Candidatus Liberibacter asiaticus", CLas, huanglongbing, HLB, Citrus tristeza virüsü, CTV, scientific video journal" />

Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Narenciye tomurcuk ağacı işlemenin, cihaz mühendisliği yoluyla aşağı akış patojen tespiti için otomatikleştirilmesi

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Floem bakımından zengin kabuklu narenciye tomurcuk ağacı dokularını hızla işleyen bir alet tasarladık, ürettik ve onayladık. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı (BTE), numune verimini artırdı ve gerekli işçilik ve ekipman maliyetlerini azalttı.

Abstract

Virüsler, viroidler ve bakteriler gibi narenciyenin greftle bulaşabilen, floemle sınırlı patojenleri, dünya çapında yıkıcı salgınlardan ve ciddi ekonomik kayıplardan sorumludur. Örneğin, narenciye tristeza virüsü dünya çapında 100 milyondan fazla narenciye ağacını öldürürken, "Candidatus Liberibacter asiaticus" Florida'ya 9 milyar dolara mal oldu. Ağaç yayılımı için patojen testi yapılmış narenciye tomurcuk ağacının kullanılması, bu tür patojenlerin yönetimi için anahtardır. Riverside, California Üniversitesi'ndeki Narenciye Klonal Koruma Programı (CCPP), Kaliforniya'nın narenciyesini korumak ve Ulusal Temiz Bitki Ağı'na temiz çoğaltma üniteleri sağlamak için her yıl narenciye tomurcuk ağacı kaynak ağaçlarından binlerce numuneyi test etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tahlillerini kullanır. Narenciye virüslerinin ve viroidlerinin yüksek verimli moleküler tespitinde ciddi bir darboğaz, bitki dokusu işleme adımıdır.

Uygun doku hazırlığı, kaliteli nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve PCR tahlillerinde aşağı akış kullanımı için kritik öneme sahiptir. Nükleik asit bozulmasını önlemek için düşük sıcaklıklarda bitki dokusu doğrama, tartma, dondurarak kurutma, öğütme ve santrifüjleme zaman yoğun ve emek yoğundur ve pahalı ve özel laboratuvar ekipmanı gerektirir. Bu makale, tomurcuk ağacı dokusu çıkarıcı (BTE) olarak adlandırılan, turunçgil tomurcuk ağacından floem bakımından zengin kabuk dokularını hızlı bir şekilde işlemek için tasarlanmış özel bir aletin doğrulanmasını sunmaktadır. BTE, mevcut yöntemlere kıyasla numune verimini %100 artırır. Ek olarak, işçiliği ve ekipman maliyetini azaltır. Bu çalışmada, BTE örnekleri, CCPP'nin elle doğrama protokolü (77.84 ng/μL) ile karşılaştırılabilir bir DNA verimine (80.25 ng/μL) sahipti. Bu cihaz ve hızlı bitki doku işleme protokolü, Kaliforniya'daki çeşitli narenciye teşhis laboratuvarlarına ve programlarına fayda sağlayabilir ve dünya çapındaki diğer odunsu çok yıllık mahsuller için doku işleme için model bir sistem haline gelebilir.

Introduction

Viroidler, virüsler ve bakteriler gibi narenciyenin greftle bulaşabilen floemle sınırlı patojenleri, dünyanın narenciye üreten her bölgesinde yıkıcı salgınlara ve ciddi ekonomik kayıplara neden olmuştur. Turunçgil viroidleri, trifoliat, trifoliat melezleri, mandalina, clementine ve mandalinagibi ekonomik açıdan önemli turunçgil türlerinde neden oldukları ekzokortis ve kaşeksi hastalıkları nedeniyle üretim faktörlerini sınırlamaktadır 1,2,3. Kaliforniya'da, bu viroide duyarlı narenciye türleri, tüketicilerin soyulması kolay, dilimlenmiş ve çekirdeksiz meyvelere yönelik tercihlerindeki değişen eğilimi takiben, büyüyen ve karlı "kolay soyulanlar" pazarının temelidir 4,5,6. Bu nedenle, narenciye viroidleri Kaliforniya Gıda ve Tarım Bakanlığı (CDFA) "Narenciye Fidanlığı Stok Haşere Temizleme Programı-Senato Yasa Tasarısı 140" kapsamında düzenlenmektedir ve CDFA'nın Bitki Zararlıları Teşhis Şubesi laboratuvarları yılda binlerce narenciye viroid testi gerçekleştirmektedir 7,8,9,10 . Narenciye tristeza virüsü (CTV), 1930'larda küresel salgının başlangıcından bu yana 100 milyondan fazla narenciye ağacının ölümünden sorumlu olmuştur 3,9,10,11. Kaliforniya'da, virüsün kök çukurlaşması ve üç yapraklı kırılma direnci izolatları, 3,6 milyar dolarlık Kaliforniya narenciye endüstrisi için ciddi bir tehdit oluşturuyor12,13,14. Sonuç olarak, CDFA, CTV'yi düzenlenmiş bir A sınıfı bitki zararlısı olarak sınıflandırır ve Orta Kaliforniya Tristeza Eradikasyon Ajansı'nın (CCTEA) laboratuvarı her yıl kapsamlı saha araştırmaları ve binlerce virüs testi gerçekleştirir15,16. "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) bakterisi ve huanglongbing (HLB) hastalığının, narenciye ekim alanlarında% 40'lık bir azalma, narenciye operasyonlarında% 57'lik bir azalma ve yaklaşık 8.000 iş kaybı sonucunda Florida'da 9 milyar dolara yakın ekonomik hasara neden olduğu tahmin edilmektedir17,18. Kaliforniya'da, HLB nedeniyle narenciye alanında varsayımsal %20'lik bir azalmanın 8.200'den fazla iş kaybına ve eyaletin gayri safi yurtiçi hasılasında yarım milyar doların üzerinde bir azalmaya neden olacağı tahmin ediliyordu. Bu nedenle, Narenciye Zararlıları ve Hastalıklarını Önleme Programı, Kaliforniya14,17,19,20'den CLas'ı test etmek, tespit etmek ve ortadan kaldırmak için yapılan anketlere yılda 40 milyon doların üzerinde harcama yapmaktadır.

Narenciye viroidlerinin, virüslerin ve bakterilerin yönetiminin önemli bir unsuru, ağaç üretimi için patojen testi yapılmış çoğaltma malzemelerinin (yani tomurcuk ağacı) kullanılmasıdır. Patojen testi yapılmış narenciye tomurcuk ağacı, gelişmiş patojen eliminasyon ve tespit tekniklerini kullanan kapsamlı karantina programları kapsamında üretilir ve bakımı yapılır10,21. Riverside, California Üniversitesi'ndeki Narenciye Klonal Koruma Programı (CCPP), Kaliforniya'nın narenciyesini korumak ve Narenciye için Ulusal Temiz Bitki Ağı'nın işlevlerini desteklemek için her yıl eyalete ve ABD'ye yeni ithal edilen narenciye çeşitlerinden ve narenciye tomurcuk ağacı kaynak ağaçlarından binlerce tomurcuk ağacı örneğini test ediyor10,17,22. Büyük hacimli narenciye testinin üstesinden gelmek için, yüksek verimli, güvenilir ve uygun maliyetli patojen tespit testleri, CCPP 7,10,22 gibi programların başarısı için temel bir bileşendir.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler bazlı patojen tespit testleri, bitki teşhis laboratuvarlarında verimde önemli artışlara izin verirken, deneyimlerimize göre, yüksek verimli protokollerin uygulanmasındaki en kritik darboğazlardan biri bitki doku numunesi işleme adımıdır. Bu özellikle narenciye için geçerlidir, çünkü yaprak sapları ve tomurcuk ağacı kabuğu gibi floem bakımından zengin dokuların işlenmesi için şu anda mevcut olan protokoller emek yoğundur, zaman alıcıdır ve pahalı ve özel laboratuvar ekipmanı gerektirir. Bu protokoller, nükleik asit bozulmasını önlemek için düşük sıcaklıklarda elle doğrama, tartma, dondurarak kurutma, öğütme ve santrifüjleme gerektirir 8,23,24. Örneğin, CCPP tanı laboratuvarında numune işleme, (i) elle doğrama (6-9 numune/saat/operatör), (ii) dondurarak kurutma (16-24 saat), (iii) toz haline getirme (30-60 saat) ve (iv) santrifüjlemeyi (1-2 saat) içerir. Süreç ayrıca özel sarf malzemeleri (örneğin, ağır hizmet tipi güvenli kilitli borular, paslanmaz çelik taşlama bilyaları, adaptörler, bıçaklar, eldivenler) ve çok sayıda maliyetli laboratuvar ekipmanı (örneğin, ultra düşük dondurucu, dondurarak kurutucu, doku pulverizatör, sıvı nitrojen kriyo istasyonu, soğutmalı santrifüj) gerektirir.

Her sektörde olduğu gibi, ekipman mühendisliği ve süreçlerin otomasyonu, maliyetleri düşürmenin, verimi artırmanın ve yüksek kaliteli, tek tip ürün ve hizmetler sunmanın anahtarıdır. Narenciye endüstrisi, çalıştırmak için minimum beceri gerektiren düşük maliyetli doku işleme cihazlarına ihtiyaç duyar ve bu nedenle, hızlı aşağı akış patojen tespiti için yüksek numune işleme kapasitesine izin vermek için teşhis laboratuvarlarına ve saha operasyonlarına aktarılması kolaydır. Teknoloji Gelişen Çözümler (TES) ve CCPP, floem bakımından zengin narenciye dokularının (yani tomurcuk ağacı) hızlı işlenmesi için düşük maliyetli (yani özel laboratuvar ekipmanına olan ihtiyacı ortadan kaldıran) bir cihaz geliştirdi (yani tasarladı ve üretti) ve doğruladı (yani, narenciye numuneleriyle test edildi ve standart laboratuvar prosedürleriyle karşılaştırıldı), tomurcuk ağacı doku çıkarıcı (BTE) olarak adlandırıldı. Şekil 1'de görüldüğü gibi, BTE, güç ve kontroller için bir temel bileşenin yanı sıra narenciye tomurcuk ağacının işlenmesi için çıkarılabilir bir oda içerir. BTE odası, floem bakımından zengin kabuk dokularını narenciye tomurcuk ağacından sıyırmak için özel olarak tasarlanmış bir öğütme çarkından oluşur. Parçalanmış kabuk dokusu, bir slayt portundan ekstraksiyon tamponu içeren bir şırıngaya hızla çıkarılır, süzülür ve herhangi bir ek işlem veya hazırlık olmaksızın nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırması için hazır hale getirilir (Şekil 1). BTE sistemi ayrıca, numune işleme bilgilerini gerçek zamanlı olarak çevrimiçi bir veritabanına kaydeden kağıtsız bir numune izleme uygulaması ve entegre bir tartım uygulaması içerir.

BTE sistemi, CCPP'nin laboratuvar teşhis kapasitesini %100'ün üzerinde artırdı ve sürekli olarak yüksek kaliteli nükleik asitlerin saflaştırılması ve PCR tahlilleri kullanılarak narenciyenin greftle bulaşan patojenlerinin aşağı yönde tespiti için uygun narenciye dokusu ekstraktları üretti. Daha spesifik olarak, BTE, doku işleme süresini numune başına 24 saatten ~3 dakikaya düşürdü, maliyeti 60.000 doların üzerinde olan laboratuvar cihazlarının yerini aldı (Şekil 2, adım 2-4) ve daha büyük numune boyutlarının işlenmesine izin verdi.

Bu makale, sırasıyla CCPP Rubidoux Karantina Tesisi ve Lindcove Vakfı Tesisi'nden alınan tüm uygun pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere, kaynak ağaçlardan alınan narenciye tomurcuk ağacı örnekleriyle BTE yüksek verimli narenciye kabuğu doku işleme, nükleik asit ekstraksiyonu ve patojen tespit doğrulama verilerini sunmaktadır. Ayrıca, mevcut laboratuvar prosedürüne kıyasla verim ve işlem süresi değişikliklerini de sunuyoruz (Şekil 2). Ek olarak, bu çalışma narenciye patojen test laboratuvarları için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar ve BTE'nin patojen temizliği yapan fidanlık stoğu, araştırma ve eradikasyon programlarının işlevlerini nasıl destekleyebileceğini gösterir.

Figure 1
Şekil 1: Tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı. BTE, güç ve kontroller için bir temel bileşenin yanı sıra narenciye tomurcuk ağacının işlenmesi için çıkarılabilir bir bölme içerir. BTE odası, floem bakımından zengin kabuk dokularını narenciye tomurcuk ağacından sıyırmak için özel olarak tasarlanmış bir öğütme çarkından oluşur. Parçalanmış kabuk dokusu, bir slayt portundan bir şırıngaya hızla çıkarılır, süzülür ve herhangi bir ek işlem veya hazırlık olmaksızın nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırması için hazır hale getirilir. Kısaltma: BTE = tomurcuk ağacı doku çıkarıcı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Konvansiyonel elle doğrama laboratuvarı prosedürü ile BTE prosesi arasında adım adım karşılaştırma. BTE işleme, yüksek verimli narenciye kabuğu dokusu işleme, nükleik asit ekstraksiyonu ve patojen tespitini içerir. Her adımın zamanı parantez içinde belirtilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Narenciye tomurcuk ağacı örneklerinin gemiye toplanması

  1. Technology Evolving Solutions'a web sunucularına yüklemeleri için bir ağaç bilgileri elektronik tablosu gönderin (sonunda kullanıcı yeni ağaçlar oluşturacaktır).
  2. Bir ağaç seçmek için telefon uygulaması TES izleyicisini kullanın ve ağaç bilgilerini etikete yüklemek için telefona bir yakın alan iletişimi (NFC) yaka etiketi tutun.
  3. Üç ila dört narenciye tomurcuk ağacı örneğini BTE uyumlu plastik torba taşıyıcısına yerleştirin ve kapakla kapatın.
    1. Tomurcuk ağacının uzunluğunun 8 inç'i geçmediğinden ve 5 inç'ten az olmadığından emin olun.
      1. Uzunluk 8 inçten büyükse, kısaltmak için steril tek kullanımlık bir tıraş bıçağı veya %10 çamaşır suyu solüsyonu (%1 sodyum hipoklorit) ile dekontamine edilmiş budama makası kullanın.
      2. Uzunluk 5 inçten azsa, torbaya koymak için farklı bir tomurcuk ağacı örneği toplayın.
    2. Herhangi bir koltuk altı büyümesinin veya büyük dikenlerin elle veya %10 ağartıcı ile sterilize edilmiş kesici aletler (%1 sodyum hipoklorit) kullanılarak çıkarıldığından emin olun.
      NOT: Bu adım, tomurcuk ağacının haznenin açılmasında manevra yapmasını kolaylaştırmak için önemlidir.
    3. Kavisli özelliklere sahip tomurcuk ağacı örneği olmadığından emin olun. Bunu yaparlarsa, %10 ağartıcıyla sterilize edilmiş kesici aletler (%1 sodyum hipoklorit) kullanarak bunları çıkarın ve BTE torbalarına numunenin yalnızca düz kısımlarını yerleştirin.
      NOT: Kavisli tomurcuk ağacının alete manevra yapması çok zordur, bu da düzensiz kabuk şeritlerine neden olur.
  4. Ağacın NFC yaka etiketini taramak ve numune çantasındaki NFC klips etiketiyle bağlamak için telefon uygulaması TES izleyicisini kullanın.
  5. Tomurcuk ağacının kalınlığına dikkat edin, çünkü bu, operatörün BTE haznesi içindeki floem bakımından zengin tomurcuk ağacı kabuğunu nasıl soyacağını belirler.
    1. Tomurcuk ağacının kalınlığı 0,20 inç'in altındaysa, tomurcuk ağacını sıyırırken dikkatli olun çünkü haznedeki yüksek hızlı eğirme iplikleri tüm tomurcuk ağacını çekirdeğine, kabuk tabakasının ötesine ve floem açısından zengin olmayan odun ve öz dokularına toz haline getirecektir.
    2. Daha kalın tomurcuk ağacı seçin çünkü floem bakımından zengin olmayan tomurcuk ağacı dokularından kaçınırken kabuk dokularını soymak daha kolaydır.
  6. Numuneleri birkaç buz paketi ile yalıtımlı bir nakliye konteynerine yerleştirin.

2. Çeker ocakta kurulum

NOT: BTE'nin çeker ocak içinde çalıştırılması tercih edilir. Bu, bitki dokusu çapraz kontaminasyonu ve laboratuvar kontaminasyonu riskini azaltacaktır.

  1. %10 (%1 sodyum hipoklorit) sprey şişesi kullanarak dezenfekte edin.
    1. Davlumbazın yüzeyine püskürtün ve çamaşır suyunu bir kağıt havluyla silmeden önce yaklaşık 1 dakika bekletin.
    2. Çamaşır suyu solüsyonu ile bir kağıt havlu püskürtün. TE tabanını, kantar bileşenlerini (tartı, hava kalkanı ve kule) ve bir keçeli kalemi silin.
  2. İşlenecek numune sayısı için bir şırınga setini açın ve bunları kapalı bir karton kutuya yerleştirin.
  3. İhtiyaç duyulması ihtimaline karşı kaputun dışında bir paket bez bulundurun.
  4. Ağırlık ölçeğini hazırlayın.
    1. Ağırlık kulesini tartıdan çıkarın ve açmak için güç düğmesini basılı tutun. Ölçek 0'ı gösterdikten sonra kuleyi ölçeğin ortasına yerleştirin.
    2. Kantar hava kalkanını kantarın ön tarafına kaydırın.
  5. Arkadaki anahtarı çevirerek doku çıkarıcı tabanını hazırlayın. Kutunun sol tarafındaki anahtarın üst kısmına basıldığından emin olun. Odanın hazır olduğunu gösteren yanıp sönen yeşil bir LED bekleyin.

3. Temizleme istasyonlarını kurun (Ek Şekil S1).

  1. Ultrasonik temizleyiciye 1 L su koyun.
  2. Ultrasonik temizleyicinin üstüne iki çöp torbası sarın.
  3. Ultrasonik temizleyiciye ~ 5 L% 10 çamaşır suyu (% 1 sodyum hipoklorit çözeltisi) dökün.
  4. Su küvetini bir hazneyi daldırmaya yetecek kadar suyla doldurun.
  5. Hava kompresörünü açın ve valfi açın.
  6. Hazne kururken sıvıyı yakalamak için bir zemin oluşturun.

4. Narenciye tomurcuk ağacı kabuğu sıyırma için BTE malzemesinin işlenmesi

  1. Hazneyi BTE Tabanına yükleyin.
    1. BTE Odasını hazırlayın.
      1. Haznenin arkasına boş bir numune torbası takın. Boş torbayı BTE odasının arka ağzına sabitlemek için iki O-ring kullanın.
      2. Bıçağı, plastiğe devam ettiği yerde bıçak üzerinde oluşan kesikler veya uçta oluşan kesikler gibi aşınma veya hasar belirtileri açısından inceleyin. Bıçak üzerindeki okun tek kilit simgesiyle aynı hizada olduğundan emin olun.
      3. Haznenin altındaki hava tahliyesinin O sembolüne doğru çevrildiğinden emin olun. Şeffaf kapağı hazne açıklığının üzerine yerleştirin ve haznenin sağındaki rayı kullanarak şeffaf BTE sürgüsünü haznenin üzerine kaydırın. Haznenin altındaki kilidi, kızağın içine girebildiği kadar itin. Piston kapağının sürgünün üstüne monte edildiğinden emin olun.
    2. Hazneyi, BTE tabanının nozulu haznenin arkasına doğru çıkıntı yapacak şekilde BTE tabanına yerleştirin. Yerleştirmenin başarılı olduğunu gösteren mavi LED'in yanıp sönmesini bekleyin.
  2. YüklesampNFC klipsindeki beyaz etiketi hareket ettirerek BTE tabanına tag kutunun sağ tarafındaki Z'ye. Sarı ışık yanıp sönmeye başlayana kadar etiketi Z üzerinde yavaş dairesel hareketlerle hareket ettirin. Numuneyi BTE tabanına takın ve numune torbasında delik olmadığından emin olun; Bir delik varsa, bantla yamalayın. O-ringi s'nin üzerine yerleştirinampBTE nozulunun önüne sabitlemek için torba.
  3. Kullanılmayan şırınga setini yükleyin.
    1. Şırınga setinin darasını alın. Kullanılmayan şırınga setini kantar kulesine yerleştirin. Kırmızı bir ışık yanıp sönmeye başladığında veya tartı 0 gösterdiğinde şırınga setini çıkarın.
    2. Pistonu filtreli şırıngadan çıkarın. Sıvının alt (filtresiz) şırıngada olduğundan emin olun. Pistonu bir kağıt havlu üzerine veya siyah pistonun herhangi bir yüzeye temas etmediği kuleye yerleştirin.
    3. Çıkış portunu şırıngaya bastırarak ve 90° çevirerek şırıngayı sürgülü çıkış portuna takın.
  4. Tomurcuk ağacı örneğini işleyin.
    DİKKAT: BTE, yüksek hızlı hareketli parçalara sahiptir. Tüm işlemlerin bir çeker ocak içinde gerçekleşmesi gerekir. Tüm kullanıcılar koruyucu gözlük, kulaklık (kulak tıkacı) ve eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi diğer tüm kişisel koruyucu ekipmanları (KKD) kullanmalıdır.
    1. Makineyi başlatmak için üstteki siyah düğmeye basın. İşleme sırasında herhangi bir zamanda motoru durdurmak için ikinci kez basın.
      NOT: Kutu, düzgün çalışmasını sağlamak için hız ve sıcaklık algılama özelliğine sahiptir.
    2. Torbadan bir tomurcuk ağacı çubuğu alın ve BTE memesinin üstünden geçirin.
    3. Diğer elinizle haznenin diğer tarafındaki tomurcuk ağacı çubuğunu tutun ve yavaşça bıçağa doğru inin. Tomurcuk ağacının kabuğundan sıyrıldığını gösteren hafif bir uğultu sesi dinleyin. Tomurcuk ağacını döndürürken yavaşça ileri geri hareket ettirin.
      1. Yüksek, agresif bir doğrama sesi duyulursa, dalı hızla yukarı doğru hareket ettirin ve/veya motoru durdurmak için üst düğmeye basın. Motoru durdurmak için, işlemi bitirmek için sağ taraftaki anahtarı kullanın (bkz. adım 4.4.3.2).
      2. Keserken çıkıştan malzeme çıkmıyorsa, haznede tıkanıklık vardır. Motoru kapatın, sürgülü piston kapağını çıkarın ve tıkanıklığı makinenin çıkışından dışarı itmek için çubuğun plastiğini kullanın. İşlemi bitirmek için sağ taraftaki anahtarı kullanın: Yukarı = İleri kesme; Orta = Motor kapalı; Aşağı = Ters Kesim.
    4. Kalan dallar için 4.4.2 ve 4.4.3 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Yeterli tomurcuk ağacı kabuğunun sıyrıldığının genel bir göstergesi, şırınganın %25'inin bitki dokusuyla doldurulmuş olmasıdır. Narenciyenin aşı ile bulaşan patojenleri ağaçta eşit olmayan bir şekilde dağılabilir. Bu nedenle, narenciye ağacı gölgesinin etrafından üç ila dört tomurcuk ağacı örneği toplanır. BTE taşıma torbasındaki her tomurcuk ağacı örneğinin, tam bir ağaç temsili numunesinin patojenler için test edilmesini sağlamak için nihai öğütülmüş doku numunesine katkıda bulunması önemlidir.
    5. İşlemeyi durdurmak için üstteki siyah düğmeye basın. Işığın tekrar sarı renkte yanıp sönmeye başlamasını bekleyin.
  5. Numune ağırlığını doğrulayın.
    1. Şırıngayı 90° döndürün ve çıkarmak için aşağı çekin. Pistonu şırıngaya geri yerleştirin ve şırıngayı kuleye yerleştirin.
    2. Terazinin numuneyi otomatik olarak algılamasını bekleyin ve numunenin uygun ağırlık aralığında (0,25 ± 0,05 g) olup olmadığını belirleyin. Numune ağırlığı çok düşükse (<0,20 g), adım 4.4'ü tekrarlayın; kırmızı LED yanıp sönmeye başlayacaktır. Numune ağırlığı çok yüksekse (>0,30 g), numune malzemesinin bir kısmını çıkarın; sarı LED daha yavaş yanıp sönmeye başlayacaktır. Numune aralık içindeyse, yeşil LED yanıp sönmeye başlayacaktır.
  6. Tomurcuk ağacı örneğinin homojenleştirilmesi
    1. Pistonu numunenin bulunduğu şırıngadan çıkarın, sıvıyı numunenin bulunduğu şırıngaya itin ve pistonu tekrar ekleyin. Piston, tamponu ve bitki özsuyunu ağ filtreden (herhangi bir büyük kabuk dokusu parçasını alıkoyarak) ve kauçuk boru yoluyla boş şırıngaya iter.
    2. Tamponu ve bitki özsuyunu bir şırıngadan diğerine ileri geri iterek numuneyi karıştırın. Numune homojen bir yeşil sıvı karışımı haline gelene kadar ~3x-4x tekrarlayın.
    3. İyice homojenize edildikten sonra, bitki özsuyu örneğini ağ filtresi olmadan şırıngaya itin ve kauçuk boruyu ve filtreli şırıngayı numunenin bulunduğu şırıngadan ayırın.
    4. Bitki özsuyu örneğini şırıngadan 2 mL'lik steril bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın ve daha fazla kullanılana kadar −20 °C'de saklayın. Numuneyi torba numarasıyla etiketlemek için kalıcı bir işaretleyici kullanın.
      NOT: Adım 4.6.5'teki bitki numunesi özsuyu artık mevcut nükleik asit, RNA veya DNA'dan herhangi biri, nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırılması için fenol-kloroform, silika kolonu veya manyetik boncuklaradayalı ekstraksiyon yöntemleri 9,25,26,27 ile işlenebilir (bkz. adım 7) ve narenciyenin greftle bulaşan patojenlerinin aşağı akış tespiti (bkz. adım 8).

5. BTE çıkarılabilir bölmesinin sterilize edilmesi

DİKKAT: Şırınga setindeki tampon hazneye veya sürgüye girerse, temizlemeden önce durulayın ve laboratuvarın tüm güvenlik kurallarına uyun. Şırınga seti guanidin tiyosiyanat içerir. Şırınga setindeki tampon ağartıcı ile temas ederse siyanür gazı oluşturur.

  1. 10. numune haznede işlendikten sonra aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Yeşil LED'in mavi yanıp sönmek yerine yanıp sönmeye devam edeceğini unutmayın.
  2. Olası tüm kirleticileri temizlemek için BTE odasını sökün; Şeffaf plastik kapağı çıkarın, hazne sürgüsünü temizleyin ve hazne kızağındaki tıkanıklık portunu temizleyin.
  3. Haznenin altındaki hava tahliye vanasını açık konuma çevirin (asma kilit işaretini açın). Hazne bileşenlerini kurulum ultrasonik temizleyiciye yerleştirin (bkz. adım 3.1). Yüzmesini önlemek için kapağı haznenin altına yerleştirin. Ultrasonik temizleyiciyi 15 dakika çalıştırın.
    NOT: Ultrasonik temizleme banyosu (5 L) iki hazneye kadar tutabilir.
  4. Hazne bileşenlerini su banyosunda (adım 3.4) en az 30 saniye durulayın. Hazne bileşenlerini kurutma istasyonuna taşıyın.
    DİKKAT: Kurutma, hazne içinde hızlı hareket eden parçalara, yüksek seslere (~85 desibel [dB]) ve olası sıçramalara neden olur. Tüm kullanıcılar, işletim laboratuvarının güvenlik kurallarının gerektirdiği şekilde koruyucu gözlük, kulaklık (kulak tıkacı), laboratuvar önlüğü ve diğer tüm KKD'leri kullanmalıdır.
  5. BTE haznesini kurutun.
    1. Hava tabancasını, haznenin üst açıklığının oluğu ile aynı hizaya getirin (sürgünün tipik olarak olacağı yer). ~30 s boyunca hava dağıtmak için tabancanın tetiğine basın.
      NOT: Açıklığın kullanıcıdan zemine doğru uzakta olduğundan emin olun. Bu, altında sıkışan sıvıyı çıkarmak için bıçak setini döndürmelidir.
    2. Hava tabancasını haznenin üst nozullarına doğru konumlandırın. Hava tabancasının tetiğine basın ve her bir nozul girişinin üç tam dairesini yavaşça izleyin.
    3. Hava tabancasını BTE'nin ortasına yerleştirin. En içteki noktadan başlayarak tetiği basılı tutun ve hava tabancası kızağın olacağı yere doğru hareket ettirin.
    4. Yüzey suyunu dışarıdan uzaklaştırmak için havayı ön ve arka olmak üzere tüm hazneye hızlı bir şekilde akıtan.
  6. BTE slaytını kurutun.
    1. Hava tabancasını sürgünün piston yuvasına yerleştirin ve sürgü çıkışından suyu çıkarmak için tetiğe basın.
    2. Kurutmak için sürgünün iç yüzeyi boyunca bir hava tabancası çalıştırın.
    3. Suyu dışarı itmek için kızak oluğu boyunca bir hava tabancası çalıştırın.
    4. Yüzey suyunu çıkarmak için havayı tüm dış kısımdan hızla geçirin.
  7. Bileşenleri kurutun.
    1. Sürgülü piston kapağını ve O-ringleri elinizde tutun ve tetiğe basın.
    2. Kapağın iç yüzeyi üzerinde bir hava tabancası çalıştırın.
    3. Bileşenleri hazneye yerleştirin ve kurutmaya devam etmek veya yeniden monte etmek için kaydırın.
      NOT: Birden fazla fonksiyonel BTE'ye sahip yüksek doku işleme ortamı için, aynı anda 10 odayı dekontamine edebilen bir toplu sanitasyon sistemi sağlanabilir.

6. İmha etme ve sterilize etme

  1. Şırıngaları ve kauçuk boruları belirtilen guanidin atık kabına atın.
  2. Herhangi bir bitki materyalini biyolojik olarak tehlikeli atık kabına atın.
  3. BTE haznesini BTE tabanından çıkarın.
  4. BTE odasını sökün ve 5. adımda açıklandığı gibi dekontaminasyona devam edin.

7. BTE narenciye tomurcuk ağacı ekstraktlarından saflaştırılan RNA'nın doku işlemesi ve kalitesinin değerlendirilmesi

NOT: Bu protokolde, narenciye tomurcuk ağacı dokusunun işlenmesi için gereken süreyi ve BTE tarafından hazırlanan kabuk dokusu ekstraktlarından saflaştırılan RNA'nın kalitesini karşılaştırmak için 255 narenciye ağacından tomurcuk ağacı örnekleri kullandık (Şekil 2, sağ taraf, adım 1, adım 5 ve adım 6) ile elle soyma ve doğrama kullanılarak düzenleyici olarak onaylanmış narenciye tomurcuk ağacı doku işleme yöntemi izlenerek hazırlananlar, Dang ve ark.23 tarafından tarif edildiği gibi kabuk dokusunun dondurularak kurutulması, toz haline getirilmesi ve santrifüjlenmesi (Şekil 2, sol taraf, adım 1-6).

  1. Mevcut laboratuvar prosedürü: Yasal olarak onaylanmış yönteme göre doku işleme için tomurcuk ağacı numuneleri hazırlayın23.
    1. Dang ve ark.23 tarafından tarif edildiği gibi kabuk dokusunun elle soyulmasını ve doğranmasını, dondurarak kurutmayı, toz haline getirmeyi, santrifüjlemeyi ve bitki özsuyunun RNA ekstraksiyon tüpüne transferini gerçekleştirin (Şekil 2, sol taraf, adım 1-6).
    2. Test edilen her ağaçtan üç ila dört tomurcuk ağacı örneğini elle soyduktan sonra, tüm tomurcuk ağacını BTE uyumlu bir plastik torba taşıyıcısına koyun ve BTE işlemine kadar 4 °C'de saklayın (adım 7.2).
  2. BTE prosedürü: BTE narenciye tomurcuk ağacı dokusu işlemeyi başlatın (bölüm 4, adım 4.1-4.6; Şekil 2, sağ taraf, adım 1, adım 5 ve adım 6).
    1. Tomurcuk ağacı s'yi kullanınampadım 7.1.2'deki BTE taşıma çantalarında saklanır.
  3. Mevcut laboratuvar prosedüründen (adım 7.1.1) ve BTE prosedüründen (adım 7.2.2) elde edilen bitki özsuyundan RNA'yı, düzenleyici olarak onaylanmış yarı otomatik manyetik boncuk bazlı yöntem 8,23,28 kullanarak ekstrakte edin ve saflaştırın.
  4. Konsantrasyonunu, saflığını ve bütünlüğünü ölçerek RNA kalitesini değerlendirin 8,23,24,29,3 3,31.
    1. Konsantrasyonu hesaplamak için 260 nm dalga boyunda spektrofotometri ve optik yoğunluk (OD) kullanın.
    2. Saflığı değerlendirmek için 260/280 spektrofotometrik OD oranı kullanın.
    3. Bütünlüğü kontrol etmek için, NADH dehidrojenaz narenciye geninin24,32 mRNA'sını hedefleyen ters transkripsiyon (RT) kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) reaksiyonu kullanın.

8. BTE narenciye tomurcuk ağacı ekstraktlarından saflaştırılmış RNA kullanılarak narenciye virüslerinin ve viroidlerinin çapraz kontaminasyonunun ve tespitinin değerlendirilmesi

NOT: Bu protokolde, BTE tarafından işlendiğinde numuneler arasında çapraz kontaminasyon potansiyelini değerlendirmek için enfekte olmamış 72 narenciye ağacından ve virüs ve viroidlerle enfekte olmuş bir ağaç karışımından tomurcuk ağacı örnekleri kullandık (Şekil 2, sağ taraf, adım 1, adım 5 ve adım 6) ve narenciye virüslerinin ve viroidlerin RT-qPCR tespiti için bir şablon olarak kullanılmak üzere BTE tarafından hazırlanan kabuk dokusu ekstraktlarından saflaştırılmış RNA'nın uygunluğu.

  1. İlk BTE numune işleme: Enfekte olmamış 72 numuneyle temel bir deney yapın.
    1. Üç (AC) BTE odası hazırlayın (adım 4.1.1).
    2. Enfekte olmayan tüm narenciye tomurcuk ağacı örneklerini (1-72) BTE taşıma torbalarında hazırlayın ve her örnek için bir şırınga sistemi ile iki şırıngalı BTE örnek toplama sisteminde eşit sayıda (72) hazırlayın (adım 2.4).
    3. Numune taşıma torbalarını ve numune toplama şırıngalarını her biri 12 numuneden oluşan altı partiye (I-VI) ayırın.
    4. Aşağıdaki sırayı izleyerek BTE narenciye tomurcuk ağacı doku işlemeyi (adım 4) başlatın (adım 8.1.4.1-8.1.4.6) (Bkz. Tablo 1, İlk BTE Numune İşleme).
      1. Parti I/Numune 1-12 için, A haznesini kullanarak 12 numuneyi işleyin. Numune 12'den sonra A haznesini sterilize edin (adım 5).
      2. Parti II/Numuneler 13-24 için, B haznesini kullanarak 12 numuneyi işleyin. Numune 24'ten sonra B haznesini sterilize edin (adım 5).
      3. Parti III/Numuneler 25-36 için, C haznesini kullanarak 12 numuneyi işleyin Numune 36'dan sonra C haznesini sterilize edin (adım 5).
      4. Parti IV/Numuneler 37-48 için, sterilize edilmiş oda A'yı kullanarak 12 numuneyi işleyin (adım 8.1.4.1).
      5. Parti V/Numuneler 49--60 için, sterilize edilmiş oda B'yi kullanarak 12 numuneyi işleyin (adım 8.1.4.2).
      6. Parti VI/Numuneler 60-72 için, sterilize edilmiş oda C'yi kullanarak 12 numuneyi işleyin (adım 8.1.4.3).
    5. BTE taşıma torbalarını tüm s'lerle birlikte 4 °C'de saklayın.ampadım 8.2'de kullanıma kadar.
    6. 72 adım 8.1.4.1-8.1.4.6'da oluşturulan bitki özsuyu örneğinden, düzenleyici olarak onaylanmış yarı otomatik manyetik boncuk bazlı yöntem 8,23,28'i kullanarak RNA'yı çıkarın ve saflaştırın.
    7. Daha önce açıklandığı gibi narenciye virüslerinin ve viroidlerin tespiti için RT-qPCR gerçekleştirin 8,33.
  2. İkinci BTE numune işleme için, 70 enfekte olmayan numune ve iki karışık enfekte numune ile çapraz kontaminasyon deneyi gerçekleştirin.
    1. Üç (AC) BTE odası hazırlayın (adım 4.1.1).
    2. Karışımla enfekte olmuş narenciye tomurcuk ağacı örneğini (73) iki BTE taşıma torbasında (adım 1.3) toplam iki enfekte numune için hazırlayın.
    3. BTE taşıma torbalarını, enfekte olmamış narenciye tomurcuk ağacı numuneleriyle birlikte toplayın, Numune 3-Parti I ve Numune 51-Parti V hariç (bkz. adım 8.2.4'teki numune değişimi), toplam enfekte olmayan numune sayısı için adım 8.2.4'ten.
    4. Toplam 72 numune sayısı için Parti I'deki Numune 3 yerine miks ile enfekte numune 73 ve Parti V'deki Numune 51 yerine ikincisini içeren ilk BTE taşıma çantasını ekleyin.
    5. Her numune için bir çift şırınga sistemi ile iki şırıngalı BTE numune toplama sisteminde eşit sayıda (72) hazırlayın (adım 2.4).
    6. 72 numune taşıma torbasını ve numune toplama şırıngasını her biri 12 numuneden oluşan altı partiye (I-VI) ayırın.
    7. BTE narenciye tomurcuk ağacı dokusu işlemeyi başlatın (adım 4), adım 4-8.1.4.1-8.1.4.6'daki sırayı takip edin.
      NOT: Tek fark, Parti I'deki Numune 3'ün ve Parti V'deki Numune 51'in enfekte numune 73 (adım 8.2.4) ile değiştirilmesidir (Tablo 1, İkinci BTE Numune İşleme).
    8. Adım 8.2.7'de oluşturulan 72 bitki özsuyu örneğinden RNA'yı adım 8.1.6'da olduğu gibi ekstrakte edin ve saflaştırın.
    9. Adım 8.1.7'de olduğu gibi narenciye virüslerinin ve viroidlerin tespiti için RT-qPCR gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BTE ile işlenmiş tomurcuk ağacı narenciye dokusu kullanılarak RNA ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalitesi ve doku işleme süresinin değerlendirilmesi
BTE'den alınan RNA kalitesini standart prosedürle karşılaştırmak için bu test için 255 temsili narenciye ağacından tomurcuk ağacı örnekleri kullandık. Numuneler, tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı (BTE) tarafından işlendi (protokol adımları 4.1-4.6 ve Şekil 2, sağ taraf, adım 1, adım 5 ve adım 6) veya Dang ve ark.23 tarafından tarif edildiği gibi kabuk dokusunun elle soyulması ve doğranması, dondurarak kurutulması, toz haline getirilmesi ve santrifüjlenmesini kullanan düzenleyici olarak onaylanmış narenciye tomurcuk ağacı doku işleme yöntemi izlenerek hazırlandı (Şekil 2, sol taraf, adım 1-6).

BTE'nin narenciye dokusu işleme için geleneksel elle doğrama ve laboratuvar ekipmanı protokolü ile yan yana karşılaştırılması, ekstrakte edilen nükleik asitlerin kalitesinin (yani konsantrasyonunun, saflığının ve bütünlüğünün) (Şekil 3A-C) ve narenciye patojenlerinin PCR tespiti için aşağı akış kullanımına uygunluğunun (veriler gösterilmemiştir) karşılaştırılabilir olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, TE/BTE sistemi kullanılarak numunelerin işlenmesi için harcanan zaman önemli ölçüde azaltıldı. BTE, CCPP laboratuvarının numune verimini iki katından fazla artırarak, boncuk çırpıcılar, santrifüjler ve kriyo istasyonları gibi on binlerce dolarlık aletlere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak işçilik ve laboratuvar ekipmanı maliyetlerini azalttı.

BTE ile ekstrakte edilen nükleik asitlerin ortalama konsantrasyonu 76.96 ng/μL ± 26.23 ng/μL (n = 181) idi ve düşük protein kontaminasyonu ile yüksek saflıktaydı (A260 / A280 2.27 ± 0.17, n = 181) (Şekil 3B, C). Bu değerler, CCPP'nin standart manuel protokolü tarafından üretilen nükleik asitlerle karşılaştırılabilirdi (konsantrasyon: 82.25 ng / μL ± 33.95 ng / μL, n = 181 ve A260 / A280 2.22 ± 0.10, n = 181) (Şekil 3B, C). Nükleik asit bütünlüğü (narenciye geni nad5 için RT-qPCR) BTE (Cq 20.97 ± 2.26, n = 181) ve standart manuel CCPP protokolü (Cq 19.25 ± 1.53, n = 181) için çok benzerdi (Şekil 3A). Sonuçlar ayrıca, BTE cihazının geleneksel yönteme kıyasla aynı zaman diliminde daha yüksek bir numune hacmini işleyebildiğini gösterdi. Geleneksel laboratuvar prosedürü, numune başına elle doğrama için ~ 7-10 dakika ve doku işleme (dondurarak kurutma, öğütme ve santrifüj) için toplam 12 dakika gerektirirken, BTE, nükleik asit ekstraksiyonu için narenciye dokusunu numune başına ~ 3 dakikada işleyebilir.

Figure 3
Şekil 3: Konsantrasyon, saflık ve bütünlük ile tanımlanan 181 temsili narenciye tomurcuk ağacı örneğinin nükleik asit ekstraktlarının kalitesi. Numuneler BTE ve konvansiyonel elle doğrama ve laboratuvar ekipmanı protokolü ile işlendi. (A) Nükleik asit konsantrasyonu, 260 nm'de absorbans kullanılarak belirlendi; (B) saflık, 260 nm ve 280 nm'deki absorbansların oranı olarak belirlendi (A260 / 280). (C) Nükleik asit bütünlüğü, NADH dehidrojenaz (Nad5) narenciye geninin mRNA'sını hedefleyen RT-qPCR ile analiz edildi. En uygun değerlerin aralıkları kırmızı kesikli daireler arasında gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Turunçgillerin greftle bulaşabilen patojenlerinin tespiti, çapraz kontaminasyonun değerlendirilmesi ve BTE narenciye tomurcuk ağacı ekstraktlarından saflaştırılmış RNA kullanılarak narenciye virüslerinin ve viroidlerinin tespiti
Doku işleme yönteminin geçerliliği, 72 sağlıklı turunçgil tomurcuk ağacı örneğinin tüm sağlıklı örneklerle yan yana işlenmesi ve virüs ve viroidlerle enfekte bir ağaç karışımından iki örneğin eklenmesiyle değerlendirildi (Tablo 1 ve Şekil 4A,B). Her iki partiden ekstrakte edilen nükleik asitler, daha önce tarif edildiği gibi geleneksel laboratuvar bazlı q-PCR'ye tabi tutuldu 8,33. İlk BTE numune işlemesinden elde edilen 72 sağlıklı numunenin hiçbiri, test edilen narenciye patojenleri için amplifikasyon eğrileri vermedi (yani, yanlış pozitifler) (Şekil 4A). Sonuçlar, BTE'nin narenciye dokusunu elle doğrama yöntemleriyle standart laboratuvar protokolüne kıyasla eşit derecede iyi işleyebildiğini göstermektedir. İkinci BTE numune işlemede, BTE başlıkları arasında ve aynı BTE kafası ile işlenen numuneler içinde çapraz kontaminasyon potansiyelini (adım 1-6) ve nükleik asitlerin aşağı akış uygulamaları için uygunluğunu değerlendirdik (yani, narenciye virüslerinin ve viroidlerinin RT-qPCR tespiti için bir şablon olarak kullanım için). Tanıtılan iki miks-enfekte numune ile ikinci BTE numune işlemede, BTE protokolü tarafından üretilen nükleik asitler, farklı narenciye virüslerini ve viroidlerini (örneğin, tripleks virüsü, narenciye yaprağı lekesi virüsü [CLBV], narenciye psorozis virüsü [CPsV], narenciye tristeza virüsü [CTV]), apscaviroidleri (turunçgil bükülmüş yaprak viroidi [CBLVd], narenciye cüce viroidi [CDVd], turunçgil viroidi V [CVd-V], turunçgil viroidi VI [CVd-VI] ve turunçgil viroidi VII [CVd-VII]), apskaviroid olmayan şerbetçiotu dublör viroidi (HSVd; hostuviroid), turunçgil kabuğu çatlama viroidi (CBCVd; cocadviroid) ve narenciye ekzokortis viroidi (CEVd; pospiviroid) parti 1 ve parti 5'te. Parti 1 ve parti 5'te, enfekte olanı takip eden numuneler yukarıdaki bitki hastalıkları için pozitifti, ancak artan Cq değerlerine sahipti. Bununla birlikte, başlıklar arasında çapraz kontaminasyon veya herhangi bir yanlış pozitif veya negatif sonuç tespit edilmemiştir (Şekil 4B).

Toplu iş Örnek BTE İlk BTE İkinci BTE
Oda Numune İşleme Numune İşleme
Ben 12 Ocak A 1-12 Enfekte olmayan 1-2 ve 4-12 Enfekte olmayan
Örnek #3, karışım enfekte olmuş ile değiştirilir
II 13-24 B 13-24 13-24
Enfekte olmayan Enfekte olmayan
III 25-36 C 25-36 25-36
Enfekte olmayan Enfekte olmayan
IV 37-48 A-Sterilize Edilmiş 37-48 37-48
Enfekte olmayan Enfekte olmayan
V 49-60 B-Sterilize Edilmiş 49-60 49-50 ve 52-60 Enfekte Olmayan
Enfekte olmayan
Örnek #51, karışım enfekte ile değiştirilir
VI 61-72 C-Sterilize Edilmiş 61-72 Enfekte olmayan 61-72 Enfekte olmayan

Tablo 1: 72 narenciye tomurcuk ağacı örneği kullanılarak BTE doku işleme yönteminin doğrulanması için izlenen süreç. Her işlem iki kez tekrarlandı. Her biri 12 numune içeren 6 parti vardı. İlk numune işlemede, 72 narenciye tomurcuk ağacı örneğinin tamamı sağlıklıydı. İkinci BTE numune işlemede, numune 3 ve numune 51, parti 1 ve parti 5'te virüs ve viroidlerle enfekte olmuş bir ağaç karışımından alınan iki numune ile değiştirildi.

Figure 4
Şekil 4: 72 narenciye tomurcuk ağacı örneği kullanılarak BTE doku işleme yönteminin doğrulanması. Her işlem iki kez tekrarlandı. Her biri 12 numune içeren 6 parti vardı. (A) 72 narenciye tomurcuk ağacı örneğinin tamamı sağlıklıydı. (B) Aynı 72 narenciye tomurcuk ağacı örneği, parti 1 (numune 3) ve parti 5'te (Numune 51) virüs ve viroidlerle enfekte olmuş bir ağaç karışımından iki numunenin eklenmesiyle. NTC ve su kontrollerinin tümü belirsiz Cq değerlerine sahipti (yani, numunede bulunmayan DNA hedefi). Tripleks (CLBV, CPsV, CTV) için pozitif kontrollerin Cq değerleri sırasıyla 23.9, 25.2 ve 22.4 idi. Apscaviroids (CBLVd, CDVd ve CBCVd) için pozitif kontrollerin Cq değerleri sırasıyla 23.39, 21.27 ve 25.17 idi. Apskaviroid olmayanlar (CEVd, HSVd, IV) için pozitif kontrollerin Cq değerleri sırasıyla 26.9, 27.0 ve 26.5 idi. Kısaltmalar: BTE = tomurcuk ağacı doku çıkarıcı; NTC = şablonsuz kontrol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Temizleme istasyonu kurulumu. 10. numune haznede işlendikten sonra, hazneyi sterilize etmek için temizleme istasyonunu hazırlamak için protokol adımları 3.1-3.6 izlenmelidir. Protokol adımı 3.1'de olduğu gibi, ultrasonik temizleyiciye 1 L su konur. Ultrasonik temizleyicinin üstüne iki çöp torbası sarılır (protokol adımı 3.2) ve ~ 5 L% 10 çamaşır suyu (% 1 sodyum hipoklorit çözeltisi) ultrasonik temizleyiciye dökülür (protokol adımı 3.3). Su küveti, bir hazneyi daldırmaya yetecek kadar suyla doldurulur (protokol adımı 3.4), hava kompresörü kapatılır ve vana açılır (protokol adımı 3.5). Hazne kururken sıvıyı yakalamak için bir zemin oluşturulur (protokol adımı 3.6). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HLB narenciye hastalığının ortaya çıkmasıyla birlikte, kayıpları azaltmak için narenciye endüstrisi, düzenleyici kurumlar ve teşhis laboratuvarları, hastalık yönetimi uygulamalarıyla birlikte tek tek ağaçların test edilmesi için qPCR34 gibi düşük verimli manuel numune işleme ve patojen tespit testleri ile birlikte yüksek verimli nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerine güvenmeye teşvik edilmiştir35. Kaliforniya'nın HLB pozitiflik oranı 2012'de %0,01'den 2020'de %1,2'ye çıktı. qPCR güçlü ve güvenilir bir patojen tespit aracı olmasına rağmen, şu anda mevcut olan teknolojiler yeterli hacimde bitki dokusunun örneklenmesine ve işlenmesine izin vermemekte, bu da Kaliforniya'daki narenciye ağaçlarında CLas için net bir şekilde yetersiz örnekleme ve yetersiz test yapılmasına neden olmaktadır. Yetersiz örnekleme ve yetersiz test, hem test edilen ağaç sayısı hem de işlenen ağaç başına bitki materyali miktarı (yani yaprak sayısı) ile ilgili olarak meydana gelir ve enfekte olmuş yaprakların ağaç gölgesi içindeki sporadik dağılımı nedeniyle, erken veya hafif enfeksiyonları kaçırma olasılığı yüksektir. Numune alma ve CLas testi için mevcut yöntemler, maliyetler (örneğin, işçilik ve ekipman) nedeniyle artan taleple ölçeklenemez. Şu anda, Kaliforniya'daki çoğu narenciye teşhis laboratuvarı tarafından narenciye patojen testine uygun nükleik asitler elde etmek için kullanılan numune işleme yöntemi, manuel numune işleme ve 100.000 doların üzerinde maliyeti olan özel malzeme ve ekipman için 17 saatten fazla bir süre gerektirmektedir.

Burada, tomurcuk ağacı dokusu çıkarıcı (BTE) adı verilen, narenciye tomurcuk ağacı kabuğu dokularını hızlı bir şekilde işlemek için tasarlanmış özel bir cihazın doğrulamasını ve narenciye teşhis laboratuvarları için ayrıntılı, adım adım numune işleme protokolünü sunuyoruz. Araştırma, tomurcuk ağacı örneklerinin mevcut emek yoğun elle doğranmasının yerini alacak ve mümkün olan en yüksek verimli ve en uygun maliyetli narenciye tomurcuk ağacı işleme aletini oluşturmak için yenilikçi bir doku işleme yöntemi geliştirmeye odaklandı. Sonuçlar, BTE'nin numune verimini artırdığını ve CCPP tanı laboratuvarında kullanılan ekipman ve malzemelerin maliyetini düşürdüğünü göstermektedir. Sunulan teknoloji ve yöntem ayrıca NFC etiketlerinin, bir telefon uygulamasının ve gerçek zamanlı örnek bilgi takibi için çevrimiçi bir veritabanının kullanımını içerir. Tomurcuk ağacı örnekleri toplandıktan sonra, telefon uygulaması NFC örnek torbası klipsini NFC ağaç etiketine bağlar. Numuneler daha sonra BTE makinesi ile işlenmek üzere laboratuvara gönderilir. Her numune için bilgiler, BTE gövdesinin yan tarafında hızlı bir kaydırma ile kaydedilir. Numune NFC etiketi aracılığıyla, her numune için işlem süresi ve numunenin ağırlığı da kaydedilir ve gerçek zamanlı olarak çevrimiçi veritabanına yüklenir. Bu yöntem, zaman açısından çok verimli bir sistem sağlar, kalite kontrolünü iyileştirir (yani numune kimliği hatalarından kaçınarak) ve laboratuvar verimliliğini artırır.

BTE'nin yüksek verimli işleme ve doğrulaması, diğer teşhis laboratuvarlarının teknolojiyi ve metodolojiyi kolayca benimseyebileceğini gösteren "gerçek hayat/tarla" narenciye numuneleri ile gerçekleştirildi. Bu teknolojinin benimsenmesi, işletme maliyetlerinin düşürülmesine ve teşhis kapasitesinin ve laboratuvar verimliliğinin artırılmasına olanak tanıyacak, böylece hastalıklı ağaçların enfeksiyon meydana geldikten sonra daha erken bir aşamada tespit edilme şansını artıracak ve hastalığın yayılma olasılığını azaltacaktır. BTE'nin geleneksel doku işleme yöntemleriyle yan yana karşılaştırılması, ekstrakte edilen nükleik asidin kalitesinin (yani konsantrasyon, saflık ve bütünlük) ve aşağı akış patojen tespitinin sonuçlarının karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir (Şekil 3A-C). Bununla birlikte, numuneleri işlemek için harcanan süre, manuel işleme protokollerine kıyasla BTE kullanılarak önemli ölçüde azaltılır (yani, 3,3 dakikaya karşı 6,8 dakika). Odalar ve BTE tabanı düzenli bir temizlik programı gerektirir. Temizleme zaman alıcı olmasına ve yöntemin bir sınırlamasını oluşturmasına rağmen, teknoloji, haznenin temizlenmesi gerekmeden önce BTE'de birden fazla numunenin hızlı bir şekilde işlenmesine olanak tanır. Geleneksel metotlar, her numunenin çoğu durumda tek kullanımlık olan kendi işleme kabına sahip olması nedeniyle daha az temizlik gerektirir, ancak daha fazla kap ve depolama alanına ihtiyaç duyarlar (örneğin, 4 °C'lik buzdolapları ve −20 °C veya −80 °C'lik dondurucular).

BTE süreci, toplu numune işleme ve test etme yoluyla (yani, büyük bir narenciye germplazm temel bloğu, fidanlık veya meyve bahçesi içinde hastalıklı bir ağaç bulma) sorunlu bir alanı belirleme olasılığını artırmak için tasarlanmış ve inşa edilmiştir. Bu nedenle, yalnızca olumlu bir sonuç bulunduğunda sapar. Bu gerçekleştiğinde (Şekil 4B, parti 1 ve parti 5), hangi numunelerin pozitif olduğunu belirlemek için müteakip numune işleme ve pozitif materyali içeren aynı partiden (yani numunelerin yalnızca bir alt kümesi) ayrı numunelerin test edilmesi gerekir. Bu nedenle, bu prosedürün öncelikle düşük enfeksiyon oranlarına sahip vakalar için uygun olduğuna dikkat etmek önemlidir, burada birçok ağaçtan yüksek miktarda malzemenin test edilmesine izin verir, bu da karşılığında çok sayıda bireysel numuneyi test etmek zorunda kalmadan hastalık tespit olasılığını artırır. Konvansiyonel yöntemler, her numunenin ayrı ayrı test edilmesine izin verdiği için enfeksiyon oranlarının yüksek olduğu vakalarda en uygun seçenek olacaktır. Bu, özellikle Kaliforniya20'deki HLB araştırmaları durumunda (hala düşük bir HLB pozitiflik oranında), CLas tespiti için kullanılan PCR tabanlı yöntemlerin öncelikle asemptomatik ağaçlarda CLas'ın varlığını veya yokluğunu doğrulamayı amaçladığı durumlarda önemlidir (yani, CLas pozitif Asya narenciye psillidlerine (ACP) maruz kalmış tipik lekeli benek, gölgelik sararma veya ağaç düşüşü yok. Enfektif bir ACP'nin ağacın neresinde beslendiğini bilmediğimiz gerçeği göz önüne alındığında, az sayıda numuneyi test ederek tarlada veya başka herhangi bir geniş alanda veya operasyonda enfekte ancak asemptomatik bir ağacı belirleme şansı çok düşüktür (örneğin, Kaliforniya'da şu anda 20 yaprak toplanmaktadır ve ağaç başına 12 yaprak test edilmektedir20). Açıkçası, ağaç kanopisi ne kadar büyükse, CLas algılama şansı o kadar düşük olur. Numune işlemeyi takip eden PCR'nin (yani reaktifler, temel laboratuvar ekipmanı ve termosiklör) ve nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırılmasının maliyetleri BTE sürecinde değişmeden devam etse de, enfekte olup olmadıklarını belirlemek için asemptomatik ağaçlardan numunelerin nereden toplanacağına ilişkin belirsizlik hala devam etmektedir ve bize göre, Kaliforniya'daki HLB araştırmasının Aşil topuğudur. Sunulan araç, teknoloji, yöntem ve iyileştirmeler, daha büyük numune boyutlarının daha kısa sürede ve daha düşük maliyetle işlenmesine olanak sağlayacaktır. Bu nedenle, bu yöntem, enfekte olmuş ağaçların zamanında tespit edilme olasılığını artıracak ve Kaliforniya'da HLB veya diğer istilacı narenciye patojenleri için eradikasyon çabalarını iyileştirecektir (örneğin, Ağustos 2022'de Kaliforniya'da bildirilen narenciye sarı damar temizleme virüsü).

Otomatik doku işleme yöntemleriyle birleştirildiğinde, toplu numune alma ve test, bitki doku işleme maliyetlerinin azaltılmasına olanak tanır. Bu maliyet düşüşü, birçok teşhis laboratuvarının birçok eyalette meyve bahçelerini daha etkili bir şekilde taramasına ve HLB ve diğer hastalıkların hareketini daha iyi izlemesine olanak tanıyacaktır. Sonuç olarak, bu, yetiştiricilerin daha verimli büyük ölçekli testler yoluyla hastalıkların yayılmasını yavaşlatmak için daha etkili bir araca sahip olacağı anlamına gelir. BTE cihazı, narenciye laboratuvarlarının mevcut teşhis kapasitesini artırabilir ve tüm narenciye endüstrisine fayda sağlayabilirken, aynı zamanda teknoloji diğer ağaç mahsullerine de aktarılabilir. OD tarafından tahmin edildiği gibi nükleik asit konsantrasyonu ve saflığının ön verileri, BTE'nin badem (59.87 ng/μL ± 7.43 ng/μL ve A260/A280 1.17 ± 0.05, n = 9), asma (135.74 ng/μL ± 50.74 ng/μL ve A260/A280 1.17 ± 0.06, n = 9) ve şeftali (66.50 ng/μL ± 6.07 ng/μL ve A260/A280 1.29 ± 0.05, n = 9) (UC Davis'teki Foundation Plant Services tarafından sağlanan örnekler).

Burada sunulan tomurcuk ağacı doku işleme platformu, ek bitki doku işleme ekipmanlarının geliştirilmesine ilham verdi. Örneğin, bir yaprak dokusu çıkarıcı (LTE) şu anda geliştirilme aşamasındadır. Narenciye yaprakları kullanılarak yapılan ön test sonuçları, LTE cihazının, California20'de kullanılan mevcut standart 12 yaprak yöntemine göre işlem süresinde yalnızca% 35'lik bir artışla yaklaşık yedi kat daha fazla yaprak işleyebildiğini göstermiştir. LTE destekli bir toplu örnekleme ve test protokolünün, narenciye yaprağı testi başına toplam maliyeti dörtte bir oranında azaltabileceğini tahmin ettik. Bu teknolojinin pratik uygulamasının değerini kanıtlamak için araştırmalar şu anda laboratuvarlarımızda bir CDFA Özel Ürün Bloğu Hibesi altında devam etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgments

Yazarlar, Cahuilla halkını, deneysel çalışmanın tamamlandığı Toprağın Geleneksel Koruyucuları olarak kabul ediyor. UCR California Tarım ve Gıda Girişimi (CAFÉ) Girişimi kapsamında bu proje için araştırma faaliyetlerini yürütmek üzere laboratuvar alanı sağladığı için Riverside'daki California Üniversitesi'nden Profesör Norman Ellstrand'a minnettarız. Bu araştırma, CDFA - Özel Mahsul Bloğu Hibe Programı (hibe no. 18-0001-055-SC) tarafından desteklenmiştir. CRB projesi 6100 tarafından da ek destek sağlandı; USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch projesi 1020106; ve Ulusal Temiz Bitki Ağı-USDA Hayvan ve Bitki Sağlığı Denetim Servisi (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) Georgios Vidalakis'e verildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Tags

Biyomühendislik Sayı 194 Tomurcuk ağacı doku ekstraksiyonu elle doğrama "Candidatus Liberibacter asiaticus" CLas huanglongbing HLB Citrus tristeza virüsü CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Narenciye tomurcuk ağacı işlemenin, cihaz mühendisliği yoluyla aşağı akış patojen tespiti için otomatikleştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter