Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65181
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Chinese Institute for Brain Research
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Abstract

Tüm omurgalılarda evrimsel olarak korunmuş bir orta beyin yapısı olan superior colliculus (SC), serebral korteksin ortaya çıkmasından önceki en karmaşık görsel merkezdir. Her biri belirli bir görsel özelliği kodlayan ~30 tip retinal ganglion hücresinden (RGC'ler) doğrudan girdiler alır. SC'nin sadece retinal özellikleri miras alıp almadığı veya SC'de ek ve potansiyel olarak de novo işlemenin meydana gelip gelmediği belirsizliğini koruyor. SC'deki görsel bilginin nöral kodlamasını ortaya çıkarmak için, burada uyanık farelerde iki tamamlayıcı yöntemle görsel yanıtları optik olarak kaydetmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bir yöntem, üst üste binen korteksi kesmeden tek hücre çözünürlüğünde kalsiyum aktivitesini görüntülemek için iki foton mikroskobu kullanırken, diğeri korteksi büyük ölçüde gelişmemiş bir mutant farenin tüm SC'sini görüntülemek için geniş alan mikroskobu kullanır. Bu protokol, hayvan hazırlama, viral enjeksiyon, başlık plakası implantasyonu, fiş implantasyonu, veri toplama ve veri analizi dahil olmak üzere bu iki yöntemi detaylandırır. Temsili sonuçlar, iki fotonlu kalsiyum görüntülemenin, tek hücre çözünürlüğünde görsel olarak uyarılmış nöronal tepkileri ortaya çıkardığını ve geniş alanlı kalsiyum görüntülemenin tüm SC boyunca nöral aktiviteyi ortaya çıkardığını göstermektedir. Bu iki yöntem birleştirilerek SK'deki nöral kodlama farklı ölçeklerde ortaya çıkarılabilir ve bu kombinasyon beynin diğer bölgelerine de uygulanabilir.

Introduction

Superior colliculus (SC) tüm omurgalılarda önemli bir görme merkezidir. Memelilerde, retinadan ve görsel kortekstendoğrudan girdi alır 1. Optik kayıt, korteks 2,3,4,5'e yaygın olarak uygulanırken, SC'deki uygulaması zayıf optik erişimler tarafından engellenmektedir 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Bu protokolün amacı, SC'deki nöral aktivitenin optik kaydı için iki tamamlayıcı yöntem hakkında ayrıntılı bilgi sağlamaktır.

SC, kolliküler nöronlara optik erişimi sınırlayan korteks ve transvers sinüsün altında bulunur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için bir yaklaşım, üst üste binen korteksi aspire etmek ve ön-lateral SC 7,9,10,13,14,19'u ortaya çıkarmaktır. Bununla birlikte, SC kortikal girdiler aldığından, böyle bir işlem SC nöronlarının görsel uyaranlara nasıl tepki verdiğini etkileyebilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, korteksi sağlam bırakırken posterior-medial SC'nin yüzeysel tabakasını silikon bir tıkaç ile görüntülemek için alternatif bir protokolü burada detaylandırıyoruz 8,11. Spesifik olarak, tek hücreli çözünürlük elde etmek için, vahşi tip farelerin posterior-medial SC'sindeki kalsiyum tepkilerini görüntülemek için iki foton mikroskobu uyguladık. Ek olarak, geniş kapsama alanı elde etmek için, posterior korteksigelişmemiş bir mutant farenin tüm SC'sini görüntülemek için geniş alan mikroskobu uyguladık 20.

Bu protokolde açıklanan iki yöntem birbirini tamamlayıcı niteliktedir. Korteks kesilmeden iki fotonlu kalsiyum görüntüleme, sağlam kortikal girdilerle tek hücre çözünürlüğünde nöral aktiviteyi kaydetmek için uygundur. Geniş alanlı kalsiyum görüntüleme, uzamsal çözünürlükten ödün verirken tüm SC'deki nöral aktiviteyi kaydetmek için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler hayvan refahı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Pekin'deki Çin Beyin Araştırmaları Enstitüsü'ndeki IACUC tarafından onaylandı.

NOT: Bu protokolün zaman çizelgesi aşağıdaki gibidir: 1) vantuzu yapın; 2) virüsü enjekte etmek; 3) kafa plakasını implante edin; 4) 3 hafta sonra, fişi implante edin; 5) Koşu bandında ~ 3 günlük bir iyileşme ve alışkanlıktan sonra, iki foton / geniş alan görüntüleme yapın.

1. Vantuz hazırlanması (Şekil 1A)

  1. Akrilik bir tabağa bir damla fosfat tamponlu salin (PBS, 1x) koyun ve ucu kılcallık ile doldurmak için 21 G düz bir iğne ile dokunun.
  2. İğnenin ucunu yarı saydam bir silikon yapıştırıcı ile kapatın ve yaklaşık ~10 dakika bekletin.
  3. Silikon yapıştırıcıyı makasla ~2 mm çapında bir diske kesin.

2. Fişlerin hazırlanması (Şekil 1B)

  1. 0,75 mm kalınlığında bir plastik şim stoğu hazırlayın ve ortasından 1 cm x 1 cm'lik bir kare kesin. İki akrilik blok hazırlayın. Şim stoğunu ve akrilik blokları alkolle temizleyin ve lens kağıdı ile silin.
  2. Şim stoğunu bir akrilik blok üzerine koyun, açıklığın ~%90'ını doldurmak için silikon yapıştırıcıyı merkeze bırakın (kabarcıkları önleyin), başka bir akrilik blok ve ~1 kg kuvvet ekleyin ve 20 dakika bekleyin.
  3. Cerrahi mikroskop altında, silikon yapıştırıcıyı bir neşter ile 1 mm yüksekliğinde ve 1,5 mm genişliğinde üçgen prizmalar üzerinde üçgen baskılı bir kağıt parçasının üzerinde kesin.
  4. Üçgen prizmalardaki tozu plastik yapışkan bantla temizleyin ve 5 mm çapında ve 0,15 mm kalınlığında bir cam lamel üzerine koyun.
  5. Üçgen prizmalarla lamel bir korona muamelecinin altına koyun, korona muamele ediciyi açın ve aydınlatma görünene kadar lamel yaklaştırın. Birbirlerine yapışana kadar birkaç dakika bu konumda tutun.
    NOT: Bu adım diğer korona tedavi ediciler için farklı olabilir.
  6. Tıkaçları bir Petri kabına koyun ve gece boyunca 70 °C'de bir inkübatöre koyun.

3. Hayvanların hazırlanması ve viral yapının enjeksiyonu

  1. C57BL / 6J (vahşi tip) ve Emx1-Cre: Pals1flox / wt (kısmi korteks) 20 fareyi 6 haftalıkken (görüntüleme sırasında 9 hafta) kullanın.
  2. Cerrahi prosedür için kullanılan tüm malzemeleri ve aletleri sterilize edin.
  3. Fareyi %5 izofluran ile uyuşturun ve ardından ameliyat sırasında 1 L / dak akış hızıyla izofluranı %1-2'de tutun. Ayak parmağı sıkıştırma refleksinin olmaması ile anestezi seviyesini onaylayın.
  4. Fareyi kulak çubukları ile stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin. Ameliyat boyunca kurumasını önlemek için fare gözlerine oftalmik merhem sürün ve termostatik ısıtma yastığı ile vücut ısısını 37 °C'de tutun.
  5. Kürkü tıraş edin ve cilt yüzeyini iyodofor ve% 75 etanol ile sterilize edin. Lidokain (5 mg/kg, deri altı enjeksiyon [SQ]), tilidin (2 mg/kg, SQ) ve meloksikam (2 mg/kg, SQ) enjekte edin.
    NOT: Sterilizasyon, analjezi ve lokal anestezi için cerrahi prosedür kurumlar arasında farklılık gösterebilir.
  6. Kafatasını ortaya çıkarmak için SC'nin üzerindeki cildi cerrahi makasla çıkarın. Kafatasını pamuklu çubukla temizleyin.
  7. Kafatası yüzeyi düz olana kadar stereotaksik çerçeveyi ayarlayın. Dura açığa çıkana kadar lambdanın 0.5 mm yanal ve 0.42 mm önünde bir delik açın.
  8. GCaMP6m (rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m; 1 x 1013 GC/mL) eksprese eden adeno-ilişkili virüsü (AAV) lambdadan 1 mm ve 1,6 mm derinliklerde eğimli bir cam mikropipetle enjekte edin (uç 40-50 μm çapında 25°'ye eğimlidir).
  9. Her derinlikte, 50 nL/dk hızında 100 nL enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra 5 dakika bekleyin. Enjeksiyondan sonra enjektörü yavaşça geri çekin.

4. Başlık plakasının implantasyonu

  1. Kafatasının üzerindeki kasları ve dokuları temizleyin ve kafatasını bir bıçakla çizin. Kanama olursa, jel köpük ile durdurun ve kanı temizleyin. Başlık plakasını (Şekil 1C) kendi kendine kürlenen bir diş yapıştırıcısı reçine simenti ile kafatasına tutturun. Spesifik olarak, 3/4 kaşık polimer, üç damla monomer ve bir damla katalizörü buz üzerinde seramik bir kapta karıştırın. Karışımı başlık plakasına ve kafatasına uygulayın. Bunları birbirine yapıştırın ve yapıştırıcının kuruması için 5 dakika bekleyin.
  2. Enfeksiyonları önlemek için antibiyotik (ceftiofur sodyum, 5 mg / kg, SQ) enjekte edin. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve kurtarma için bir ısıtma yastığına yerleştirin. Anesteziden kurtulduktan sonra ev kafesine geri koyun. Ağrı yönetimi için, ameliyattan sonraki 3 gün boyunca fareye ibuprofen içeren içme suyu (0,5 mL / 50 mL) sağlayın.

5. Fişin implantasyonu (Şekil 2)

  1. Viral enjeksiyondan 3 hafta sonra fişi implante edin. Fareyi 3.2-3.5 adımlarında açıklandığı gibi stereotaksik bir çerçeveye uyuşturun ve sabitleyin. Olası kanamayı durdurmak için tuzlu suya batırılmış jel köpüğü hazırlayın.
  2. Lambdanın 3 mm arkasında ortalanmış bir mikro matkapla 2 mm x 0.5 mm oval delin. Ovalin kenarını çatlayana kadar inceltin. Lameli SC'ye yaklaştırmak için oval kayıt penceresinin önündeki kafatasını inceltin.
  3. İnce forseps kullanarak kemik kapaklarını çıkarın. Transvers sinüsün arkasındaki dura'da bir kesi yapın ve dura parçasını çıkarın. Gerekirse, kurumayı önlemek için beyne 3 mL'lik bir şırınga ile yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ekleyin. Kafatasını ve kayıt penceresini jel köpük ve pamuklu çubuklarla kurulayın.
  4. Kayıt penceresine bir damla silikon yapıştırıcı bırakın. Fişi negatif basınçla tutmak için vantuzu kullanın. Vantuzu hareket ettirmek için motorlu bir mikromanipülatör kullanın ve lamel kafatasına değene kadar tapayı silikon yapıştırıcıya indirin. Ardından, transvers sinüsü itmek ve SC'yi ortaya çıkarmak için fişi ~1 mm ileri hareket ettirin. Bu adım, silikon yapıştırıcı yapışkan hale gelmeden önce 1-2 dakika içinde yapılmalıdır.
  5. Başlık plakasını temizleyin ve başlık plakasına sabitlemek için tapanın sınırına bütil siyanoakrilat ve reçine çimentosu uygulayın.
    NOT: Adım 4.2'de açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakım sağlayın.

6. İki fotonlu görüntüleme (Şekil 3)

  1. Hayvanı, kafa plakası ile dönen bir koşu bandına sabitleyin. Koşu bandını iki fotonlu bir mikroskobu altına yerleştirin ve yüksekliği uygun bir konuma ayarlayın. Görsel stimülasyon için monitörden ışık kirlenmesini önlemek için objektif ile başlık arasına siyah bir alüminyum koni koyun. Fareyi ~15 dakika alıştırın.
  2. Mikroskopta 16x büyütme, 0.8 sayısal açıklık (NA) ve 3 mm çalışma mesafesi (WD) objektifi ile iki fotonlu görüntüleme gerçekleştirin. GCaMP6m'yi 920 nm'de uyarmak için iki galvo tarayıcı tarafından kontrol edilen mod kilitleme tekniğine sahip bir Ti: safir lazer kullanın. S'deki lazer gücünü ayarlayınampdüzlem 20-80 mW arasında.
  3. 4,8 Hz'de 600 μm x 600 μm görüş alanını 2,4 μ m/piksel uzamsal çözünürlükle ve 350 μ m'ye kadar derinlikte görüntü nöral aktivitesini tarayın.
    NOT: Örnekleme hızı ve uzamsal çözünürlük galvo tarayıcılar içindir ve rezonans tarayıcılar için ayarlanmalıdır.
  4. Yayılan floresansı dikroik bir ayna ile toplayın ve bir bant geçiren filtreden geçirdikten sonra bir fotoçoğaltıcı tüp (PMT) kullanarak tespit edin.
  5. Döner kodlayıcı ile farenin koşu bandındaki hareketini kaydedin. Göz bebeği boyutunu ve konumunu kaydetmek için 50 mm lensli bir kamera kullanın. Stimülasyon bilgisayarı tarafından gönderilen tetikleyicileri kaydederek bu kayıtları ve görüntü alımlarını görsel stimülasyonla senkronize edin.

7. İki fotonlu görüntüleme ile ölçülen kalsiyum yanıtlarının analizi

  1. SIMA21 veya NoRMCorre22 kullanarak görüntüleme sırasında beyin hareketini düzeltin.
  2. Hücre Sihirli Değnek aracını (ImageJ) kullanarak ilgilenilen bir bölgeyi (ROI) manuel olarak çizin ve MATLAB'de bir elips ile sığdırın. Nöropil kontaminasyonunu giderdikten sonra her ROI'nin floresan izlerini çıkarın:
    Equation 1
    F true ve F raw, sırasıyla ROI'nin düzeltilmiş ve ham floresan genlikleridir, F nöropil, çevreleyen nöropilin floresan genliğidir ve r, odak dışı nöropilkontaminasyon faktörüdür (kurulumumuz için 0.7). R, daha önce açıklandığı gibi, Ftrue= 0 olan bir kan damarı üzerindeki sinyallerin ölçülmesiyle tahmin edilir23,24.
  3. Her karede25 ortalanmış 15 sn penceresinden sekizinci yüzdebirlik değeri çıkararak yavaş taban çizgisi dalgalanmalarını kaldırın.
  4. Bir nöronun görsel tepkilerini, uyaran periyodu sırasında ROI'sindeki floresan genliğinin göreceli değişimi olarak tanımlayın:
    Equation 2
    F zirvesi , görsel stimülasyon sırasında floresan izinin tepe genliğidir ve Ftaban çizgisi, stimülasyondan önceki 0.5 saniyelik bir süre boyunca ortalama genliktir.

8. Geniş alan görüntüleme ve veri analizi (Şekil 4)

  1. Tandem lens4 ile geniş alanlı bir makroskop oluşturun (Şekil 4A). Tandem lensli makroskop , bir adaptörle bağlanan iki kamera merceğidir (50 mm ve 105 mm) ve büyütme ~2x'tir.
  2. Kısmi korteks mutant fareleri adım 3.2-3.5'te açıklandığı gibi hazırlayın. SC'nin her iki tarafının ortasına 200 μm derinlikte GCaMP6m eksprese eden 100 nL AAV enjekte edin.
  3. ~ 3 hafta sonra, SC'nin üzerine 5 mm çapında bir lamel yerleştirin. SC'de ortalanmış 4 mm x 3 mm'lik oval bir kraniotomi yapın ve etrafındaki kemiği inceltin. Ardından, lamel doğrudan SC'nin üzerine bastırın ve reçine çimentosu ile sabitleyin.
  4. GCaMP6m'yi uyarma filtreli (469 nm ± 35 nm) mavi ışık yayan diyot (LED) ile uyarın. 10 Hz'de bir emisyon filtresinden (525 nm ± 39 nm) geçtikten sonra tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera kullanarak görüntü elde edin. Kamera, 2,63 μm/piksel uzamsal çözünürlükte 5,36 mm x 2,85 mm'lik bir alanı kaplar.
  5. Alınan her görüntüyü normalleştirilmiş bir kutu filtresiyle birleştirin ve orijinal boyutunun 1/4'üne kadar alt örnekleyin. Görüntüdeki her piksel için, adım 7.4'te açıklandığı gibi yanıtı tanımlayın.
    NOT: Adım 4.2'de açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakım sağlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1A,B, sırasıyla vantuz ve tapaların nasıl yapılacağını göstermektedir. Şekil 2 , fişin nasıl başarılı bir şekilde implante edileceğini göstermektedir. Tıkaç implante edildikten sonra, Şekil 2D'de gösterildiği gibi posterior-medial SC ortaya çıkar. Şekil 3 , iki foton mikroskobu kullanılarak görüntülenen örnek bir vahşi tip fareden SC nöronlarının kalsiyum tepkilerini göstermektedir. Mikroskop altında kolayca yakalanan üçgen prizma, görüntüleme bölgesini bulmak için kullanılabilir (Şekil 3B). Görsel yanıtlar tek hücre çözünürlüğünde gösterilir (Şekil 3C , Dve Video 1). Şekil 4 , geniş alan mikroskobu kullanılarak görüntülenen örnek bir kısmi korteks mutant fareden SC nöronlarının kalsiyum yanıtlarını göstermektedir. Elde edilen görüntü ilk olarak orijinal boyutun dörtte birine indirildi (Şekil 4B). Görsel olarak uyarılmış kalsiyum yanıtları SC'nin her iki tarafında gösterilmiştir (Şekil 4C ve Video 2). Şekil 5 , enjeksiyon bölgesinde ve görüntüleme bölgesinde SC'de GCaMP6m'nin ekspresyonunu göstermektedir; Enjeksiyon bölgesinde daha az nöron vardır.

Figure 1
Şekil 1: Hazırlık. (A) Vantuz yapmak için üç adım (adım 1.1-1.3); İğnenin içindeki PBS gösterilmez. (B) Fişleri yapmak için üç adım (adım 2.1-2.3). (C) Yabani tip fareler için 8 mm çapında iki tip başlık plakası. Kısmi korteks mutant fareler için 7 mm çapında iki tip kafa plakası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Fişin implantasyonu (adım 5.2-5.5). (A) Kemik incelir. Çevresi reçine çimentodur. (B) İnferior kollikulus ve serebellumu ortaya çıkarmak için kemik ve dura çıkarılır. (C) Tıkaç indirilir ve posterior-medial SC'yi ortaya çıkarmak için transvers sinüsü öne doğru iter. Yeşil kesikli daire lameli işaretler. Mavi kesikli üçgen fişi işaretler. Kırmızı kesikli daire vantuzu işaretler. (D) Tapa, bütil siyanoakrilat ve reçine çimentosu ile sabitlenmiştir. Görüntü, posterior-medial SK'yi net bir şekilde göstermek için aşırı pozlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: İki fotonlu kalsiyum görüntüleme . (A) Tıkaç implante edildikten sonra fare beyin anatomisinin şeması. Koyu kesikli çizgi, SC'nin ana hatlarını işaretler. Sarı üçgen üçgen prizmayı gösterir. Yeşil renk GCaMP ifadesini gösterir. (B) Taramadan önce mikroskop altında silikon üçgen prizmanın bir resmi. (C) Örnek bir vahşi tip fareden alınan iki foton mikroskobu ile ölçülen, SC nöronlarından GCamMP'nin floresansının bir görüntüsü. (D) Floresanın görüntüler boyunca standart sapma projeksiyonu (bkz. Video 1). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Geniş alanlı kalsiyum görüntüleme . (A) Geniş alan görüntüleme kurulumunun bir fotoğrafı. (B) Örnek bir ham görüntü ve altörneklenmiş görüntü. Kesikli sarı çizgi, SC'nin ana hatlarını işaretler. (C) Örnek bir kısmi korteks fareden geniş alan mikroskobu ile ölçülen, SC nöronlarının kalsiyum yanıtlarının tek bir çerçevesi ve standart sapma izdüşümü (bkz. Video 2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Bir fare beyninin enjeksiyon bölgesinden farklı mesafelerdeki koronal bölümleri. Alt sıra, üst satırda işaretlenmiş kutuların yüksek büyütme oranını gösterir. Sarı kesikli dikdörtgen, sağındaki bölgeden daha az nöron içeren enjeksiyon bölgesini işaretler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: İki foton mikroskobu ile SC nöronlarının görsel uyarana kalsiyum tepkilerinin ham ve hareket düzeltilmiş videoları Video 3'te. Görüntüler 4.8 Hz'de alındı ve 20 Hz'de görüntülendi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Geniş alan mikroskobu ile SC nöronlarının görsel uyarana kalsiyum tepkilerinin ham ve hareket düzeltilmiş videoları Video 3'te. Görüntüler 10 Hz'de alındı ve 20 Hz'de görüntülendi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 3: 12 farklı yönde (50°/sn) sürüklenen siyah tam ekran çubuk (5° genişliğinde). Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokoldeki kritik adımlar
En kritik adım, 5.2 ve 5.3 adımlarındaki kraniyotomidir. İlk olarak, lambdanın 0,5 mm arkasındaki kemik kalındır ve içinde kan damarları vardır, bu da delme işlemi sırasında kanamaya neden olabilir. Kanamayı durdurmak için yeterli jel köpük hazırlanmalıdır. İkincisi, transvers sinüsün hemen üzerindeki kemiği çıkarırken iyi bir anjiorreksi olasılığı vardır. Sorun giderme için alternatif bir yaklaşım, ovalin içindeki kemiği inceltmek ve parça parça çıkarmaktır. Diğer bir püf noktası, duranın kemikten ayrılmasını kolaylaştırmak ve kanamayı önlemek için kaldırmadan önce kemiği ıslatmaktır.

Bir diğer kritik adım, tüm sürecin 1-2 dakika sürmesi gereken adım 5.4'teki tıkaç implantasyonudur. Sorun giderme için, önce mikromanipülatör ile fişi ACSF'de uygun bir konuma getirebilir ve fişin son konumu ayarlanabilir. Ardından silikon yapıştırıcıyı ekleyin ve tapayı uygun bir hızda son konuma getirin.

Mana
Bu protokolün iki avantajı vardır. İlk olarak, vahşi tip farelerde sağlam bir korteks ile tek hücreli çözünürlükte posterior-medial SC'nin görüntülenmesi için ayrıntılar sağlarken, önceki raporlarda üst üste binen korteks anterior-lateral SC'yi ortaya çıkarmak için aspire edildi. İkincisi, geniş alan kalsiyum görüntüleme tekniğini kullanarak kısmi korteks mutant farelerin tüm SC'sinin nasıl görüntüleneceğini detaylandırıyor. Bu iki yaklaşım, farklı ölçeklerde davranan hayvanlarda diğer beyin bölgelerini görüntülemek için uygulanabilir.

Posterior-medial SC'yi üst üste binen korteks aspire etmeden görüntülemek için iki alternatif yöntem bildirilmiştir15,16. Schröder ve ark. dairesel 4 mm'lik bir kraniyotomi yaptılar ve SC16'yı ortaya çıkarmak için her iki ucunda bir rondela ve bir cam lamel bulunan paslanmaz çelik bir boru uyguladılar. Kullandığımıza kıyasla daha büyük kraniotomi ve daha sert materyal, implantasyon sırasında kanamaya neden olma olasılığı daha yüksektir. Ek olarak, paslanmaz çelik biyouyumlu olmadığından, kronik görüntüleme için enfeksiyona neden olma olasılığı daha yüksektir. Benzer şekilde, Savier ve ark. da daha sertti ve biyouyumlu değildi ve kanama ve enfeksiyonlara neden olma olasılığı daha yüksekti15. Bu iki yöntemden bir diğer farkı, viral enjeksiyon bölgemizin görüntüleme penceresinin dışında olması ve dolayısıyla görüntüleme kalitesinin enjeksiyon bölgesindeki olası hasardan daha az etkilenmesidir (Şekil 5).

Protokolün sınırlamaları
Bu protokol, SC'nin yüzeysel katmanındaki kalsiyum yanıtlarının görüntülenmesi için ayrıntılar sağlar. Daha derin katmanların görüntülenmesi, örneğin bir prizma26 kullanılarak kapsanmamıştır. İki fotonlu kalsiyum görüntüleme yaklaşımı, posterior-medial SC'deki nöral aktiviteyi kaydetmek için kullanılır ve anterior-lateral SC'yi kapsamaz 7,13. Mutant parsiyel korteks farelere geniş alan mikroskobu ile tüm SC kalsiyum görüntüleme uygulandı. Geniş tip farelerin tüm SC'sini görüntülemek için, üst üste binen korteksin aspire edilmesi gerekir. Viral enjeksiyon olmadan tüm SC'yi görüntülemenin alternatif bir yolu, intrinsik görüntüleme tekniğidir; ancak, daha düşük bir sinyal-gürültü oranınasahiptir 6,8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32271060) tarafından desteklenmektedir. Y.-t.L. araştırmayı tasarladı, deneyi gerçekleştirdi, verileri analiz etti ve makaleyi yazdı. Deneyi Z.L. ve R.W. gerçekleştirdi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Tags

Nörobilim Sayı 194
Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Wu, R., Li, Y. t. Calcium… More

Li, Z., Wu, R., Li, Y. t. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter