Summary
여기에서 우리는 비침습적 구인두 기관내 삽관을 통한 기관내 지질다당류(LPS) 전달을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 동물에 대한 수술 절차의 외상을 최소화하고 LPS를 기관으로 정확하게 전달한 다음 폐로 전달합니다.
Abstract
지질다당류(LPS) 또는 내독소에 의해 유도된 급성 폐 손상(ALI) 마우스 모델은 여전히 급성 폐 손상 또는 급성 염증에 대한 동물 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델 중 하나입니다. 급성 폐 손상 마우스 모델에서 현재 가장 일반적으로 사용되는 방법은 LPS의 복강내 주사 및 LPS의 기관 주입을 위한 기관 절개술이다. 그러나 전자의 방법은 폐 표적이 부족하고 다른 장기를 손상시키며, 후자의 방법은 수술적 외상, 감염 위험 및 낮은 생존율을 유발합니다. 여기서는 생쥐에 LPS 점적을 위한 비침습적 구인두 기관내 삽관 방법을 권장합니다. 이 방법에서, LPS는 구강 인두강을 통해 비 침습적으로 기관 내로 도입되어 기관 내 삽관을위한 장치의 도움으로 폐에 주입된다. 이 방법은 폐 표적화를 보장할 뿐만 아니라 동물의 손상 및 사망 위험을 방지합니다. 우리는 이 접근법이 급성 폐 손상 분야에서 널리 사용될 것으로 기대합니다.
Introduction
급성 폐 손상(ALI)은 흔한 임상 증후군입니다. 다양한 병원성 요인 하에서 폐 상피 세포와 혈관 내피 세포의 생리적 장벽이 파괴되면 폐포 투과성이 증가하여 폐 순응도 감소, 폐부종 및 중증 저산소혈증을 유발합니다1. 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 ALI의 가장 심각한 형태입니다. 조절되지 않는 염증 및 산화 스트레스 손상은 ALI와 더 심각한 ARDS2의 주요 원인으로 간주됩니다. 외상으로 인해 폐포 상피세포가 직접 손상되면 폐포 대식세포의 염증 반응 사슬이 활성화되어 폐에 염증을 일으킨다3. 전 세계적으로 연간 300만 명 이상의 급성 ARDS 환자가 있으며 중환자실 입원의 약 10%를 차지합니다. 또한 중증의 경우 사망률은 46%4,5,6에 달합니다. 따라서 ALI의 발병기전을 연구하기 위해 적합한 ALI 동물모델을 확립할 필요가 있다. 마우스는 ALI 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 실험 동물로, 호흡기가 ALI 연구를 위해 인간의 호흡기를 잘 시뮬레이션할 수 있기 때문입니다. 또한 ALI는 대규모 염증 세포 침윤, 폐혈관 투과성 증가 및 폐부종으로 나타납니다. 혈청 내 염증성 사이토카인의 변화와 폐 건습식 중량비는 ALI7의 정도를 반영한다.
현재, 마우스에서 LPS 유도 ALI를 모델링하는 주요 방법은 비강내 및 외과적 기관 삽관을 포함한다8,9. 여기에서 우리는 비침습적 구인두 삽관을 통해 LPS를 기관으로 전달하는 새로운 방법을 제안합니다. 이 방법은 조명 삽관기를 사용하여 마우스의 기관을 찾은 다음 LPS를 기관과 폐로 전달합니다. 이 방법은 비강 내 전달 방법보다 더 정확하게 LPS를 폐에 전달합니다. 외과적 기관 삽관과 비교하여, 이 방법은 수술을 필요로 하지 않고, 상처를 유발하는 것을 피하며, 생쥐의 통증을 감소시킨다10. 따라서 이 방법을 사용하여 보다 설득력 있는 ALI 마우스 모델을 구축할 수 있습니다.
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Protocol
동물 실험 프로토콜은 청두 한의과대학 경영위원회(기록 번호 2021-11)에서 검토 및 승인되었습니다. 수컷 C57/BL 마우스(20-25g, 6-8주령)를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 동물 챔버에 보관되었고 실험 중에 자유롭게 마시고 먹을 수 있었습니다.
1. 준비
- 삽관 플랫폼이 받침대, 라이저, 종이 클립, 두 개의 고무 밴드 및 일부 끈으로 구성되어 있는지 확인하십시오. 끈을 잡고 라이저 상단의 두 구멍을 통해 끈을 통과시키고 끈의 두 끝을 라이저 상단의 작은 돌출부에 각각 묶습니다.
알림: 마우스의 머리가 끈과 두 구멍 사이를 통과할 수 있도록 공간을 남겨 두십시오. - 종이 클립의 양쪽 끝에 두 개의 고무 밴드를 묶고 고무 밴드로 종이 클립을 라이저 뒷면에 테이프로 붙입니다. 마지막으로 라이저를 베이스에 90°로 고정합니다(그림 1).
- 적절한 크기와 길이의 캐뉼라를 선택하십시오. 20-30g 마우스의 경우 22G 카테터(길이 2.5-3.8cm)를 사용할 수 있습니다11. 캐뉼라를 캐뉼라 펜에 조립하고 펜의 표시등을 켭니다(그림 2).
- 작은 수술용 집게와 파스퇴르 피펫을 70% 알코올로 소독하여 준비합니다.
2. 시험 화합물의 제조
- LPS 3mg을 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2) 1mL에 무게를 달아 용해시켜 3mg/mL 농도의 LPS 용액을 형성합니다.
- 펜토바르비탈 나트륨 10mg을 생리식염수 1mL에 칭량하여 용해시켜 1% 펜토바르비탈 나트륨 용액을 만듭니다. 0.45μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터 멸균합니다.
3. 비침습적 구인두 점적
- 50 mg/kg의 용량으로 1% 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 마우스를 마취시킨다12,13. 정정 반사에 대한 반응의 부족으로 마취의 깊이를 결정하십시오.
- 마취된 마우스를 삽관 플랫폼에 놓습니다. 위쪽 앞니는 실로 고정하고 앞발 두 개는 고무줄로 고정합니다(그림 3).
- 핀셋으로 혀를 당겨 왼손으로 잡습니다. 캐뉼라를 입을 따라 오른손을 위로 올려 하악 후두개까지 천천히 밉니다. 캐뉼라 펜의 빛을 사용하여 기관을 찾아 천천히 기관에 삽입합니다(그림 4).
- 캐뉼라를 기관에 삽입한 후 삽관 펜을 천천히 빼내고 캐뉼라를 안에 둡니다. 파스퇴르 피펫을 캐뉼라 조인트에 삽입하고 헤드를 누릅니다(그림 5).
참고: 마우스의 가슴이 부풀어 오르면 삽관이 성공한 것입니다(그림 6). - 성공적인 기관내 삽관 후, 납작한 머리 미세 주사기를 사용하여 캐뉼라를 통해 3 mg/kg의 3 mg/mL LPS를 마우스에 주입합니다14,15 (그림 7).
- 완료되면 캐뉼라와 미세 주사기를 제거합니다. 스캐폴드에서 마우스를 제거하고 별도로 케이지에 넣어 복구합니다. 마우스가 회복되고 의식을 회복 할 때까지 마우스의 호흡 상태를 관찰하십시오.
참고: LPS 기관 점적 후 12시간에 동물 윤리 위원회에서 승인한 절차에 따라 마우스를 안락사시킵니다. 혈청 TNF-α 분석 및 건식-습식 폐 중량 측정은 표준 절차를 사용하여 수행하였다.
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Representative Results
마우스에 LPS 점적을 위해 제안된 방법은 LPS 점적 후 12시간 후에 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현과 폐건습윤 중량비를 평가하여 검증하였다. 실험에는 4개의 그룹이 있었다: 블랭크 대조군(치료 없음), 외과적 삽관 16, 비강내 삽관17,18 및 비침습적 구인두삽관(n = 6). 블랭크 대조군과 비교하여, 비침습성 구인두 삽관군에서 혈청 TNF-α 수치가 유의하게 증가하였다(도 8A). 폐 건식-습식 중량 비율도 증가하여(그림 8B), 외과적 기관 삽관 그룹과 동일한 수준에 도달했습니다. 데이터 세트는 짝을 이루지 않은 ANOVA와 사후 다중 비교 Tukey Kramer 테스트를 사용하여 통계적으로 분석되었습니다. 모든 데이터는 SEM± 평균으로서 제시되고, 0.05< p의 수준은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
그림 1: 삽관 플랫폼 피팅 및 조립. 플랫폼은 받침대, 라이저, 종이 클립, 두 개의 고무 밴드 및 일부 끈으로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 삽관 키트. 이 그림은 삽관 키트와 그 조립을 보여줍니다. 여기에는 펜 램프, 광섬유 및 캐뉼라가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스 고정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 기관 찾기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 파스퇴르 피펫 펌프 확인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 성공적인 삽관을 보여주는 흉부 전후 이미지. (A) 삽관 전 가슴. (B) 삽관 후 흉부; 가슴의 부풀어 오른 부분을 보여주는 영역은 빨간색 원으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: LPS 전달을 위한 플랫 헤드 마이크로샘플러. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 비침습적 LPS 점적의 타당성 평가 . (A) LPS의 기관내 주사 12시간 후 C57BL/6 마우스의 혈청에서 TNF-α의 발현. (B) 폐 조직 건식-습윤 중량비의 데이터 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
처음에는 기관19의 위치를 찾기 위해 구강 내부를 조사했습니다. 그러나, 이 과정 동안, C57/BL 마우스의 기관이 좁아서, 내시경(20)과 같은 장비의 도움 없이는 이 방법으로 정확한 위치를 찾기가 어렵다는 것을 발견하였다. 추가 탐사를 통해 삽관 램프의 빛이 신체 표면을 관통하여 작업자가 캐뉼라(21)의 위치를 결정할 수 있음을 발견했습니다.
튜브가 기관에 들어 갔는지 확인하기 위해 처음에는 작은 거울을 사용하여 얼음 위에 올려 놓아 식혔습니다. 삽관 후 거울을 사용하여 캐뉼라 입구에 접근했습니다. 거울에 안개가 나타나면 삽관이 성공한 것으로 간주됩니다. 그러나 이 검사 방법으로는 캐뉼라가 기관에 들어갔는지 여부를 정확하게 판단할 수 없다는 것을 발견했습니다. 첫째, 캐뉼라 헤드가 마우스의 입에 가까웠고, 거울에 나타난 안개가 입에서 내뿜는 가스로 인한 것인지 여부를 확인할 수 없었습니다. 둘째, 거울을 식혀야 했습니다. 지속적으로 사용하면 거울을 식히는 데 필요한 시간도 실험 시간이 늘어났습니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 사용하여 기관으로 공기를 펌핑했습니다. 캐뉼라가 기관에 삽입되면 마우스의 가슴이 부풀어 오르고, 식도에 삽입되면 오른쪽 하복부가 부풀어 오른다22. 따라서 삽관의 성공 여부를 판단하기 위한 기준으로 이 방법을 사용하였다.
외과적 기관 삽관과 비교하여, 비침습적 구인두 삽관은 수술 상처를 피하고 실험동물의 생존율을 향상시킨다23. 비강 삽관과 비교하여, 비침습적 구인두 삽관은 캐뉼라가 기관지와 폐로 더 정확하게 들어갈 수 있도록 한다24. 그러나 이러한 기술을 습득하려면 많은 연습이 필요합니다. 몸집이 작은 생쥐의 경우 캐뉼라를 기관에 삽입하는 것이 어렵고 수술 중에 기관을 쉽게 긁을 수 있습니다. 따라서 실험을 위해 더 큰 체형의 마우스를 선택하는 것이 좋습니다.
이 방법은 또한 기관지와 폐에 다른 액체 약물을 전달하는 데 사용될 수 있으므로 광범위한 응용 가능성이 있음을 의미합니다25,26.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (No.: 81903902), 중국 박사후 과학 재단 (No.: 2019M663457), 쓰촨 과학 기술 프로그램 (No.: 2020YJ0172) 및 청두 중의학 대학의 Xinglin Scholar Research Premotion Project(No.: QJRC2022053)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
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