Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65181
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Chinese Institute for Brain Research
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

Abstract

הקוליקולוס העליון (SC), מבנה מוח אמצעי שנשמר אבולוציונית אצל כל בעלי החוליות, הוא מרכז הראייה המתוחכם ביותר לפני הופעתה של קליפת המוח. הוא מקבל קלט ישיר מ ~ 30 סוגים של תאי גנגליון רשתית (RGCs), כאשר כל אחד מהם מקודד תכונה חזותית ספציפית. עדיין לא ברור אם ה-SC פשוט יורש תכונות רשתית או אם מתרחש עיבוד נוסף ופוטנציאלי דה נובו ב-SC. כדי לחשוף את הקידוד העצבי של מידע חזותי ב-SC, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט לרישום אופטי של תגובות חזותיות בשתי שיטות משלימות בעכברים ערים. שיטה אחת משתמשת במיקרוסקופ של שני פוטונים כדי לדמות פעילות סידן ברזולוציה של תא בודד מבלי לבעור את קליפת המוח המכסה אותו, ואילו השיטה השנייה משתמשת במיקרוסקופ רחב שדה כדי לצלם את כל ה-SC של עכבר מוטנטי שקליפת המוח שלו אינה מפותחת ברובה. פרוטוקול זה מפרט את שתי השיטות הללו, כולל הכנת בעלי חיים, הזרקה ויראלית, השתלת לוחית ראש, השתלת תקעים, איסוף נתונים וניתוח נתונים. התוצאות המייצגות מראות כי הדמיית הסידן של שני פוטונים חושפת תגובות עצביות מעוררות חזותית ברזולוציה של תא יחיד, והדמיית הסידן בשדה רחב חושפת פעילות עצבית על פני כל ה-SC. על-ידי שילוב שתי השיטות הללו, ניתן לחשוף את הקידוד העצבי ב-SC בקני מידה שונים, ושילוב כזה יכול להיות מיושם גם על אזורי מוח אחרים.

Introduction

הקוליקולוס העליון (SC) הוא מרכז ראייה חשוב בכל בעלי החוליות. ביונקים הוא מקבל קלט ישיר מהרשתית ומקליפת המוח הראייתית1. בעוד שהקלטה אופטית יושמה באופן נרחב על קליפת המוח 2,3,4,5, היישום שלה ב-SC מעוכב על ידי גישה אופטית גרועה 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. מטרת פרוטוקול זה היא לספק פרטים על שתי שיטות משלימות לרישום אופטי של הפעילות העצבית ב-SC.

ה-SC ממוקם מתחת לקליפת המוח ולסינוס הרוחבי, מה שמגביל את הגישה האופטית לנוירונים הקוליקולריים. גישה אחת להתגבר על מגבלה זו היא לשאוף את קליפת המוח המכסה ולחשוף את SC 7,9,10,13,14,19 הקדמי-לטרלי. אולם מאחר שה-SC מקבל קלט מקליפת המוח, פעולה כזו עשויה להשפיע על האופן שבו תאי העצב מסוג SC מגיבים לגירויים חזותיים. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מפרטים כאן פרוטוקול חלופי להדמיה של השכבה השטחית של SC האחורי-מדיאלי עם תקע סיליקון, תוך השארת קליפת המוח שלמה 8,11. באופן ספציפי, כדי להשיג רזולוציה של תא יחיד, השתמשנו במיקרוסקופ של שני פוטונים כדי לדמיין תגובות סידן ב-SC האחורי-מדיאלי של עכברי בר. בנוסף, כדי להשיג כיסוי רחב, השתמשנו במיקרוסקופ רחב שדה כדי לצלם את כל ה-SC של עכבר מוטנטי שקליפת המוח האחורית שלו לא התפתחה20.

שתי השיטות המתוארות בפרוטוקול זה משלימות זו את זו. הדמיית סידן של שני פוטונים ללא שריפה של קליפת המוח מתאימה לרישום פעילות עצבית ברזולוציה של תא בודד עם קלט קליפת המוח השלם. הדמיית הסידן רחבת השדה מתאימה לרישום הפעילות העצבית ב-SC כולו תוך הקרבת הרזולוציה המרחבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות רווחת בעלי החיים ואושרו על ידי IACUC במכון הסיני לחקר המוח, בייג'ינג.

הערה: ציר הזמן עבור פרוטוקול זה הוא כדלקמן: 1) להכין את היניקה; 2) להזריק את הנגיף; 3) להשתיל את לוחית הראש; 4) לאחר 3 שבועות, להשתיל את התקע; 5) לאחר ~3 ימי התאוששות והתרגלות על ההליכון, בצע הדמיה של שני פוטונים/שדה רחב.

1. הכנת יניקה (איור 1A)

  1. הניחו טיפה של מלח חוצץ פוספט (PBS, 1x) בכלי אקרילי וגעו בו עם מחט שטוחה 21 G כדי למלא את הקצה על ידי נימים.
  2. מכסים את קצה המחט בדבק סיליקון שקוף ומניחים למשך כ~10 דקות.
  3. חותכים את דבק הסיליקון עם מספריים לדיסק בקוטר ~2 מ"מ.

2. הכנת תקעים (איור 1B)

  1. מכינים ציר פלסטיק בעובי 0.75 מ"מ וחותכים ריבוע בגודל 1X1 ס"מ במרכז. הכינו שני בלוקים אקריליים. נקו את ציר השיים ואת קוביות האקריליק באלכוהול ונגבו אותם בנייר עדשה.
  2. מניחים את ציר ה-shim על בלוק אקרילי אחד, מפקידים את דבק הסיליקון במרכז כדי למלא ~90% מהפתח (הימנעו מבועות), מוסיפים עוד בלוק אקרילי וכוח ~1 ק"ג, וממתינים 20 דקות.
  3. תחת מיקרוסקופ כירורגי, חותכים את דבק הסיליקון עם אזמל לגובה 1 מ"מ על מנסרות משולשות ברוחב 1.5 מ"מ מעל פיסת נייר עם משולשים מודפסים עליה.
  4. הסר את כל האבק מהמנסרות המשולשות עם סרט פלסטיק דביק והניח אותו על כיסוי זכוכית בקוטר 5 מ"מ ועובי 0.15 מ"מ.
  5. שמים את הכיסוי עם המנסרות המשולשות מתחת לטיפול בקורונה, מפעילים את מטפל הקורונה ומקרבים אותו לתלוש הכיסוי עד להופעת ברק. החזיקו אותו בתנוחה זו למשך מספר דקות עד שהם מחוברים זה לזה.
    הערה: שלב זה עשוי להיות שונה עבור מטפלים אחרים בקורונה.
  6. שים את התקעים בצלחת פטרי ומניחים אותו באינקובטור ב 70 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

3. הכנת בעלי חיים והזרקת מבנה ויראלי

  1. השתמש C57BL/6J (סוג פראי) ו Emx1-Cre:Pals1flox/wt (קליפת המוח חלקית)20 עכברים משני המינים בגיל 6 שבועות (9 שבועות בזמן ההדמיה).
  2. לעקר את כל החומרים והמכשירים המשמשים להליך הכירורגי.
  3. מרדימים את העכבר עם 5% איזופלורן ולאחר מכן שומרים על איזופלורן ב 1%-2% עם קצב זרימה של 1 ליטר לדקה במהלך הניתוח. לאשר את רמת ההרדמה על ידי חוסר רפלקס צביטת הבוהן.
  4. תקן את העכבר בראש על מסגרת סטריאוטקסית עם מוטות אוזניים. במהלך הניתוח, יש למרוח משחה אופתלמית על עיני העכבר כדי למנוע התייבשות, ולשמור על טמפרטורת הגוף ב-37 מעלות צלזיוס בעזרת כרית חימום תרמוסטטית.
  5. לגלח את הפרווה ולעקר את פני העור עם יודופור ואתנול 75%. הזרקת לידוקאין (5 מ"ג/ק"ג, הזרקה תת-עורית [SQ]), טילידין (2 מ"ג/ק"ג, SQ) ומלוקסיקאם (2 מ"ג/ק"ג, SQ).
    הערה: ההליך הכירורגי לעיקור, שיכוך כאבים והרדמה מקומית עשוי להיות שונה בין מוסדות.
  6. הסר את העור מעל SC עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הגולגולת. נקו את הגולגולת עם צמר גפן.
  7. התאם את המסגרת הסטריאוטקסית עד שמשטח הגולגולת שטוח. קודחים חור 0.5 מ"מ לרוחב ו-0.42 מ"מ קדמי ללמדא עד לחשיפת הדורה.
  8. הזרקת וירוס הקשור לאדנו (AAV) המבטא GCaMP6m (rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m; 1 x10 13 GC/mL מומס ב-1x PBS) בעומקים של 1 מ"מ ו-1.6 מ"מ מהלמבדה עם מיקרופיפטה משופעת מזכוכית (הקצה משופע ל-25° בקוטר של 40-50 מיקרומטר).
  9. בכל עומק, יש להזריק 100 nL במהירות של 50 nL/min ולהמתין 5 דקות לאחר כל הזרקה. לאחר ההזרקה, לאט למשוך את המזרק.

4. השתלת לוחית הראש

  1. נקו את השרירים והרקמות מעל הגולגולת ושרטו את הגולגולת בעזרת להב. אם מתרחש דימום, לעצור אותו עם קצף ג'ל ולנקות את הדם. חברו את לוחית הראש (איור 1C) לגולגולת באמצעות מלט שרף דבק דנטלי המרפא את עצמו. באופן ספציפי, ערבבו 3/4 כף פולימר, שלוש טיפות מונומר וטיפה אחת של זרז בקערת קרמיקה על קרח. מרחו את התערובת על לוחית הראש והגולגולת. חברו אותם יחד והמתינו 5 דקות עד שהדבק יתגדר.
  2. הזריקו אנטיביוטיקה (ceftiofur sodium, 5 מ"ג/ק"ג, SQ) למניעת זיהומים. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח אותו על כרית חימום להתאוששות. החזירו אותו לכלוב הביתי לאחר שהתאושש מההרדמה. לטיפול בכאב, יש לספק מי שתייה המכילים איבופרופן (0.5 מ"ל/50 מ"ל) לעכבר במשך 3 ימים לאחר הניתוח.

5. השתלת התקע (איור 2)

  1. יש להשתיל את התקע 3 שבועות לאחר ההזרקה הנגיפית. להרדים ולתקן את העכבר על מסגרת סטריאוטקסית, כמתואר בשלבים 3.2-3.5. הכינו קצף ג'ל ספוג במי מלח כדי למנוע דימום פוטנציאלי.
  2. קדח אליפסה בגודל 3 מ"מ x 2 מ"מ עם מיקרו-מקדח שמרכזו 0.5 מ"מ אחורי ללמדא. דק את גבול האליפסה עד שהיא נסדקת. דק את הגולגולת לפני חלון ההקלטה הסגלגל כדי להפוך את הכיסוי קרוב ל- SC.
  3. הסירו את דשי העצם בעזרת מלקחיים עדינים. בצע חתך על האחורי דורה לסינוס הרוחבי ולהסיר את חתיכת דורה. במידת הצורך, הוסף נוזל מוחי מלאכותי (ACSF) למוח עם מזרק 3 מ"ל כדי למנוע התייבשות. יבשו את הגולגולת ואת חלון ההקלטה בעזרת קצף ג'ל וצמר גפן.
  4. הפקידו טיפת דבק סיליקון בחלון ההקלטה. השתמש בכוס היניקה כדי להחזיק את התקע בלחץ שלילי. השתמש במיקרומניפולטור ממונע כדי להזיז את היניקה ולהוריד את התקע לתוך דבק הסיליקון עד שהכיסוי נוגע בגולגולת. לאחר מכן, הזז את התקע קדימה ~ 1 מ"מ כדי לדחוף את הסינוס הרוחבי ולחשוף את SC. שלב זה צריך להיעשות תוך 1-2 דקות לפני שדבק הסיליקון הופך לדביק.
  5. נקו את לוחית הראש ומרחו בוטיל ציאנואקרילט וצמנט שרף סביב גבול התקע כדי לקבע אותו ללוחית הראש.
    הערה: ספק טיפול לאחר הניתוח, כמתואר בשלב 4.2.

6. דימות של שני פוטונים (איור 3)

  1. תקן את הראש של בעל החיים על הליכון מסתובב עם לוחית הראש שלו. הניחו את ההליכון תחת מיקרוסקופ בעל שני פוטונים והתאימו את הגובה למיקום המתאים. שים חרוט אלומיניום שחור בין המטרה לבין לוחית הראש כדי למנוע זיהום אור מהצג לגירוי חזותי. הרגלו את העכבר למשך ~15 דקות.
  2. בצע הדמיה של שני פוטונים במיקרוסקופ עם יעד הגדלה של 16x, צמצם מספרי של 0.8 (NA) ומרחק עבודה של 3 מ"מ (WD). השתמש בלייזר Ti:sapphire עם טכניקת נעילת מצב הנשלטת על ידי שני סורקי גלבו כדי לעורר GCaMP6m ב- 920 ננומטר. כוונן את עוצמת הלייזר במישור הדגימה בין 20-80 mW.
  3. סרוק שדה ראייה של 600 מיקרומטר x 600 מיקרומטר ב- 4.8 הרץ עם רזולוציה מרחבית של 2.4 μ מטר לפיקסל, וצלם פעילות עצבית לרוחב עומק של עד 350 μ מטר.
    הערה: קצב הדגימה והרזולוציה המרחבית מיועדים לסורקי גלבו, ויש להתאים אותם לסורקי תהודה.
  4. אסוף פלואורסצנטיות שנפלטה באמצעות מראה דיכרואית וזהה אותה באמצעות צינור מכפיל אור (PMT) לאחר העברתה דרך מסנן פסים.
  5. הקלט את תנועת העכבר על ההליכון באמצעות מקודד סיבובי. השתמש במצלמה עם עדשת 50 מ"מ כדי לתעד את גודל האישון ואת מיקומו. סנכרן הקלטות ורכישות תמונה אלה לגירוי חזותי על-ידי הקלטת טריגרים שנשלחו על-ידי מחשב הגירוי.

7. ניתוח תגובות סידן שנמדדו על ידי הדמיה של שני פוטונים

  1. תקן את תנועת המוח במהלך הדמיה באמצעות SIMA21 או NoRMCorre22.
  2. ציירו ידנית אזור עניין (ROI) באמצעות הכלי שרביט הקסם של התא (ImageJ) והתאימו לו אליפסה ב-MATLAB. חלץ עקבות פלואורסצנטיות של כל ROI לאחר הסרת זיהום נוירופיל:
    Equation 1
    Ftrue  ו-Frawהם המשרעת הפלואורסצנטית המתוקנת והגולמית של החזר ההשקעה, בהתאמה, F neuropilהוא המשרעת הפלואורסצנטית של הנוירופיל שמסביב, ו-r הוא גורם זיהום נוירופיל מחוץ למיקוד (0.7 עבור ההתקנה שלנו). r נאמד על ידי מדידת האותות על כלי דם שעבורו Ftrue= 0, כפי שתואר קודם לכן23,24.
  3. הסר תנודות איטיות בקו הבסיס על-ידי חיסור ערך האחוזון השמיני מחלון של 15 שניות שבמרכזו כל מסגרת25.
  4. הגדר תגובות חזותיות של תא עצב כשינוי יחסי של משרעת פלואורסצנטית בהחזר ההשקעה שלו במהלך תקופת הגירוי:
    Equation 2
    שיא F הוא משרעת השיא של עקבות הפלואורסצנטיות במהלך הגירוי החזותי, וקו הבסיסFהוא המשרעת הממוצעת במהלך תקופה של 0.5 שניות לפני הגירוי.

8. הדמיה בשדה רחב וניתוח נתונים (איור 4)

  1. בנו מקרוסקופ רחב שדה עם עדשת טנדם4 (איור 4A). המקרוסקופ של עדשת הטנדם הוא שתי עדשות מצלמה (50 מ"מ ו-105 מ"מ) המחוברות באמצעות מתאם, וההגדלה היא ~ 2x.
  2. הכינו עכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית כמתואר בשלבים 3.2-3.5. הזריקו 100 nL של AAV המבטא GCaMP6m בעומק של 200 מיקרומטר במרכז כל צד של SC.
  3. לאחר ~3 שבועות, השתילו כיסוי בקוטר 5 מ"מ מעל ה-SC. בצעו קרניוטומיה אליפסה בגודל 4 מ"מ x 3 מ"מ שמרכזו ב-SC ודללו את העצם סביבה. לאחר מכן, לחץ על הכיסוי ישירות על SC וקבע אותו עם מלט שרף.
  4. הפעל את GCaMP6m עם דיודה פולטת אור כחול (LED) עם מסנן עירור (469 ננומטר ± 35 ננומטר). קבל תמונות באמצעות מצלמת מוליך למחצה משלימה של תחמוצת מתכת (CMOS) לאחר העברת מסנן פליטה (525 ננומטר ± 39 ננומטר) ב- 10 הרץ. המצלמה מכסה שטח של 5.36 מ"מ x 2.85 מ"מ ברזולוציה מרחבית של 2.63 מיקרומטר לפיקסל.
  5. סובבו כל תמונה שנרכשה עם מסנן תיבה מנורמל ודגמו אותה לאחור ל-1/4 מהגודל המקורי. לכל פיקסל בתמונה, הגדירו את התגובה, כמתואר בשלב 7.4.
    הערה: ספק טיפול לאחר הניתוח, כמתואר בשלב 4.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איורים 1A,B מראים כיצד ליצור את היניקה ואת התקעים, בהתאמה. איור 2 מראה כיצד להשתיל את התקע בהצלחה. לאחר השתלת התקע, ה-SC האחורי-מדיאלי נחשף, כפי שמוצג באיור 2D. איור 3 מראה תגובות סידן של תאי עצב מסוג SC מעכבר פראי לדוגמה שצולם באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. המנסרה המשולשת, שנלכדת בקלות תחת המיקרוסקופ, יכולה לשמש לאיתור אתר ההדמיה (איור 3B). תגובות חזותיות מוצגות ברזולוציה של תא בודד (איורים 3C, D ווידאו 1). איור 4 מראה תגובות סידן של תאי עצב מסוג SC מדוגמה של עכבר מוטנטי בקליפת המוח החלקית שצולם באמצעות מיקרוסקופ רחב שדה. התמונה שנרכשה צומצמה תחילה לרבע מהגודל המקורי (איור 4B). תגובות סידן מעוררות ויזואלית מוצגות בשני צידי ה-SC (איור 4C ווידאו 2). איור 5 מראה את הביטוי של GCaMP6m ב-SC באתר ההזרקה ובאתר ההדמיה; יש פחות נוירונים באתר ההזרקה.

Figure 1
איור 1: הכנה. (A) שלושה שלבים להכנת היניקה (שלבים 1.1-1.3); PBS בתוך המחט אינו מוצג. (B) שלושה שלבים להכנת התקעים (שלבים 2.1-2.3). (C) שני סוגים של לוחית ראש בקוטר 8 מ"מ לעכברי בר. שני סוגים של לוחית ראש בקוטר 7 מ"מ עבור עכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השתלת התקע (שלבים 5.2-5.5). (A) העצם מדולדלת. הסביבה היא מלט שרף. (B) העצם והדורה מוסרים כדי לחשוף את הקוליקולוס והמוח הקטן הנחותים. (C) התקע מונמך, והוא דחף את הסינוס הרוחבי קדימה כדי לחשוף את ה-SC האחורי-מדיאלי. העיגול המקווקו הירוק מסמן את תלוש הכיסוי. המשולש המקווקו הכחול מסמן את התקע. העיגול המקווקו האדום מסמן את היניקה. (D) התקע קבוע עם בוטיל ציאנואקרילט ומלט שרף. התמונה חשופה יתר על המידה כדי להראות בבירור את ה-SC האחורי-מדיאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דימות סידן של שני פוטונים . (A) סכמה של האנטומיה של מוח העכבר לאחר השתלת התקע. הקו המקווקו הכהה מסמן את קווי המתאר של SC. המשולש הצהוב מציין את המנסרה המשולשת. הצבע הירוק מציין את ביטוי GCaMP. (B) תמונה של מנסרת משולש הסיליקון מתחת למיקרוסקופ לפני הסריקה. (C) תמונה של הפלואורסצנטיות של GCamMP מתאי עצב מסוג SC, שנמדדה במיקרוסקופ של שני פוטונים מעכבר פראי לדוגמה. (D) הקרנת סטיית תקן של הפלואורסצנטיות על פני תמונות (ראה סרטון 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דימות סידן בשדה רחב. (A) צילום של מערך הדמיה בשדה רחב. (B) דוגמה לתמונה גולמית ולתמונה שנדגם לאחור. הקו הצהוב המקווקו מסמן את קווי המתאר של SC. (C) מסגרת בודדת וסטיית תקן של תגובות הסידן של נוירוני SC, שנמדדו במיקרוסקופ רחב שדה מעכבר לדוגמה בקליפת המוח החלקית (ראו סרטון 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מקטעים קורונליים במוח עכבר במרחקים שונים ממקום ההזרקה. השורה התחתונה מציגה את ההגדלה הגבוהה של התיבות המסומנות בשורה העליונה. המלבן המקווקו הצהוב מסמן את אתר ההזרקה, המכיל פחות תאי עצב מהאזור שמימינו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: סרטונים גולמיים ומתוקני תנועה של תגובות הסידן של נוירוני SC לגירוי החזותי בסרטון 3 במיקרוסקופ של שני פוטונים. התמונות נרכשו ב-4.8 הרץ והוצגו ב-20 הרץ. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

וידאו 2: סרטונים גולמיים ומתוקני תנועה של תגובות הסידן של נוירוני SC לגירוי החזותי בסרטון 3 באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב. התמונות נרכשו ב -10 הרץ והוצגו ב -20 הרץ. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון 3: פס שחור במסך מלא (ברוחב 5°) נסחף ל-12 כיוונים שונים (50° לשנייה). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים בפרוטוקול
השלב הקריטי ביותר הוא קרניוטומיה בשלבים 5.2 ו -5.3. ראשית, העצם ב-0.5 מ"מ אחורית ללמדא עבה ובתוכה כלי דם, מה שעלול לגרום לדימום בתהליך הקידוח. קצף ג'ל הולם צריך להיות מוכן לעצור את הדימום. שנית, יש סיכוי טוב לאנגיורקסיס בעת הסרת העצם ממש מעל הסינוס הרוחבי. לפתרון בעיות, גישה חלופית אחת היא לדלל את העצם בתוך האליפסה ולהסיר אותה חתיכה אחר פיסה. טריק נוסף הוא להשרות את העצם לפני ההרמה כדי להקל על ניתוק הדורה מהעצם ולמנוע דימום.

שלב קריטי נוסף הוא השתלת תקע בשלב 5.4, שעבורו התהליך כולו אמור להימשך 1-2 דקות. לפתרון בעיות, ניתן תחילה להזיז את התקע עם המיקרומניפולטור למיקום מתאים ב- ACSF ולהגדיר את המיקום הסופי של התקע. לאחר מכן, מוסיפים את דבק הסיליקון ומזיזים את התקע במהירות המתאימה למצב הסופי.

משמעות
לפרוטוקול זה שני יתרונות. ראשית, הוא מספק פרטים להדמיית SC אחורי-מדיאלי ברזולוציה של תא בודד עם קליפת מוח שלמה בעכברי בר, בעוד שבדיווחים קודמים קליפת המוח המכסה נשאפתה לחשוף את ה-SC הקדמי-לטרלי. שנית, הוא מפרט כיצד לדמיין את כל ה-SC של עכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית באמצעות טכניקת דימות סידן רחבת שדה. שתי הגישות האלה יכולות להיות מיושמות כדי לדמיין אזורי מוח אחרים בהתנהגות של בעלי חיים בקני מידה שונים.

דווח על שתי שיטות חלופיות לדמיין את ה-SC האחורי-מדיאלי מבלי לשאוף את קליפת המוח15,16. שרדר ועמיתיו היו קרניוטומיה עגולה בקוטר 4 מ"מ וחיברו צינור נירוסטה עם מכונת כביסה וכיסוי זכוכית בכל קצה כדי לחשוף את SC16. הקרניוטומיה הגדולה יותר והחומר הקשיח יותר, בהשוואה למה שהשתמשנו בו, נוטים יותר לגרום לדימום במהלך ההשתלה. בנוסף, מכיוון שנירוסטה אינה תואמת ביולוגית, סביר יותר שהיא תגרום לזיהום לצורך הדמיה כרונית. באופן דומה, כיסוי הזכוכית ששימש את Savier et al. היה גם קשיח יותר ולא תואם ביולוגית, וסביר יותר לגרום לדימום וזיהומים15. הבדל נוסף משתי השיטות האלה הוא שאתר ההזרקה הנגיפי שלנו נמצא מחוץ לחלון ההדמיה, ולכן איכות ההדמיה מושפעת פחות מהנזק הפוטנציאלי באתר ההזרקה (איור 5).

מגבלות הפרוטוקול
פרוטוקול זה מספק פרטים להדמיית תגובות סידן בשכבה השטחית של SC. הדמיה של שכבות עמוקות יותר, למשל באמצעות פריזמה26, אינה מכוסה. גישת דימות הסידן הדו-פוטוני משמשת לרישום הפעילות העצבית ב-SC האחורי-מדיאלי ואינה מכסה את SC 7,13 הקדמי-לטרלי. הדמיית סידן SC שלמה במיקרוסקופ רחב שדה יושמה על עכברים מוטנטיים בעלי קליפת המוח החלקית. כדי לדמיין את כל ה-SC של עכברים רחבי-סוג, יש לשאוף את קליפת המוח השכבת-על. דרך חלופית לדמות את כל ה-SC, ללא הזרקה ויראלית, היא טכניקת ההדמיה הפנימית; עם זאת, יש לו יחס אות לרעש נמוך יותר 6,8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32271060). י.-ת.ל. תכנן את המחקר, ביצע את הניסוי, ניתח את הנתונים וכתב את כתב היד. ז.ל. ור.ו. ביצעו את הניסוי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Tags

מדעי המוח גיליון 194
הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Z., Wu, R., Li, Y. t. Calcium… More

Li, Z., Wu, R., Li, Y. t. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter