å injisere 10 μL av den fremstilte prøveløsningen og bestemme toppområdene etter 0 timer, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 12 timer og 24 timer.
    MERK: Toppområdene registreres automatisk av det refererte HPLC-systemet. Disse tidspunktene var basert på relevant litteratur15,16,17.
  4. Utfør reproduserbarhetstesten ved å ta samme batch av Zanba-woket TBC for å forberede seks testprøveløsninger parallelt i henhold til metoden i trinn 1.2. Injiser 10 mikrol av hver prøve i HPLC-systemet og kjør prøvene som beskrevet i avsnitt 2.
    MERK: Reproduserbarhet ble vurdert ved å sammenligne konsentrasjonsforskjellene mellom de seks prøvene.
  5. Utfør restitusjonseksperimentet ved å klargjøre seks porsjoner av samme batch Zanba-wokede TBC for testløsningen. Deretter legger du til ~ 100% av referansesubstansen til hver indekskomponent i seks deler av testløsningen for å beregne gjenvinningsgraden. Injiser disse prøvene (10 μL) i HPLC-systemet under de samme forholdene som beskrevet i avsnitt 2 og beregne utvinningsgraden ved hjelp av ligning (1):
    Equation 1(1)
    MERK: I Eq. (1) er A mengden av komponenten som skal måles i testløsningen, B er mengden referansestoff tilsatt, og C er den målte verdien av løsningen som inneholder referansestoffet og Zanba-stir-fried TBC-prøven.

4. Enkeltfaktor eksperimenter

  1. Sammenligning av skivetykkelse
    1. Forbered fem grupper for tester, hver med 30 g TBC, hvor tykkelsen på TBC er henholdsvis 0,5, 1, 2, 3 og 4 cm. Vei en mengde Zanba som er tre ganger så mye som TBC (90 g).
      MERK: TBC er giftig. Bruk riktig beskyttelse, for eksempel hansker, laboratoriefrakk, vernebriller og avtrekkshette, og vær forsiktig under klippeprosessen. Gjennom pre-eksperimentet ble det funnet at tre ganger mengden Zanba var nødvendig for fullstendig kontakt mellom TBC og Zanba. Derfor, i det formelle eksperimentelle designet, valgte studien tre ganger mengden Zanba når man undersøkte skivetykkelsen.
    2. Sett temperaturen og klokkeslettet på den automatiske stekemaskinen til henholdsvis 140 °C og 40 minutter.
    3. Tilsett ~30 g TBC og 90 g Zanba i maskinen etter at den automatiske stekemaskinen har varmet opp til den innstilte temperaturen.
    4. Klargjør eksempelløsningene ved å følge trinn 1.2. Beregne innholdet av MDA og DDA i ulike bearbeidingsprodukter i henhold til standardkurven (tabell 2). Beregn den omfattende poengsummen basert på resultatene via CRITIC-metoden i avsnitt 6.
    5. På denne måten kan du sammenligne mengdene Zanba, samt behandle temperaturer og tider for optimalisering av forholdene.
  2. Sammenligning av mengden Zanba
    1. Utfør fem grupper av tester, hver med 30 g TBC (2 cm), hvor mengden Zanba er henholdsvis en, to, tre, fire og fem ganger så mye som TBC.
    2. Slå på stekemaskinen for bearbeiding. Still inn tiden og temperaturen på stekemaskinen til 40 min og 140 °C.
    3. Klargjør eksempelløsningene ved å følge trinn 1.2. Beregne innholdet av MDA og DDA i ulike bearbeidingsprodukter i henhold til standardkurven (tabell 2). Beregn den omfattende poengsummen basert på resultatene via CRITIC-metoden i avsnitt 6.
  3. Sammenligning av behandlingstemperatur
    1. Utfør fem grupper av tester, hver med 30 g TBC (2 cm) og 90 g Zanba.
    2. Slå på stekemaskinen for bearbeiding. Sett behandlingstemperaturen til 100 °C, 120 °C, 140 °C, 160 °C og 180 °C. Sett behandlingstiden til 40 min.
      MERK: Gjennom pre-eksperimenter ble det funnet at hastigheten på Zanba gulning er svært lav når behandlingstemperaturen er under 100 ° C, og Zanba er lett å brenne og bli svart hvis temperaturen er for høy (over 180 ° C). Derfor ble 100 °C og 180 °C satt til å være henholdsvis minimums- og maksimumsverdier for temperatur under prosessering.
    3. Klargjør eksempelløsningene ved å følge trinn 1.2. Registrer toppområdene til MDA- og DDA-ene. Beregne innholdet av MDA og DDA i ulike bearbeidingsprodukter i henhold til standardkurven (tabell 2). Beregn den omfattende poengsummen basert på resultatene via CRITIC-metoden i avsnitt 6.
      MERK: Eksperimentet involverer høye temperaturer på 160 °C og 180 °C. Vær oppmerksom på sikkerheten under forsøket, i henhold til laboratoriets sikkerhetskode.
  4. Sammenligning av saksbehandlingstid
    1. Utfør fem grupper av tester, hver med 30 g TBC (2 cm) og 90 g Zanba.
    2. Slå på stekemaskinen for bearbeiding. Sett behandlingstiden til 20, 40, 60, 80 og 100 min. Sett temperaturen til 140 °C.
    3. Klargjør eksempelløsningene ved å følge beskrivelsen i trinn 1.2. Registrer toppområdene til MDA- og DDA-ene. Beregn kvaliteten på MDA og DDA i forskjellige prosesseringsprodukter i henhold til standardkurven (tabell 2). Beregn den omfattende poengsummen basert på resultatene via CRITIC-metoden i avsnitt 6.

5. Optimalisering av prosesseringsteknologi av Zanba-woket TBC ved bruk av responsflatemetodikk (RSM)

  1. Box-Behnken respons overflatedesign
    1. Bestem rekkevidden av skivetykkelse (A, 1-3 cm), mengden Zanba (B, 2-4x), behandlingstemperaturen (C, 100-140 ° C) og behandlingstiden (D, 40-80 min) ved innledende eksperimenter ved hjelp av enkeltfaktortester (trinn 4.1-4.4).
      MERK: De kodede verdiene for fire variabler og deres nivåer er vist i tabell 3. Tre nivåer av hver variabel ble kodet som -1, 0 og 1.
  2. Bruk programvare til å generere matrisen og analysere responsflatemodellene.
    MERK: Skjermbildene for programvarebruk vises i tilleggsfil 1.
    1. Bruk en tre-nivå-fire-faktor Box-Behnken-design bestående av 24 eksperimenter (som gjort i denne studien), og mål fem replikater (kjørerekkefølge 1, 9, 14, 16 og 25) for å beregne den rene feilsummen av kvadrater (tabell 4). Angi den fullstendige poengsummen (Y) som svaret (trinn 1–4, tilleggsfil 1).
      1. På hjemmesiden klikker du på Nytt design (trinn 1, tilleggsfil 1), og i venstre panel på Design-siden klikker du på Response Surface | Box-Behnken og angi parametrene for de fire faktorene i tabellen (trinn 2, tilleggsfil 1).
      2. Klikk på Neste (trinn 2, tilleggsfil 1), angi svarnavnene og klikk på Fullfør (trinn 3, tilleggsfil 1).
      3. Generer responsflatedesignet gjennom operasjonen ovenfor (trinn 4, tilleggsfil 1).
  3. Fullfør eksperimentet basert på de 29 scenariene som er utformet for responsoverflaten.
  4. Klargjør eksempelløsningene ved å følge trinn 1.2.
  5. Registrer toppområdene til MDA- og DDA-ene.
    MERK: Toppområdene registreres automatisk av det refererte HPLC-systemet.
  6. Beregne kvaliteten på MDA og DDA i de ulike prosessproduktene.
  7. Beregn den omfattende poengsummen basert på resultatene via CRITIC-metoden i trinn 6.
    MERK: Den spesifikke metoden er illustrert i trinn 6.
  8. Skriv inn den oppnådde omfattende poengsummen på 29 forsøk i datamaskinen og analyser den ved hjelp av den refererte programvaren (trinn 5, tilleggsfil 1).
  9. Utføre statistisk validering av polynomligningene og responsflateanalysene plottet i 3D-modellgrafer gjennom programvaren (trinn 6-8, tilleggsfil 1).
    1. I venstre navigasjonsrute , under Analyse (+), klikker du på Y, og deretter klikker du på Start analyse i Konfigurer-vinduet (trinn 6, tilleggsfil 1).
    2. Klikk på ANOVA i toppmenyen og se resultattabellen som viser variansanalyse (trinn 7, tilleggsfil 1).
    3. I toppmenyen klikker du på Modellgrafer og deretter 3D Surface for å få responsflateplottene som gjenspeiler effekten av prosesseringsparametere på de syntetiske poengsummene (trinn 8, tilleggsfil 1).
  10. Utfør valideringen av responsflatemodellen i triplikat under de forventede optimale forholdene (trinn 9, tilleggsfil 1) for å verifisere stabiliteten til prosesseringsteknologien. I venstre navigasjonsrute , under Optimalisering, klikker du på Numerisk Deretter klikker du på Løsninger i toppmenyen. Vær oppmerksom på de forventede optimale forholdene.

6. Modell evaluering

MERK: Dette trinnet skal utføres etter at hvert enkeltfaktoreksperiment eller responsoverflateeksperiment er fullført. Etter at hvert eksperiment (f.eks. sammenligning av stykketykkelse) er fullført, måles innholdet av MDA og DDA i de forskjellige prøvene for å oppnå fem datasett, i henhold til trinn 1.2 og seksjon 2. Dataene er vist i tilleggstabell S1.

  1. Dimensjonsløs behandling av indeksen
    Dette trinnet transformerer den målte verdien (Xij) til en dimensjonsløs relativ verdi, slik at verdien av hver indeks er på samme antallsnivå. Denne operasjonen kan legge til rette for omfattende analyse og sammenligning av indikatorer i forskjellige enheter eller størrelsesordener18. Til illustrasjon er det brukt stykketykkelsesverdier for beregningene vist nedenfor (tilleggstabell S1).
    1. Standardiser innholdet i MDA (få yMDA; MDA refererer til benzoylakonitin) ved å bruke formelen i Eq. (2).
      MERK: Indeksen "i" står for en av fire faktorer, og skivetykkelse er den første faktoren som undersøkes. Derfor er verdien av i lik 1. Indeksen "j" står for hvert nivå av faktorer; Således, når skivetykkelsen er det første nivået (0,5 cm), er J lik 1; Når skivetykkelsen er det femte nivået (4 cm), er j lik 5. Innholdet av MDA (Xij) i den behandlede TBC med tykkelser på 0,5, 1, 2, 3 og 4 cm var henholdsvis 0,9693, 1,0876, 1,3940, 1,4185 og 1,3614 mg/g. Dermed er x j, maks 1,4185 og xj, min er 0,9693.
      Equation 2(2)
      Således Equation 3
      Her er Xij det målte innholdet i MDA i eksperimentet i i-faktoren og på j-te nivå; xj, min er minimumsinnholdet i MDA i denne gruppen eksperimenter; og xj, max er det maksimale innholdet av MDA i denne gruppen eksperimenter. Dermed er i = 1, 2, ..., m og j = 1, 2, ..., n.
      MERK: Dermed er de standardiserte verdiene til MDA 0,0000, 0,2634, 0,9455, 1,0000 og 0,8729 ved bruk av Eq. (2).
    2. Standardiser det totale innholdet i DDA-ene (fåy DDAer; DDA refererer til akonitin og 3-deoksyakonitin) ved å bruke formelen i Eq. (3).
      MERK: i er en av fire faktorer, og j er hvert nivå av faktorene; Xij er det målte innholdet i DDAene i eksperimentet i i-th-faktoren og på j-te nivå; xj, min er minimumsinnholdet i DDAene i dette gruppeeksperimentet av data; og xj, max er det maksimale innholdet i DDAene i dette gruppeeksperimentet av data. På denne måten er i = 1, 2, ..., m og j = 1, 2, ..., n. Innholdet av DDA (Xij) i den behandlede TBC med tykkelser på 0,5, 1, 2, 3 og 4 cm var henholdsvis 0,3492, 0,2692, 0,2962, 0,5354, 0,5124 mg/g. Dermed er x j, maks 0,5354 og xj, min er 0,2692.
      Equation 4(3)
      Equation 5
      De standardiserte verdiene er 0,6995, 1,0000, 0,8986, 0,0000 og 0,0864 ved bruk av Eq. (3).
  2. Beregn tilsvarende kontrastintensitet (S i), konflikt (δ i), informasjon (C i) og indeksvekt (W i) i henhold til Eqs. (4) til (7), henholdsvis19,20.
    MERK: i = 1, 2, ..., m. yij er de standardiserte dataene for MDA- eller DDA-innholdet i eksperimentet i i-th-faktoren og på j-th-nivået.
    1. For å beregne kontrastintensiteten må du først beregne den gjennomsnittlige MDA-verdien.
      Equation 6
      Hvor Equation 7 er gjennomsnittsverdien av MDA.
      Equation 8(4)
      Equation 21
    2. For å beregne konfliktverdien må du først beregne korrelasjonskoeffisienten γij ved hjelp av KORRELASJON-funksjonen i Excel21.
      Equation 9(5)
      Equation 10
    3. Beregn informasjonsverdier som følger.
      Equation 11(6)
      Equation 12
      MERK: På samme måte er C1, DDAS = 0,7210
    4. Beregn indeksvekten på følgende måte.
      Equation 13(7)
      Equation 14
      MERK: Derfor ble vektkoeffisientene til MDA og DDA i sammenligning av skivetykkelse etablert som henholdsvis 0,4945 og 0,5055.
  3. Beregn de omfattende poengsummene for stykketykkelser.
    Equation 15
    Equation 16
    Equation 17
    Equation 18
    Equation 19
    MERK: Y13 er maksimumsverdien. Derfor er den beste parameteren for skivetykkelser det tredje nivået - 2 cm.

   

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne studien hadde elueringsgradienten som ble brukt en god oppløsning (figur 1) for de tre indekskomponentene i Zanba-stir-fried TBC, som bestemt etter gjentatt feilsøking. De tre indekskomponentene i Zanba-stir-fried TBC hadde et godt lineært forhold innenfor et spesifikt konsentrasjonsområde (tabell 2). Presisjonen (tabell 5), stabiliteten (tabell 6), repeterbarheten (tabell 7) og prøvegjenvinningen (tabell 8) av Zanba-stir-fried TBC var alle innenfor metodologisk område spesifisert i den kinesiske farmakopéen (volum 4, 2020)22, noe som indikerer at metoden var gjennomførbar. Derfor var HPLC-metoden pålitelig for å utføre analysen av Zanba-stir-fried TBC.

Effekten av hver faktor på prosesseringsteknologi ble belyst ved hjelp av enkeltfaktortester, hvor resultatene er vist i figur 2. Trenden med den omfattende poengsummen av Zanba-stir-fried TBC under forskjellige forhold ble visualisert. Utvalget av skivetykkelse (A, 1-3 cm), mengde Zanba (B, 2-4x), prosesseringstemperatur (C, 100-140 °C) og behandlingstid (D, 40-80 min) ble bestemt ved hjelp av enfaktortester (figur 2).

CRITIC-metoden er en objektiv evalueringsmetode som utnytter målte data 19,20. Når hver indeks har svært forskjellige nivåer, vil bruk av den opprinnelige indeksverdien direkte til analyse resultere i en større rolle for indeksen med en høyere verdi i den omfattende analysen og en mindre rolle for indeksen med en lavere verdi. Derfor må de opprinnelige indikatordataene standardiseres for å sikre påliteligheten av resultatene, som anvendt på eksperimentelle verdier i denne studien. I henhold til responsoverflatetestresultatene og CRITIC-metoden ble vektkoeffisientene til MDA og DDA i responsflateeksperimentet etablert som henholdsvis 0,5295 og 0,4705. Den omfattende skåren (Y) kunne beregnes etter Eq. (8).

Equation 20(8)

Resultatene fra det eksperimentelle designet Box-Behnken er vist i tabell 4, mens tabell 9 presenterer resultatene fra ANOVA- og regresjonskoeffisientene. Polynomligningene med omfattende score ble også oppnådd etter programvareanalysen. Sannsynlighetsverdier mindre enn 0,05 antydet at modellen var signifikant (p < 0,0001)23; Ligningen i form av faktiske faktorer ble oppnådd i Eq. (9) (Y: omfattende skår; A: skiver tykkelse; B: mengde Zanba; C: prosesseringstemperatur; og D: saksbehandlingstid). Ligningen indikerte at intensiteten av innflytelsen på omfattende score følger denne rekkefølgen: behandlingstid > behandlingstemperatur > skivetykkelse > mengde Zanba for fire forskjellige faktorer.

Y = 89,05 + 4,57 A + 2,88 B + 4,63 C - 4,83 D + 5,19AB + 4,91AC + 6,97AD + 6,69f.Kr. - 7,05BD - 1,17CD - 22,80A 2 - 21,93B 2 - 19,58C 2 - 27,19 D 2 (9)

Responsflatene og konturplottene er vist i figur 3, som viser endringene i syntetiske skårer som funksjon av fire variabler. På grunnlag av de eksperimentelle resultatene ble de optimale behandlingsparametrene for Zanba-stir-fried TBC bestemt til å være som følger: skivetykkelse på 2.117 cm, 3.118 ganger mer Zanba enn TBC, behandlingstemperatur på 123.106 °C og behandlingstid på 58.156 min. Avhengig av gjennomførbarheten av operasjonen ble den optimale prosesseringsteknologien til Zanba justert - den optimale skivetykkelsen på TBC var 2 cm, mengden Zanba var tre ganger, behandlingstemperaturen var 125 ° C og behandlingstiden var 60 min. Modellens pålitelighet ble bevist gjennom tre tester som ble utført i henhold til de oppnådde behandlingsparametrene (tabell 10).

Figure 1
Figur 1: Kromatogrammer. Kromatogrammet av prøveløsningen (A) og den blandede standardløsningen (B) (1: benzoylakonitin; 2: akonitin; 3: 3-deoksyakonitin). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: De syntetiske skårene av alle enkeltfaktorer. (A) Skivetykkelse; (B) mengden Zanba; (C) behandlingstemperatur; og (D) behandlingstid. Resultatene viste at de omfattende poengsummene for Zanba-wokede TBC er høyest når skivetykkelsen er 2 cm, mengden Zanba er tre ganger, behandlingstemperaturen er 120 °C og behandlingstiden er 60 min. Så resultatene viste rekkevidden av skivetykkelse (A, 1-3 cm), mengde Zanba (B, 2-4x), prosesseringstemperatur (C, 100-140 ° C) og behandlingstid (D, 40-80 min) som skal brukes til å designe neste eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Responsoverflateplott (3D) som gjenspeiler effekten av prosesseringsparametere på omfattende score. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: HPLC-gradienten. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Det lineære forholdet mellom indekskomponentene i Zanba-stir-fried TBC. Resultatene antydet at de tre indekskomponentene i Zanba-stir-fried TBC hadde et godt lineært forhold innenfor et visst konsentrasjonsområde. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Nivåer av variabler for eksperimentelt design. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Box-Behnken eksperimentelt design med svar. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 5: Resultatene av presisjonsmålingen. De relative standardavviksverdiene (RSD) for toppområdene av benzoylakonitin, akonitin og 3-deoksyakonitin var henholdsvis 0,42 %, 0,71 % og 2,95 % (n = 6). Forkortelse: RSD = relativt standardavvik. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 6: Resultatene av stabilitetstesten. RSD-verdiene for toppområdene av benzoylakonitin, akonitin og 3-deoksyakonitin var henholdsvis 1,86 %, 0,54 % og 2,81 % (n = 6). Forkortelse: RSD = relativt standardavvik. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 7: Resultatene av reproduserbarhetstesten. RSD-verdiene for toppområdene av benzoylakonitin, akonitin og 3-deoksyakonitin var henholdsvis 1,99 %, 1,84 % og 2,41 % (n = 6). Forkortelse: RSD = relativt standardavvik. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 8: Målinger av utvinningsgrad for prøver. RSD-verdiene for utvinningsgraden av benzoylakonitin, akonitin og 3-deoksyakonitin var henholdsvis 2,47%, 1,88% og 2,33%. Forkortelse: RSD = relativt standardavvik. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 9: Variansanalyseresultater (ANOVA) i forsøksmodellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 10: Resultatene av verifiserende tester. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: Instruksjonene til designprogramvaren Box-Behnken Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Beregningsresultatet av stykketykkelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TBC er en viktig tibetansk medisin med effekten av å fjerne kulde og lindre smerte. Det har vært mest brukt til å behandle traumatisk skade og revmatisk artralgi i Kina i tusenvis av år24,25,26. Diterpenoid alkaloider er både aktive og giftige ingredienser av TBC27,28,29. De viktigste toksiske effektene av aconitumalkaloider av TBC er nevrotoksisitet, kardiotoksisitet og gastrointestinal toksisitet30,31. TBC behandles vanligvis før oral bruk for å redusere risikoen for toksisitet. Ulike behandlingsmetoder, som damping, avkok og sandsteking, samt behandling med Hezi-avkok, Qingke-vin og Zanba, har vært nyttige for å redusere toksisiteten til TBC samtidig som effekten opprettholdes. Blant dem er Zanba-steking en viktig behandlingsmetode. Zanba er produsert av høylandsbygg (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f), som er et viktig korn for folk som bor på Qinghai-Tibet-platået32,33. Imidlertid er de nøyaktige parametrene for formulering av Zanba-stir-fried TBC fortsatt uklare, og derfor må denne prosesseringsteknologien standardiseres for å sikre kvalitetskontroll og sikker applikasjon.

Det mest avgjørende aspektet ved metoden er at evalueringsindeksen ble bestemt med CRITIC-metoden. Ifølge nyere studier kan svært giftige DDAer hydrolyseres eller pyrolyseres til en MDA med moderat toksisitet under oppvarmingsprosessen34,35. Studier har vist at akonitinhydrolyse til benzoylakonin er det typiske eksempelet36. Derfor ble sammensetningsendringene i prosesseringsprosessen tatt som evalueringsindeksen i prosessteknologioptimaliseringen. CRITIC-metoden er en objektivvektmetode som hovedsakelig vurderer variasjonen av indikatorer og konflikten mellom indikatorer, som uttrykkes av henholdsvis standardavvik og korrelasjonskoeffisient. Det har blitt mye brukt i behandlingen av tradisjonell kinesisk medisin37,38. I denne protokollen ble vekten av hovedkomponentene i Zanba-stir-fried TBC, inkludert benzoylakonitin, akonitin og 3-deoksyakonitin, beregnet ved hjelp av CRITIC-veiemetoden for objektiv tildeling, som ble brukt som evalueringsstandard for Zanba-stir-fried TBC.

En av de viktigste eksperimentelle prosedyrene er å sikre en konstant prosesseringstemperatur under behandlingen, da prosesseringstemperaturen i stor grad påvirker nedbrytningen av DDAer. Derfor involverte pre-eksperimentet bruk av mange typer varmeenheter, for eksempel en induksjonskomfyr, elektrisk keramisk komfyr og multifunksjonell stekemaskin. Den multifunksjonelle stekemaskinen kan opprettholde en konstant temperatur og stabilisere kvaliteten på det bearbeidede produktet.

Selv om den optimaliserte prosesseringsteknologien kan redusere TBCs toksisitet effektivt, eksisterer det fortsatt begrensninger. For det første forblir noen av de aktive ingrediensene i Zanba-wokede TBC ukjente. Kvalitativ og kvantitativ analyse kan derfor ikke utføres da det relevante referanseproduktet ikke er tilgjengelig. Mer oppmerksomhet bør gis til fytokjemiske undersøkelser for å oppnå målkvalitetskontrollkomponentene. I tillegg er den farmakologiske sammenligningen av rå og Zanba-stir-fried TBC uklar. Avgiftning og evaluering av effektreservasjonseffekter i dyremodeller vil være de neste målene.

Tradisjonell kinesisk medisinbehandlingskultur overføres hovedsakelig fra mester til lærling, og sluttpunktet for behandling vurderes generelt av folks subjektive bevissthet, noe som ikke bidrar til etablering av en standardisert behandlingsmetode. I denne studien ble digitale prosessparametere brukt til å spesifisere prosesseringsendepunktet, som til en viss grad kan realisere kombinasjonen av moderne teknologi. Oppsummert standardiserte denne studien Zanba-stir-fried prosesseringsteknologi for giftig demping og effektreservasjon av TBC. Denne tilnærmingen kan gi nyttig informasjon og veiledning for behandling av teknologi av andre giftige etniske medisiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (nr. 82130113), China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021MD703800), Science Foundation for Youths of Science & Technology Department of Sichuan Province (nr. 2022NSFSC1449), og "Xinglin Scholars" Research Promotion Program of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (nr. BSH2021009).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Deoxyaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DST221109-033
Aconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDW000602
Ammonium acetate Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd Chromatographic grade
Benzoylaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDB005502
Design-Expert software Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA version 13.0
Electronic analytical balance Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. FA1004
High performance liquid chromatography SHIMADZU Co., Ltd. LC-20A
High-speed smashing machine Beijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd. FW-100
Millipore filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd φ13 0.22 Nylon66
stir-Fry machine Changzhou Maisi Machinery Co., Ltd Type 5
Tiebangchui Gannan Baicao Biotechnology Development Co., Ltd 20211012
Ultra pure water systemic RephiLe Bioscience, Ltd. Genie G
Ultrasonic cleansing machine Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd SB2200
Zanba 27 Chuanzang Road, Ganzi County -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, C. Y., et al. Aconitum pendulum and Aconitum flavum: A narrative review on traditional uses, phytochemistry, bioactivities and processing methods. Journal of Ethnopharmacology. 292, 115216 (2022).
  2. Wang, J., Meng, X. H., Chai, T., Yang, J. L., Shi, Y. P. Diterpenoid alkaloids and one lignan from the roots of Aconitum pendulum Busch. Natural Products and Bioprospecting. 9 (6), 419-423 (2019).
  3. Yu, L., et al. Traditional Tibetan medicine: therapeutic potential in rheumatoid arthritis. Frontiers In Pharmacology. 13, 938915 (2022).
  4. Zhao, R., et al. One case of ventricular arrhythmia caused by poisoning of traditional Chinese medicine Aconitum pendulum Busch. Journal of People's Military Medical. 61 (4), 346-348 (2018).
  5. Qinghai Medical Products Administration. Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai province. Qinghai Nationalities Publishing House. , 96-97 (2010).
  6. Li, J., et al. Comparison of three objective weighting methods to optimize the extraction process of Jianwei Chupi granules. Journal of Guangdong Pharmaceutical University. 38 (6), 91-97 (2022).
  7. Feng, Z. G., et al. Processing methods and the underlying detoxification mechanisms for toxic medicinal materials used by ethnic minorities in China: A review. Journal of Ethnopharmacology. 305, 116126 (2023).
  8. Hsu, Y. T., Su, C. S. Application of Box-Behnken design to investigate the effect of process parameters on the microparticle production of ethenzamide through the rapid expansion of the supercritical solutions process. Pharmaceutics. 12 (1), 42 (2020).
  9. Cheng, F., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with box-behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (8), 1838-1842 (2022).
  10. Huang, X., et al. Optimization of microwave processing technology for carbonized Gardenia jasminoides by Box-Behnken response surface methodology based on CRITIC weighted evaluation. Chinese Herbal Medicines. 48 (6), 1133-1138 (2017).
  11. Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
  12. Gu, J., Wang, Y. P., Ma, X. Simultaneous determinnation of three diester diterpenoid alkaloids in the toots of Aconiti flavi et penduli by HPLC method. Chinese Pharmaceutical Affairs. 28 (6), 618-621 (2014).
  13. Zhang, Y., Fu, X. UPLC simultaneous determination of six esteric alkaloids components in Aconitum Flaram Hand.Mazz. Asia-Pacific Traditional Medicine. 16 (5), 62-65 (2020).
  14. Rumachik, N. G., Malaker, S. A., Paulk, N. K. VectorMOD: Method for bottom-up proteomic characterization of rAAV capsid post-translational modifications and vector impurities. Frontiers In Immunology. 12, 657795 (2021).
  15. Wang, Y. J., Tao, P., Wang, Y. Attenuated structural transformation of aconitine during sand frying process and antiarrhythmic effect of its converted products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 7243052 (2021).
  16. Wang, H. P., Zhang, Y. B., Yang, X. W., Zhao, D. Q., Wang, Y. P. Rapid characterization of ginsenosides in the roots and rhizomes of Panax ginseng by UPLC-DAD-QTOF-MS/MS and simultaneous determination of 19 ginsenosides by HPLC-ESI-MS. Journal of Ginseng Research. 40 (4), 382-394 (2016).
  17. vander Leeuw, G., et al. Pain and cognitive function among older adults living in the community. Journals of Gerontology Series A. Biological Sciences and Medical Sciences. 71 (3), 398-405 (2016).
  18. Lao, D., Liu, R., Liang, J. Study on plasma metabolomics for HIV/AIDS patients treated by HAART based on LC/MS-MS. Frontiers in Pharmacology. 13, 885386 (2022).
  19. Li, Y., et al. Evaluation of the effectiveness of VOC-contaminated soil preparation based on AHP-CRITIC-TOPSIS model. Chemosphere. 271, 129571 (2021).
  20. Zhong, S., Chen, Y., Miao, Y. Using improved CRITIC method to evaluate thermal coal suppliers. Scientific Reports. 13 (1), 195 (2023).
  21. Lewis, N. S., et al. Magnetically levitated mesenchymal stem cell spheroids cultured with a collagen gel maintain phenotype and quiescence. Journal of Tissue Engineering. 8, (2017).
  22. Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, Chinese Medical Science and Technology Press. (2020).
  23. Li, G., et al. Effect of response surface methodology-optimized ultrasound-assisted pretreatment extraction on the composition of essential oil released from tribute citrus peels. Frontiers in Nutrition. 9, 840780 (2022).
  24. Liu, X. F., et al. Hezi inhibits Tiebangchui-induced cardiotoxicity and preserves its anti-rheumatoid arthritis effects by regulating the pharmacokinetics of aconitine and deoxyaconitine. Journal of Ethnopharmacology. 302, 115915 (2023).
  25. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nature Reviews.Disease Primers. 4, 18001 (2018).
  26. Wang, F., et al. C19-norditerpenoid alkaloids from Aconitum szechenyianum and their effects on LPS-activated NO production. Molecules. 21 (9), 1175 (2016).
  27. Wang, B., et al. Study on the alkaloids in Tibetan medicine Aconitum pendulum Busch by HPLC-MSn combined with column chromatography. Journal of Chromatographic Science. 54 (5), 752-758 (2016).
  28. Liu, S., et al. A review of traditional and current methods used to potentially reduce toxicity of Aconitum roots in Traditional Chinese Medicine. Journal of Ethnopharmacology. 207, 237-250 (2017).
  29. Qiu, Z. D., et al. Online discovery of the molecular mechanism for directionally detoxification of Fuzi using real-time extractive electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114216 (2021).
  30. El-Shazly, M., et al. Use, history, and liquid chromatography/mass spectrometry chemical analysis of Aconitum. Journal of Food and Drug Analysis. 24 (1), 29-45 (2016).
  31. Chan, T. Y. K. Aconitum alkaloid poisoning because of contamination of herbs by aconite roots. Phytotherapy Research. 30 (1), 3-8 (2016).
  32. Guo, L., et al. Exploring microbial dynamics associated with flavours production during highland barley wine fermentation. Food Research International. 130, 108971 (2020).
  33. Guo, T. L., Horvath, C., Chen, L., Chen, J., Zheng, B. Understanding the nutrient composition and nutritional functions of highland barley (Qingke): A review. Trends in Food Science & Technology. 103, 109-117 (2020).
  34. Wu, H., et al. Anti-myocardial infarction effects of Radix Aconiti Lateralis Preparata extracts and their influence on small molecules in the heart using matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4837 (2019).
  35. Huang, G., et al. Study on cardiotoxicity and mechanism of "Fuzi" extracts based on metabonomics. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3506 (2018).
  36. Li, S. L., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  37. Xie, Y., et al. Optimization of processing technology of braised Rehmanniae Raidx based on multiple indexes and response surface technology and correlation between components and color. Journal of Chinese Traditional Medicine. 47 (18), 4927-4937 (2022).
  38. Yang, X. Q., Xu, W., Xiao, C. P., Sun, J., Feng, Y. Z. Study on processing technology of Atractylodes chinensis with rice water and its pharmacodynamics of anti-diarrhea. Chinese Herbal Medicines. 53 (1), 78-86 (2022).

Tags

Medisin utgave 195 Aconitum pendel Busch. prosesseringsteknologi Zanba-stir-fried Tiebangchui CRITIC-metode responsflatemetode
Optimalisering av prosesseringsteknologi for Tiebangchui med Zanba basert på CRITIC kombinert med Box-Behnken Response Surface Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N.,… More

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N., Lai, X., Liu, Y., Zhang, Y. Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method. J. Vis. Exp. (195), e65139, doi:10.3791/65139 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter