Kalsiumavbildning i mus Superior Colliculus
Summary
Denne protokollen beskriver prosedyren for avbildning av kalsiumresponser i overlegen colliculus (SC) av våken mus, inkludert avbildning av enkeltneuronaktivitet med to-foton mikroskopi mens du forlater cortex intakt i villtypemus, og avbildning av hele SC med bredfeltsmikroskopi i partial-cortex mutante mus.
Abstract
Superior colliculus (SC), en evolusjonært bevart midthjernestruktur hos alle vertebrater, er det mest sofistikerte visuelle senteret før fremveksten av hjernebarken. Den mottar direkte innganger fra ~ 30 typer retinal ganglionceller (RGC), med hver koding av en bestemt visuell funksjon. Det er fortsatt unnvikende om SC bare arver retinale egenskaper eller om ytterligere og potensielt de novo-behandling skjer i SC. For å avsløre nevral koding av visuell informasjon i SC, gir vi her en detaljert protokoll for optisk registrering av visuelle responser med to komplementære metoder i våkne mus. Den ene metoden bruker to-foton mikroskopi for å avbilde kalsiumaktivitet ved enkeltcelleoppløsning uten å ablatere overliggende cortex, mens den andre bruker bredfeltsmikroskopi for å avbilde hele SC av en mutant mus hvis cortex i stor grad er uutviklet. Denne protokollen beskriver disse to metodene, inkludert dyreforberedelse, virusinjeksjon, implantasjon av hodeplater, pluggimplantasjon, datainnsamling og dataanalyse. De representative resultatene viser at to-foton kalsiumavbildningen avslører visuelt fremkalte nevronresponser ved enkeltcelleoppløsning, og bredfeltkalsiumavbildningen avslører nevral aktivitet over hele SC. Ved å kombinere disse to metodene kan man avsløre nevral koding i SC på forskjellige skalaer, og en slik kombinasjon kan også brukes på andre hjernegrupper.
Introduction
Superior colliculus (SC) er et viktig visuelt senter hos alle virveldyr. Hos pattedyr mottar den direkte innganger fra netthinnen og den visuelle cortex1. Mens optisk opptak har blitt mye brukt på cortex 2,3,4,5, hindres anvendelsen i SC av dårlig optisk tilgang 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Målet med denne protokollen er å gi detaljer om to komplementære metoder for optisk opptak av nevral aktivitet i SC.
SC ligger under cortex og tverrgående sinus, som begrenser optisk tilgang til de kollikulære nevronene. En tilnærming for å overvinne denne begrensningen er å aspirere den overliggende cortex og eksponere den fremre-laterale SC 7,9,10,13,14,19. Men fordi SC mottar kortikale innganger, kan en slik operasjon påvirke hvordan SC-nevronene reagerer på visuelle stimuli. For å overvinne denne begrensningen, beskriver vi her en alternativ protokoll for å avbilde det overfladiske laget av den bakre-mediale SC med en silisiumplugg, mens du lar cortex være intakt 8,11. Spesielt, for å oppnå enkeltcelleoppløsning, brukte vi to-foton mikroskopi for å avbilde kalsiumresponser i bakre mediale SC av villtype mus. I tillegg, for å oppnå bred dekning, brukte vi bredfeltsmikroskopi for å avbilde hele SC av en mutant mus hvis bakre cortex ikke har utviklet20.
De to metodene beskrevet i denne protokollen er komplementære til hverandre. To-foton kalsiumavbildning uten å ablatere cortex er egnet for opptak av nevral aktivitet ved enkeltcelleoppløsning med intakte kortikale innganger. Kalsiumavbildningen med bredt felt er egnet for registrering av nevral aktivitet i hele SC mens du ofrer romlig oppløsning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Det mest kritiske trinnet er kraniotomi i trinn 5.2 og 5.3. For det første er benet på 0,5 mm bakenfor lambda tykt og har blodkar inni, noe som kan forårsake blødning under boreprosessen. Tilstrekkelig gelskum bør tilberedes for å stoppe blødningen. For det andre er det en god sjanse for angiorrhexis når du fjerner beinet like over den tverrgående sinus. For feilsøking er en alternativ tilnærming å tynne beinet inne i ovalen og fjerne det bit for bit. Et annet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av National Natural Science Foundation of China (32271060). Y.-t.L. designet forskningen, utførte eksperimentet, analyserte dataene og skrev manuskriptet. Z.L. og R.W. utførte eksperimentet.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
References
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
- Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
- de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
- Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
- Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
- Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
- de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
- Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
- Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
- Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
- Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
- Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
- Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
- Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
- Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
- Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
- Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
- Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).
