Summary
In dieser Arbeit schlagen wir ein Protokoll für die intratracheale Lipopolysaccharid-Abgabe (LPS) mittels nicht-invasiver oropharyngealer endotrachealer Intubation vor. Diese Methode minimiert das Trauma des chirurgischen Eingriffs für das Tier und gibt LPS genau in die Luftröhre und dann in die Lunge ab.
Abstract
Das Mausmodell der akuten Lungenschädigung (ALI), das durch Lipopolysaccharid (LPS) oder Endotoxin induziert wird, gehört nach wie vor zu den am häufigsten verwendeten Modellen in Tierstudien zur akuten Lungenschädigung oder akuten Entzündung. Die derzeit am häufigsten verwendeten Methoden in Mausmodellen für akute Lungenverletzungen sind eine intraperitoneale Injektion von LPS und eine Tracheotomie für die tracheale Infusion von LPS. Die erste Methode ist jedoch nicht zielgerichtet auf die Lunge ausgerichtet und schädigt andere Organe, und die letztere Methode induziert ein operatives Trauma, ein Infektionsrisiko und eine niedrige Überlebensrate. Hier empfehlen wir eine nicht-invasive oropharyngeale endotracheale Intubationsmethode für die LPS-Instillation bei Mäusen. Bei dieser Methode wird LPS nicht-invasiv durch die oropharyngeale Höhle in die Luftröhre eingeführt, um mit Hilfe einer Apparatur zur endotrachealen Intubation in die Lunge instilliert zu werden. Diese Methode gewährleistet nicht nur die gezielte Ausrichtung auf die Lunge, sondern vermeidet auch Schäden und das Risiko des Todes bei den Tieren. Wir gehen davon aus, dass dieser Ansatz im Bereich der akuten Lungenschädigung weit verbreitet sein wird.
Introduction
Die akute Lungenschädigung (ALI) ist ein häufiges klinisches Syndrom. Unter einer Vielzahl von pathogenen Faktoren führt die Störung der physiologischen Barriere der Lungenepithelzellen und der vaskulären Endothelzellen zu einer erhöhten alveolären Permeabilität, wodurch eine verminderte Lungencompliance, ein Lungenödem und eine schwere Hypoxämie verursachtwerden 1. Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist die schwerste Form der ALI. Unkontrollierte Entzündungen und Schäden durch oxidativen Stress gelten als Hauptursachen für ALI und das schwerere ARDS2. Wenn Alveoladepithelzellen durch ein Trauma direkt verletzt werden, wird die Entzündungsreaktionskette der Alveolarmakrophagen aktiviert, was zu einer Entzündung in der Lunge führt3. Weltweit gibt es mehr als 3 Millionen Patienten mit akutem ARDS pro Jahr, und sie machen etwa 10 % der Einweisungen auf Intensivstationen aus. Darüber hinaus liegt die Sterblichkeitsrate in schweren Fällen bei bis zu 46 %4,5,6. Daher ist es notwendig, ein geeignetes Tiermodell für ALI zu etablieren, um seine Pathogenese zu untersuchen. Die Maus ist das am häufigsten verwendete Versuchstier in der ALI-Studie, da ihre Atemwege die menschlichen Atemwege für ALI-Studien gut simulieren können. Darüber hinaus äußert sich ALI als massive Infiltration von Entzündungszellen, erhöhte pulmonale Gefäßpermeabilität und Lungenödeme. Die Veränderungen der inflammatorischen Zytokine im Serum und das Trocken-Nass-Gewichtsverhältnis der Lunge spiegeln den Grad der ALI7 wider.
Gegenwärtig umfassen die wichtigsten Methoden zur Modellierung der LPS-induzierten ALI in Mäusen die intranasale und chirurgische tracheale Intubation 8,9. In dieser Arbeit schlagen wir eine neue Methode vor, um LPS mittels nicht-invasiver oropharyngealer Intubation in die Luftröhre zu bringen. Bei dieser Methode wird ein beleuchteter Intubator verwendet, um die Luftröhre der Maus zu finden, und dann LPS in die Luftröhre und die Lunge abgegeben. Bei dieser Methode gelangt LPS genauer in die Lunge als bei der intranasalen Verabreichungsmethode. Im Vergleich zur chirurgischen trachealen Intubation ist bei dieser Methode keine Operation erforderlich, es werden keine Wunden verursacht und die Schmerzen bei Mäusen reduziert10. Daher kann diese Methode verwendet werden, um ein überzeugenderes Mausmodell von ALI zu etablieren.
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Protocol
Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Verwaltungsausschuss der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Chengdu geprüft und genehmigt (Aktenzeichen 2021-11). Für die vorliegende Studie wurden männliche C57/BL-Mäuse (20-25 g, 6-8 Wochen alt) verwendet. Die Mäuse wurden in einer Tierkammer gehalten und konnten während des Experiments frei trinken und essen.
1. Vorbereitung
- Stellen Sie sicher, dass die Intubationsplattform aus einer Basis, einem Steigrohr, einer Büroklammer, zwei Gummibändern und einigen Schnüren besteht. Nehmen Sie eine Schnur, führen Sie die Schnur durch die beiden Löcher oben am Tragegurt und binden Sie die beiden Enden der Schnur an die kleinen Vorsprünge oben am Tragegurt.
Anmerkungen: Lassen Sie Platz für den Kopf der Maus zwischen der Schnur und den beiden Löchern. - Binden Sie zwei Gummibänder an jedes Ende der Büroklammer und kleben Sie die Büroklammer mit den Gummibändern an die Rückseite des Tragegurts. Befestigen Sie zum Schluss das Tragegurt im 90°-Winkel an der Basis (Abbildung 1).
- Wählen Sie eine Kanüle in der richtigen Größe und Länge. Für eine 20−30 g schwere Maus kann ein 22 g Katheter (2,5−3,8 cm lang) verwendet werden11. Montieren Sie die Kanüle auf einem Kanülenstift und schalten Sie das Licht des Pens ein (Abbildung 2).
- Bereiten Sie eine kleine chirurgische Pinzette und eine Pasteurpipette vor, indem Sie sie mit 70%igem Alkohol desinfizieren.
2. Herstellung der Prüfverbindung
- 3 mg LPS werden in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) abgewogen und gelöst, um eine LPS-Lösung mit einer Konzentration von 3 mg/ml zu bilden.
- Wiegen Sie 10 mg Pentobarbitalnatrium ab und lösen Sie sie in 1 ml normaler Kochsalzlösung, um eine 1%ige Pentobarbitalnatriumlösung zu bilden. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,45 μm Spritzenvorsatzfilter.
3. Nichtinvasive oropharyngeale Instillation
- Betäuben Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von 1% Pentobarbitalnatrium in einer Dosis von 50 mg/kg12,13. Bestimmen Sie die Narkosetiefe durch mangelndes Ansprechen auf den Aufrichtungsreflex.
- Legen Sie die betäubte Maus auf die Intubationsplattform. Fixieren Sie die oberen Vorderzähne mit dem Gewinde und die beiden Vorderfüße mit den Gummibändern (Abbildung 3).
- Ziehen Sie die Zunge mit einer Pinzette heraus und halten Sie sie mit der linken Hand fest. Schieben Sie die Kanüle langsam mit der rechten Hand nach oben am Mund entlang bis zum Kehldeckel des Unterkiefers. Verwenden Sie das Licht des Kanülenstifts, um die Luftröhre zu finden, und führen Sie sie langsam in die Luftröhre ein (Abbildung 4).
- Nachdem die Kanüle in die Luftröhre eingeführt wurde, ziehen Sie den Intubationsstift langsam heraus und lassen Sie die Kanüle drin. Führen Sie die Pasteur-Pipette in das Kanülengelenk ein und drücken Sie auf den Kopf (Abbildung 5).
HINWEIS: Wenn sich der Brustkorb der Maus vorwölbt, ist die Intubation erfolgreich (Abbildung 6). - Nach erfolgreicher endotrachealer Intubation wird den Mäusen 3 mg/ml LPS in einer Dosis von 3 mg/kg mit einer Mikrospritze mit flachem Kopf durch die Kanüle injiziert14,15 (Abbildung 7).
- Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Kanüle und die Mikrospritze. Nehmen Sie die Maus vom Gerüst und legen Sie sie separat in einen Käfig, um sich zu erholen. Beobachten Sie den Atemzustand der Maus, bis sie sich erholt hat und das Bewusstsein wiedererlangt hat.
HINWEIS: 12 Stunden nach der LPS-Trachealinstillation werden die Mäuse nach dem von der Tierethikkommission genehmigten Verfahren eingeschläfert. TNF-α-Serum-Assays und Trocken-Nass-Lungengewichtsmessungen wurden mit Standardverfahren durchgeführt.
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Representative Results
Die vorgeschlagene Methode zur LPS-Instillation in Mäusen wurde durch die Auswertung der Expression des inflammatorischen Zytokins TNF-α und des Trocken-Nass-Gewichtsverhältnisses der Lunge 12 h nach LPS-Instillation verifiziert. Es gab vier Gruppen im Experiment: Blindkontrolle (ohne Behandlung), chirurgische Intubation16, intranasale 17,18 und nichtinvasive oropharyngeale Intubation (n = 6). Im Vergleich zur Blind-Kontrollgruppe waren die TNF-α-Serumspiegel in der nicht-invasiven oropharyngealen Intubationsgruppe signifikant erhöht (Abbildung 8A). Das Trocken-Nass-Gewichtsverhältnis der Lunge war ebenfalls erhöht (Abbildung 8B) und erreichte das gleiche Niveau wie in der chirurgischen Trachealintubationsgruppe. Die Datensätze wurden statistisch mit einer ungepaarten ANOVA und Post-hoc-Mehrfachvergleichen Tukey Kramer-Tests analysiert. Alle Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt, und ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Abbildung 1: Anpassung und Montage der Intubationsplattform. Die Plattform besteht aus einem Sockel, einem Mittelteil, einer Büroklammer, zwei Gummibändern und einigen Schnüren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Intubationsset. Diese Abbildung zeigt das Intubationskit und seine Montage. Dazu gehören eine Stiftlampe, ein Lichtwellenleiter und eine Kanüle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Fixierung der Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Lokalisieren der Luftröhre. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Überprüfung der Pasteurpipettenpumpe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Vorher-Nachher-Bild des Brustkorbs mit erfolgreicher Intubation. (A) Brustkorb vor der Intubation. (B) Brustkorb nach Intubation; Der Bereich, der die Vorwölbung des Brustkorbs zeigt, ist mit einem roten Kreis markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Flachkopf-Mikrosampler zur Abgabe von LPS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Beurteilung der Validität der nicht-invasiven LPS-Instillation. (A) Expression von TNF-α im Serum von C57BL/6-Mäusen 12 h nach einer endotrachealen LPS-Injektion. (B) Datenanalyse des Trocken-Nass-Gewichtsverhältnisses des Lungengewebes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Zunächst suchten wir in der Mundhöhle, um die Lage der Luftröhrezu finden 19. Dabei stellten wir jedoch fest, dass die Luftröhre von C57/BL-Mäusen schmal ist, was es schwierig macht, mit dieser Methode ohne die Hilfe von Geräten wie einem Endoskop20 die richtige Stelle zu finden. Bei weiteren Untersuchungen stellten wir fest, dass das Licht der Intubatorlampe die Oberfläche des Körpers durchdringen konnte, so dass der Bediener die Position der Kanüle21 bestimmen konnte.
Um zu überprüfen, ob der Schlauch in die Luftröhre eingedrungen war, versuchten wir es zunächst mit einem kleinen Spiegel, der gekühlt wurde, indem wir ihn auf Eis legten. Nach der Intubation näherten wir uns mit einem Spiegel der Kanülenöffnung. Wenn sich Nebel auf dem Spiegel bildete, galt die Intubation als erfolgreich. Wir stellten jedoch fest, dass diese Untersuchungsmethode nicht genau feststellen konnte, ob die Kanüle in die Luftröhre eingedrungen war. Erstens befand sich der Kanülenkopf in der Nähe des Mausmauls, und es konnte nicht festgestellt werden, ob der Nebel, der auf dem Spiegel erschien, durch ausgeatmetes Gas aus dem Mund verursacht wurde. Zweitens musste der Spiegel gekühlt werden. Bei ständiger Nutzung führte auch die Zeit, die zum Abkühlen des Spiegels benötigt wurde, zu einer Verlängerung der Versuchszeit. Wir haben dann eine Pasteur-Pipette verwendet, um Luft in die Luftröhre zu pumpen. Der Brustkorb der Maus würde anschwellen, wenn die Kanüle in die Luftröhre eingeführt würde, und wenn sie in die Speiseröhre eingeführt würde, würde der rechte Unterbauch anschwellen22. Daher haben wir diese Methode als Grundlage für die Beurteilung verwendet, ob die Intubation erfolgreich war.
Im Vergleich zur chirurgischen trachealen Intubation vermeidet die nichtinvasive oropharyngeale Intubation Operationswunden und verbessert die Überlebensrate der Versuchstiere23. Im Vergleich zur intranasalen Intubation führt die nichtinvasive oropharyngeale Intubation zu einem genaueren Einführen der Kanüle in den Bronchus und die Lunge24. Die Beherrschung dieser technischen Fähigkeiten erfordert jedoch viel Übung. Bei Mäusen mit kleinen Körpergrößen ist das Einführen der Kanüle in die Luftröhre schwierig, und man kann die Luftröhre während der Operation leicht zerkratzen. Daher schlagen wir vor, Mäuse mit größerer Körpergröße für das Experiment auszuwählen.
Die Methode kann auch verwendet werden, um andere flüssige Arzneimittel in den Bronchus und die Lunge zu verabreichen, was bedeutet, dass sie ein breites Anwendungspotenzial hat25,26.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr.: 81903902), der China Postdoctoral Science Foundation (Nr.: 2019M663457), dem Sichuan Science and Technology Program (Nr.: 2020YJ0172) und dem Xinglin Scholar Research Premotion Project der Chengdu University of TCM (Nr.: QJRC2022053) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
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