Candidatus Liberibacter asiaticus", CLas, huanglongbing, HLB, Citrus tristeza virus, CTV, scientific video journal" />

Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatisering van citrus budwood verwerking voor downstream pathogene detectie door middel van instrument engineering

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

We hebben een instrument ontworpen, gefabriceerd en gevalideerd dat snel floëemrijke schors citrusknophoutweefsels verwerkt. In vergelijking met de huidige methoden heeft de budwood tissue extractor (AHO) de monsterdoorvoer verhoogd en de vereiste arbeids- en apparatuurkosten verlaagd.

Abstract

Overdraagbare, floëembeperkte pathogenen van citrusvruchten zoals virussen, viroïden en bacteriën zijn verantwoordelijk voor verwoestende epidemieën en ernstige economische verliezen wereldwijd. Het citrus tristeza-virus doodde bijvoorbeeld wereldwijd meer dan 100 miljoen citrusbomen, terwijl "Candidatus Liberibacter asiaticus" Florida $ 9 miljard heeft gekost. Het gebruik van op ziekteverwekkers getest citrusknophout voor boomvermeerdering is de sleutel tot het beheer van dergelijke pathogenen. Het Citrus Clonal Protection Program (CCPP) aan de Universiteit van Californië, Riverside, gebruikt polymerasekettingreactie (PCR) -testen om elk jaar duizenden monsters van citrusknophoutbronbomen te testen om de citrusvruchten van Californië te beschermen en om schone vermeerderingseenheden te leveren aan het National Clean Plant Network. Een ernstig knelpunt in de high-throughput moleculaire detectie van citrusvirussen en viroïden is de stap van de verwerking van plantenweefsel.

Een goede weefselvoorbereiding is van cruciaal belang voor de extractie van hoogwaardige nucleïnezuren en downstream gebruik in PCR-testen. Plantenweefsel hakken, wegen, vriesdrogen, malen en centrifugeren bij lage temperaturen om nucleïnezuurafbraak te voorkomen is tijdsintensief en arbeidsintensief en vereist dure en gespecialiseerde laboratoriumapparatuur. Dit artikel presenteert de validatie van een gespecialiseerd instrument dat is ontworpen om snel floëemrijke schorsweefsels van citrusknophout te verwerken, de budwood tissue extractor (AHO). De AHO verhoogt de monsterdoorvoer met 100% in vergelijking met de huidige methoden. Bovendien vermindert het de arbeid en de kosten van apparatuur. In dit werk hadden de AHO-monsters een DNA-opbrengst (80,25 ng / μL) die vergelijkbaar was met het handhakkende protocol van de CCPP (77,84 ng / μL). Dit instrument en het snelle plantenweefselverwerkingsprotocol kunnen verschillende citrusdiagnoselaboratoria en -programma's in Californië ten goede komen en een modelsysteem worden voor weefselverwerking voor andere houtachtige meerjarige gewassen wereldwijd.

Introduction

Transplantaat-overdraagbare floëem-beperkte pathogenen van citrusvruchten, zoals viroïden, virussen en bacteriën, hebben verwoestende epidemieën en ernstige economische verliezen veroorzaakt in elk citrusproducerend gebied van de wereld. Citrusviroïden beperken de productiefactoren vanwege de exocortis- en cachexieziekten die ze veroorzaken in economisch belangrijke citrussoorten, zoals trifoliaat, trifoliaathybriden, mandarijnen, clementines en mandarijnen 1,2,3. In Californië vormen deze viroïde-gevoelige citrussoorten de basis van de groeiende en winstgevende markt van "easy-peelers", in navolging van de veranderende trend in de voorkeur van consumenten voor fruit dat gemakkelijk te schillen, gesegmenteerd en pitloos is 4,5,6. Zo worden citrusviroïden gereguleerd onder het California Department of Food and Agriculture (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140", en de laboratoria van CDFA's Plant Pest Diagnostics Branch voeren jaarlijks duizenden citrusviroïde tests uit 7,8,9,10 . Citrus tristeza virus (CTV) is verantwoordelijk voor de dood van meer dan 100 miljoen citrusbomen sinds het begin van de wereldwijde epidemie in de jaren 1930 3,9,10,11. In Californië vormen stengelputjes en trifoliate brekende resistentie-isolaten van het virus een ernstige bedreiging voor de $ 3,6 miljard Californische citrusindustrie12,13,14. Bijgevolg classificeert CDFA CTV als een gereguleerde klasse-A plantenplaag en voert het laboratorium van het Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) elk jaar uitgebreide veldonderzoeken en duizenden virustests uit15,16. De bacterie "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) en de huanglongbing (HLB) -ziekte hebben naar schatting bijna $ 9 miljard aan economische schade aan Florida veroorzaakt als gevolg van een vermindering van 40% van het citrusareaal, een afname van 57% in citrusactiviteiten en een verlies van bijna 8.000 banen17,18. In Californië werd voorspeld dat een hypothetische vermindering van 20% van het citrusareaal als gevolg van HLB zou resulteren in meer dan 8.200 banenverlies en een vermindering van meer dan een half miljard dollar in het bruto binnenlands product van de staat. Daarom besteedt het Citrus Pest and Disease Prevention Program jaarlijks meer dan $ 40 miljoen aan enquêtes om CLas uit Californië te testen, detecteren en uitroeien 14,17,19,20.

Een belangrijk element van het beheer van citrusviroïden, virussen en bacteriën is het gebruik van pathogeen-getest teeltmateriaal (d.w.z. budwood) voor de productie van bomen. Op pathogenen getest citrusknophout wordt geproduceerd en onderhouden binnen uitgebreide quarantaineprogramma's die geavanceerde eliminatie- en detectietechnieken voor pathogenen gebruiken10,21. Het Citrus Clonal Protection Program (CCPP) aan de Universiteit van Californië, Riverside, test elk jaar duizenden knophoutmonsters van citrusvariëteiten die nieuw zijn geïmporteerd in de staat en de VS, evenals citrusknophoutbronbomen, om de citrusvruchten van Californië te beschermen en de functies van het National Clean Plant Network for Citrus10,17,22 te ondersteunen. Om het grote volume van citrustests aan te kunnen, zijn high-throughput, betrouwbare en kosteneffectieve pathogene detectietests een fundamenteel onderdeel voor het succes van programma's zoals de CCPP 7,10,22.

Hoewel moleculaire pathogene detectietests zoals polymerasekettingreactie (PCR) hebben gezorgd voor een aanzienlijke toename van de doorvoer in fabrieksdiagnoselaboratoria, is in onze ervaring een van de meest kritieke knelpunten bij de implementatie van protocollen met hoge doorvoer de verwerkingsstap van plantenweefselmonsters. Dit geldt met name voor citrus omdat de momenteel beschikbare protocollen voor de verwerking van floëemrijke weefsels zoals bladstelen en knophoutschors arbeidsintensief en tijdrovend zijn en dure en gespecialiseerde laboratoriumapparatuur vereisen. Deze protocollen vereisen handhakken, wegen, vriesdrogen, malen en centrifugeren bij lage temperaturen om nucleïnezuurafbraak te voorkomen 8,23,24. In het CCPP-diagnoselaboratorium omvat monsterverwerking bijvoorbeeld (i) handhakken (6-9 monsters / h / operator), (ii) vriesdrogen (16-24 h), (iii) verpulvering (30-60 s) en (iv) centrifugeren (1-2 h). Het proces vereist ook gespecialiseerde benodigdheden (bijv. Heavy-duty safe-lock buizen, roestvrijstalen slijpballen, adapters, messen, handschoenen) en meerdere kostbare laboratoriumapparatuur (bijv. Ultra-lage vriezer, vriesdroger, weefselvergruizer, vloeibare stikstof cryostation, gekoelde centrifuge).

Zoals in elke branche zijn equipment engineering en de automatisering van processen de sleutel tot het verlagen van de kosten, het verhogen van de doorvoer en het leveren van hoogwaardige, uniforme producten en diensten. De citrusindustrie heeft goedkope weefselverwerkingsinstrumenten nodig die minimale vaardigheid vereisen om te werken en als zodanig gemakkelijk kunnen worden overgedragen aan diagnostische laboratoria en veldoperaties om een hoge monsterverwerkingscapaciteit mogelijk te maken voor snelle downstream pathogeendetectie. Technology Evolving Solutions (TES) en de CCPP ontwikkelden (d.w.z. ontwerpen en fabriceren) en valideerden (d.w.z. getest met citrusmonsters en vergeleken met standaard laboratoriumprocedures) een goedkoop (d.w.z. elimineerden de behoefte aan gespecialiseerde laboratoriumapparatuur) instrument voor de snelle verwerking van floëemrijke citrusweefsels (d.w.z. budwood), genaamd de budwood tissue extractor (AHO). Zoals te zien is in figuur 1, bevat de AHO een basiscomponent voor voeding en bedieningselementen, plus een verwijderbare kamer voor de verwerking van citrusknophout. De AHO-kamer bestaat uit een slijpschijf die speciaal is ontworpen om de floëemrijke schorsweefsels van het citrusknophout te strippen. Het versnipperde schorsweefsel wordt snel uitgeworpen via een schuifpoort in een spuit met extractiebuffer, gefilterd en klaargemaakt voor nucleïnezuurextractie en -zuivering zonder extra behandeling of voorbereiding (figuur 1). Het AHO-systeem omvat ook een papierloze monstervolgtoepassing en een geïntegreerde weegtoepassing, die de monsterverwerkingsinformatie in realtime in een online database registreert.

Het AHO-systeem heeft de laboratoriumdiagnostische capaciteit van het CCPP met meer dan 100% verhoogd en heeft consequent citrusweefselextracten geproduceerd die geschikt zijn voor de zuivering van hoogwaardige nucleïnezuren en de downstream-detectie van transplantaatoverdraagbare pathogenen van citrusvruchten met behulp van PCR-assays. Meer specifiek heeft AHO de tijd voor weefselverwerking teruggebracht van meer dan 24 uur tot ~ 3 minuten per monster, laboratoriuminstrumenten vervangen die meer dan $ 60.000 kosten (figuur 2, stappen 2-4) en de verwerking van grotere monstergroottes mogelijk gemaakt.

Dit artikel presenteert de AHO-high-throughput citrusschorsweefselverwerking, nucleïnezuurextractie en validatiegegevens voor pathogeendetectie met citrusknophoutmonsters van bronbomen, inclusief alle geschikte positieve en negatieve controles van respectievelijk de CCPP Rubidoux Quarantine Facility en Lindcove Foundation Facility. We presenteren ook de veranderingen in doorvoer en verwerkingstijd ten opzichte van de huidige laboratoriumprocedure (figuur 2). Bovendien biedt dit werk een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor testlaboratoria voor citruspathogenen en laat het zien hoe de AHO de functies van pathogeen-schone kwekerijen, enquête en uitroeiingsprogramma's kan ondersteunen.

Figure 1
Figuur 1: Budwood tissue extractor. De AHO bevat een basiscomponent voor voeding en bedieningselementen, plus een verwijderbare kamer voor de verwerking van citrusknophout. De AHO-kamer bestaat uit een slijpschijf die speciaal is ontworpen om de floëemrijke schorsweefsels van citrusknophout te strippen. Het versnipperde schorsweefsel wordt snel door een schuifpoort in een spuit geworpen, gefilterd en klaargemaakt voor nucleïnezuurextractie en -zuivering zonder extra hantering of voorbereiding. Afkorting: AHO = budwood tissue extractor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Stapsgewijze vergelijking tussen de conventionele hand-hak lab procedure en AHO verwerking. AHO-verwerking omvat high-throughput citrusschorsweefselverwerking, nucleïnezuurextractie en detectie van pathogenen. De tijd voor elke stap wordt tussen haakjes aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Het verzamelen van de citrusknophoutmonsters om te verzenden

  1. Stuur Technology Evolving Solutions een spreadsheet met boominformatie die ze op hun webserver kunnen laden (uiteindelijk zal de gebruiker nieuwe bomen maken).
  2. Gebruik de TES-tracker van de telefoonapp om een boom te selecteren en houd een NFC-halsband (Near Field Communication) tegen de telefoon om de boominformatie in de tag te laden.
  3. Steek drie tot vier citrusknophoutmonsters in de AHO-compatibele plastic zakdrager en sluit met het deksel.
    1. Zorg ervoor dat de lengte van het knophout niet groter is dan 8 inch en niet minder dan 5 inch.
      1. Als de lengte groter is dan 8 inch, gebruik dan een steriel wegwerpscheermesje of een snoeischaar die is ontsmet met 10% bleekoplossing (1% natriumhypochloriet) om het korter te maken.
      2. Als de lengte minder dan 5 inch is, verzamel dan een ander knophoutmonster om in de zak te doen.
    2. Zorg ervoor dat eventuele okselgroei of grote doornen met de hand worden verwijderd of met behulp van 10% bleekmiddel (1% natriumhypochloriet).
      OPMERKING: Deze stap is belangrijk zodat het knophout gemakkelijker te manoeuvreren is in de opening van de kamer.
    3. Zorg ervoor dat er geen knophoutmonsters zijn met gebogen kenmerken. Als ze dat doen, verwijder ze dan met 10% bleekmiddel ontsmet snijgereedschappen (1% natriumhypochloriet) en plaats in de AHO-zakken alleen de rechte delen van het monster.
      OPMERKING: Gebogen knophout is zeer moeilijk in het instrument te manoeuvreren, wat resulteert in ongelijke schorsstrepen.
  4. Gebruik de TES-tracker van de telefoonapp om de NFC-halsbandtag van de boom te scannen en deze te koppelen aan de NFC-cliptag op de monsterzak.
  5. Let op de dikte van het knophout, want dat bepaalt hoe de operator de floëemrijke knophoutschors in de AHO-kamer zal strippen.
    1. Als het knophout een dikte heeft van minder dan 0,20 inch, wees dan voorzichtig bij het strippen van het knophout, omdat de snelle draaiende draden in de kamer het hele knophout tot zijn kern zullen verpulveren, voorbij de schorslaag en in de niet-floëemrijke weefsels van hout en merg.
    2. Selecteer dikker knophout omdat het gemakkelijker is om de schorsweefsels te strippen terwijl de niet-floëemrijke knophoutweefsels worden vermeden.
  6. Plaats de monsters in een geïsoleerde zeecontainer met een paar ijspakken.

2. Opstelling in de zuurkast

OPMERKING: Het heeft de voorkeur om de AHO in een zuurkast te bedienen. Dit vermindert het risico op kruisbesmetting van plantenweefsel en laboratoriumbesmetting.

  1. Desinfecteer met een 10% (1% natriumhypochloriet) spuitfles.
    1. Spuit het oppervlak van de kap en laat het bleekmiddel ongeveer 1 minuut zitten voordat je het afveegt met een papieren handdoek.
    2. Besproei een papieren handdoek met de bleekoplossing. Veeg de TE-basis, onderdelen van de weegschaal (weegschaal, luchtschild en toren) en een markeerpen schoon.
  2. Pak een spuitset uit voor het aantal te verwerken monsters en plaats ze in een afgedekte kartonnen doos.
  3. Zorg dat er een pak wattenstaafjes beschikbaar is buiten de kap voor het geval ze nodig zijn.
  4. Bereid de weegschaal voor.
    1. Verwijder de gewichtstoren van de weegschaal en houd de aan/uit-knop ingedrukt om deze in te schakelen. Plaats de toren in het midden van de schaal nadat de schaal 0 weergeeft.
    2. Schuif het luchtscherm van de weegschaal over de voorkant van de weegschaal.
  5. Bereid de weefselextractorbasis voor door de schakelaar aan de achterkant om te draaien. Zorg ervoor dat de schakelaar aan de linkerkant van de doos aan de bovenkant is ingedrukt. Wacht op een knipperende groene LED, die aangeeft dat de kamer klaar is.

3. Stel de reinigingsstations in (aanvullende figuur S1).

  1. Plaats 1 L water in de ultrasone reiniger.
  2. Wikkel twee vuilniszakken over de bovenkant van de ultrasone reiniger.
  3. Giet ~ 5 L van 10% bleekmiddel (1% natriumhypochlorietoplossing) in de ultrasone reiniger.
  4. Vul het waterbad met voldoende water om een kamer onder te dompelen.
  5. Zet de luchtcompressor aan en open de klep.
  6. Zet een achtergrond op om de vloeistof op te vangen terwijl de kamer aan het drogen is.

4. Verwerking van het materiaal voor de AHO voor het strippen van citrusknophoutschors

  1. Laad de kamer op de AHO-basis.
    1. Bereid de AHO-kamer voor.
      1. Bevestig een lege monsterzak aan de achterkant van de kamer. Gebruik twee O-ringen om de lege zak aan het achterste mondstuk van de AHO-kamer te bevestigen.
      2. Inspecteer het mes op tekenen van slijtage of schade, zoals snijwonden die zich vormen op het mes waar het doorloopt in het plastic of snijwonden die zich vormen op de punt. Zorg ervoor dat de pijl op het blad is uitgelijnd met het enkele vergrendelingssymbool.
      3. Zorg ervoor dat de luchtafgifte op de bodem van de kamer naar het O-symbool is gedraaid. Plaats het doorzichtige deksel over de kameropening en schuif de doorzichtige AHO-schuif op de kamer met behulp van de rail aan de rechterkant van de kamer. Duw het slot aan de onderkant van de kamer zo ver mogelijk in de glijbaan. Zorg ervoor dat de zuigerdop aan de bovenkant van de glijbaan is gemonteerd.
    2. Plaats de kamer op de AHO-basis met het mondstuk van de AHO-basis dat uitsteekt in de achterkant van de kamer. Wacht tot de blauwe LED knippert, wat aangeeft dat de plaatsing is geslaagd.
  2. Laad het monster op de AHO-basis door de witte sticker op de NFC-cliptag naar een Z aan de rechterkant van de doos te verplaatsen. Verplaats de tag in een langzame cirkelvormige beweging op Z totdat het gele lampje begint te knipperen. Bevestig het monster aan de BTE-basis en zorg ervoor dat de monsterzak geen gaten bevat; Als er een gat is, patch het dan met tape. Plaats de O-ring over de monsterzak om deze aan de voorkant van het AHO-mondstuk te bevestigen.
  3. Plaats de ongebruikte spuitset.
    1. Tarra de spuitset. Plaats de ongebruikte spuitset op de weegschaaltoren. Verwijder de spuitset wanneer een rood lampje begint te knipperen of de weegschaal 0 aangeeft.
    2. Verwijder de zuiger uit de spuit met het filter. Zorg ervoor dat de vloeistof zich in de onderste (niet-filter) spuit bevindt. Plaats de zuiger opzij op een papieren handdoek of op de toren waar de zwarte zuiger geen oppervlakken raakt.
    3. Bevestig de spuit aan de schuifuitgangspoort door de uitgangspoort in de spuit te drukken en 90° te draaien.
  4. Verwerk het knophoutmonster.
    LET OP: AHO heeft bewegende delen met hoge snelheid. Alle bewerkingen moeten plaatsvinden in een zuurkast. Alle gebruikers moeten een beschermende bril, oorkappen (oordoppen) en alle andere persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) gebruiken, zoals handschoenen en laboratoriumjassen.
    1. Druk op de bovenste zwarte knop om het apparaat te starten. Druk een tweede keer om de motor op elk moment tijdens de verwerking te stoppen.
      OPMERKING: De doos heeft snelheids- en temperatuurdetectie om ervoor te zorgen dat deze goed functioneert.
    2. Pak een knopenhouten stokje door de zak en steek deze door de bovenkant van het AHO-mondstuk.
    3. Pak de knophouten stok aan de andere kant van de kamer met de andere hand en ga langzaam naar beneden in het mes. Luister naar een zacht zoemend geluid dat aangeeft dat het knophout van zijn schors wordt ontdaan. Beweeg het knophout langzaam heen en weer terwijl je het draait.
      1. Als er een luid, agressief hakgeluid wordt gehoord, verplaatst u de tak snel naar boven en/of drukt u op de bovenste knop om de motor te stoppen. Om de motor te stoppen, gebruikt u de schakelaar aan de rechterkant om de verwerking te voltooien (zie stap 4.4.3.2).
      2. Als er tijdens het snijden geen materiaal uit de uitgang komt, heeft de kamer een verstopping. Schakel de motor uit, verwijder de schuifdop van de zuiger en gebruik het plastic van het wattenstaafje om de verstopping uit de uitgang van de machine te duwen. Gebruik de schakelaar aan de rechterkant om de verwerking te voltooien: Omhoog = Voorwaarts snijden; Midden = Motor uit; Omlaag = omgekeerd snijden.
    4. Herhaal stap 4.4.2 en stap 4.4.3 voor de overige vertakkingen.
      OPMERKING: Een algemene indicator dat voldoende knophoutschors is gestript, is wanneer 25% van de spuit is gevuld met plantenweefsel. Overdraagbare ziekteverwekkers van citrusvruchten kunnen ongelijk verdeeld zijn in de boom. Daarom worden drie tot vier knophoutmonsters verzameld rond het bladerdak van de citrusboom. Het is belangrijk dat elk knophoutmonster in de AHO-draagzak bijdraagt aan het uiteindelijke grondweefselmonster om ervoor te zorgen dat een volledig boomrepresentatief monster wordt getest op ziekteverwekkers.
    5. Druk op de bovenste zwarte knop om de verwerking te stoppen. Wacht tot het lampje weer geel begint te knipperen.
  5. Controleer het gewicht van het monster.
    1. Draai de spuit 90° en trek hem naar beneden om los te maken. Plaats de zuiger terug op de spuit en plaats de spuit op de toren.
    2. Wacht tot de weegschaal het monster automatisch detecteert en bepaal of het binnen het juiste gewichtsbereik ligt (0,25 ± 0,05 g). Als het monstergewicht te laag is (<0,20 g), herhaalt u stap 4.4; de rode LED begint te knipperen. Als het monstergewicht te hoog is (>0,30 g), verwijdert u een deel van het monstermateriaal; de gele LED begint langzamer te knipperen. Als het monster zich binnen het bereik bevindt, begint de groene LED te knipperen.
  6. Homogeniseren van het knophoutmonster
    1. Verwijder de zuiger met het monster uit de spuit, duw de vloeistof met het monster in de spuit en voeg de zuiger opnieuw toe. De zuiger duwt de buffer en het plantensap door het gaasfilter (zonder grote stukken schorsweefsel) en via de rubberen slang in de lege spuit.
    2. Meng het monster door de buffer te duwen en plant sap heen en weer van de ene spuit naar de andere. Herhaal ~3x-4x en totdat het monster een homogeen groen vloeibaar mengsel wordt.
    3. Eenmaal goed gehomogeniseerd, duwt u het plantensapmonster in de spuit zonder het gaasfilter en maakt u de rubberen slang en de spuit met het filter los van de spuit met het monster.
    4. Haal het plantensapmonster uit de spuit in een steriele microcentrifugebuis van 2 ml en bewaar bij −20 °C tot verder gebruik. Gebruik een permanente marker om het monster te labelen met het zaknummer.
      OPMERKING: Het sap van het plantenmonster uit stap 4.6.5 kan nu worden verwerkt met een van de beschikbare nucleïnezuur-, RNA- of DNA-extractiemethoden op basis van fenol-chloroform, silicakolom of magnetische kralen 9,25,26,27 voor nucleïnezuurextractie en -zuivering (zie stap 7) en de downstream-detectie van entoverdraagbare pathogenen van citrusvruchten (zie stap 8).

5. Ontsmetten van de AHO verwijderbare kamer

LET OP: Als de buffer van de spuitset op de kamer komt of schuift, spoel dan af en volg alle veiligheidsregels van het laboratorium voordat u deze schoonmaakt. De spuitset bevat guanidinethiocyanaat. Als de buffer van de spuitset in contact komt met bleekmiddel, ontstaat er cyanidegas.

  1. Voer de volgende stappen uit nadat het 10e monster in de kamer is verwerkt. Houd er rekening mee dat de groene LED blijft knipperen in plaats van naar blauw knipperen te gaan.
  2. Demonteer de AHO-kamer om alle mogelijke verontreinigingen te reinigen; Verwijder het doorzichtige plastic deksel, wis de kamerschuif en maak de klompenpoort op de kamerschuif vrij.
  3. Draai de luchtafvoerklep aan de onderkant van de kamer naar de open stand (open hangslotmarkering). Plaats de kamercomponenten in de ultrasone reiniger (zie stap 3.1). Plaats het deksel onder de kamer om te voorkomen dat het gaat drijven. Laat de ultrasone reiniger 15 minuten draaien.
    OPMERKING: Het ultrasoon reinigingsbad (5 L) kan maximaal twee kamers bevatten.
  4. Spoel de kameronderdelen in het waterbad (stap 3.4) gedurende ten minste 30 s. Verplaats de kameronderdelen naar het droogstation.
    LET OP: Drogen veroorzaakt snel bewegende delen in de kamer, harde geluiden (~ 85 decibel [dB]) en mogelijk spatten. Alle gebruikers moeten beschermende brillen, oorkappen (oordoppen), laboratoriumjassen en alle andere PBM's gebruiken zoals vereist door de veiligheidsregels van het operationele laboratorium.
  5. Droog de AHO-kamer.
    1. Plaats het luchtpistool in lijn met de groef van de bovenste opening van de kamer (waar de schuif zich normaal gesproken zou bevinden). Druk op de trekker van het pistool om lucht af te geven gedurende ~ 30 s.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de opening uit de buurt van de gebruiker naar de achtergrond is. Dit moet de messet draaien om de vloeistof die eronder gevangen zit te verwijderen.
    2. Plaats het luchtpistool in de richting van de bovenste spuitmonden van de kamer. Druk op de trekker van het luchtpistool en volg langzaam drie volledige cirkels van elke ingang van het mondstuk.
    3. Plaats het luchtpistool in het midden van de AHO. Begin vanaf het binnenste punt, houd de trekker ingedrukt en beweeg totdat het luchtpistool naar de plaats van de glijbaan wijst.
    4. Laat snel lucht over de hele kamer lopen, voor en achter, om het oppervlaktewater van de buitenkant te krijgen.
  6. Droog de AHO-glijbaan.
    1. Plaats het luchtpistool in de zuigersleuf van de glijbaan en druk op de trekker om water uit de glijbaan te werpen.
    2. Laat een luchtpistool langs het binnenoppervlak van de glijbaan lopen om het te drogen.
    3. Laat een luchtpistool langs de glijgroef lopen om water naar buiten te duwen.
    4. Laat snel lucht over de hele buitenkant lopen om er oppervlaktewater vanaf te krijgen.
  7. Droog de componenten.
    1. Houd de schuifdop van de zuiger en de O-ringen in de hand en druk op de trekker.
    2. Laat een luchtpistool over het binnenoppervlak van het deksel lopen.
    3. Plaats de componenten in de kamer en schuif om verder te drogen of opnieuw te monteren.
      OPMERKING: Voor een omgeving met veel weefselverwerking met meerdere functionele BTE's kan een batchontsmettingssysteem worden geleverd dat in staat is om 10 kamers tegelijkertijd te ontsmetten.

6. Weggooien en ontsmetten

  1. Gooi de spuiten en rubberen slangen weg in de daarvoor bestemde guanidine-afvalcontainer.
  2. Gooi al het plantmateriaal weg in de biogevaarlijke afvalcontainer.
  3. Verwijder de AHO-kamer van de AHO-basis.
  4. Demonteer de AHO-kamer en ga verder met hun decontaminatie, zoals beschreven in stap 5.

7. Beoordeling van de weefselverwerking en de kwaliteit van RNA gezuiverd uit de AHO-citrusknophoutextracten

OPMERKING: In dit protocol hebben we knophoutmonsters van 255 citrusbomen gebruikt om de tijd te vergelijken die nodig is voor de verwerking van citrusknophoutweefsel en de kwaliteit van RNA gezuiverd uit schorsweefselextracten bereid door AHO (figuur 2, rechterkant, stap 1, stap 5 en stap 6) versus die bereid volgens de wettelijk goedgekeurde citrusknophout weefselverwerkingsmethode met behulp van handpeeling en hakken, vriesdrogen, verpulveren en centrifugeren van het schorsweefsel, zoals beschreven door Dang et al.23 (figuur 2, linkerkant, stappen 1-6).

  1. Huidige laboratoriumprocedure: Knophoutmonsters voorbereiden voor weefselverwerking volgens de wettelijk goedgekeurde methode23.
    1. Voer handpeeling en hakken van het schorsweefsel uit, vriesdrogen, verpulveren, centrifugeren en overbrengen van het plantensap naar de RNA-extractiebuis, zoals beschreven door Dang et al.23 (figuur 2, linkerkant, stappen 1-6).
    2. Nadat u de drie tot vier knophoutmonsters van elke geteste boom met de hand hebt afgepeld, plaatst u al het knophout in een AHO-compatibele plastic zakdrager en bewaart u deze bij 4 °C tot de AHO-verwerking (stap 7.2).
  2. AHO-procedure: Start de AHO-weefselverwerking van citrusknophout (sectie 4, stappen 4.1-4.6; Figuur 2, rechterkant, stap 1, stap 5 en stap 6).
    1. Gebruik de knophoutmonsters die zijn opgeslagen in de AHO-draagtassen uit stap 7.1.2.
  3. Extraheer en zuiver het RNA uit het plantensap verkregen uit de huidige laboratoriumprocedure (stap 7.1.1) en de AHO-procedure (stap 7.2.2) met behulp van de door de toezichthouder goedgekeurde semi-geautomatiseerde magnetische kralenmethode 8,23,28.
  4. Beoordeel de RNA-kwaliteit door de concentratie, zuiverheid en integriteit te meten 8,23,24,29,3 3,31.
    1. Gebruik voor het berekenen van de concentratie spectrofotometrie en optische dichtheid (OD) bij een golflengte van 260 nm.
    2. Gebruik voor het beoordelen van de zuiverheid een spectrofotometrische OD-verhouding van 260/280.
    3. Om de integriteit te controleren, gebruikt u reverse transcriptie (RT) kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) reactie gericht op het mRNA van het NADH-dehydrogenase citrusgen 24,32.

8. Beoordeling van de kruisbesmetting en detectie van citrusvirussen en viroïden met behulp van RNA gezuiverd uit AHO-extracten van citrusknophout

OPMERKING: In dit protocol hebben we knophoutmonsters gebruikt van 72 niet-geïnfecteerde citrusbomen en één boommix die is geïnfecteerd met virussen en viroïden om het potentieel van kruisbesmetting tussen monsters te beoordelen wanneer ze worden verwerkt door AHO (figuur 2, rechterkant, stap 1, stap 5 en stap 6) en de geschiktheid van RNA gezuiverd uit schorsweefselextracten bereid door AHO om te worden gebruikt als sjabloon voor de RT-qPCR-detectie van citrusvirussen en viroïden.

  1. Eerste AHO-monsterverwerking: Voer een basislijnexperiment uit met 72 niet-geïnfecteerde monsters.
    1. Bereid drie (A-C) BTE-kamers voor (stap 4.1.1).
    2. Bereid alle niet-geïnfecteerde citrusknophoutmonsters (1-72) voor in AHO-draagzakken en bereid een gelijk aantal (72) voor in het AHO-monsterafnamesysteem met twee spuiten, met één spuitsysteem voor elk monster (stap 2.4).
    3. Scheid de monsterdragerzakken en monsterverzamelingsspuiten in zes batches (I-VI) van elk 12 monsters.
    4. Start de AHO-citrusknophoutverwerking (stap 4) volgens de onderstaande volgorde (stappen 8.1.4.1-8.1.4.6) (zie tabel 1, eerste AHO-monsterverwerking).
      1. Voor batch I/monsters 1-12 verwerkt u 12 monsters met kamer A. Ontsmettingskamer A na monster 12 (stap 5).
      2. Verwerk voor batch II/monsters 13-24 12 monsters met kamer B. Ontsmettingskamer B na monster 24 (stap 5).
      3. Verwerk voor batch III/monsters 25-36 12 monsters met kamer C. Ontsmettingskamer C na monster 36 (stap 5).
      4. Voor batch IV/monsters 37-48 verwerkt u 12 monsters met behulp van de ontsmette kamer A (stap 8.1.4.1).
      5. Verwerk voor batch V/monsters 49--60 12 monsters met behulp van de ontsmette kamer B (stap 8.1.4.2).
      6. Verwerk voor batch VI/monsters 60-72 12 monsters met behulp van de ontsmette kamer C (stap 8.1.4.3).
    5. Bewaar de AHO-draagzakken met alle monsters bij 4 °C tot gebruik bij stap 8.2.
    6. Extraheer en zuiver het RNA uit de 72 plantensapmonsters die zijn gegenereerd in stappen 8.1.4.1-8.1.4.6 met behulp van de door de regelgevende instanties goedgekeurde semi-geautomatiseerde magnetische kralenmethode 8,23,28.
    7. Voer RT-qPCR uit voor de detectie van citrusvirussen en viroïden, zoals eerder beschreven 8,33.
  2. Voer voor de tweede AHO-monsterverwerking een kruisbesmettingsexperiment uit met 70 niet-geïnfecteerde monsters en twee gemengde geïnfecteerde monsters.
    1. Bereid drie (A-C) BTE-kamers voor (stap 4.1.1).
    2. Bereid het met het mengsel besmette citrusknophoutmonster (73) in twee AHO-draagzakken (stap 1.3) voor een totaal aantal van twee geïnfecteerde monsters.
    3. Verzamel de AHO-draagzakken met de niet-geïnfecteerde citrusknophoutmonsters van stap 8.1.5, met uitzondering van monster 3-batch I en monster 51-batch V (zie monstervervanging in stap 8.2.4), voor een totaal aantal van 70 niet-geïnfecteerde monsters.
    4. Voeg de eerste AHO-draagtas toe met het met de mix geïnfecteerde monster 73 in plaats van monster 3 in batch I en de tweede in plaats van monster 51 in batch V voor een totaal aantal van 72 monsters.
    5. Bereid een gelijk aantal (72) voor in het AHO-monsterafnamesysteem met twee spuiten, met één systeem met dubbele spuit voor elk monster (stap 2.4).
    6. Scheid de 72 monsterdragers en monsterverzamelingsspuiten in zes batches (I-VI) van elk 12 monsters.
    7. Start de AHO-weefselverwerking van citrusknophout (stap 4), volgens dezelfde volgorde als in de stappen 8.1.4.1-8.1.4.6.
      OPMERKING: Het enige verschil is de vervanging van monster 3 in batch I en monster 51 in batch V door het geïnfecteerde monster 73 (stap 8.2.4) (tabel 1, verwerking van tweede beetmonster).
    8. Extraheer en zuiver het RNA uit de 72 plantensapmonsters die in stap 8.2.7 zijn gegenereerd, zoals in stap 8.1.6.
    9. Voer RT-qPCR uit voor de detectie van citrusvirussen en viroïden, zoals in stap 8.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNA-extractie, zuivering en kwaliteit met behulp van BEO-verwerkt budwood citrusweefsel en beoordeling van de tijd voor weefselverwerking
We gebruikten knophoutmonsters van 255 representatieve citrusbomen voor deze test om de RNA-kwaliteit van de AHO te vergelijken met de standaardprocedure. Monsters werden verwerkt door de knophoutweefselextractor (AHO) (protocolstappen 4.1-4.6 en figuur 2, rechterkant, stap 1, stap 5 en stap 6) of bereid volgens de wettelijk goedgekeurde citrusknophoutweefselverwerkingsmethode, die gebruik maakt van handpeeling en hakken, vriesdrogen, verpulvering en centrifugeren van het schorsweefsel, zoals beschreven door Dang et al.23 (figuur 2, linkerkant, stappen 1-6).

De zij-aan-zij vergelijking van de AHO met het conventionele handhakken en laboratoriumapparatuurprotocol voor de verwerking van citrusweefsel toonde aan dat de kwaliteit (d.w.z. concentratie, zuiverheid en integriteit) van de geëxtraheerde nucleïnezuren (figuur 3A-C) en geschiktheid voor downstreamgebruik voor de PCR-detectie van citruspathogenen (gegevens niet weergegeven) vergelijkbaar waren. Tegelijkertijd werd de tijd die werd besteed aan het verwerken van monsters aanzienlijk verminderd met behulp van het TE/AHO-systeem. De AHO verdubbelde meer dan de monsterdoorvoer van het CCPP-laboratorium, waardoor de arbeids- en laboratoriumapparatuurkosten werden verminderd door de noodzaak van tienduizenden dollars aan instrumenten, zoals kralenkloppers, centrifuges en cryostations, te elimineren.

De met AHO geëxtraheerde nucleïnezuren hadden een gemiddelde concentratie van 76,96 ng/μL ± 26,23 ng/μL (n = 181) en waren zeer zuiver, met een lage eiwitverontreiniging (A260/A280 2,27 ± 0,17, n = 181) (figuur 3B,C). Deze waarden waren vergelijkbaar met de nucleïnezuren geproduceerd door het standaard handmatige protocol van CCPP (concentratie: 82,25 ng/μL ± 33,95 ng/μL, n = 181 en A260/A280 2,22 ± 0,10, n = 181) (Figuur 3B,C). De nucleïnezuurintegriteit (RT-qPCR voor het citrusgen nad5) was zeer vergelijkbaar voor AHO (Cq 20,97 ± 2,26, n = 181) en het standaard handmatige CCPP-protocol (Cq 19,25 ± 1,53, n = 181) (figuur 3A). De resultaten toonden ook aan dat het AHO-instrument in hetzelfde tijdsbestek een hoger monstervolume kon verwerken in vergelijking met de conventionele methode. De conventionele laboratoriumprocedure vereiste ~ 7-10 minuten voor het met de hand hakken per monster en een totaal van 12 minuten voor weefselverwerking (vriesdrogen, malen en centrifugeren), terwijl de AHO citrusweefsel kon verwerken voor nucleïnezuurextractie in ~ 3 minuten per monster.

Figure 3
Figuur 3: Kwaliteit van de nucleïnezuurextracten van de 181 representatieve citrusknophoutmonsters, zoals gedefinieerd door de concentratie, zuiverheid en integriteit. De monsters werden verwerkt door AHO en het conventionele hand-hak- en laboratoriumapparatuurprotocol. (A) De nucleïnezuurconcentratie werd bepaald met behulp van absorptie bij 260 nm; B) de zuiverheid werd bepaald als de verhouding tussen de absorpties bij 260 nm en 280 nm (A260/280). (C) De nucleïnezuurintegriteit werd geanalyseerd door RT-qPCR gericht op het mRNA van het NADH-dehydrogenase (Nad5) citrusgen. De bereiken van optimale waarden worden aangegeven tussen rode stippelcirkels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Detectie van ent-overdraagbare pathogenen van citrusvruchten, beoordeling van kruisbesmetting en detectie van citrusvirussen en viroïden met behulp van RNA gezuiverd uit AHO-citrusknophoutextracten
De validiteit van de weefselverwerkingsmethode werd geëvalueerd door 72 gezonde citrusknophoutmonsters naast alle gezonde monsters te verwerken en door twee monsters van een boommix die besmet was met virussen en viroïden (tabel 1 en figuur 4A, B). Nucleïnezuren geëxtraheerd uit beide batches werden onderworpen aan conventionele laboratoriumgebaseerde q-PCR zoals eerder beschreven 8,33. Geen van de 72 gezonde monsters van de eerste AHO-monsterverwerking gaf amplificatiecurves voor de geteste citruspathogenen (d.w.z. valse positieven) (figuur 4A). De resultaten suggereren dat de AHO citrusweefsel even goed kan verwerken in vergelijking met het standaard laboratoriumprotocol met handhakmethoden. In de tweede AHO-monsterverwerking beoordeelden we het potentieel voor kruisbesmetting tussen AHO-koppen en in monsters die met dezelfde AHO-kop werden verwerkt (stappen 1-6) en de geschiktheid van de nucleïnezuren voor downstream-toepassingen (d.w.z. voor gebruik als sjabloon voor de RT-qPCR-detectie van citrusvirussen en viroïden). In de tweede AHO-monsterverwerking met twee geïntroduceerde mix-geïnfecteerde monsters werden de nucleïnezuren geproduceerd door het AHO-protocol met succes gebruikt om verschillende citrusvirussen en viroïden te detecteren (bijv. Triplex-virus, citrusbladvlekvirus [CLBV], citrus psorosevirus [CPsV], citrus tristeza-virus [CTV]), apscaviroïden (citrusgebogen bladviroïde [CBLVd], citrusdwergviroïde [CDVd], citrusviroïde V [CVd-V], citrus viroïde VI [CVd-VI], en citrus viroïde VII [CVd-VII]), niet-apscaviroïden hop stunt viroïde (HSVd; hostuviroïde), citrusschors krakende viroïde (CBCVd; cocadviroïde) en citrus exocortis viroïde (CEVd; pospiviroïde) in batch 1 en batch 5. Binnen batch 1 en batch 5 waren monsters die volgden op de geïnfecteerde positief voor de bovengenoemde plantenziekten, maar hadden ze stijgende Cq-waarden. Er werd echter geen kruisbesmetting tussen koppen gedetecteerd, noch vals positieve of negatieve resultaten (figuur 4B).

Batch Monster BTE Eerste AHO Tweede AHO
Kamer Monsterverwerking Monsterverwerking
Ik 12-jan Een 1-12 Niet-geïnfecteerd 1-2 & 4-12 Niet-geïnfecteerd
Monster #3 wordt vervangen door mix geïnfecteerd
II 13-24 B 13-24 13-24
Niet-geïnfecteerd Niet-geïnfecteerd
III 25-36 C 25-36 25-36
Niet-geïnfecteerd Niet-geïnfecteerd
IV 37-48 A-Sanitized 37-48 37-48
Niet-geïnfecteerd Niet-geïnfecteerd
V 49-60 B-Ontsmet 49-60 49-50 & 52-60 Niet-geïnfecteerd
Niet-geïnfecteerd
Monster #51 is vervangen door mix geïnfecteerd
VI 61-72 C-Sanitized 61-72 Niet-geïnfecteerd 61-72 Niet-geïnfecteerd

Tabel 1: Gevolgde procedure voor de validatie van de BTE-weefselverwerkingsmethode met behulp van 72 citrusknophoutmonsters. Elke bewerking werd twee keer herhaald. Er waren 6 batches met elk 12 monsters. Bij de eerste monsterverwerking waren alle 72 citrusknophoutmonsters gezond. Bij de tweede BTE-monsterverwerking werden monster 3 en monster 51 vervangen door twee monsters van een boommix die besmet was met virussen en viroïden in batch 1 en batch 5.

Figure 4
Figuur 4: Validatie van de AHO-weefselverwerkingsmethode met behulp van 72 citrusknophoutmonsters. Elke bewerking werd twee keer herhaald. Er waren 6 batches met elk 12 monsters. (A) Alle 72 citrusknophoutmonsters waren gezond. B) Dezelfde 72 monsters van citrusknophout met de introductie van twee monsters van een boommix die besmet is met virussen en viroïden in batch 1 (monster 3) en batch 5 (monster 51). De NTC- en watercontroles hadden allemaal onbepaalde Cq-waarden (d.w.z. DNA-doelwit dat niet in het monster aanwezig was). De positieve controles voor de triplex (CLBV, CPsV, CTV) hadden Cq-waarden van respectievelijk 23,9, 25,2 en 22,4. De positieve controles voor apscaviroïden (CBLVd, CDVd en CBCVd) hadden Cq-waarden van respectievelijk 23,39, 21,27 en 25,17. De positieve controles voor niet-apscaviroïden (CEVd, HSVd, IV) hadden Cq-waarden van respectievelijk 26,9, 27,0 en 26,5. Afkortingen: AHO = budwood tissue extractor; NTC = controle zonder sjabloon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Opstelling reinigingsstation. Nadat het 10e monster in de kamer is verwerkt, moeten protocolstappen 3.1-3.6 worden gevolgd om het reinigingsstation voor te bereiden om de kamer te ontsmetten. Net als in protocolstap 3.1 wordt 1 L water in de ultrasone reiniger geplaatst. Twee vuilniszakken worden over de bovenkant van de ultrasone reiniger gewikkeld (protocolstap 3.2) en ~ 5 L 10% bleekmiddel (1% natriumhypochlorietoplossing) wordt in de ultrasone reiniger gegoten (protocolstap 3.3). Het waterbad wordt gevuld met voldoende water om een kamer onder te dompelen (protocolstap 3.4), de luchtcompressor wordt uitgeschakeld en de klep wordt geopend (protocolstap 3.5). Er wordt een achtergrond opgezet om de vloeistof op te vangen terwijl de kamer aan het drogen is (protocolstap 3.6). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met de komst van HLB-citrusziekte, om verliezen te verminderen, zijn de citrusindustrie, regelgevende instanties en diagnostische laboratoria aangespoord om te vertrouwen op nucleïnezuurextractiemethoden met hoge doorvoer in combinatie met handmatige monsterverwerking met lage doorvoer en pathogene detectietests zoals qPCR34 voor het testen van individuele bomen, in combinatie met ziektebeheerpraktijken35. De HLB-positiviteitsratio van Californië is gestegen van 0,01% in 2012 naar 1,2% in 2020. Hoewel qPCR een krachtig en betrouwbaar pathogeendetectie-instrument is, laten de momenteel beschikbare technologieën niet toe dat een voldoende volume plantenweefsel wordt bemonsterd en verwerkt, wat resulteert in duidelijke ondersampling en ondertesten voor CLas in citrusbomen in Californië. Onderbemonstering en ondertesten treden op in relatie tot zowel het aantal geteste bomen als de hoeveelheid plantmateriaal per boom die wordt verwerkt (d.w.z. het aantal bladeren), en vanwege de sporadische verspreiding van geïnfecteerde bladeren in het bladerdak van de boom, is er een grote kans op het missen van vroege of milde infecties. De huidige methoden voor bemonstering en CLas-testen kunnen niet worden geschaald met de toegenomen vraag vanwege de kosten (bijv. Arbeid en apparatuur). Momenteel vereist de monsterverwerkingsmethode die door de meeste citrusdiagnoselaboratoria in Californië wordt gebruikt om nucleïnezuren te verkrijgen die geschikt zijn voor het testen van citruspathogenen, meer dan 17 uur voor handmatige monsterverwerking en gespecialiseerde benodigdheden en apparatuur die meer dan $ 100.000 kosten.

Hier presenteren we de validatie van een gespecialiseerd instrument dat is ontworpen om snel citrusknophoutschorsweefsels te verwerken, de budwood tissue extractor (AHO) genoemd, en een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor monsterbehandeling voor citrusdiagnoselaboratoria. Het onderzoek richtte zich op het ontwikkelen van een innovatieve weefselverwerkingsmethode om het huidige arbeidsintensieve handhakken van knophoutmonsters te vervangen en het meest kosteneffectieve en meest kosteneffectieve citrusknophoutverwerkingsinstrument mogelijk te maken. De resultaten tonen aan dat AHO de monsterdoorvoer verhoogt en de kosten verlaagt van apparatuur en benodigdheden die worden gebruikt in het CCPP-diagnoselaboratorium. De gepresenteerde technologie en methode omvatten ook het gebruik van NFC-tags, een telefoon-app en een online database voor het bijhouden van realtime voorbeeldinformatie. Nadat knophoutmonsters zijn verzameld, koppelt de telefoon-app de NFC-monsterzakclip aan de NFC-boomtag. De monsters worden vervolgens naar het laboratorium verzonden voor verwerking met de AHO-machine. Informatie voor elk monster wordt geregistreerd met een snelle veegbeweging over de zijkant van de AHO-body. Via de NFC-tag van het monster worden de verwerkingstijd voor elk monster en het gewicht van het monster ook geregistreerd en in realtime geüpload naar de online database. Deze methode biedt een zeer tijdsefficiënt systeem, verbetert de kwaliteitscontrole (d.w.z. door monster-ID-fouten te vermijden) en verhoogt de laboratoriumefficiëntie.

De AHO-verwerking en -validatie met hoge doorvoer werden uitgevoerd met "real-life/ field" citrusmonsters, wat aantoont dat andere diagnostische laboratoria de technologie en methodologie gemakkelijk kunnen overnemen. Het gebruik van deze technologie zal het mogelijk maken om de operationele kosten te verlagen en de diagnostische capaciteit en laboratoriumefficiëntie te verhogen, waardoor de kans op het identificeren van zieke bomen in een eerder stadium na infectie wordt vergroot en de kans op verspreiding van de ziekte wordt verlaagd. De zij-aan-zij vergelijking van AHO versus conventionele weefselverwerkingsmethoden toont aan dat de kwaliteit van geëxtraheerd nucleïnezuur (d.w.z. concentratie, zuiverheid en integriteit) en de resultaten van de downstream pathogeendetectie vergelijkbaar zijn (figuur 3A-C). De tijd die wordt besteed aan het verwerken van de monsters is echter aanzienlijk verminderd met behulp van de AHO in vergelijking met handmatige verwerkingsprotocollen (d.w.z. 3,3 min versus 6,8 min). De kamers en AHO-basis vereisen een regelmatig reinigingsschema. Hoewel de reiniging tijdrovend is en een beperking van de methode vormt, maakt de technologie het mogelijk om meerdere monsters snel in de AHO te verwerken voordat de kamer moet worden gereinigd. Conventionele methoden vereisen minder reiniging omdat elk monster zijn eigen verwerkingscontainer heeft, die in veel gevallen wegwerpbaar is, maar ze hebben meer containers en opslagruimte nodig (bijv. 4 °C koelkasten en −20 °C of −80 °C vriezers).

Het AHO-proces is bedacht en gebouwd om de kans op het identificeren van een probleemgebied te vergroten via bulkmonsterverwerking en -testen (d.w.z. het vinden van een zieke boom in een groot citruskiemplasma-funderingsblok, kwekerij of boomgaard) door slechts een klein aantal bulktests uit te voeren die hotspots kunnen identificeren. Daarom wijkt het alleen af wanneer een positief resultaat wordt gevonden. Wanneer dit gebeurt (figuur 4B, batch 1 en batch 5), zijn de daaropvolgende monsterverwerking en het testen van individuele monsters van dezelfde batch die het positieve materiaal bevat (d.w.z. slechts een subset van monsters) vereist om te bepalen welke monsters positief zijn. Het is dus belangrijk op te merken dat deze procedure in de eerste plaats geschikt is voor gevallen met lage infectiepercentages, waar het mogelijk is om een groot volume materiaal van veel bomen te testen, wat in ruil daarvoor de kans op ziektedetectie verhoogt zonder een groot aantal individuele monsters te hoeven testen. Conventionele methoden zijn de optimale optie in gevallen met hoge infectiepercentages, omdat ze het mogelijk maken om elk monster afzonderlijk te testen. Dit is vooral belangrijk in het geval van HLB-onderzoeken in Californië20 (nog steeds met een lage HLB-positiviteitsratio), waar de gebruikte PCR-gebaseerde methoden voor CLas-detectie voornamelijk bedoeld zijn om de aan- of afwezigheid van CLas in asymptomatische bomen te bevestigen (d.w.z. geen typische vlekkerige vlek, vergeeling van het bladerdak of achteruitgang van bomen) die zijn blootgesteld aan CLas-positieve Aziatische citrus psylliden (ACP). Gezien het feit dat we niet weten waar in de boom een besmettelijke ACP zich heeft gevoed, is de kans op het identificeren van een geïnfecteerde maar asymptomatische boom in het veld of in een ander groot gebied of operatie door een klein aantal monsters te testen erg laag (bijvoorbeeld in Californië worden momenteel 20 bladeren verzameld en 12 bladeren worden getest per boom20). Het is duidelijk dat hoe groter het bladerdak van de boom, hoe kleiner de kans op CLas-detectie. Hoewel de kosten van de PCR zelf (d.w.z. reagentia, basislaboratoriumapparatuur en thermocycler), die de monsterverwerking volgt, en de nucleïnezuurextractie en -zuivering onveranderd blijven in het AHO-proces, blijft de onzekerheid bestaan over waar de monsters van asymptomatische bomen moeten worden verzameld om te bepalen of ze besmet zijn of niet, en naar onze mening, is de achilleshiel van de HLB-enquête in Californië. Het gepresenteerde instrument, de technologie, de methode en de verbeteringen zullen de verwerking van grotere steekproefgroottes in een kortere tijd en tegen lagere kosten mogelijk maken. Daarom zal deze methode de kans vergroten om geïnfecteerde bomen tijdig te identificeren en de uitroeiingsinspanningen voor HLB of andere invasieve pathogenen van citrus in Californië verbeteren (bijv. Citrusgeel aderopruimingsvirus gemeld in Californië in augustus 2022).

In combinatie met geautomatiseerde weefselverwerkingsmethoden zouden bulkbemonstering en -tests de verwerkingskosten van plantenweefsel kunnen verlagen. Deze kostenreductie zou veel diagnostische laboratoria in staat stellen om boomgaarden in veel staten effectiever te screenen en de beweging van HLB en andere ziekten beter te volgen. Uiteindelijk betekent dit dat telers een effectiever hulpmiddel hebben om de verspreiding van ziekten te vertragen door efficiënter op grote schaal te testen. Hoewel het AHO-instrument de huidige diagnostische capaciteit van citruslaboratoria kan verbeteren en de hele citrusindustrie ten goede kan komen, kan de technologie tegelijkertijd ook worden overgedragen op andere boomgewassen. De voorlopige gegevens over nucleïnezuurconcentratie en -zuiverheid, zoals geschat door de OD, hebben aangegeven dat AHO effectief weefsels kan verwerken van amandel (59,87 ng / μL ± 7,43 ng / μL en A260 / A280 1,17 ± 0,05, n = 9), wijnstok (135,74 ng / μL ± 50,74 ng / μL en A260 / A280 1,17 ± 0,06, n = 9), en perzik (66,50 ng / μL ± 6,07 ng / μL en A260 / A280 1,29 ± 0,05, n = 9) (monsters vriendelijk verstrekt door Foundation Plant Services bij UC Davis).

Het hier gepresenteerde budwood tissue processing platform heeft de ontwikkeling van extra plantweefselverwerkingsapparatuur geïnspireerd. Zo is er momenteel een leaf tissue extractor (LTE) in ontwikkeling. Voorlopige testresultaten met citrusbladeren hebben aangetoond dat het LTE-instrument ongeveer zeven keer meer bladeren kan verwerken met slechts een toename van 35% in verwerkingstijd ten opzichte van de huidige standaard 12-bladmethode die wordt gebruikt in Californië20. We hebben geschat dat een LTE-ondersteund bulkbemonsterings- en testprotocol de totale kosten per citrusbladtest met een vierde zou kunnen verlagen. Onderzoek om de waarde van de praktische toepassing van deze technologie te bewijzen, is momenteel aan de gang onder een CDFA Specialty Crop Block Grant in onze laboratoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Acknowledgments

De auteurs erkennen het Cahuilla-volk als de traditionele bewaarders van het land waarop het experimentele werk werd voltooid. We zijn professor Norman Ellstrand van de Universiteit van Californië, Riverside, dankbaar voor het beschikbaar stellen van laboratoriumruimte om onderzoeksactiviteiten uit te voeren voor dit project in het kader van het UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Dit onderzoek werd ondersteund door het CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (subsidie nr. 18-0001-055-SC). Aanvullende steun werd ook verleend door het CRB-project 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1020106; en de National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, &; AP20PPQS&T00C049) toegekend aan Georgios Vidalakis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Tags

Bioengineering Budwood tissue extraction hand chopping "Candidatus Liberibacter asiaticus" CLas huanglongbing HLB Citrus tristeza virus CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Automatisering van citrus budwood verwerking voor downstream pathogene detectie door middel van instrument engineering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter