Summary
Burada, noninvaziv orofaringeal endotrakeal entübasyon yoluyla intratrakeal lipopolisakkarit (LPS) doğumu için bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, hayvan için cerrahi prosedürün travmasını en aza indirir ve LPS'yi trakeaya ve daha sonra akciğerlere doğru bir şekilde iletir.
Abstract
Lipopolisakkarit (LPS) veya endotoksin tarafından indüklenen akut akciğer hasarı (ALI) fare modeli, akut akciğer hasarı veya akut inflamasyon ile ilgili hayvan çalışmalarında hala en sık kullanılan modeller arasındadır. Akut akciğer hasarlı fare modellerinde en sık kullanılan yöntemler, LPS'nin intraperitoneal enjeksiyonu ve LPS'nin trakeal infüzyonu için trakeostomidir. Bununla birlikte, ilk yöntem akciğer hedeflemesinden yoksundur ve diğer organlara zarar verir ve ikinci yöntem operatif travmaya, enfeksiyon riskine ve düşük sağkalım oranına neden olur. Burada, farelerde LPS instilasyonu için noninvaziv bir orofaringeal endotrakeal entübasyon yöntemi öneriyoruz. Bu yöntemde LPS, endotrakeal entübasyon için bir aparat yardımıyla akciğere aşılanmak üzere orofaringeal boşluktan trakeaya noninvaziv olarak sokulur. Bu yöntem sadece akciğer hedeflemesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda hayvanlarda hasarı ve ölüm riskini de önler. Bu yaklaşımın akut akciğer hasarı alanında yaygın olarak kullanılmasını bekliyoruz.
Introduction
Akut akciğer hasarı (ALI) sık görülen bir klinik sendromdur. Çeşitli patojenik faktörler altında, akciğer epitel hücrelerinin ve vasküler endotel hücrelerinin fizyolojik bariyerinin bozulması, alveoler geçirgenliğin artmasına neden olur, böylece akciğer kompliyasının azalmasına, pulmoner ödem ve ciddi hipoksemiye neden olur1. Akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) ALI'nin en şiddetli formudur. Kontrolsüz inflamasyon ve oksidatif stres hasarı, ALI'nin ve daha şiddetli ARDS2'nin ana nedenleri olarak kabul edilir. Alveoler epitel hücreleri travma nedeniyle doğrudan yaralandığında, alveoler makrofajların enflamatuar yanıt zinciri aktive olur ve akciğerde iltihaplanmaya yol açar3. Küresel olarak, yılda 3 milyondan fazla akut ARDS'li hasta vardır ve yoğun bakım ünitesi başvurularının yaklaşık% 10'unu oluşturmaktadır; Ek olarak, ağır vakalarda ölüm oranı% 46 kadar yüksektir4,5,6. Bu nedenle, patogenezini incelemek için uygun bir ALI hayvan modeli oluşturmaya ihtiyaç vardır. Fare, ALI çalışmasında en yaygın kullanılan deney hayvanıdır, çünkü solunum yolu ALI çalışmaları için insan solunum yolunu iyi simüle edebilir. Ayrıca, ALI masif inflamatuar hücre infiltrasyonu, artmış pulmoner vasküler geçirgenlik ve pulmoner ödem olarak kendini gösterir. Serumdaki inflamatuar sitokinlerdeki değişiklikler ve akciğer kuru-ıslak ağırlık oranı ALI7 derecesini yansıtır.
Şu anda, farelerde LPS'ye bağlı ALI'yi modellemek için ana yöntemler arasında intranazal ve cerrahi trakeal entübasyon 8,9 bulunmaktadır. Burada, noninvaziv orofaringeal entübasyon yoluyla trakeaya LPS vermek için yeni bir yöntem öneriyoruz. Bu yöntem, farenin trakeasını bulmak için ışıklı bir entübatör kullanır ve daha sonra LPS'yi trakea ve akciğere iletir. Bu yöntem, LPS'yi akciğerlere intranazal doğum yönteminden daha doğru bir şekilde iletir. Cerrahi trakeal entübasyon ile karşılaştırıldığında, bu yöntem ameliyat gerektirmez, yaralara neden olmaktan kaçınır ve farelerde ağrıyı azaltır10. Bu nedenle, bu yöntem ALI'nin daha ikna edici bir fare modelini oluşturmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyi protokolü, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Yönetim Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Kayıt No. 2021-11). Bu çalışmada erkek C57/BL fareler (20-25 g, 6-8 haftalık) kullanıldı. Fareler bir hayvan odasında tutuldu ve deney sırasında içmek ve yemek yemekte özgürdüler.
1. Hazırlık
- Entübasyon platformunun bir taban, bir yükseltici, bir ataş, iki lastik bant ve bazı iplerden oluştuğundan emin olun. Bir ip alın, ipi yükselticinin üstündeki iki delikten geçirin ve ipin iki ucunu sırasıyla yükselticinin üstündeki küçük çıkıntılara bağlayın.
NOT: Fare kafasının ip ile iki delik arasından geçmesi için yer bırakın. - Ataşın her iki ucuna iki lastik bant bağlayın ve ataşları lastik bantlarla yükselticinin arkasına bantlayın. Son olarak, yükselticiyi tabana 90°'de sabitleyin (Şekil 1).
- Uygun boyut ve uzunlukta bir kanül seçin. 20−30 g'lık bir fare için, 22 G'lik bir kateter (2,5-3,8 cm uzunluğunda) kullanılabilir11. Kanülü bir kanül kalemi üzerine monte edin ve kalemin ışığını açın (Şekil 2).
- Küçük cerrahi forseps ve Pasteur pipetini %70 alkolle dezenfekte ederek hazırlayın.
2. Test bileşiğinin hazırlanması
- 3 mg / mL konsantrasyona sahip bir LPS çözeltisi oluşturmak için 3 mg LPS'yi 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.2) içinde ağırlıklandırın ve çözün.
- % 1'lik bir pentobarbital sodyum çözeltisi oluşturmak için 10 mg pentobarbital sodyumu 1 mL normal salin içinde tartın ve çözün. 0,45 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak çözeltiyi filtreleyin-sterilize edin.
3. Noninvaziv orofaringeal instilasyon
- Fareleri, 50 mg/kg12,13 dozunda %1 pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Anestezinin derinliğini, doğru reflekse yanıt eksikliği ile belirleyin.
- Anestezi uygulanan fareyi entübasyon platformuna yerleştirin. Üst ön dişleri iplikle ve iki ön ayağı lastik bantlarla sabitleyin (Şekil 3).
- Dili cımbızla dışarı çekin ve sol elinizle tutun. Kanülü yavaşça, ağız boyunca, sağ elinizle mandibuler epiglottiste doğru itin. Trakeayı bulmak için kanül kaleminin ışığını kullanın ve yavaşça trakeaya yerleştirin (Şekil 4).
- Kanül trakeaya yerleştirildikten sonra, entübasyon kalemini yavaşça çekin ve kanülü içeride bırakın. Pasteur pipetini kanül eklemine yerleştirin ve kafaya bastırın (Şekil 5).
NOT: Farenin göğsü şişerse, entübasyon başarılı olur (Şekil 6). - Başarılı endotrakeal entübasyondan sonra, düz başlı bir mikroşırınga14,15 kullanarak farelere kanül yoluyla 3 mg / kg'da 3 mg / mL LPS aşılayın (Şekil 7).
- İşiniz bittiğinde, kanülü ve mikro şırıngayı çıkarın. Fareyi iskeleden çıkarın ve kurtarmak için ayrı bir kafese yerleştirin. İyileşene ve vicdanını yeniden kazanana kadar farenin solunum durumunu gözlemleyin.
NOT: LPS trakeal instilasyondan 12 saat sonra, hayvan etik komitesi tarafından onaylanan prosedürü izleyerek fareleri ötenazi yapın. Serum TNF-α testleri ve kuru-ıslak akciğer ağırlığı ölçümleri standart prosedürler kullanılarak yapıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farelerde LPS instilasyonu için önerilen yöntem, LPS damlatılmasından 12 saat sonra inflamatuar sitokin TNF-α ekspresyonu ve akciğer kuru-ıslak ağırlık oranı değerlendirilerek doğrulanmıştır. Deneyde dört grup vardı: boş kontrol (herhangi bir tedavi olmadan), cerrahi entübasyon16, intranazal17,18 ve noninvaziv orofaringeal entübasyon (n = 6). Boş kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, noninvaziv orofaringeal entübasyon grubunda serum TNF-α düzeyleri anlamlı olarak artmıştır (Şekil 8A). Akciğer kuru-ıslak ağırlık oranı da artmış (Şekil 8B), cerrahi trakeal entübasyon grubundakiyle aynı seviyeye ulaşmıştır. Veri setleri eşlenmemiş ANOVA ve post-hoc çoklu karşılaştırmalı Tukey Kramer testleri ile istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Tüm veriler SEM ± ortalama olarak sunulmuş ve p < 0.05 düzeyi istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Resim 1: Entübasyon platformu bağlantı parçaları ve montajı. Platform bir taban, bir yükseltici, bir ataş, iki lastik bant ve bazı iplerden oluşur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Entübasyon kiti. Bu şekil entübasyon kitini ve montajını göstermektedir. Buna bir kalem lambası, bir optik fiber ve bir kanül dahildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fare sabitleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Trakeanın yerinin belirlenmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Pasteur pipet pompası doğrulaması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Başarılı entübasyonu gösteren göğüs öncesi ve sonrası görüntüsü . (A) Entübasyondan önce göğüs. (B) Entübasyon sonrası göğüs; Göğsün şişkinliğini gösteren alan kırmızı bir daire ile işaretlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: LPS sağlamak için düz kafalı mikro numune alma cihazı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Noninvaziv LPS instilasyonunun geçerliliğinin değerlendirilmesi . (A) LPS'nin endotrakeal enjeksiyonundan 12 saat sonra C57BL/6 farelerin serumunda TNF-α ekspresyonu. (B) Akciğer dokusu kuru-ıslak ağırlık oranının veri analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başlangıçta, trakea19'un yerini bulmak için ağız boşluğunun içine baktık. Bununla birlikte, bu işlem sırasında, C57 / BL farelerinin trakeasının dar olduğunu keşfettik, bu da endoskop20 gibi ekipmanların yardımı olmadan bu yöntemle doğru yeri bulmayı zorlaştırıyor. Daha fazla araştırma üzerine, entübatör lambasından gelen ışığın vücudun yüzeyine nüfuz edebileceğini ve operatörün kanül21'in konumunu belirlemesine izin verdiğini bulduk.
Tüpün trakeaya girip girmediğini kontrol etmek için, başlangıçta, buzun üzerine yerleştirilerek soğutulan küçük bir ayna kullanmayı denedik. Entübasyondan sonra kanül açıklığına yaklaşmak için ayna kullandık. Aynada sis belirirse, entübasyon başarılı kabul edildi. Bununla birlikte, bu inceleme yönteminin kanülün trakeaya girip girmediğini doğru bir şekilde belirleyemediğini gördük. İlk olarak, kanül başı farenin ağzına yakındı ve aynada görünen sisin ağızdan solunan gazdan kaynaklanıp kaynaklanmadığı belirlenemedi. İkincisi, aynanın soğutulması gerekiyordu. Sürekli kullanımda, aynayı soğutmak için gereken süre de deney süresinde bir artışa neden oldu. Daha sonra trakeaya hava pompalamak için bir Pasteur pipeti kullandık; kanül trakeaya sokulduğunda farenin göğsü şişer ve yemek borusuna sokulursa sağ alt karın22 şişer. Bu nedenle, entübasyonun başarılı olup olmadığını değerlendirmek için bu yöntemi temel olarak kullandık.
Cerrahi trakeal entübasyon ile karşılaştırıldığında, noninvaziv orofaringeal entübasyon cerrahi yaraları önler ve deney hayvanlarının hayatta kalma oranını arttırır23. İntranazal entübasyon ile karşılaştırıldığında, noninvaziv orofaringeal entübasyon, kanülün bronş ve akciğerlere daha doğru girmesine yol açar24. Bununla birlikte, bu teknik becerilere hakim olmak çok fazla pratik gerektirir. Küçük vücut boyutlarına sahip farelerde, kanülün trakeaya sokulması zordur ve operasyon sırasında trakeayı kolayca çizebilir. Bu nedenle, deney için daha büyük vücut boyutlarına sahip farelerin seçilmesi gerektiğini öneriyoruz.
Yöntem ayrıca bronş ve akciğere diğer sıvı ilaçları vermek için de kullanılabilir, bu nedenle geniş uygulama potansiyeline sahip olduğu anlamına gelir25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.: 81903902), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No.: 2019M663457), Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (No.: 2020YJ0172) ve Chengdu TCM Üniversitesi Xinglin Scholar Research Premotion Projesi (No.: QJRC2022053) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
