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Optimización de la tecnología de procesamiento para Tiebangchui con Zanba basada en CRITIC combinada con el método de superficie de respuesta Box-Behnken

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65139
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 2, 2
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

El presente protocolo describe un método de procesamiento de desintoxicación eficiente y estándar para Tiebangchui salteado de Zanba utilizando CRITIC combinado con el método de superficie de respuesta Box-Behnken.

Abstract

La raíz seca de Aconitum pendulum Busch., llamada Tiebangchui (TBC) en chino, es una de las medicinas tibetanas más famosas. Es una hierba ampliamente utilizada en el noroeste de China. Sin embargo, muchos casos de envenenamiento han ocurrido debido a la intensa toxicidad de TBC y porque sus dosis terapéuticas y tóxicas son similares. Por lo tanto, encontrar un método seguro y eficaz para reducir su toxicidad es una tarea urgente. Una búsqueda a través de los clásicos de la medicina tibetana muestra que el método de procesamiento de TBC salteado con Zanba se registró en la "Especificación de procesamiento de la medicina tibetana de la provincia de Qinghai (2010)". Sin embargo, los parámetros de procesamiento específicos aún no están claros. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo optimizar y estandarizar la tecnología de procesamiento de TBC salteado de Zanba.

Primero, se realizó un experimento de un solo factor en cuatro factores: el grosor de la rebanada de TBC, la cantidad de Zanba, la temperatura de procesamiento y el tiempo. Con el contenido de alcaloides monoéster y diéster en TBC salteado de Zanba como índices, se utilizó CRITIC combinado con el método de superficie de respuesta Box-Behnken para optimizar la tecnología de procesamiento de TBC salteado de Zanba. Las condiciones de procesamiento optimizadas de TBC salteado de Zanba fueron un grosor de rebanada TBC de 2 cm, tres veces más Zanba que TBC, una temperatura de procesamiento de 125 °C y 60 min de salteado. Este estudio determinó las condiciones de procesamiento optimizadas y estándar para el uso de TBC salteado de Zanba, proporcionando así una base experimental para el uso clínico seguro y la producción industrial de TBC salteado de Zanba.

Introduction

La raíz seca de Aconitum pendulum Busch y A. flavum Hand.-Mazz., una de las medicinas tibetanas más famosas, se llama Tiebangchui (TBC) en chino 1,2. Las raíces secas de TBC son útiles para disipar el frío y el viento, reducir el dolor y calmar el shock. Fue registrado en el primer volumen de "Estándares de medicamentos (medicina tibetana) del Ministerio de Salud de la República Popular de China", que establece que las raíces secas de TBC se usan comúnmente para tratar la artritis reumatoide, moretones y otras enfermedades del resfriado3. Sin embargo, la dosis terapéutica clínica de TBC es similar a su dosis tóxica, y los incidentes de envenenamiento o muerte han sido frecuentemente reportados debido al uso inadecuado4. Por lo tanto, reducir la toxicidad y preservar la eficacia de TBC se ha convertido en un punto caliente de investigación a lo largo de los años.

En la medicina tibetana, el procesamiento es uno de los métodos más efectivos para atenuar la toxicidad de TBC. De acuerdo con la "Especificación de procesamiento de la medicina tibetana de la provincia de Qinghai (2010)", las hierbas originales (TBC) deben colocarse en una olla de hierro y saltearse con Zanba hasta que la Zanba se vuelva amarilla, después de lo cual se elimina la Zanba y las hierbas se secan al aire 5,6. Sin embargo, no se han documentado parámetros de proceso específicos, lo que dificulta el control de la tecnología de procesamiento y la calidad del TBC salteado con Zanba. El método CRITIC es un método de ponderación objetiva que puede evitar la fuzzificación y la subjetividad, y mejorar la objetividad del pesaje7. El método de superficie de respuesta de Box-Behnken puede reflejar directamente la interacción entre cada factor a través del ajuste polinómico8. La combinación de la superficie de respuesta Box-Behnken y el método CRITIC se utiliza comúnmente para optimizar la tecnología de procesamiento para adquirir el protocolo de procesamiento optimizado 9,10. En este trabajo, se utilizaron como índices de evaluación un alcaloide monoéster-diterpenoide (MDA) (benzoilaconitina) y dos alcaloides diésteres-diterpenoides (DDA) (aconitina, 3-desoxiaconitina). CRITIC combinado con el método de superficie de respuesta Box-Behnken se aplicó para optimizar la tecnología de procesamiento de TBC salteado de Zanba y establecer un método de procesamiento estándar para un uso clínico seguro.

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Protocol

El método de procesamiento TBC salteado de Zanba fue optimizado y estandarizado por CRITIC combinado con el método de superficie de respuesta Box-Behnken. La benzoilaconitina, la aconitina y la 3-deoxiaconitina se utilizaron como índices de evaluación durante este procedimiento.

1. Preparación de la solución de muestra

  1. Preparar la solución madre de la sustancia de referencia. Pesar exactamente 9,94 mg de benzoilaconitina, 8,49 mg de aconitina y 6,25 mg de 3-deoxiaconitina (Tabla de materiales) en una balanza analítica electrónica y colocarlos en un matraz aforado de 10 ml. Luego, agregue una solución de metanol de ácido clorhídrico al 0,05% para disolver los sólidos y completar el volumen a 10 ml. Finalmente, agitar bien la mezcla para obtener la solución madre de la sustancia de referencia con concentraciones másicas de 0,9940 mg/ml de benzoilaconitina, 0,8490 mg/ml de aconitina y 0,6250 mg/ml de 3-deoxiaconitina.
    PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es un material altamente corrosivo11. Use la protección adecuada, como guantes, una bata de laboratorio, gafas protectoras y una capucha extractora.
  2. Prepare la solución de muestra de prueba.
    1. Pesar 2 g de polvo TBC salteado con Zaba en un matraz cónico.
      1. Prepare TBC salteado de Zanba pesando 30 g de TBC (2 cm) y 90 g de Zanba y añadiéndolos a la máquina de salteado precalentada. Ajuste el tiempo y la temperatura de la máquina salteada a 40 min y 140 °C, respectivamente. Configure la máquina para completar el procesamiento.
      2. Use una máquina trituradora de alta velocidad para moler el TBC salteado de Zaba por separado en muestras de polvo que pueden pasar a través de un tamiz de malla 50 (0.355 mm).
    2. Añadir 3 ml de solución de amoníaco y 50 ml de una solución mezclada de alcohol isopropílico y acetato de etilo (una proporción de 1:1 v/v) en el matraz cónico anterior, basado en estudios previos12,13.
      NOTA: Para preparar la solución de amoníaco, añadir 40 ml de solución concentrada de amoníaco en un matraz aforado de 100 ml y llenar con agua purificada hasta la línea de medición. Tome las medidas de protección adecuadas cuando use una solución concentrada de amoníaco, ya que tiene un olor fuerte.
    3. Pesar la muestra anterior y el matraz cónico y registrar el peso. Ultrasonicado durante 30 min (voltaje: 220 V, frecuencia: 40 kHz).
      NOTA: Los alcaloides de aconitina se descomponen fácilmente por calor. Por lo tanto, la temperatura de extracción ultrasónica debe ser inferior a 25 ° C.
    4. Pesar la muestra y el matraz cónico después de la extracción ultrasónica.
    5. Compensar el peso perdido añadiendo una mezcla de alcohol isopropílico y acetato de etilo (proporción de 1:1 v/v).
    6. Filtre la solución de muestra. Evaporar 25 ml del filtrado a sequedad utilizando un evaporador rotativo a 40 °C.
    7. Disuelva el residuo agregando 5 ml de solución de metanol de ácido clorhídrico al 0,05%, filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm y analícela realizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
  3. Prepare una solución mixta de referencia que contenga 0.1988 mg/ml de benzoilaconitina, 0.0509 mg/ml de aconitina y 0.0938 mg/ml de 3-desoxiaconitina.
    NOTA: Cada patrón (0,9940 mg de benzoilaconitina, 0,2545 mg de aconitina y 0,4690 mg de 3-deoxiaconitina) se disuelve en un matraz aforado de 5 ml en metanol de ácido clorhídrico al 0,05% como medio de disolución.
  4. Preparar tampón de acetato de amonio 0,04 M disolviendo 6,16 g de acetato de amonio (Tabla de materiales) en 2 L de agua ultrapura (fase móvil A). Ajuste el pH a 8.50 usando amoníaco.
    PRECAUCIÓN: El amoníaco es un material peligroso. Use la protección adecuada, como guantes, una bata de laboratorio, gafas protectoras y una capucha extractora.
  5. Filtrar 2 L de ultrapuro 100% acetonitrilo (fase móvil B) y desgasificarlo.
    PRECAUCIÓN: El acetonitrilo es un material peligroso13. Use la protección adecuada, como guantes, una bata de laboratorio, gafas protectoras y una capucha extractora.

2. Estado cromatográfico

  1. Inyecte 10 μL de las soluciones de muestra pretratadas en un sistema de HPLC con bombas binarias. Utilice un sistema de HPLC que emplee una columna ODS-3 (5 μm x 4,6 mm x 250 mm; trabajando a 30 °C) con fases móviles A y B para la separación MDA y DDA. Inyecte cada muestra tres veces para la replicación técnica.
  2. Programe el método como se muestra en la Tabla 1 para la columna ODS-3. Establezca un caudal de 1,0 ml/min y la longitud de onda de detección como 235 nm.
  3. Registre las áreas pico de cada compuesto objetivo.
    NOTA: Los detalles de los instrumentos se pueden encontrar en la Tabla de materiales.

3. Prueba de adaptabilidad del sistema

NOTA: Consulte la sección 2 para conocer las condiciones cromatográficas para realizar los pasos 3.1-3.5.

  1. Investigar la relación lineal entre la concentración y el área pico.
    1. Prepare varias concentraciones - 19.88, 39.76, 59.64, 159.04, 198.80 y 497.00 μg / ml - de solución de benzoilaconitina.
    2. Prepare varias concentraciones - 8.49, 16.98, 25.47, 33.96, 50.94 y 169.80 μg / ml - de solución de aconitina.
    3. Prepare varias concentraciones - 1.875, 12.50, 37.50, 62.50, 93.75 y 125.00 μg / ml - de solución de 3-deoxiaconitina.
    4. Inyecte las soluciones de referencia anteriores de baja concentración de masa a alta concentración de masa y registre las áreas máximas.
    5. Obtener tres ecuaciones de regresión lineal a partir de la gráfica de la concentración de la solución de referencia (μg/L) contra el área del pico.
      NOTA: Asegúrese de que las concentraciones de benzoilaconitina, aconitina y 3-deoxiaconitina caigan dentro del rango lineal de esta curva estándar.
  2. Realizar pruebas de precisión inyectando continuamente seis repeticiones de 10 μL de la solución de muestra en el sistema de HPLC y ejecutar las muestras en las mismas condiciones de HPLC descritas en la sección 2. Registre las áreas máximas de benzoilaconitina, aconitina y 3-deoxiaconitina.
  3. Realizar experimentos de pruebas de estabilidad inyectando 10 μL de la solución de muestra preparada y determinar las áreas pico después de 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h y 24 h.
    NOTA: Las áreas pico son registradas automáticamente por el sistema HPLC referenciado. Estos puntos de tiempo fueron basados en literatura relevante15,16,17.
  4. Realice la prueba de reproducibilidad tomando el mismo lote de TBC salteado con Zanba para preparar seis soluciones de muestra de prueba en paralelo de acuerdo con el método del paso 1.2. Inyecte 10 μL de cada muestra en el sistema de HPLC y ejecute las muestras como se describe en la sección 2.
    NOTA: La reproducibilidad se evaluó comparando las diferencias de concentración entre las seis muestras.
  5. Realice el experimento de recuperación preparando seis porciones del mismo lote de TBC salteado con Zaba para la solución de prueba. Luego, agregue ~ 100% de la sustancia de referencia de cada componente índice en seis porciones de la solución de prueba para calcular la tasa de recuperación. Inyectar estas muestras (10 μL) en el sistema de HPLC en las mismas condiciones descritas en la sección 2 y calcular la tasa de recuperación utilizando la ecuación (1):
    Equation 1(1)
    NOTA: En la Ec. (1), A es la cantidad del componente que debe medirse en la solución de ensayo, B es la cantidad de sustancia de referencia añadida y C es el valor medido de la solución que contiene la sustancia de referencia y la muestra TBC salteada de Zanba.

4. Experimentos de un solo factor

  1. Comparación del grosor de la rebanada
    1. Prepare cinco grupos para las pruebas, cada uno con 30 g de TBC, donde el grosor del TBC es de 0.5, 1, 2, 3 y 4 cm, respectivamente. Pesar una cantidad de Zanba que es tres veces mayor que la de TBC (90 g).
      NOTA: TBC es tóxico. Use la protección adecuada, como guantes, una bata de laboratorio, gafas y una campana extractora, y tenga cuidado durante el proceso de corte. A través del pre-experimento, se encontró que se requería tres veces la cantidad de Zanba para el contacto completo entre TBC y Zanba. Por lo tanto, en el diseño experimental formal, el estudio seleccionó tres veces la cantidad de Zanba al examinar el grosor de la rebanada.
    2. Ajuste la temperatura y la hora de la salteadora automática a 140 °C y 40 min, respectivamente.
    3. Agregue ~ 30 g de TBC y 90 g de Zanba en la máquina después de que la máquina automática de salteado se haya calentado hasta la temperatura establecida.
    4. Prepare las soluciones de ejemplo siguiendo el paso 1.2. Calcular el contenido de los MDA y DDAs en diferentes productos de procesamiento de acuerdo con la curva estándar (Tabla 2). Calcule la puntuación completa basada en los resultados a través del método CRITIC en la sección 6.
    5. De esta manera, compare las cantidades de Zanba, así como las temperaturas y tiempos de procesamiento para la optimización de las condiciones.
  2. Comparación de la cantidad de Zanba
    1. Realice cinco grupos de pruebas, cada una con 30 g de TBC (2 cm), donde la cantidad de Zanba es una, dos, tres, cuatro y cinco veces más que TBC, respectivamente.
    2. Encienda la máquina salteada para su procesamiento. Ajuste la hora y la temperatura de la máquina salteada a 40 min y 140 °C.
    3. Prepare las soluciones de ejemplo siguiendo el paso 1.2. Calcular el contenido de los MDA y DDAs en diferentes productos de procesamiento de acuerdo con la curva estándar (Tabla 2). Calcule la puntuación completa basada en los resultados a través del método CRITIC en la sección 6.
  3. Comparación de la temperatura de procesamiento
    1. Realizar cinco grupos de pruebas, cada una con 30 g de TBC (2 cm) y 90 g de Zanba.
    2. Encienda la máquina salteada para su procesamiento. Ajuste la temperatura de procesamiento a 100 °C, 120 °C, 140 °C, 160 °C y 180 °C. Establezca el tiempo de procesamiento en 40 min.
      NOTA: A través de experimentos previos, se encontró que la velocidad de amarilleo de Zanba es muy baja cuando la temperatura de procesamiento es inferior a 100 ° C, y Zanba es fácil de quemar y volverse negro si la temperatura es demasiado alta (por encima de 180 ° C). Por lo tanto, 100 °C y 180 °C se establecieron para ser los valores mínimo y máximo de temperatura durante el procesamiento, respectivamente.
    3. Prepare las soluciones de ejemplo siguiendo el paso 1.2. Registre las áreas pico de los MDA y DDA. Calcular el contenido de los MDA y DDAs en diferentes productos de procesamiento de acuerdo con la curva estándar (Tabla 2). Calcule la puntuación completa basada en los resultados a través del método CRITIC en la sección 6.
      NOTA: El experimento implica altas temperaturas de 160 °C y 180 °C. Preste atención a la seguridad durante el experimento, de acuerdo con el código de seguridad del laboratorio.
  4. Comparación del tiempo de procesamiento
    1. Realizar cinco grupos de pruebas, cada una con 30 g de TBC (2 cm) y 90 g de Zanba.
    2. Encienda la máquina salteada para su procesamiento. Establezca el tiempo de procesamiento en 20, 40, 60, 80 y 100 minutos. Ajuste la temperatura a 140 °C.
    3. Prepare las soluciones de ejemplo siguiendo la descripción del paso 1.2. Registre las áreas pico de los MDA y DDA. Calcular la calidad de los MDA y DDAs en diferentes productos de procesamiento de acuerdo con la curva estándar (Tabla 2). Calcule la puntuación completa basada en los resultados a través del método CRITIC en la sección 6.

5. Optimización de la tecnología de procesamiento de TBC Zanba-salteado utilizando la metodología de superficie de respuesta (RSM)

  1. Diseño de superficie de respuesta Box-Behnken
    1. Determine el rango de espesor de la rebanada (A, 1-3 cm), la cantidad de Zanba (B, 2-4x), la temperatura de procesamiento (C, 100-140 °C) y el tiempo de procesamiento (D, 40-80 min) mediante experimentos preliminares utilizando pruebas de un solo factor (paso 4.1-4.4).
      NOTA: Los valores codificados de cuatro variables y sus niveles se muestran en la Tabla 3. Tres niveles de cada variable se codificaron como -1, 0 y 1.
  2. Utilice software para generar la matriz y analizar los modelos de superficie de respuesta.
    NOTA: Las capturas de pantalla para el uso del software se muestran en Archivo complementario 1.
    1. Utilice un diseño de Box-Behnken de tres niveles y cuatro factores compuesto por 24 experimentos (como se hizo en este estudio) y mida cinco réplicas (orden de ejecución 1, 9, 14, 16 y 25) para calcular la suma de errores puros de los cuadrados (Tabla 4). Establezca la puntuación completa (Y) como respuesta (pasos 1-4, Archivo complementario 1).
      1. En la página de inicio, haga clic en Nuevo diseño (paso 1, Archivo complementario 1) y, en el panel izquierdo de la página Diseño, haga clic en Superficie de respuesta | Box-Behnken y establecer los parámetros de los cuatro factores de la tabla (paso 2, Archivo complementario 1).
      2. Haga clic en Siguiente (paso 2, Archivo complementario 1), establezca los nombres de las respuestas y haga clic en Finalizar (paso 3, Archivo complementario 1).
      3. Genere el diseño de la superficie de respuesta mediante la operación anterior (paso 4, Archivo complementario 1).
  3. Complete el experimento basado en los 29 escenarios diseñados para la superficie de respuesta.
  4. Prepare las soluciones de ejemplo siguiendo el paso 1.2.
  5. Registre las áreas pico de los MDA y DDA.
    NOTA: Las áreas pico son registradas automáticamente por el sistema HPLC referenciado.
  6. Calcular la calidad de los MDA y DDAs en los diferentes productos de procesamiento.
  7. Calcule la puntuación completa basada en los resultados a través del método CRITIC en el paso 6.
    Nota: El método específico se ilustra en el paso 6.
  8. Ingrese la puntuación completa obtenida de 29 ensayos en la computadora y analícela utilizando el software de referencia (paso 5, Archivo complementario 1).
  9. Realizar la validación estadística de las ecuaciones polinómicas y los análisis de superficie de respuesta trazados en gráficos de modelos 3D a través del software (pasos 6-8, Archivo complementario 1).
    1. En el panel de navegación izquierdo, en Análisis (+), haga clic en Y y, a continuación, haga clic en Iniciar análisis en la ventana Configurar (paso 6, Archivo complementario 1).
    2. Haga clic en ANOVA en el menú superior y observe la tabla de resultados que muestra el análisis de varianza (paso 7, Archivo complementario 1).
    3. En el menú superior, haga clic en Gráficos de modelo y luego en Superficie 3D para obtener los gráficos de superficie de respuesta que reflejan los efectos de los parámetros de procesamiento en las puntuaciones sintéticas (paso 8, Archivo complementario 1).
  10. Realizar la validación del modelo de superficie de respuesta por triplicado en las condiciones óptimas previstas (paso 9, Archivo Suplementario 1) para verificar la estabilidad de la tecnología de procesamiento. En el panel de navegación izquierdo, en Optimización, haga clic en Numérica Luego, en el menú superior, haga clic en Soluciones. Observe las condiciones óptimas previstas.

6. Evaluación del modelo

NOTA: Este paso debe realizarse después de que se haya completado cada experimento de un solo factor o experimento de superficie de respuesta. Después de completar cada experimento (por ejemplo, comparación del grosor del corte), se mide el contenido de MDA y DDA en las diferentes muestras para obtener cinco conjuntos de datos, de acuerdo con el paso 1.2 y la sección 2. Los datos figuran en el cuadro suplementario S1.

  1. Procesamiento adimensional del índice
    NOTA: Este paso transforma el valor medido (Xij) en un valor relativo adimensional, de modo que el valor de cada índice está en el mismo nivel de cantidad. Esta operación puede facilitar el análisis exhaustivo y la comparación de indicadores en diferentes unidades u órdenes de magnitud18. A efectos ilustrativos, se han utilizado los valores de espesor de los sectores para los cálculos que se muestran a continuación (cuadro suplementario S1).
    1. Estandarizar el contenido del MDA (obtener yMDA; MDA se refiere a benzoilaconitina) utilizando la fórmula en la Ec. (2).
      NOTA: El índice "i" representa uno de cuatro factores, y el grosor del corte es el primer factor investigado. Por lo tanto, el valor de i es igual a 1. El índice "j" representa cada nivel de factores; Así, cuando el grosor de la rebanada es el primer nivel (0,5 cm), j es igual a 1; Cuando el grosor de la rebanada es el quinto nivel (4 cm), j es igual a 5. Los contenidos de MDA (Xij) en el TBC procesado con espesores de 0,5, 1, 2, 3 y 4 cm fueron 0,9693, 1,0876, 1,3940, 1,4185 y 1,3614 mg/g, respectivamente. Así, x j,max es 1.4185 y xj, min es 0.9693.
      Equation 2(2)
      Así Equation 3
      Aquí, Xij es el contenido medido del MDA del experimento en el factor i-ésimo y en el nivel j-ésimo; xj, min es el contenido mínimo del MDA en este grupo de experimentos; y xj, max es el contenido máximo del MDA en este grupo de experimentos. Así, i = 1, 2, ..., m, y j = 1, 2, ..., n.
      NOTA: Por lo tanto, los valores estandarizados del MDA son 0.0000, 0.2634, 0.9455, 1.0000 y 0.8729 usando Eq. (2).
    2. Estandarizar el contenido total de los PDD (obtener yDDAs; DDAs se refiere a aconitina y 3-deoxiaconitina) utilizando la fórmula en la Ec. (3).
      NOTA: i es uno de cuatro factores, y j es cada nivel de los factores; Xij es el contenido medido de los DDA del experimento en el factor i-ésimo y en el nivel j-ésimo; xj, min es el contenido mínimo de los DDA en este experimento grupal de datos; y xj, max es el contenido máximo de los DDA en este experimento grupal de datos. De esta manera, i = 1, 2, ..., m y j = 1, 2, ..., n. Los contenidos de los DDAs (Xij) en el TBC procesado con espesores de 0,5, 1, 2, 3 y 4 cm fueron 0,3492, 0,2692, 0,2962, 0,5354, 0,5124 mg/g, respectivamente. Así, x j,max es 0.5354 y xj, min es 0.2692.
      Equation 4(3)
      Equation 5
      NOTA: Los valores estandarizados son 0.6995, 1.0000, 0.8986, 0.0000 y 0.0864 usando Eq. (3).
  2. Calcule la intensidad de contraste correspondiente (S i), el conflicto (δ i), la información (C i) y el peso del índice (W i) según Eqs. (4) a (7), respectivamente19,20.
    NOTA: i = 1, 2, ..., m. yij son los datos estandarizados del contenido MDA o DDAs del experimento en el factor i-ésimo y en el nivel j-ésimo.
    1. Para estimar la intensidad del contraste, primero calcule el valor promedio de MDA.
      Equation 6
      Donde Equation 7 es el valor promedio del MDA.
      Equation 8(4)
      Equation 21
    2. Para calcular el valor del conflicto, primero estime el coeficiente de correlación γij utilizando la función CORREL en Excel21.
      Equation 9(5)
      Equation 10
    3. Calcule los valores de información de la siguiente manera.
      Equation 11(6)
      Equation 12
      NOTA: De manera similar, C1, DDAS = 0.7210
    4. Calcule el peso del índice de la siguiente manera.
      Equation 13(7)
      Equation 14
      NOTA: Por lo tanto, los coeficientes de peso de los MDA y DDA en comparación con el espesor del corte se establecieron como 0,4945 y 0,5055, respectivamente.
  3. Calcule las puntuaciones completas de los espesores de las rebanadas.
    Equation 15
    Equation 16
    Equation 17
    Equation 18
    Equation 19
    NOTA: Y13 es el valor máximo. Por lo tanto, el mejor parámetro de espesores de corte es el tercer nivel: 2 cm.

   

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Representative Results

En este estudio, el gradiente de elución utilizado tuvo una buena resolución (Figura 1) para los tres componentes del índice en TBC Zanba-salteado-frito, según lo determinado después de la depuración repetida. Los tres componentes del índice en TBC Zanba-salteado tuvieron una buena relación lineal dentro de un rango de concentración específico (Tabla 2). La precisión (Tabla 5), la estabilidad (Tabla 6), la repetibilidad (Tabla 7) y la recuperación de la muestra (Tabla 8) del TBC salteado de Zanba estaban dentro del rango metodológico especificado en la Farmacopea China (Volumen 4, 2020)22, lo que indica que el método era factible. Por lo tanto, el método HPLC fue confiable para realizar el análisis de TBC salteado de Zanba.

El efecto de cada factor en la tecnología de procesamiento se dilucidó mediante pruebas de un solo factor, cuyos resultados se muestran en la Figura 2. Se visualizó la tendencia de la puntuación completa de TBC salteado de Zanba en diferentes condiciones. El rango de espesor de la rebanada (A, 1-3 cm), la cantidad de Zanba (B, 2-4x), la temperatura de procesamiento (C, 100-140 °C) y el tiempo de procesamiento (D, 40-80 min) se determinaron mediante pruebas de un solo factor (Figura 2).

El método CRITIC es un método de evaluación objetiva que aprovecha los datos medidos19,20. Cuando cada índice tiene niveles muy diferentes, el uso del valor del índice original directamente para el análisis da como resultado un papel más grande del índice con un valor más alto en el análisis integral y un papel más pequeño del índice con un valor más bajo. Por lo tanto, los datos originales del indicador deben estandarizarse para garantizar la confiabilidad de los resultados, tal como se aplican a los valores experimentales en este estudio. De acuerdo con los resultados de la prueba de superficie de respuesta y el método CRITIC, los coeficientes de peso de los MDA y DDA en el experimento de superficie de respuesta se establecieron como 0.5295 y 0.4705, respectivamente. La puntuación global (Y) podría calcularse de acuerdo con la Ec. (8).

Equation 20(8)

Los resultados del diseño experimental de Box-Behnken se muestran en la Tabla 4, mientras que la Tabla 9 presenta los resultados del ANOVA y los coeficientes de regresión. Las ecuaciones polinómicas de puntajes integrales también se obtuvieron después del análisis del software. Valores de probabilidad menores a 0,05 sugirieron que el modelo fue significativo (p < 0,0001)23; La ecuación en términos de factores reales se obtuvo en la Ec. (9) (Y: puntuación completa; A: espesor de corte; B: cantidad de Zanba; C: temperatura de procesamiento; y D: tiempo de procesamiento). La ecuación indicó que la intensidad de la influencia en las puntuaciones completas sigue este orden: tiempo de procesamiento > temperatura de procesamiento > grosor de la rebanada > cantidad de Zanba para cuatro factores diferentes.

Y = 89,05 + 4,57 A + 2,88 B + 4,63 C - 4,83 D + 5,19AB + 4,91CA + 6,97AD + 6,69a. C. - 7,05BD - 1,17CD - 22,80A 2 - 21,93B 2 - 19,58 C 2 - 27,19 D 2 (9)

Las superficies de respuesta y los gráficos de contorno se muestran en la Figura 3, lo que demuestra los cambios en las puntuaciones sintéticas en función de cuatro variables. Sobre la base de los resultados experimentales, se determinó que los parámetros óptimos de procesamiento de TBC salteado de Zanba eran los siguientes: espesor de rodaja de 2.117 cm, 3.118 veces más Zanba que TBC, temperatura de procesamiento de 123.106 ° C y tiempo de procesamiento de 58.156 min. Dependiendo de la viabilidad de la operación, se ajustó la tecnología de procesamiento óptima de Zanba: el grosor óptimo de corte de TBC fue de 2 cm, la cantidad de Zanba fue tres veces, la temperatura de procesamiento fue de 125 ° C y el tiempo de procesamiento fue de 60 min. La confiabilidad del modelo se demostró a través de tres pruebas que se realizaron de acuerdo con los parámetros de procesamiento obtenidos (Tabla 10).

Figure 1
Figura 1: Cromatogramas. El cromatograma de la solución de muestra (A) y la solución estándar mixta (B) (1: benzoilaconitina; 2: aconitina; 3: 3-deoxiaconitina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las puntuaciones sintéticas de todos los factores individuales. (A) Grosor del corte; (B) la cantidad de Zanba; C) temperatura de elaboración; y (D) tiempo de procesamiento. Los resultados mostraron que las puntuaciones completas de TBC salteado de Zanba son más altas cuando el grosor de la rebanada es de 2 cm, la cantidad de Zanba es tres veces, la temperatura de procesamiento es de 120 ° C y el tiempo de procesamiento es de 60 min. Por lo tanto, los resultados mostraron el rango de espesor de corte (A, 1-3 cm), la cantidad de Zanba (B, 2-4x), la temperatura de procesamiento (C, 100-140 ° C) y el tiempo de procesamiento (D, 40-80 min) que se utilizará para diseñar el siguiente experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Gráficos de superficie de respuesta (3D) que reflejan los efectos de los parámetros de procesamiento en puntuaciones completas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: El gradiente de HPLC. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: La relación lineal de los componentes índice en TBC Zanba-salteado-frito. Los resultados sugirieron que los tres componentes del índice en TBC Zanba-salteado tenían una buena relación lineal dentro de un cierto rango de concentración. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Niveles de variables para el diseño experimental. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: El diseño experimental de Box-Behnken con respuestas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Los resultados de la medición de precisión. Los valores de desviación estándar relativa (DSR) de las áreas pico de benzoilaconitina, aconitina y 3-deoxiaconitina fueron 0,42%, 0,71% y 2,95%, respectivamente (n = 6). Abreviatura: RSD = desviación estándar relativa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6: Resultados de la prueba de estabilidad. Los valores de RSD de las áreas pico de benzoilaconitina, aconitina y 3-deoxiaconitina fueron 1,86%, 0,54% y 2,81%, respectivamente (n = 6). Abreviatura: RSD = desviación estándar relativa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 7: Resultados de la prueba de reproducibilidad. Los valores de DSR de las áreas pico de benzoilaconitina, aconitina y 3-deoxiaconitina fueron 1,99%, 1,84% y 2,41%, respectivamente (n = 6). Abreviatura: RSD = desviación estándar relativa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 8: Mediciones de la tasa de recuperación de la muestra. Los valores de DSR de la tasa de recuperación de benzoilaconitina, aconitina y 3-deoxiaconitina fueron 2,47%, 1,88% y 2,33%, respectivamente. Abreviatura: RSD = desviación estándar relativa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 9: Resultados del análisis de varianza (ANOVA) del modelo experimental. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 10: Los resultados de las pruebas de verificación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Las instrucciones del software de diseño Box-Behnken Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: El resultado del cálculo del grosor del corte. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

TBC es una importante medicina tibetana con los efectos de disipar el frío y aliviar el dolor. Se ha utilizado principalmente para tratar lesiones traumáticas y artralgia reumática en China durante miles de años24,25,26. Los alcaloides diterpenoides son ingredientes activos y tóxicos de TBC27,28,29. Los principales efectos tóxicos de los alcaloides acónitos del TBC son neurotoxicidad, cardiotoxicidad y toxicidad gastrointestinal30,31. TBC generalmente se procesa antes del uso oral para mitigar el riesgo de toxicidad. Varios métodos de procesamiento, como el vapor, la decocción y la fritura de arena, así como el procesamiento con decocción Hezi, vino Qingke y Zanba, han sido útiles para reducir la toxicidad del TBC preservando su eficacia1. Entre ellos, Zanba-stir-frying es un método de procesamiento importante. Zanba se produce a partir de cebada de tierras altas (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f), que es un grano importante para las personas que viven en la meseta Qinghai-Tíbet32,33. Sin embargo, los parámetros precisos de formulación de TBC salteados de Zanba aún no están claros, por lo que esta tecnología de procesamiento debe estandarizarse para garantizar su control de calidad y aplicación segura.

El aspecto más crucial del método es que el índice de evaluación se determinó con el método CRITIC. Según estudios recientes, los DDAs altamente tóxicos pueden ser hidrolizados o pirolizados en un MDA con toxicidad moderada durante el proceso de calentamiento34,35. Estudios han demostrado que la hidrólisis de aconitina a benzoilaconina es el ejemplo típico36. Por lo tanto, los cambios de composición en el proceso de procesamiento se tomaron como índice de evaluación en la optimización de la tecnología del proceso. El método CRITIC es un método de ponderación objetiva que considera principalmente la variación de los indicadores y el conflicto entre indicadores, que se expresan por la desviación estándar y el coeficiente de correlación, respectivamente. Se ha aplicado ampliamente en el procesamiento de la medicina tradicional china37,38. En este protocolo, el peso de los componentes principales de TBC salteado de Zanba, incluyendo benzoilaconitina, aconitina y 3-deoxiaconitina, se calculó utilizando el método de pesaje CRITIC de asignación objetiva, que se utilizó como el estándar de evaluación de TBC salteado de Zanba.

Uno de los procedimientos experimentales clave es garantizar una temperatura de procesamiento constante durante el procesamiento, ya que la temperatura de procesamiento afecta en gran medida la descomposición de los DDA. Por lo tanto, el experimento previo involucró el uso de muchos tipos de dispositivos de calefacción, como una cocina de inducción, una estufa de cerámica eléctrica y una máquina de salteado multifuncional. La máquina salteada multifuncional podría mantener una temperatura constante y estabilizar la calidad del producto procesado.

Aunque la tecnología de procesamiento optimizada podría reducir la toxicidad de TBC de manera efectiva, aún existen limitaciones. En primer lugar, algunos de los ingredientes activos en Zanba-salteado TBC siguen siendo desconocidos. Por lo tanto, no se puede realizar un análisis cualitativo y cuantitativo ya que el producto de referencia pertinente no está disponible. Se debe prestar más atención a las investigaciones fitoquímicas para obtener los componentes de control de calidad objetivo. Además, la comparación farmacológica del TBC crudo y salteado con Zanba no está clara. La desintoxicación y la evaluación de los efectos de reserva de eficacia en modelos animales serán los próximos objetivos.

La cultura de procesamiento de la medicina tradicional china se transmite principalmente de maestro a aprendiz, y el punto final del procesamiento generalmente se juzga por la conciencia subjetiva de las personas, que no es propicia para el establecimiento de un método de procesamiento estandarizado. En este estudio, se utilizaron parámetros de proceso digital para especificar el punto final de procesamiento, que puede realizar la combinación de tecnología moderna hasta cierto punto. En resumen, este estudio estandarizó la tecnología de procesamiento Zanba-stir-fried para la atenuación tóxica y la reserva de eficacia de TBC. Este enfoque puede proporcionar información útil y orientación para la tecnología de procesamiento de otros medicamentos étnicos venenosos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82130113), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No. 2021MD703800), la Fundación de Ciencias para Jóvenes del Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Sichuan (No. 2022NSFSC1449) y el Programa de Promoción de la Investigación "Xinglin Scholars" de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (No. BSH2021009).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Deoxyaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DST221109-033
Aconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDW000602
Ammonium acetate Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd Chromatographic grade
Benzoylaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDB005502
Design-Expert software Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA version 13.0
Electronic analytical balance Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. FA1004
High performance liquid chromatography SHIMADZU Co., Ltd. LC-20A
High-speed smashing machine Beijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd. FW-100
Millipore filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd φ13 0.22 Nylon66
stir-Fry machine Changzhou Maisi Machinery Co., Ltd Type 5
Tiebangchui Gannan Baicao Biotechnology Development Co., Ltd 20211012
Ultra pure water systemic RephiLe Bioscience, Ltd. Genie G
Ultrasonic cleansing machine Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd SB2200
Zanba 27 Chuanzang Road, Ganzi County -

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References

  1. Li, C. Y., et al. Aconitum pendulum and Aconitum flavum: A narrative review on traditional uses, phytochemistry, bioactivities and processing methods. Journal of Ethnopharmacology. 292, 115216 (2022).
  2. Wang, J., Meng, X. H., Chai, T., Yang, J. L., Shi, Y. P. Diterpenoid alkaloids and one lignan from the roots of Aconitum pendulum Busch. Natural Products and Bioprospecting. 9 (6), 419-423 (2019).
  3. Yu, L., et al. Traditional Tibetan medicine: therapeutic potential in rheumatoid arthritis. Frontiers In Pharmacology. 13, 938915 (2022).
  4. Zhao, R., et al. One case of ventricular arrhythmia caused by poisoning of traditional Chinese medicine Aconitum pendulum Busch. Journal of People's Military Medical. 61 (4), 346-348 (2018).
  5. Qinghai Medical Products Administration. Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai province. Qinghai Nationalities Publishing House. , 96-97 (2010).
  6. Li, J., et al. Comparison of three objective weighting methods to optimize the extraction process of Jianwei Chupi granules. Journal of Guangdong Pharmaceutical University. 38 (6), 91-97 (2022).
  7. Feng, Z. G., et al. Processing methods and the underlying detoxification mechanisms for toxic medicinal materials used by ethnic minorities in China: A review. Journal of Ethnopharmacology. 305, 116126 (2023).
  8. Hsu, Y. T., Su, C. S. Application of Box-Behnken design to investigate the effect of process parameters on the microparticle production of ethenzamide through the rapid expansion of the supercritical solutions process. Pharmaceutics. 12 (1), 42 (2020).
  9. Cheng, F., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with box-behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (8), 1838-1842 (2022).
  10. Huang, X., et al. Optimization of microwave processing technology for carbonized Gardenia jasminoides by Box-Behnken response surface methodology based on CRITIC weighted evaluation. Chinese Herbal Medicines. 48 (6), 1133-1138 (2017).
  11. Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
  12. Gu, J., Wang, Y. P., Ma, X. Simultaneous determinnation of three diester diterpenoid alkaloids in the toots of Aconiti flavi et penduli by HPLC method. Chinese Pharmaceutical Affairs. 28 (6), 618-621 (2014).
  13. Zhang, Y., Fu, X. UPLC simultaneous determination of six esteric alkaloids components in Aconitum Flaram Hand.Mazz. Asia-Pacific Traditional Medicine. 16 (5), 62-65 (2020).
  14. Rumachik, N. G., Malaker, S. A., Paulk, N. K. VectorMOD: Method for bottom-up proteomic characterization of rAAV capsid post-translational modifications and vector impurities. Frontiers In Immunology. 12, 657795 (2021).
  15. Wang, Y. J., Tao, P., Wang, Y. Attenuated structural transformation of aconitine during sand frying process and antiarrhythmic effect of its converted products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 7243052 (2021).
  16. Wang, H. P., Zhang, Y. B., Yang, X. W., Zhao, D. Q., Wang, Y. P. Rapid characterization of ginsenosides in the roots and rhizomes of Panax ginseng by UPLC-DAD-QTOF-MS/MS and simultaneous determination of 19 ginsenosides by HPLC-ESI-MS. Journal of Ginseng Research. 40 (4), 382-394 (2016).
  17. vander Leeuw, G., et al. Pain and cognitive function among older adults living in the community. Journals of Gerontology Series A. Biological Sciences and Medical Sciences. 71 (3), 398-405 (2016).
  18. Lao, D., Liu, R., Liang, J. Study on plasma metabolomics for HIV/AIDS patients treated by HAART based on LC/MS-MS. Frontiers in Pharmacology. 13, 885386 (2022).
  19. Li, Y., et al. Evaluation of the effectiveness of VOC-contaminated soil preparation based on AHP-CRITIC-TOPSIS model. Chemosphere. 271, 129571 (2021).
  20. Zhong, S., Chen, Y., Miao, Y. Using improved CRITIC method to evaluate thermal coal suppliers. Scientific Reports. 13 (1), 195 (2023).
  21. Lewis, N. S., et al. Magnetically levitated mesenchymal stem cell spheroids cultured with a collagen gel maintain phenotype and quiescence. Journal of Tissue Engineering. 8, (2017).
  22. Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, Chinese Medical Science and Technology Press. (2020).
  23. Li, G., et al. Effect of response surface methodology-optimized ultrasound-assisted pretreatment extraction on the composition of essential oil released from tribute citrus peels. Frontiers in Nutrition. 9, 840780 (2022).
  24. Liu, X. F., et al. Hezi inhibits Tiebangchui-induced cardiotoxicity and preserves its anti-rheumatoid arthritis effects by regulating the pharmacokinetics of aconitine and deoxyaconitine. Journal of Ethnopharmacology. 302, 115915 (2023).
  25. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nature Reviews.Disease Primers. 4, 18001 (2018).
  26. Wang, F., et al. C19-norditerpenoid alkaloids from Aconitum szechenyianum and their effects on LPS-activated NO production. Molecules. 21 (9), 1175 (2016).
  27. Wang, B., et al. Study on the alkaloids in Tibetan medicine Aconitum pendulum Busch by HPLC-MSn combined with column chromatography. Journal of Chromatographic Science. 54 (5), 752-758 (2016).
  28. Liu, S., et al. A review of traditional and current methods used to potentially reduce toxicity of Aconitum roots in Traditional Chinese Medicine. Journal of Ethnopharmacology. 207, 237-250 (2017).
  29. Qiu, Z. D., et al. Online discovery of the molecular mechanism for directionally detoxification of Fuzi using real-time extractive electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114216 (2021).
  30. El-Shazly, M., et al. Use, history, and liquid chromatography/mass spectrometry chemical analysis of Aconitum. Journal of Food and Drug Analysis. 24 (1), 29-45 (2016).
  31. Chan, T. Y. K. Aconitum alkaloid poisoning because of contamination of herbs by aconite roots. Phytotherapy Research. 30 (1), 3-8 (2016).
  32. Guo, L., et al. Exploring microbial dynamics associated with flavours production during highland barley wine fermentation. Food Research International. 130, 108971 (2020).
  33. Guo, T. L., Horvath, C., Chen, L., Chen, J., Zheng, B. Understanding the nutrient composition and nutritional functions of highland barley (Qingke): A review. Trends in Food Science & Technology. 103, 109-117 (2020).
  34. Wu, H., et al. Anti-myocardial infarction effects of Radix Aconiti Lateralis Preparata extracts and their influence on small molecules in the heart using matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4837 (2019).
  35. Huang, G., et al. Study on cardiotoxicity and mechanism of "Fuzi" extracts based on metabonomics. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3506 (2018).
  36. Li, S. L., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  37. Xie, Y., et al. Optimization of processing technology of braised Rehmanniae Raidx based on multiple indexes and response surface technology and correlation between components and color. Journal of Chinese Traditional Medicine. 47 (18), 4927-4937 (2022).
  38. Yang, X. Q., Xu, W., Xiao, C. P., Sun, J., Feng, Y. Z. Study on processing technology of Atractylodes chinensis with rice water and its pharmacodynamics of anti-diarrhea. Chinese Herbal Medicines. 53 (1), 78-86 (2022).

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Medicina Número 195 Aconitum pendulum Busch. tecnología de procesamiento Tiebangchui salteado Zanba-frito método CRITIC método de superficie de respuesta
Optimización de la tecnología de procesamiento para Tiebangchui con Zanba basada en CRITIC combinada con el método de superficie de respuesta Box-Behnken
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Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N.,… More

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N., Lai, X., Liu, Y., Zhang, Y. Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method. J. Vis. Exp. (195), e65139, doi:10.3791/65139 (2023).

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