Summary
Antimikrobielle Laborkittel verhindern die Kreuzkontamination durch die Ansammlung von Krankheitserregern und das versehentliche Verschütten von Biodaten. Hier beschreiben wir das Protokoll zur Entwicklung eines hautfreundlichen antimikrobiellen Gewebes unter Verwendung von nanopflanzlicher Verkapselung und modifizierten Standardtests, um die Wirksamkeit und Eignung des Laborkittels für die typische Verwendung genau zu bewerten.
Abstract
Laborkittel werden häufig in Labors für biologische Gefahren und in Gesundheitseinrichtungen als Schutzkleidung verwendet, um eine direkte Exposition gegenüber Krankheitserregern, Verschüttungen und Verbrennungen zu verhindern. Diese Schutzmäntel auf Baumwollbasis bieten aufgrund ihrer porösen Beschaffenheit, ihrer Feuchtigkeitsspeicherkapazität und ihrer Wärmespeicherung vom Körper des Benutzers ideale Bedingungen für mikrobielles Wachstum und Anheftungsstellen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass pathogene Bakterien auf Krankenhauskleidung und Laborkitteln überleben und als Vektoren der mikrobiellen Übertragung fungieren.
Ein gängiger Ansatz zur Behebung dieser Probleme ist der Einsatz antimikrobieller Wirkstoffe in der Textilveredelung, aber aufgrund der Toxizität und der Umweltauswirkungen vieler synthetischer Chemikalien wurden Bedenken geäußert. Die anhaltende Pandemie hat auch ein Fenster für die Untersuchung wirksamer antimikrobieller Mittel und umweltfreundlicher und giftfreier Formulierungen geöffnet. In dieser Studie werden zwei natürliche bioaktive Verbindungen, Carvacrol und Thymol, verwendet, die in Chitosan-Nanopartikeln verkapselt sind und einen wirksamen Schutz gegen vier menschliche Krankheitserreger mit einer Reduktion von bis zu 4 Log-Stoffen (99,99 %) garantieren. Diese Krankheitserreger werden häufig in Laborkitteln nachgewiesen, die in Laboratorien für biologische Gefahren verwendet werden.
Die behandelten Stoffe hielten außerdem bis zu 10 Waschgängen mit 90% mikrobieller Reduktion stand, was für den vorgesehenen Verwendungszweck ausreichend ist. Wir haben Modifikationen an den bestehenden Standard-Stofftests vorgenommen, um die typischen Szenarien der Verwendung von Laborkitteln besser abzubilden. Diese Verfeinerungen ermöglichen eine genauere Bewertung der Wirksamkeit von antimikrobiellen Laborkitteln und die Simulation des Verbleibs versehentlicher mikrobieller Verschüttungen, die innerhalb kurzer Zeit neutralisiert werden müssen. Weitere Studien werden empfohlen, um die Anreicherung von Krankheitserregern im Laufe der Zeit auf antimikrobiellen Laborkitteln im Vergleich zu herkömmlichen Schutzkitteln zu untersuchen.
Introduction
Der weiße Schutzkittel ist eine obligatorische persönliche Schutzausrüstung (PSA) in mikrobiologischen Labors und Gesundheitseinrichtungen und schützt vor direkter Exposition gegenüber Krankheitserregern, Verschüttungen und Verbrennungen. Diese Baumwollmäntel fördern das mikrobielle Wachstum aufgrund vieler Faktoren - der gewebte Stoff bietet Ansatzstellen und Belüftung, Baumwolle und Stärke, die im Herstellungsprozess verwendet werden, sowie abgeblätterte Epithelzellen des Benutzers liefern Nährstoffe, und die Nähe zum Benutzer gibt Wärme und Feuchtigkeit. Die Ansammlung von Mikroben auf Textilien kann auch zu gesundheitlichen Problemen wie Allergien und nosokomialen Infektionen, unangenehmen Gerüchen und Stoffverfall führen1.
Im Gegensatz zu normaler Kleidung werden Schutzmäntel nur selten gewaschen oder desinfiziert, wie in vielen Umfragen festgestellt wurde 2,3. Viele Studien belegen die Wirkung von Laborkitteln als Vektor der mikrobiellen Übertragung und das Risiko nosokomialer Infektionen im Gesundheitswesen2,4, insbesondere resistente Stämme3 wie Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA); Daher werfen sie gesundheitliche Bedenken hinsichtlich der PSA auf, die vor mikrobieller Kontamination schützen soll. Es gibt nicht genügend Querschnittsstudien zu Laborkittel-assoziierten Infektionen im Zusammenhang mit Einrichtungen der biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) oder mikrobiologischen Lehrlaboren, aber viele Zulassungsbehörden schränken die Verwendung von Laborkitteln innerhalb der Eindämmungsstufe ein. Viele akademische Einrichtungen in Nordamerika haben jedoch aufgrund praktischer Zwänge Schwierigkeiten, die Anforderungen zu erfüllen, wie z. B. das Waschen und Lagern in der Einrichtung, die Vorfälle des Tragens von Laborkitteln in öffentlichen Bereichen wie Cafeterias und Bibliotheken sind häufig. Eine praktikable Lösung für diese Probleme ist der Einsatz antimikrobieller Wirkstoffe in der Textilveredlung.
Antimikrobielle Stoffe werden in Sportbekleidung, Sportbekleidung und Socken immer beliebter, da sie hauptsächlich Körpergeruch reduzieren sollen. Die Verwendung dieser Stoffe ist jedoch bei der Entwicklung von PSA nicht üblich, mit Ausnahme einiger silberbeschichteter Baumwollmasken und Kleidungsstücke für das Gesundheitswesen5. Wir berichten über die Entwicklung eines antimikrobiellen Gewebes für Laborkittel, das häufige Krankheitserreger in BSL-2-Laboren hemmt und einen wirksamen Schutz vor der Kreuzkontamination durch häufige Krankheitserreger bietet.
Derzeit ist eine Vielzahl von antimikrobiellen Stoffen und Ausrüstungen auf dem Markt erhältlich, aber die meisten von ihnen verwenden kolloidale Schwermetallpartikel (z. B. Silber, Kupfer, Zink), Organometalle oder synthetische Chemikalien wie Triclosan und quartäre Ammoniumverbindungen, die nicht umweltfreundlich sind1 und zu gesundheitlichen Problemen wie Hautreizungen und Allergien führen können6. Einige synthetische Formulierungen sind aufgrund von Nicht-Zielmikroben, wie z. B. einer normalen Flora oder der Induktion von antimikrobiellen Resistenzen (AMR), besorgniserregend. Die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) reguliert kommerzielle antimikrobielle Stoffe, die für den Benutzer ungiftig und frei von Ökotoxizität sein müssen. Daher sind antimikrobielle Gewebe auf Basis natürlicher Biozide vorzuziehen, die ein breites Spektrum von Mikroben hemmen. Ätherische Öle (EOs) werden häufig als antimikrobielle und therapeutische Mittel verwendet, aber ihre Verwendung in der antimikrobiellen Ausrüstung ist aufgrund ihrer Haltbarkeit begrenzt 6,7,8. Basierend auf unserem Wissen und unserer Marktforschung über nano-pflanzliche Ausrüstung8 ist kein antimikrobielles Gewebe auf Kräuterbasis im Handel erhältlich. Das liegt daran, dass synthetische Beschichtungen einfach herzustellen sind und eine lange Haltbarkeit haben. Zu den wenigen nano-kräuterbeschichteten Textilien, die nur zu Forschungszwecken gemeldet wurden, gehören Neem7, Moringa 9 und Curryblätter9.
In der vorliegenden Studie werden zwei bioaktive Komponenten verwendet, die aus Oregano-EOs extrahiert werden, Carvacrol und Thymol, die gegen eine Vielzahl von bakteriellen Krankheitserregern und Viren wirksam sind, aber allgemein als sicher für den Menschen anerkannt sind10. Diese bioaktiven Komponenten sind jedoch flüchtig und daher ist ihr antimikrobielles Potenzial nur von kurzer Dauer, wenn sie direkt auf das Gewebe aufgetragen werden. Die Nano-Kräuterverkapselung ist ein Prozess, bei dem bioaktive Komponenten oder Medikamente in eine Polymerhülle geladen werden, die den Kern vor Umweltzerstörung schützt und so die Haltbarkeit verlängert. Darüber hinaus erhöht die geringe Größe der Polymerpartikel, die im Allgemeinen zwischen 10 nm und 100 nm liegen, die Wirksamkeit der Anwendung und verlangsamt die Freisetzung der bioaktiven Verbindungen auf das Gewebe. Diese bioaktiven Verbindungen werden für verschiedene Zwecke verwendet, z. B. für die Konservierung von Lebensmitteln10, jedoch nicht für die Beschichtung von Textilien.
Unter vielen polymeren Verkapselungsmitteln ist Chitosan aufgrund vieler seiner Eigenschaften wie Nichttoxizität, biologische Abbaubarkeit, Mukoadhäsivität und Biokompatibilität ein attraktiver Kandidat11. Es ist ein natürliches Polysaccharid, das durch den Deacetylierungsprozess aus Chitin gewonnen wird, das in Muscheln und Pilzzellwänden vorkommt. Es wird in biochemischen und lebensmittelkonservierenden Anwendungen wie der Verabreichung von Medikamenten oder Proteinen 11, 12, 13, der kontrollierten Freisetzung 14 und antimikrobiellen Filmen 10 verwendet. Chitosan ist nicht leicht wasserlöslich, bildet aber in sauren Medien eine kolloidale Suspension. Bioaktive Moleküle werden durch eine einfache zweistufige ionische Gelierungsmethode in Chitosan-Nanopartikel (NPs) geladen14,15,16. Dabei bilden hydrophobe bioaktive Verbindungen wie Carvacrol und Thymol eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die durch ein Tensid, Tween 80, unterstützt wird. Anschließend wird eine polyanionische Verbindung, Pentanatriumtripolyphosphat (TPP), verwendet, um die Querverbindungen zwischen den Aminogruppen entlang der polykationischen Polymermoleküle und den Phosphatgruppen der TPP-Moleküle zu bilden, um den Komplex zu stabilisieren. Dieser Komplexierungsprozess verfestigt die bioaktiven Verbindungen in der Matrix von Chitosan, das anschließend gereinigt und auf Baumwollmuster aufgetragen wird, um antimikrobielles Gewebe herzustellen.
Die Nano-Formulierungen müssen zunächst auf ihre antimikrobielle Wirksamkeit in Emulsionsform getestet werden, bevor sie auf das Gewebe aufgetragen werden. Dies kann bequem durch eine qualitative Methode wie die Kirby-Bauer-Scheibendiffusion, die Well-Diffusion und den Zylinderplatten-Assay bewertet werden. Der Zylinderplattenassay17 bietet jedoch die Flexibilität, unterschiedliche Volumina der Formulierung zu laden und die Abstandszone zu vergleichen. Bei diesem Verfahren werden die antimikrobiellen Formulierungen in Edelstahlzylinder geladen und auf eine weiche Agarschicht aufgebracht, die mit dem Testmikroorganismus oder Krankheitserreger beimpft wird. Der Durchmesser der Clearance-Zone, die gegen den Testorganismus erzeugt wird, ist proportional zum Hemmpotenzial der antimikrobiellen Formulierung und kann daher als Alternative zu Brüheverdünnungsmethoden verwendet werden. Die Größe der klaren Zonen ist jedoch nur ein vergleichendes oder qualitatives Maß innerhalb einer bestimmten Platte, es sei denn, es werden bestimmte Standards eingehalten. Antimikrobielle Wirkstoffe wirken gegen die Krankheitserreger, indem sie entweder ihr Wachstum hemmen (biostatisch) oder die Zellen abtöten (biozid), was durch die minimale Hemmkonzentration (MHK) bzw. die minimale bakterizide Konzentration (MBC) quantifiziert werden kann. Die Wirksamkeit und das Verhalten der bioaktiven Chemikalien unterscheiden sich jedoch in ihren Formulierungen (flüssiger Zustand) und wenn sie auf einem Substrat, wie z. B. einem Gewebe18, beschichtet sind. Dies liegt daran, dass mehrere Faktoren eine Rolle bei der Wirksamkeit spielen, wie z. B. die Stabilität der Haftung der antimikrobiellen Wirkstoffe auf dem Gewebe, der Feuchtigkeitsgehalt, die Substratart und die Haftung der Mikroben. Wenn der beabsichtigte Zweck nur die bakteriostatische Aktivität ist, kann ein qualitativer Assay wie die "Parallel-Streak-Methode"19 eine relativ schnelle und einfache Bewertung der diffusionsfähigen antimikrobiellen Formulierung ermöglichen. Sollen jedoch die bakteriziden Wirkungen bestimmt werden, kann die "Bewertung antibakterieller Ausrüstungen auf textilen Materialien"20 eingesetzt werden, die für die logarithmische Reduktion des Stachelerregers sorgt.
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Protocol
1. Herstellung von Nanopartikeln
- Nano-pflanzliche Verkapselung
- Bereiten Sie 50 ml 1%ige (v/v) Essigsäure vor.
VORSICHT: Gletscheressig ist ein Reizstoff, der schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen kann. Tragen Sie einen Laborkittel in voller Länge, Nitrilhandschuhe und eine Schutzbrille und arbeiten Sie unter einem Abzug. - Stellen Sie Chitosanlösung (1,2 Gew.-%) her, indem Sie 0,6 g Chitosanflocken (mittleres Molekulargewicht) in 50 ml 1%iger Essigsäure (oben zubereitet) auflösen. Über Nacht (O/N) bei Raumtemperatur (R/T) rühren, um eine homogene Emulsion zu erhalten.
- 0,5 g Tween 80 zugeben und 2 h bei 60 °C rühren (1.000 U/min), um eine homogene Lösung zu erhalten. Bringen Sie die Lösung zu R/T, bevor Sie bioaktive Verbindungen (Carvacrol oder Thymol) hinzufügen.
- 0,75 g Carvacrol (oder Thymol) tropfenweise oder nach und nach unter Rühren (1.000 U/min) zugeben. Das Gewichtsverhältnis von Chitosan zu bioaktiver Verbindung beträgt 1:1,25.
- Fügen Sie der Mischung 50 ml (0,5 % w/v) TPP tropfenweise hinzu, während Sie bei R/T rühren. Rühren Sie 30 Minuten lang weiter, um eine homogene Emulsion zu erhalten.
- Bereiten Sie eine Negativkontrolle vor, indem Sie das gleiche Verfahren anwenden, jedoch ohne Zusatz von bioaktiven Verbindungen.
- Bereiten Sie 50 ml 1%ige (v/v) Essigsäure vor.
- Reinigung
- Zentrifugieren Sie die Emulsion bei 10.000 × g für 30 min bei 4 °C und sammeln Sie die gebildeten NPs (Pellets) nach dem Umfüllen des Überstands. Reservieren Sie den Überstand, um die Wirksamkeit der Verkapselung zu testen.
- Waschen Sie die Partikel (ab Schritt 1.2.1) mit wässrigem Tween 80 (1 % v/v) mit dem doppelten Volumen der gebildeten Pellets, um die ungebundenen oder freien bioaktiven Verbindungen zu entfernen. Achten Sie darauf, das Pellet durch Wirbeln zu stören, bis sich in jedem Waschschritt eine homogene Lösung bildet.
- Waschen Sie die Partikel (ab Schritt 1.2.2) zweimal mit deionisiertem Wasser, um Verunreinigungen zu entfernen.
- Die NPs werden rekonstituiert, indem das Pellet (aus Schritt 1.2.3) in 30 ml deionisiertem Wasser resuspendiert wird. Lagern Sie die NPs bei 4 °C für bis zu 6 Monate.
HINWEIS: Das Experiment kann zu diesem Zeitpunkt angehalten werden.
- Charakterisierung
- Verdünnen Sie die NPs in deionisiertem Wasser, bis die UV-Vis-Werte (UV-Vis) zwischen 250 und 400 nm in den Bereich (Absorption >1) fallen.
- Nehmen Sie die UV-Vis-Absorptionsspektren der NPs über die Wellenlängen von 250 bis 400 nm mit einem UV-Vis-Spektralphotometer auf.
- Lagern Sie ein aliquotes (1 ml) NPs bei R/T für einen bestimmten Zeitraum (z. B. 1 bis 6 Monate) und testen Sie die antimikrobielle Wirkung mit der Zylinderplattenmethode zusammen mit einer frischen Probe.
- Beschichtung auf Stoff
- Tragen Sie NPs mit einem Pad-Dry-Cure-Verfahren auf ein gewebtes Baumwollgewebeauf 7,21.
- Tauchen Sie die Stoffmuster 3 Minuten lang in die Lösung mit NPs, die mit einem Stoffbindemittel vermischt sind, bis sie durchnässt sind. Führen Sie dann die Farbfelder durch einen Zwei-Walzen-Laborsticker, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Die Proben bei 100 °C 30 min im Ofen trocknen und bei 130 °C 10 min aushärten.
- Zum Schluss waschen Sie die Proben 15 Minuten lang in einem Ultraschallbad, um ungebundene NPs zu entfernen.
HINWEIS: Befolgen Sie alternativ die unten beschriebene vereinfachte Methode.
- Schneiden Sie den Baumwollstoff (oder die Muster des Laborkittels) in 10 cm x 10 cm große Quadrate.
- Tauchen Sie die geschnittenen Stücke in 2 ml des synthetisierten NP (10%) in einen Kunststoffbehälter (12 cm x 12 cm) für 2 Minuten bei R/T. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit durch Lufttrocknung.
- 3 min bei 100 °C erhitzen, um die NPs zu binden.
- Ungebundene NPs durch Spülen in wässrigem Tween 80 (2 Gew.-%) entfernen und im Ofen bei 100 °C für 30 min trocknen.
HINWEIS: Dieses antimikrobielle Gewebe kann 2 Jahre bei R / T gelagert werden.
- Tragen Sie NPs mit einem Pad-Dry-Cure-Verfahren auf ein gewebtes Baumwollgewebeauf 7,21.
- Haltbarkeit der Waschung
- Schneiden Sie den Stoff in quadratische Maschen von 50 mm x 50 mm.
- Legen Sie die Farbfelder in 50 ml warmes Leitungswasser (40 °C) in einen Glas-/Kunststoffbehälter und fügen Sie zwei Tropfen normales Reinigungsmittel (nicht antimikrobiell) hinzu.
- 30 Minuten lang auf einem Schaukelplattform-Shaker oder Magnetrührer abspülen.
- 2 h an der Luft trocknen oder bei 60 °C inkubieren und auf antimikrobielle Wirksamkeit testen.
2. Zylinderplattenassay für das Screening von Nanopartikeln
- Bereiten Sie Trypticase-Sojaagar (TSA), Trypticase-Sojabrühe (TSB), antibiotisches Basisagar (ABA) und antibiotisches Samenagar (ASA) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu und sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren bei 121 °C bei 15 psi für 15 Minuten.
- Subkulturieren Sie die interessierenden Mikroben (aus dem Lager), gegen die die Wirksamkeitstests durchgeführt werden, auf frisch präparierten TSA-Platten (oder einem geeigneten Medium) nach der Drei-Wege-Streak-Plate-Methode und inkubieren Sie sie, um Reinheitsplatten herzustellen. (Empfohlene Arten: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa und C. albicans.)
- Beimpfen Sie die Kulturen aus frischen Reinheitsplatten in TSB (10-ml-Röhrchen) bei 35 °C O/N unter mäßigem Schütteln (100-200 U/min).
- Aliquotieren Sie 5,0 ml der geschmolzenen ASA in jedem der Reagenzgläser. Die Anzahl der Röhrchen entspricht der Anzahl der getesteten Mikroorganismen.
- Gießen Sie 20 ml vorsterilisiertes geschmolzenes ABA aseptisch in jede Petriplatte (100 mm x 20 mm), um die Basisschicht zu bilden. Die Anzahl der Agarplatten entspricht der Anzahl der zu testenden Mikroorganismen. Warten Sie, bis sich das Medium verfestigt hat.
- Nach dem Erstarren der Basisschicht wird jede geschmolzene ASA mit einer Übernachtkultur aus Schritt 2.3 (1,0 mL, vorgewärmt auf 35 °C) beimpft und der Inhalt (Mischung aus ASS und Kultur) sofort auf die Oberfläche einer ABA-Platte übertragen. Schwenken Sie die Platte, um die geschmolzene Agarschicht gleichmäßig zu verteilen. Achten Sie darauf, dass die Saatschicht glatt und frei von Unebenheiten oder Blasen erscheint.
- Platzieren Sie mit einer sterilen Pinzette bis zu sechs Edelstahlzylinder (6 mm x 6 mm x 10 mm; vorautoklaviert) in gleichmäßigen Abständen in einem sechseckigen Muster pro Agarplatte (Abbildung 1).
- Beladen Sie die Zylinder mit den synthetisierten NPs unterschiedlicher Volumina (30 μl, 50 μl, 75 μl und 100 μl), die auf antimikrobielle Wirkungen untersucht werden sollen. Die Negativkontrolle ist diejenige ohne bioaktive Verbindungen.
- Häufige bakterielle Krankheitserreger (z. B . E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) bei 35 °C für 24 h und Pilzarten (z. B. C. albicans) bei R/T für 3 Tage inkubieren.
- Messen Sie den Durchmesser der klaren Zone und vergleichen Sie die Wirksamkeit der synthetisierten NPs.
HINWEIS: Dieser Test kann verwendet werden, um die besten NPs vorzuprüfen, die auf dem Stoff beschichtet werden sollen.
3. Parallelstreifen-Methode (modifiziert von AATCC 147)
- Materialaufbereitung
- Schneiden Sie den NP-behandelten Stoff in 50 mm x 25 mm große Muster.
- Bereiten Sie Mueller-Hinton-Agar (MHA), TSA und TSB gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und sterilisieren Sie die Medien durch Autoklavieren bei 121 °C bei 15 psi für 15 Minuten.
- Subkulturieren Sie die interessierenden Mikroben (aus dem Lager), an denen die Wirksamkeitstests durchgeführt werden, auf frisch präparierten TSA-Platten (oder einem geeigneten Medium) nach der Drei-Wege-Streak-Plate-Methode und inkubieren Sie sie bei 35 °C für 2 Tage für bakterielle Färbungen und bei R/T für 5 Tage für Pilzstämme, um Reinheitsplatten herzustellen. (Empfohlene Arten: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa und C. albicans.)
- Spiking von mikrobiellen Kulturen
- Beimpfen Sie die Kulturen aus frischen Reinheitsplatten in TSB (10-ml-Röhrchen) bei 35 °C O/N unter mäßigem Schütteln (100-200 U/min).
- Verdünnen Sie die O/N-Kulturen auf 1,5 × 108 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml oder entsprechend der Trübung von 0,5 McFarland-Standard (normalerweise eine Verdünnung von 1/10 bis 1/20 für die meisten gesunden Kulturen).
- Beimpfen Sie die obige verdünnte Kultur mit einer 4 mm sterilen Schlaufe wie folgt. Laden Sie eine Schlaufe voll Brühekultur und übertragen Sie sie auf die Oberfläche der MHA-Agarplatte, indem Sie fünf parallele Streifen mit einer Länge von jeweils 6 cm und einem Abstand von 1 cm gemäß Abbildung 2 machen. Füllen Sie die Schlaufe nicht nach.
- Drücken Sie das Stoffmuster vorsichtig mit einem sterilen Spatel über die fünf Streifen, so dass sich der Stoff in der Mitte befindet und alle fünf Streifenlinien berührt. Bei 35 °C für 24 h inkubieren.
- Qualitative Bewertung der antimikrobiellen Wirksamkeit
- Untersuchen Sie die inkubierte Platte auf die Unterbrechung des Wachstums entlang der Streifen über die Ränder des Gewebes hinaus (eine klare Zone zeigt eine Hemmung des Wachstums an).
- Berechnen Sie die durchschnittliche Breite einer Hemmzone entlang der Streifenlinie (W) auf beiden Seiten des Stoffmusters mit Gleichung (1).
W = (T - D)/2 (1)
W = Breite der freien Zone; T = Gesamtlänge der lichten Zone, einschließlich der Farbfeldbreite; D = Breite des Stoffmusters (25 mm).
4. Quantitative logarithmische Reduktionsmethode (modifiziert von AATCC 100)
- Versuchsvorbereitung
- Schneiden Sie den Stoff in quadratische Maschen von 50 mm x 50 mm.
- Bereiten Sie TSA, TSB, Letheen-Brühe und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und sterilisieren Sie die Medien durch Autoklavieren.
- Bereiten Sie O/N-Kulturen von Mikroben von Interesse vor, gegen die die Wirksamkeitstests durchgeführt werden, indem isolierte Kolonien von Reinheitsplatten in sterilem TSB inokuliert und bei 35 °C für 18-24 h inkubiert werden (empfohlene Arten: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa und C. albicans.)
- Spiking von mikrobiellen Kulturen
- Verdünnen Sie die O/N-Kulturen auf 1,5 × 108 KBE/ml oder entsprechend der Trübung von 0,5 McFarland-Standard (normalerweise eine Verdünnung von 1/10 bis 1/20 für die meisten gesunden Kulturen).
- Bestimmen Sie das geeignete Volumen der Kulturen für das Spiking, indem Sie die Flüssigkeitsaufnahmekapazität des Gewebes wie folgt messen.
- Geben Sie eine Reihe von Volumina der verdünnten Bouillonkultur (z. B. 100-500 μL) auf Stoffmuster (in separaten Petriplatten) und wählen Sie das Volumen so, dass das Stoffmuster das Wasser vollständig aufnimmt und keine Restflüssigkeit hinterlässt. Die Flüssigkeitsaufnahmekapazität unterscheidet sich von der Art und Dicke des Gewebes. Bei normalen Laborkitteln aus Baumwolle sind es etwa 200 μl.
- Erhöhen Sie das Volumen (die oben ermittelte Flüssigkeitshaltekapazität [z. B. 200 μl]) jeder Kultur auf die Proben, die in sterile Petriplatten gelegt werden. Die Anzahl der Muster entspricht der Anzahl der Tests (z. B. getesteter Stoff unmittelbar und nach dem Waschen [und der getesteten Waschzyklen]) und der getesteten antimikrobiellen Wirkung über die Kontaktzeit (nach einer festgelegten Zeit/Tag [z. B. 30 min, 2 h, Tag 1-3]).
Anmerkungen: Verwenden Sie eine Mikropipette mit Aerosolfilterspitzen (um eine Kontamination der Pipette bei späteren Anwendungen zu vermeiden), um die Kulturen auf den Mustern gleichmäßig zu beimpfen. - Verwenden Sie für die Negativkontrolle die gleiche Art von unbehandelten Stoffmustern. Führen Sie die Negativkontrolle für jede entsprechende Testmikrobenspezies, die Kontaktdauer, die verschiedenen Stoffe und die Waschzyklen durch.
- Rückgewinnung von Mikroben durch lebensfähige Keimzahl
- Lassen Sie die geimpften Muster (sowohl behandelte als auch unbehandelte) in den Petriplatten (Deckel angelehnt) bei R/T für die erforderliche Kontaktzeit(en) trocknen, um sie zu testen (z. B. 0 min, 30 min, 60 min usw. oder sogar Tage für Langzeitwirkungen). Fügen Sie immer eine "0 min" hinzu, um eine sofortige Wirkung und neutralisierende Wirksamkeit darzustellen.
- Übertragen Sie die Proben aseptisch in separate sterile Zentrifugenröhrchen (50 ml) und schrauben Sie die Kappen fest.
- Fügen Sie Letheen-Bouillon (alle relevanten neutralisierenden Puffer) hinzu, um eine 1/100-Verdünnung herzustellen (z. B. 19,8 ml für ein Inokulum von 200 μl).
- Die Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen fest verschließen und 1 min bei mittlerer Geschwindigkeit wirbeln.
- Die Suspension wird in nachfolgenden 1/10-Verdünnungen seriell mit dem sterilen PBS verdünnt, so dass die Koloniezahlen der "unbehandelten" Gruppe zu niedrig werden, um gezählt zu werden (TLTC).
- Legen Sie die Verdünnungen (0,1 ml) auf geeignete Medienplatten, die das Wachstum des Mikroorganismus unterstützen (z. B. TSA für Bakterien oder Sabouraud-Dextrose-Agar [SDA] für Pilze) oder andere Medien, die das Wachstum optimieren und einen guten Kontrast bieten, um die Koloniezählung genau zu machen.
- Inkubieren Sie die Bakterienplatten bei 35 °C für 2 Tage und die Pilzplatten bei R/T für 5 Tage.
- Zählen Sie die lebensfähigen KBE direkt mit einem Koloniezähler oder mit einer Bildgebungssoftware (z. B. KBE AI).
- Berechnen Sie die mikrobielle Log-Reduktion (R) aufgrund von antimikrobiellem Gewebe mit Gleichung (2):
R =
× 100 (2)
A = logarithmischer Wert der Anzahl der KBE, die aus unbehandeltem Gewebe gewonnen wurden; B = logarithmischer Wert der Anzahl der KBE, die aus behandeltem Gewebe gewonnen werden.
× 100 (2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erstes Screening der synthetisierten NPs
Nach der zweistufigen Öl-in-Wasser-Emulsionstechnik16 wurden die bioaktiven Verbindungen (Carvacrol und Thymol) erfolgreich in Chitosan verkapselt. Dies wurde durch UV-Vis-Spektrophotometrie für die maximale Absorption der jeweiligen bioaktiven Verbindungen im Vergleich zu Kontrollen, bei denen es sich um die Chitosan-NPs ohne bioaktive Verbindungen handelte, bestätigt. Die konstituierten NPs waren homogen und stabil über 12 Monate bei 4 °C. Das initiale Screening der antimikrobiellen Wirksamkeit wurde mit der Zylinderplattenmethode verifiziert (Abbildung 1). Dies ist eine qualitative Methode, da die Clearance-Zone von mehreren Faktoren beeinflusst wird, wie z. B. der Agardicke, der Stärke des Inokulums und der Konzentration der Testproben. Viele einfachere Methoden, wie z. B. die Kirby-Bauer-Scheibendiffusionsmethode und die Well-Diffusionsmethode, können zu diesem Zweck verwendet werden, aber die Zylinderplattenmethode bietet die Möglichkeit, die Konzentrationen (Abbildung 1A) durch Verdünnen der NPs zu variieren, und jeder Zylinder kann das Testprobenvolumen bis zu 200 μl aufnehmen. Darüber hinaus bildet die Agar-Überlagerung mit Kulturen ein glattes Inokulum, das die Bestimmung der klaren Zonen mit besserer Präzision ermöglicht17. Die Ergebnisse zeigten, dass die klaren Zonen proportional zu den progressiv steigenden Konzentrationen sind (Abbildung 1A). Dies erhöht die Gültigkeit der Daten und unterscheidet sie von Artefakten oder abnormalen Zonen. Basierend auf der Größe der klaren Zonen (in der Regel über 20 mm) kann die richtige Konzentration von NPs für die Beschichtung ausgewählt werden. Zuvor charakterisierte oder alte NPs, die entsprechend gelagert wurden (4 °C), können vor dem Aufziehen auf das Gewebe auch durch die großen Zonen (Abbildung 1B,C) verifiziert werden.
Qualitatives Screening der behandelten Stoffmuster
Trotz der antimikrobiellen Wirksamkeit der verkapselten NPs, die durch große klare Zonen bestätigt wird, müssen die NP-beschichteten Gewebe getestet werden. Dies liegt daran, dass die antimikrobiellen Wirkstoffe beim Auftragen auf den Stoff anders wirken können als ihre ursprünglichen Formulierungen. Viele Faktoren, wie z. B. die Eigenschaften des Gewebes (Dicke, Hydrophobie), die Wirksamkeit der Beschichtung und der Abbau bioaktiver Verbindungen während der Beschichtung, beeinflussen die Wirksamkeit20. Daher wurde die Parallelstreifenmethode verwendet, um die antimikrobielle Wirkung der behandelten Gewebe qualitativ zu bewerten. Die Negativkontrollen (unbehandelte Stoffe) zeigten keine antimikrobiellen Effekte durch das ununterbrochene mikrobielle Wachstum entlang aller fünf Streifenlinien (Abbildung 3 A,B). Das behandelte Gewebe zeigte ein unterbrochenes mikrobielles Wachstum entlang der Streifenlinien (Abbildung 3 C,D), was auf die diffundierten bioaktiven Verbindungen aus dem Gewebe zurückzuführen war. Die durchschnittliche Breite der klaren Zonen war jedoch gering (<5 mm), da die Testmuster vor der Prüfung 10 Waschzyklen unterzogen wurden. Wenn die Inokulumkonzentrationen entlang der parallelen Steaks vom ersten bis zum fünften Streifen abnehmen (Abbildung 2), sind die klaren Zonen in den nachfolgenden Streifen auffällig. Zeigt der erste Streifen (hohes Inokulum) eine klare Zone, ist das antimikrobielle Potenzial des Gewebes in der Regel hoch. Einige Unregelmäßigkeiten, wie z. B. die fünfte Linie in Abbildung 3D, können aufgrund des qualitativen Charakters des Tests auftreten. Die freie Zone (unterbrochenes Wachstum) aufgrund der bakteriostatischen Aktivität gibt einen Hinweis auf das antimikrobielle Potenzial, gibt aber keinen ausreichend sensitiven Richtwert18, der durch den "logarithmischen Reduktionstest" berechnet wird. Die Parallelstreifenmethode ist jedoch nützlich für ein relativ schnelles und einfach auszuführendes Verfahren, um eine große Anzahl von Farbfeldern 6,7,20 zu überprüfen, insbesondere wenn für einen Waschhaltbarkeitstest über viele Zyklen getestet wird.
Quantitative Analyse der behandelten Gewebeproben
Der logarithmische Reduktionstest (auch bekannt als prozentualer Reduktionstest) zeigte eine signifikante (<0,001) Reduktion der mikrobiellen Kulturen bei Kontakt mit dem behandelten Gewebe für 30 min (Abbildung 4 und Abbildung 5). Die antimikrobiellen Stoffmuster waren signifikant wirksam (>99%) gegen ein grampositives Bakterium (S. aureus), gramnegative Bakterien (E. coli und P. aeruginosa) und eine Hautpilzart (C. albicans). Da das unbehandelte Gewebe (Negativkontrolle) keine antimikrobielle Aktivität aufwies, waren die gewonnenen KBE zu zahlreich, um sie zu zählen, bis sie bis zur Extinktion verdünnt wurden, bis zu 106 Verdünnungen (Abbildung 4). Die Anzahl der KBE, die aus den behandelten Geweben bei einer Kontaktzeit von "0" (sofort nach Inokulation und Neutralisation plattiert) gewonnen wurden, war der des unbehandelten Gewebes sehr ähnlich, und die Daten wurden der Einfachheit halber weggelassen. Der verwendete Neutralisator (Letheen-Brühe) neutralisiert wirksam die Wirkung von phenolischen Derivaten wie Carvacrol und Thymol. Im Vergleich zu Carvacrol-NPs zeigten Thymol-NPs eine etwas höhere antimikrobielle Wirkung gegen alle vier Mikroben (Abbildung 5). Sowohl das Thymol- als auch das Carvacrol-beschichtete Gewebe wirkten gleichermaßen effektiv gegen drei Mikroben (S. aureus, E. coli und C. albicans) mit einer Reduktion von über 4 Log-Schichten (99,99 %), mit Ausnahme von P. aeruginosa, die von 2,8 bis 3,2 Log-Reduktionen (99,9) reichte. Dies war zu erwarten, da P. aeruginosa intrinsisch resistent gegen eine Reihe von antimikrobiellen Mitteln ist22. Der Waschhaltbarkeitstest zeigte, dass das behandelte Gewebe nach 10 Waschgängen eine effektive antimikrobielle Resistenz (>99%) gegen drei Arten (S. aureus, E. coli und C. albicans) und eine moderate Resistenz gegen P. aeruginosa aufweisen konnte.
Abbildung 1: Zylinderplatten-Assay von synthetisierten Nanopartikeln mit einer Reihe von Konzentrationen, die gegen Bakterien getestet wurden . (A) Seriell verdünnte Thymol-NPs für ein erstes Screening gegen E. coli , das die Platzierung von Zylindern und klaren Zonen nach 18 h Inkubation zeigt. Progressiv steigende Konzentrationen von "o" bis "r" führten zu proportional höheren Zonen. Die klare Zone, die durch die höchste Konzentration erzeugt wird, wird durch einen roten Kreis angezeigt. Die Negativkontrolle (Chitosan-NPs ohne die bioaktiven Verbindungen) wird durch "t" und der während der Reinigung extrahierte Überstand durch "s" dargestellt. (B) Zwei von drei Konzentrationen von Carvacrol-NPs (12 Monate alt, bei 4 °C gelagert), die für die Gewebebehandlung gescreent wurden, zeigten wirksame Zonen (>20 mm) gegen S. aureus. (C) Drei Konzentrationen von Thymol-NPs (12 Monate alt, gelagert bei 4 °C), die für die Gewebebehandlung gescreent wurden, zeigten wirksame Zonen gegen S. aureus. Abkürzung: NP = Nanopartikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Layout der parallelen Streak-Methode. Platzierung eines Stoffmusters auf Mueller-Hinton-Agar, das mit fünf aufeinanderfolgenden parallelen Streifen beimpft wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ergebnisse der parallelen Streifenmethode, die klare Zonen für die behandelten Stoffmuster zeigen. Die Proben wurden auf das Inokulum gelegt (untere Reihe) im Vergleich zu unbehandelten (obere Reihe). (A) Unbehandeltes Gewebe gegen S. aureus, (B) unbehandeltes Gewebe gegen C. albicans, (C) Thymol NP-beschichtetes Gewebe (nach 10 Waschgängen) gegen S. aureus und (D) Thymol NP-beschichtetes Gewebe (nach 10 Waschgängen) gegen C. albicans. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Log-Reduktionsergebnisse von antimikrobiellen Geweben, die mit Thymol-verkapselten Chitosan-Nanopartikeln beschichtet sind, die gegen vier Krankheitserreger getestet wurden. Die Lactose-Agar-Platten in Tafel B wurden von der kanadischen Lebensmittelaufsichtsbehörde gespendet, die ihre Etiketten auf der Rückseite enthalten und wie Farbfelder aussehen. Andere Agarplatten wurden im Labor ohne Etiketten hergestellt. Stoffmuster wurden nicht wie in dem in Abbildung 3 gezeigten Experiment auf die Agarplatten gelegt. Vielmehr wurden die Mikroben aus den Swatches (nach dem Wirbeln in PBS) gewonnen und plattiert. (A) S. aureus auf Blutagar, (B) E. coli auf Purpur-Lactose-Agar, (C) P. aeruginosa auf Cetrimid-Agar, (D) C. albicans auf SDA. Die Erreger wurden 30 Minuten lang auf "unbehandelte" (obere Reihe) und "behandelte" (untere Reihe) Proben aufgespießt und nach Neutralisation und Verdünnung wiederhergestellt. Die Verdünnungsverhältnisse zwischen der behandelten und der unbehandelten Reihe sind dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Log-Reduktion von drei Bakterien (S. aureus, E. coli und P. aeruginosa) und einem Pilz (C. albicans) durch den Kontakt von antimikrobiellen Geweben, die mit zwei bioaktiven Verbindungen (Carvacrol und Thymol separat) imprägniert sind. Die antimikrobielle Wirksamkeit ist nach Waschzyklen (fünfmal bzw. 10-mal) sowohl bei Carvacrol- als auch bei Thymol-beschichteten Stoffen geschwächt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die antimikrobielle Wirksamkeit von Bioziden wird konventionell durch quantitative Assays wie die minimale Hemmkonzentration (MHK) und die minimale bakterizide Konzentration (MBC) getestet, bei denen die Bakterien 24 Stunden lang in eine antimikrobielle Flüssigkeit getaucht werden. Diese Assays sind jedoch nicht für beschichtete Gewebe geeignet, bei denen die flüssige Grenzfläche fehlt und die Biozide langsam entlang der Gewebefasern diffundieren. Aus diesem Grund haben sich viele Standard-Stofftests etabliert, wie z. B. AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 und JIS L 1902. Eine Vergleichsstudie dieser Standards von Pinho et al.23 räumt ein, dass es keinen Konsens über die am besten geeignete Methode gibt. Diese Studie modifizierte das Protokoll leicht, um die Verwendung von antimikrobiellen Laborkitteln in Biosicherheitslabors besser darzustellen. Bei den verwendeten Testmikroorganismen handelte es sich um die Spezies, die häufig aus den Laborkitteln in BSL-2-Laboren nachgewiesen wurden, basierend auf einer früheren Studie (unveröffentlicht). Sie repräsentieren auch eine Vielzahl pathogener Mikroben, die häufig in pharmazeutischen Tests verwendet werden, z. B. ein grampositiver humanpathogener Erreger (S. aureus), eine gramnegative Indikatorspezies (E. coli), eine hochresistente Spezies (P. aeruginosa) und ein dermal pathogener Pilz (C. albicans).
Die in dieser Studie beobachtete antimikrobielle Gesamtwirksamkeit (99,99 %) war höher als die in ähnlichen Studien berichtete Wirksamkeit 7,9,23,24, die zwischen 80 % und 99 % lag. Die Art und Weise, wie die Experimente in den anderen Studien durchgeführt wurden (gemäß AATCC 100)19, stellt jedoch eine Einschränkung dar, um die Wirksamkeit zu verfeinern, insbesondere wenn die Wirksamkeit 100 % beträgt. Das modifizierte Protokoll mit einer Reihe von fünf Platten (Abbildung 5), das in dieser Studie verwendet wurde, ermöglicht eine genauere Berechnung der Log-Reduktion. Nach der Inokulation der Stoffproben wurde die Inkubation bei R/T für 30 min durchgeführt, verglichen mit der Standard-O/N-Inkubation bei 37 °C. Die Modifikation repräsentiert besser die typische Verwendung des Laborkittels bei R/T und versehentliche mikrobielle Verschüttungen, die innerhalb kurzer Zeit (20-30 Minuten) neutralisiert werden müssen, um den antimikrobiellen Laborkittel als wirksam zu betrachten. Die Haltbarkeitstests der Wäsche zeigen, dass die antimikrobielle Wirksamkeit (>90%) nach 10 Waschgängen erhalten blieb. Die antimikrobielle Retention des Gewebes ist im Vergleich zu einigen Studienetwas geringer 7,9, die eine Wirksamkeit von bis zu 20-30 Zyklen ergaben. Schutzkleidung wie Laborkittel wird jedoch im Gegensatz zu normaler Kleidung nur selten gewaschen 2,3, und daher wären 10 Waschgänge ausreichend.
Die Auswahl der bioaktiven Verbindungen ist von größter Bedeutung, da die Verbindung für den Benutzer sicher sein muss. Daher sind viele giftige Chemikalien und Reizstoffe nicht kompatibel. EOs aus einer Reihe von pflanzlichen Produkten wurden extrahiert und auf ihre Eignung als idealer Kandidat für die nanopflanzliche Verkapselung untersucht, wobei die Wirksamkeit gegen die vier Krankheitserreger, die auf dem Stoff erzeugten Flecken und ein akzeptables Geruchsniveau berücksichtigt wurden. Zum Beispiel zeigte Granatapfelschalenextrakt signifikante Wirkungen gegen die Krankheitserreger, aber die Beize war für einen weißen Kittel nicht akzeptabel. Es wurde jedoch festgestellt, dass Carvacrol und Thymol bei einem akzeptablen Geruchsgehalt in der Textilveredelung wirksam sind. Die Verkapselungswirksamkeit war optimal, wenn das Gewichtsverhältnis von Chitosan zu Carvacrol (oder Thymol) 1:1,25 betrug, was mit früheren Forschungsergebnissen übereinstimmte10,16. Die Verkapselung der EOs wird durch die Vernetzung von polykationischen Gruppen (NH3+) von Chitosanmolekülen und polyanionischen Gruppen (P3O10,5-) vonTPP-Molekülen erleichtert. Der Vernetzer TPP stabilisiert die NPs, aber zu viel Vernetzer kann zu verklumpten Partikeln führen. Die Verkapselungswirksamkeit (EE) hängt von vielen Faktoren ab, wie z. B. dem Gewichtsverhältnis von Polymer zu EOs, der Dosierrate der EOs und der Temperatur. Einige flüchtige bioaktive Verbindungen können unter einem Kaltwasserbad mit Eis10 effektiv verkapselt werden. Eine einfache Möglichkeit, den EE zu testen, besteht darin, den Überstand zu testen, wie in Abbildung 1A gezeigt. Wenn der Überstand aufgrund der ungebundenen EOs stark antimikrobiell ist, ist der EE niedrig. Alle Inhaltsstoffe, die im Prozess verwendet werden, sind lebensmittelechte Materialien und sicher für den Benutzer und die Umwelt. Es gibt nur wenige Studien zu pflanzlichen NP-beschichteten Stoffen, die EOs und Chitosan oder natürliche Polymere verwenden. Diese Studie hat sich insbesondere auf die Entwicklung und Erprobung von antimikrobiellen Geweben für Laborkittel konzentriert und schlägt eine wirksame Lösung zur Reduzierung der mikrobiellen Kontamination in Biosicherheitslaboren vor. Weitere Studien werden empfohlen, um die Wirksamkeit des antimikrobiellen Gewebes im wirklichen Leben zu überprüfen, indem nach längerem Gebrauch in biologisch gefährlichen Labors oder Gesundheitseinrichtungen Proben von regulären im Vergleich zu antimikrobiellen Laborkitteln genommen werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde gefördert durch "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Kanada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Millipore Sigma | 64-19-7 | |
| Antibiotic base agar | BD Difco | DF0270-17-4 | Also known as Antibiotic Medium 2 |
| Antibiotic seed agar | BD Difco | DF0263-17-3 | Also known as Antibiotic Medium 1 |
| Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood) | Donated by CFIA | ||
| Bromcresol Purple Lactose Agar | Donated by CFIA | ||
| Candida albicans | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 10231 | |
| Carvacrol | Millipore Sigma | 282197 (CAS# 499-75-2) | |
| Centrifuge Allergra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | Model # X-22R | Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time. |
| Chitosan Medium Molecular Weight (CS) | Millipore Sigma | 448877 (CAS # 9012-76-4) | |
| Clamshell Heat Press | Intiva | IM1200 | |
| Escherichia coli (E. coli) | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 23725 | |
| Incubator | Thermo Scientific | 1205M34 | |
| Letheen Broth | BD Difco | DF0681-17-7 | Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product. |
| Milli Q water | Millipore Sigma | ZR0Q16WW | Deionized water |
| Mueller-Hinton Agar | BD Difco | DF0252-17-6 | |
| Pentasodium tripolyphosphate (TPP) | Millipore Sigma | 238503 (CAS# 7758-29-4) | |
| Phospahte Buffered Saline (PBS) | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 9027 | |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD Difco | DF0109-17-1 | |
| Shaking incubator/ Thermo shaker | VWR | Model# SHKA2000 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 6538 | |
| Thymol | Millipore Sigma | T0501 (CAS# 89-83-8) | |
| Trypticase Soy Agar | BD Difco | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth | BD Difco | 215235 | |
| Tween 80 | Millipore Sigma | STS0204 (CAS # 9005-65-6) | |
| UV-Vis Spectrophometer | Thermo Scientific | GENESYS 30 (840-277000) |
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