Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Антимикробная ткань с использованием нано-травяной инкапсуляции эфирных масел

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of Engineering Technology and Applied Sciences (SETAS), Centennial College

Summary

Антимикробные лабораторные халаты предотвращают перекрестное загрязнение в результате накопления патогенов и случайных биоразливов. Здесь мы описываем протокол разработки благоприятной для кожи антимикробной ткани с использованием нанотравяной инкапсуляции и модифицированных стандартных тестов для точной оценки эффективности и пригодности для типичного использования лабораторного халата.

Abstract

Лабораторные халаты широко используются в лабораториях биологической опасности и медицинских учреждениях в качестве защитной одежды для предотвращения прямого воздействия патогенов, разливов и ожогов. Эти защитные покрытия на основе хлопка обеспечивают идеальные условия для роста микробов и мест прикрепления благодаря своей пористой природе, влагоудерживающей способности и удержанию тепла от тела пользователя. Несколько исследований продемонстрировали выживание патогенных бактерий на больничной одежде и лабораторных халатах, действующих как переносчики микробной передачи.

Распространенным подходом к решению этих проблем является применение противомикробных агентов в отделке текстиля, но были высказаны опасения из-за токсичности и воздействия на окружающую среду многих синтетических химикатов. Продолжающаяся пандемия также открыла окно для изучения эффективных противомикробных препаратов и экологически чистых и нетоксичных составов. В этом исследовании используются два природных биологически активных соединения, карвакрол и тимол, инкапсулированные в наночастицы хитозана, которые гарантируют эффективную защиту от четырех патогенов человека с уменьшением до 4 log (99,99%). Эти патогены часто обнаруживаются в лабораторных халатах, используемых в лабораториях биологической опасности.

Обработанные ткани также выдержали до 10 циклов стирки с 90% -ным микробным снижением, что достаточно для использования по назначению. Мы внесли изменения в существующие стандартные тесты ткани, чтобы лучше представить типичные сценарии использования лабораторного халата. Эти усовершенствования позволяют более точно оценить эффективность противомикробных лабораторных покрытий и смоделировать судьбу любых случайных разливов микробов, которые должны быть нейтрализованы в течение короткого времени. Рекомендуется провести дальнейшие исследования для изучения накопления патогенов с течением времени на антимикробных лабораторных халатах по сравнению с обычными защитными покрытиями.

Introduction

Защитный белый халат является обязательным элементом средств индивидуальной защиты (СИЗ) в микробиологических лабораториях и медицинских учреждениях и защищает от прямого воздействия патогенов, разливов и ожогов. Эти хлопчатобумажные пальто способствуют росту микробов из-за многих факторов - тканый материал обеспечивает места прикрепления и аэрации, хлопок и крахмал, используемые в производственном процессе вместе с отслоившимися эпителиальными клетками пользователя, поставляют питательные вещества, а близость к пользователю дает тепло и влагу. Накопление микробов на текстиле также может вызвать проблемы со здоровьем, такие как аллергия и внутрибольничная инфекция, неприятные запахи и порча ткани1.

В отличие от обычной одежды, защитные пальто редко стирают или дезинфицируют, как было обнаружено во многих исследованиях 2,3. Многие исследования свидетельствуют о том, что лабораторные халаты выступают в качестве переносчика микробной передачи и риска внутрибольничных инфекций в медицинских учреждениях2,4, особенно резистентных штаммов3, таких как метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA); таким образом, они вызывают проблемы со здоровьем СИЗ, которые предназначены для защиты от микробного загрязнения. Недостаточно перекрестных исследований инфекций, связанных с лабораторными халатами, в контексте объектов уровня биобезопасности 2 (BSL-2) или учебных лабораторий по микробиологии, но многие регулирующие органы ограничивают использование лабораторных халатов в пределах уровня сдерживания. Тем не менее, многие академические учреждения в Северной Америке изо всех сил пытаются соответствовать требованиям из-за практических ограничений, таких как стирка и хранение внутри объекта, случаи ношения лабораторных халатов в общественных местах, таких как кафетерии и библиотеки, являются обычным явлением. Одним из практических решений этих проблем является применение антимикробных средств в отделке текстиля.

Антимикробные ткани набирают все большую популярность в спортивной одежде, спортивной одежде и носках, в основном предназначенных для уменьшения запаха тела. Однако использование этих тканей не является обычным явлением при разработке СИЗ, за исключением некоторых хлопчатобумажных масок с серебряным покрытием и медицинской одежды5. Мы сообщаем о разработке антимикробной ткани для лабораторных халатов, которая подавляет распространенные патогены, обнаруженные в лабораториях BSL-2, и обеспечивает эффективную защиту от перекрестного загрязнения распространенными патогенами.

В настоящее время на рынке доступны различные антимикробные ткани и отделочные материалы, но в большинстве из них используются коллоидные частицы тяжелых металлов (например, серебро, медь, цинк), металлоорганические соединения или синтетические химические вещества, такие как триклозан и четвертичные аммониевые соединения, которые не являются экологически чистыми1 и могут привести к проблемам со здоровьем, таким как раздражение кожи и аллергия6. Некоторые синтетические составы вызывают опасения из-за нецелевых микробов, таких как нормальная флора или индуцирование устойчивости к противомикробным препаратам (УПП). Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) регулирует коммерческие антимикробные ткани, которые должны быть нетоксичными для пользователя и не иметь экотоксичности. Поэтому предпочтительны антимикробные ткани на основе природных биоцидов, которые подавляют широкий спектр микробов. Эфирные масла (ЭО) широко используются в качестве противомикробных и терапевтических средств, но их использование в антимикробной отделке ограничено из-за их долговечности 6,7,8. Основываясь на наших знаниях и исследованиях рынка нанотравяной отделки8, антимикробная ткань на травяной основе не доступна в продаже. Это связано с тем, что синтетические покрытия просты в изготовлении и имеют длительный срок службы. Несколько текстильных изделий с нанотравяным покрытием, о которых сообщалось только в исследовательских целях, включают ним7, морингу 9 и листья карри9.

В настоящем исследовании используются два биологически активных компонента, извлеченных из ЭО орегано, карвакрол и тимол, которые эффективны против широкого спектра бактериальных патогенов и вирусов, но в целом признаны безопасными для человека10. Однако эти биологически активные компоненты являются летучими, и поэтому их антимикробный потенциал недолговечен, если их наносить непосредственно на ткань. Нанотравяная инкапсуляция - это процесс, при котором биологически активные компоненты или лекарства загружаются внутрь полимерной оболочки, которая защищает ядро от деградации окружающей среды и, таким образом, увеличивает срок годности. Кроме того, малый размер полимерных частиц, которые обычно варьируются от 10 до 100 нм, повышает эффективность применения и замедляет высвобождение биологически активных соединений на ткань. Эти биологически активные соединения используются для различных целей, таких как консервирование пищевыхпродуктов 10, но не для текстильного покрытия.

Среди многих полимерных инкапсуляторов хитозан является привлекательным кандидатом из-за многих его свойств, таких как нетоксичность, биоразлагаемость, слизистая адгезия и биосовместимость11. Это природный полисахарид, полученный в процессе деацетилирования из хитина, который содержится в ракушках и клеточных стенках грибов. Он используется в биохимических приложениях и приложениях для консервирования пищевых продуктов, таких как доставка лекарств или белков 11,12,13, контролируемое высвобождение 14 и антимикробные пленки 10. Хитозан плохо растворяется в воде, но образует коллоидную суспензию в кислых средах. Биологически активные молекулы загружаются в наночастицы хитозана (НЧ) простым двухстадийным методом ионного гелеобразования14,15,16. В этом процессе гидрофобные биологически активные соединения, такие как карвакрол и тимол, образуют эмульсию масло-в-воде, которой способствует поверхностно-активное вещество Tween 80. Впоследствии полианионное соединение, пентатриполифосфат натрия (ТЭС), используется для формирования поперечных связей между аминогруппами вдоль молекул поликатионного полимера и фосфатными группами молекул ТЭС для стабилизации комплекса. Этот процесс комплексообразования затвердевает биологически активные соединения в матрице хитозана, которая затем очищается и наносится на образцы хлопка для получения антимикробной ткани.

Наносоставы должны быть сначала протестированы на антимикробную эффективность в форме эмульсии, прежде чем наносить их на ткань. Это может быть удобно оценено качественным методом, таким как диффузия диска Кирби-Бауэра, диффузия скважины и анализ пластины цилиндра. Тем не менее, пробирная пластинацилиндра 17 обеспечивает гибкость для загрузки различных объемов состава и сравнения зоны зазора. В этом методе антимикробные составы загружают в цилиндры из нержавеющей стали и помещают на мягкий слой агара, который инокулируют исследуемым микроорганизмом или патогеном. Диаметр зоны клиренса, образующейся против исследуемого организма, пропорционален ингибирующему потенциалу антимикробной композиции и, следовательно, может быть использован в качестве альтернативы методам разведения бульона. Однако размер свободных зон является лишь сравнительным или качественным показателем в пределах конкретной плиты, если не поддерживаются конкретные стандарты. Противомикробные агенты действуют против патогенов либо путем ингибирования их роста (биостатический), либо путем уничтожения клеток (биоцидный), что может быть количественно определено минимальной ингибирующей концентрацией (MIC) и минимальной бактерицидной концентрацией (MBC) соответственно. Однако эффективность и поведение биологически активных химических веществ различны в их составах (жидкое состояние) и при нанесении покрытия на подложку, такую как ткань18. Это связано с тем, что в эффективности играют роль несколько факторов, таких как стабильность адгезии антимикробных агентов к ткани, содержание влаги, тип субстрата и адгезия микробов. Если предполагаемой целью является только бактериостатическая активность, качественный анализ, такой как «Метод параллельной полосы»19 , может обеспечить относительно быструю и простую оценку диффузионного антимикробного состава. Однако, если необходимо определить бактерицидные эффекты, можно использовать «Оценку антибактериальных покрытий текстильных материалов»20 , которая обеспечивает логарифмическое снижение количества шипованного патогена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение наночастиц

  1. Нано-травяная инкапсуляция
    1. Приготовьте 50 мл 1% (об./об.) уксусной кислоты.
      ВНИМАНИЕ: Ледяная уксусная кислота является раздражителем, который может вызвать серьезные ожоги кожи и повреждение глаз. Наденьте лабораторный халат во всю длину, нитриловые перчатки и защитные очки и работайте под вытяжным шкафом.
    2. Приготовьте раствор хитозана (1,2% мас./об.), растворив 0,6 г хлопьев хитозана (со средней молекулярной массой) в 50 мл 1% уксусной кислоты (приготовленной выше). Перемешивайте в течение ночи (O / N) при комнатной температуре (R / T), чтобы получить однородную эмульсию.
    3. Добавьте 0,5 г Tween 80 и перемешайте (1,000 об/мин) при 60 ° C в течение 2 ч до получения однородного раствора. Доведите раствор до R/T перед добавлением биологически активных соединений (карвакрола или тимола).
    4. Добавьте 0,75 г карвакрола (или тимола) по каплям или постепенно, помешивая (1000 об/мин) смесь в течение 20 мин при R/T. Массовое соотношение хитозана к биологически активному соединению составляет 1:1,25.
    5. Добавьте 50 мл (0,5% мас./об.) ТЭС по каплям в смесь, помешивая при R/T. Продолжайте перемешивать в течение 30 мин, чтобы получить однородную эмульсию.
    6. Подготовьте отрицательный контроль, следуя той же процедуре, но без добавления биологически активных соединений.
  2. Очистка
    1. Центрифугируют эмульсию при 10 000 × г в течение 30 мин при 4 °C и собирают образовавшиеся NP (гранулы) после декантации надосадочной жидкости. Зарезервируйте надосадочную жидкость для проверки эффективности инкапсуляции.
    2. Промывают частицы (из этапа 1.2.1) с помощью водной среды Tween 80 (1% об./об.) с удвоенным объемом образующихся гранул для удаления несвязанных или свободных биологически активных соединений. Обязательно потревожьте гранулы встряхиванием до тех пор, пока на каждом этапе стирки не образуется однородный раствор.
    3. Промойте частицы (из шага 1.2.2) деионизированной водой дважды, чтобы избавиться от примесей.
    4. Восстановите НЧ, ресуспендировав гранулу (с этапа 1.2.3) в 30 мл деионизированной воды. Храните NP при температуре 4 °C до 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент можно приостановить.
  3. Характеристика
    1. Разбавляйте НЧ в деионизированной воде до тех пор, пока показания ультрафиолетового излучения (УФ-видимые) показания в диапазоне от 250 до 400 нм не попадут в диапазон (поглощение >1).
    2. Запишите спектры поглощения УФ-ВИД НЧ на длинах волн от 250 до 400 нм с помощью УФ-ВИД спектрофотометра.
    3. Храните аликвоту (1 мл) НП при R/T в течение определенного периода времени (например, от 1 до 6 месяцев) и проверяйте антимикробный эффект методом цилиндрической пластины вместе со свежим образцом.
  4. Нанесение покрытия на ткань
    1. Наносят NP на тканую хлопчатобумажную ткань методом сухого отверждения 7,21.
      1. Погрузите образцы ткани в раствор, содержащий NP, смешанный с тканевым связующим веществом, на 3 мин до замачивания. Затем пропустите образцы через двухроликовую лабораторную прокладку, чтобы удалить лишнюю жидкость.
      2. Высушите образцы в духовке при температуре 100 °C в течение 30 минут и отверждайте при 130 °C в течение 10 минут.
      3. Наконец, промойте образцы в ультразвуковой ванне в течение 15 минут, чтобы удалить несвязанные NP.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы следуйте упрощенному методу, описанному ниже.
    2. Разрежьте хлопчатобумажную ткань (или образцы лабораторного халата) на квадраты размером 10 см х 10 см.
    3. Погрузите нарезанные кусочки в 2 мл синтезированного NP (10%) в пластиковый контейнер (12 см x 12 см) на 2 мин при R/T. Удалите лишнюю жидкость сушкой на воздухе.
    4. Нагрейте пресс при 100 °C в течение 3 мин, чтобы связать NP.
    5. Удалите несвязанные NP, промыв в водной среде Tween 80 (2% мас./об.) и высушите в духовке при 100 °C в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта антимикробная ткань может храниться в течение 2 лет при R / T.
  5. Долговечность стирки
    1. Разрежьте ткань на квадратные образцы размером 50 мм x 50 мм.
    2. Поместите образцы в 50 мл теплой водопроводной воды (40 °C) в стеклянный/пластиковый контейнер и добавьте две капли обычного моющего средства (не антимикробного).
    3. Промойте на шейкере с качающейся платформой или магнитной мешалкой в течение 30 минут.
    4. Высушить на воздухе или инкубировать при 60 °C в течение 2 часов и проверить на антимикробную эффективность.

2. Анализ цилиндрической пластины для скрининга наночастиц

  1. Приготовьте триптиказный соевый агар (TSA), триптиказный соевый бульон (TSB), агар на основе антибиотика (ABA) и агар из семян антибиотика (ASA) в соответствии с инструкциями производителя и стерилизуйте среду автоклавированием при 121 ° C при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут.
  2. Субкультурируйте интересующие микробы (из запасов), против которых проводятся тесты эффективности, на свежеприготовленных пластинах TSA (или любых соответствующих средах) методом трехсторонней пластины с полосами и инкубируйте для получения пластин чистоты. (Рекомендуемые виды: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans.)
  3. Инокулируют культуры из свежих планшетов чистоты в TSB (пробирки по 10 мл) при 35 °C O/N с умеренным встряхиванием (100-200 об/мин).
  4. Аликвота 5,0 мл расплавленного АСК в каждой из пробирок. Количество пробирок соответствует количеству тестируемых микроорганизмов.
  5. Налейте 20 мл предварительно стерилизованного расплавленного ABA в каждую чашку Петри (100 мм x 20 мм) асептически, чтобы сформировать базовый слой. Количество агаровых пластин соответствует количеству тестируемых микроорганизмов. Подождите, пока носитель затвердеет.
  6. После застывания базового слоя инокулируют каждую расплавленную АСК ночной культурой с этапа 2,3 (1,0 мл, предварительно нагретую до 35 °С) и немедленно переносят содержимое (смесь АСК и культуры) на поверхность пластины АВА. Закрутите пластину, чтобы равномерно распределить слой расплавленного агара. Убедитесь, что слой семян выглядит гладким и без неровностей или пузырьков.
  7. Поместите до шести цилиндров из нержавеющей стали (6 мм x 6 мм x 10 мм; предварительно автоклавированных), равномерно расположенных на шестиугольном рисунке, на агаровую пластину с помощью стерильного пинцета (рис. 1).
  8. Загрузите баллоны синтезированными НЧ разного объема (30 мкл, 50 мкл, 75 мкл и 100 мкл) для скрининга на антимикробные эффекты. Отрицательный контроль - это тот, который не содержит биологически активных соединений.
  9. Инкубируйте распространенные бактериальные патогены (например, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) при 35 °C в течение 24 часов и виды грибов (например, C. albicans) при R/T в течение 3 дней.
  10. Измерьте диаметр чистой зоны и сравните эффективность синтезированных NP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест можно использовать для предварительного скрининга лучших NP для нанесения покрытия на ткань.

3. Метод параллельных полос (модифицированный из AATCC 147)

  1. Подготовка материала
    1. Разрежьте обработанную NP ткань на образцы размером 50 мм x 25 мм.
    2. Приготовьте агар Мюллера-Хинтона (MHA), TSA и TSB в соответствии с инструкциями производителя и стерилизуйте среду автоклавированием при 121 ° C при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут.
    3. Субкультурируют интересующие микробы (из запасов), против которых проводятся тесты на эффективность, на свежеприготовленных планшетах TSA (или любых соответствующих средах) методом трехсторонней пластины с полосами и инкубируют при 35 ° C в течение 2 дней для бактериальных пятен и при R/T в течение 5 дней для штаммов грибов для получения пластин чистоты. (Рекомендуемые виды: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans.)
  2. Всплески микробных культур
    1. Инокулируют культуры из свежих планшетов чистоты в TSB (пробирки по 10 мл) при 35 °C O/N с умеренным встряхиванием (100-200 об/мин).
    2. Разбавляют культуры O/N до 1,5 × 108 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл или соответствует мутности стандарта 0,5 Макфарланда (обычно разведение от 1/10 до 1/20 для большинства здоровых культур).
    3. Прививают разведенную культуру выше, используя стерильную петлю диаметром 4 мм следующим образом. Загрузите петлю бульонной культуры и перенесите ее на поверхность агаровой пластины MHA, сделав пять параллельных полос, каждая длиной 6 см и расстоянием 1 см друг от друга, как показано на рисунке 2. Не заправляйте петлю.
    4. Аккуратно прижмите образец ткани стерильным шпателем к пяти полосам так, чтобы ткань оказалась в центре и коснулась всех пяти линий полос. Инкубировать при 35 °C в течение 24 ч.
  3. Качественная оценка антимикробной эффективности
    1. Осмотрите инкубированную пластину на предмет прерывания роста по прожилкам за краями ткани (четкая зона указывает на торможение роста).
    2. Рассчитайте среднюю ширину зоны торможения вдоль линии полосы (W) по обе стороны от образца ткани, используя уравнение (1).
      Ш = (Т - Г)/2 (1)
      W = ширина свободной зоны; T = общая длина свободной зоны, включая ширину образца; D = ширина образца ткани (25 мм).

4. Метод количественного логарифмического сокращения (модифицированный AATCC 100)

  1. Экспериментальная подготовка
    1. Разрежьте ткань на квадратные образцы размером 50 мм x 50 мм.
    2. Приготовьте TSA, TSB, бульон Letheen и фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) в соответствии с инструкциями производителя и стерилизуйте среду автоклавированием.
    3. Подготовьте O/N-культуры интересующих микробов, против которых проводятся испытания на эффективность, путем инокуляции изолированных колоний из чистоты планшетов в стерильный БСЭ и инкубации при 35 °C в течение 18-24 ч. (Рекомендуемые виды: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans.)
  2. Всплески микробных культур
    1. Разбавляют культуры O/N до 1,5 × 108 КОЕ/мл или соответствует мутности стандарта 0,5 Макфарланда (обычно разведение от 1/10 до 1/20 для большинства здоровых культур).
    2. Определите подходящий объем культур для пикировки, измерив влагоудерживающую способность ткани следующим образом.
      1. Добавьте ряд объемов разбавленной бульонной культуры (например, 100-500 мкл) на образцы ткани (в отдельных пластинах Петри) и выберите объем таким образом, чтобы образец ткани полностью поглощал воду и не оставлял остаточной/свободной жидкости. Способность удерживать жидкость отличается от типа и толщины ткани. Для обычных хлопчатобумажных лабораторных халатов это примерно 200 мкл.
      2. Нанесите объем (емкость удерживания жидкости, определенная выше [например, 200 мкл]) каждой культуры на образцы, помещенные в стерильные пластины Петри. Количество образцов соответствует количеству тестов (например, ткань, протестированная сразу и после стирки [и протестированных циклов стирки]), а также антимикробным эффектам, протестированным во время контакта (через установленное время/день [например, 30 мин, 2 часа, 1-3 день]).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте микропипетку с наконечниками аэрозольного фильтра (чтобы предотвратить загрязнение пипетки при последующих использованиях) для инокуляции культур на образцах с равномерным распределением.
      3. Для отрицательного контроля используйте необработанные образцы ткани того же типа. Выполните отрицательный контроль для каждого соответствующего вида тестируемых микробов, периода контакта, различных тканей и циклов стирки.
  3. Восстановление микробов путем подсчета жизнеспособных планшетов
    1. Дайте инокулированным образцам (как обработанным, так и необработанным) высохнуть на воздухе внутри пластин Петри (крышки приоткрыты) при R / T в течение требуемого периода / с контакта, подлежащего испытанию (например, 0 мин, 30 мин, 60 мин и т. д., или даже дней для долгосрочных эффектов). Всегда включайте «0 минут», чтобы представить немедленный эффект и нейтрализующую эффективность.
    2. Перенесите образцы асептически в отдельные стерильные центрифужные пробирки (50 мл) и плотно закрутите крышки.
    3. Добавьте бульон Letheen (любые соответствующие нейтрализующие буферы), чтобы получить разведение 1/100 (например, 19,8 мл для инокулята 200 мкл).
    4. Плотно закройте пробирки центрифуги завинчивающимися крышками и вихревите в течение 1 мин на средней скорости.
    5. Последовательно разбавляют суспензию стерильным PBS в последующих 1/10 разведениях, так что количество колоний в «необработанной» группе становится слишком низким для подсчета (TLTC).
    6. Нанесите разведения (0,1 мл) на соответствующие пластины-среды, которые поддерживают рост микроорганизмов (например, TSA для бактерий или декстрозный агар Сабуро [SDA] для грибов) или любые среды, которые оптимизируют рост и обеспечивают хороший контраст, чтобы сделать подсчет колоний точным.
    7. Бактериальные пластины инкубировать при 35 ° C в течение 2 дней и грибковые пластины при R/T в течение 5 дней.
    8. Подсчитайте жизнеспособные КОЕ непосредственно с помощью счетчика колоний или с помощью программного обеспечения для визуализации (например, КОЕ AI).
    9. Рассчитайте микробное логарифмическое сокращение (R) из-за антимикробной ткани, используя уравнение (2):
      R = Equation 1 × 100 (2)
      A = логарифмическое значение количества КОЕ, извлеченных из необработанной ткани; B = логарифмическое значение количества КОЕ, извлеченных из обработанной ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первичный скрининг синтезированных НУП
После двухступенчатой эмульсии масло-в-воде16 биологически активные соединения (карвакрол и тимол) были успешно инкапсулированы в хитозан. Это было подтверждено УФ-ВИД-спектрофотометрией для пикового поглощения соответствующих биологически активных соединений по сравнению с контрольной группой, которая представляла собой НЧ хитозана без каких-либо биологически активных соединений. Полученные НУП были однородными и стабильными в течение 12 месяцев при 4 ° C. Первичный скрининг антимикробной эффективности был проверен методом цилиндрической пластины (рис. 1). Это качественный метод, так как на зону зазора влияет множество факторов, таких как толщина агара, прочность инокулята и концентрация испытуемых образцов. Для этой цели можно использовать многие более простые методы, такие как метод дисковой диффузии Кирби-Бауэра и метод луночной диффузии, но метод цилиндрической пластины дает возможность изменять концентрации (рис. 1A) путем разбавления NP, и каждый цилиндр может удерживать объем испытуемого образца до 200 мкл. Кроме того, наложение агара на культуры образует гладкий инокулят, что позволяет определять чистые зоны с большей точностью17. Результаты показали, что свободные зоны пропорциональны постепенно возрастающим концентрациям (рис. 1А). Это повышает достоверность данных и отличает их от любых артефактов или аномальных зон. Исходя из размера прозрачных зон (обычно более 20 мм), для покрытия можно выбрать правильную концентрацию NP. Любые ранее охарактеризованные или старые NP, которые хранились надлежащим образом (4 °C), также могут быть проверены по большим зонам (рис. 1B, C) перед нанесением покрытия на ткань.

Качественный скрининг обработанных образцов тканей
Несмотря на антимикробную эффективность инкапсулированных НУП, подтвержденную большими прозрачными зонами, ткани с покрытием NP должны быть протестированы. Это связано с тем, что противомикробные агенты могут работать по-разному при нанесении на ткань по сравнению с их оригинальными составами. На эффективность влияют многие факторы, такие как свойства ткани (толщина, гидрофобность), эффективность покрытия и деградация биологически активных соединений при нанесениипокрытия20. Таким образом, метод параллельных полос был использован для качественной оценки антимикробного действия обработанных тканей. Отрицательный контроль (необработанные ткани) не продемонстрировал антимикробного эффекта из-за непрерывного роста микробов вдоль всех пяти линий полос (рис. 3 A, B). Обработанная ткань показала прерванный рост микробов вдоль линий полос (рис. 3 C, D), что было связано с диффузией биологически активных соединений из ткани. Однако средняя ширина чистых зон была низкой (<5 мм), так как перед испытанием испытуемые образцы подвергались 10 циклам стирки. По мере того, как концентрация инокулята уменьшается вдоль параллельных стейков от первой до пятой полосы (рис. 2), в последующих полосах выделяются четкие зоны. Если первая полоса (высокий посевной материал) показывает четкую зону, антимикробный потенциал ткани обычно высок. Некоторые неровности, такие как пятая строка на рисунке 3D, могут возникать из-за качественного характера теста. Свободная зона (прерванный рост) из-за бактериостатической активности дает представление об антимикробном потенциале, но не дает адекватно чувствительного ориентира18, который рассчитывается с помощью «логарифмического редукционного теста». Тем не менее, метод параллельных полос полезен для относительно быстрой и легко выполняемой процедуры скрининга большого количества образцов 6,7,20, особенно при тестировании на долговечность при стирке в течение многих циклов.

Количественный анализ обработанных образцов тканей
Тест на логарифмическое сокращение (также известный как тест на процентное снижение) продемонстрировал значительное (<0,001) снижение микробных культур при контакте с обработанной тканью в течение 30 мин (рис. 4 и рис. 5). Антимикробные образцы тканей были значительно эффективны (>99%) против грамположительных бактерий (S. aureus), грамотрицательных бактерий (E. coli и P. aeruginosa) и видов кожных грибов (C. albicans). Поскольку необработанная ткань (отрицательный контроль) не обладала антимикробной активностью, восстановленных КОЕ было слишком много, чтобы их можно было сосчитать, пока они не были разбавлены до исчезновения, до 10-6 разведений (рис. 4). Количество КОЕ, извлеченных из обработанных тканей при времени контакта «0» (нанесенных сразу после инокуляции и нейтрализации), было очень похоже на количество необработанных тканей, и данные были опущены для простоты. Используемый нейтрализатор (бульон Letheen) эффективен для нейтрализации эффектов фенольных производных, таких как карвакрол и тимол. По сравнению с НП карвакрола, НП тимола показали несколько более высокие антимикробные эффекты против всех четырех микробов (рис. 5). Как тимол, так и ткань с карвакрольным покрытием одинаково эффективно работали против трех микробов (S. aureus, E. coli и C. albicans) с более чем 4-логарифмическим снижением (99,99%), за исключением P. aeruginosa, которое варьировалось от 2,8 до 3,2-логарифмического снижения (99,9). Это было ожидаемо, поскольку P. aeruginosa по своей природе устойчив к ряду противомикробных препаратов22. Испытание на долговечность при стирке показало, что обработанная ткань способна продемонстрировать эффективную устойчивость к противомикробным препаратам (>99%) против трех видов (S. aureus, E. coli и C. albicans) и умеренную устойчивость к P. aeruginosa после 10 циклов стирки.

Figure 1
Рисунок 1: Анализ цилиндрической пластины синтезированных наночастиц с диапазоном концентраций, протестированных против бактерий . (A) Последовательно разбавленные НЧ тимола для первоначального скрининга против кишечной палочки, показывающего размещение цилиндров и свободных зон после 18 ч инкубации. Постепенное увеличение концентраций от «o» до «r» привело к пропорционально более высоким зонам. Чистая зона, образованная наибольшей концентрацией, обозначена красным кружком. Отрицательный контроль (НУП хитозана без биологически активных соединений) обозначается буквой «t», а надосадочная жидкость, извлеченная при очистке, обозначается буквой «s». (B) Две из трех концентраций НП карвакрола (12-месячный возраст, хранение при 4 °C) были проверены для обработки ткани с указанием эффективных зон (>20 мм) против S. aureus. (C) Три концентрации НП тимола (12-месячного возраста, хранятся при 4 °C), проверенные для обработки тканей, показывающие эффективные зоны против S. aureus. Аббревиатура: NP = наночастица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема метода параллельных полос. Размещение образца ткани на агаре Мюллера-Хинтона, инокулированном пятью последующими параллельными полосами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Результаты метода параллельных полос, показывающие четкие зоны для обработанных образцов ткани. Образцы помещали поверх инокулята (нижний ряд) по сравнению с необработанными (верхний ряд). (A) Необработанная ткань против S. aureus, (B) необработанная ткань против C. albicans, (C) ткань с тимоловым NP-покрытием (после 10 циклов стирки) против S. aureus и (D) ткань с тимоловым NP-покрытием (после 10 циклов стирки) против C. albicans. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Результаты логарифмического снижения антимикробной ткани, покрытой инкапсулированными тимолом наночастицами хитозана, протестированы без четырех патогенов. Пластины с лактозным агаром на панели B были подарены Канадским агентством по инспекции пищевых продуктов, которые имеют свои этикетки на обратной стороне и выглядят как образцы. Другие агаровые пластины были приготовлены в лаборатории без этикеток. Образцы ткани не помещали поверх агаровых пластин, как в эксперименте, показанном на рисунке 3. Скорее, микробы были извлечены из образцов (после вихря в PBS) и покрыты пластиной. (A) S. aureus на кровяном агаре, (B) E. coli на пурпурном лактозном агаре, (C) P. aeruginosa на цетримидном агаре, (D) C. albicans на SDA. Патогенные микроорганизмы были помещены в «необработанные» (верхний ряд) и «обработанные» (нижний ряд) образцы в течение 30 минут и извлечены после нейтрализации и разбавления. Коэффициенты разбавления показаны между обработанной и необработанной сериями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Логарифмическое снижение трех бактерий (S. aureus, E. coli и P. aeruginosa) и одного гриба (C. albicans) из-за контакта антимикробных тканей, пропитанных двумя биологически активными соединениями (карвакрол и тимол отдельно). Антимикробная эффективность ослабевает после циклов стирки (пять раз и 10 раз соответственно) как для тканей с карвакролом, так и для тканей с тимоловым покрытием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Антимикробная эффективность биоцидов обычно проверяется количественными анализами, такими как минимальная ингибирующая концентрация (MIC) и минимальная бактерицидная концентрация (MBC), при которых бактерии погружают в антимикробную жидкость на 24 часа. Однако эти анализы не подходят для тканей с покрытием, где отсутствует жидкая граница раздела и биоциды медленно диффундируют вдоль волокон ткани. Поэтому было установлено множество стандартных испытаний ткани, таких как AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 и JIS L 1902. Сопоставительное исследование этих стандартов, проведенное Pinho et al.23 , признает, что нет единого мнения о наиболее подходящем методе для использования. Это исследование немного изменило протокол, чтобы лучше представить использование противомикробных лабораторных халатов в лабораториях биобезопасности. Используемые тестовые микроорганизмы были видами, часто обнаруживаемыми в лабораторных халатах в лабораториях BSL-2, на основе предыдущего исследования (неопубликованного). Они также представляют широкий спектр патогенных микробов, которые обычно используются в фармацевтических тестах, например, грамположительный патоген человека (S. aureus), грамотрицательный вид-индикатор (E. coli), высокоустойчивый вид (P. aeruginosa) и кожный патогенный гриб (C. albicans).

Общая антимикробная эффективность, наблюдаемая в этом исследовании (99,99%), была выше, чем эффективность, о которой сообщалось в аналогичных исследованиях 7,9,23,24, которая варьировалась от 80% до 99%. Однако то, как эксперименты проводились в других исследованиях (согласно AATCC 100)19, ограничивает повышение эффективности, особенно когда эффективность составляет 100%. Модифицированный протокол с серией из пяти пластин (рис. 5), используемый в этом исследовании, позволяет с большей точностью рассчитать логарифмическое сокращение. После инокуляции образцов ткани инкубацию проводили при R/T в течение 30 мин по сравнению со стандартной инкубацией O/N при 37 °C. Модификация лучше отражает типичное использование лабораторного покрытия при R/T и любые случайные разливы микробов, которые должны быть нейтрализованы в течение короткого времени (20-30 минут), чтобы антимикробный лабораторный халат считался эффективным. Испытания на долговечность стирки показывают, что антимикробная эффективность (>90%) сохраняется после 10 циклов стирки. Антимикробное удержание ткани немного ниже по сравнению с некоторыми исследованиями7,9, которые показали эффективность до 20-30 циклов. Однако защитную одежду, такую как лабораторные халаты, в отличие от обычной одежды, редко стирают2,3, и поэтому 10 циклов стирки будет достаточно.

Выбор биологически активных соединений имеет первостепенное значение, так как соединение должно быть безопасным для пользователя. Таким образом, многие токсичные химические вещества и раздражители несовместимы. ЭО из ряда растительных продуктов были извлечены и проверены на их пригодность в качестве идеального кандидата для нано-травяной инкапсуляции, учитывая эффективность против четырех патогенов, пятен, образующихся на ткани, и приемлемый уровень запаха. Например, экстракт кожуры граната показал значительное действие против патогенов, но пятно было неприемлемым для белого халата. Тем не менее, было обнаружено, что карвакрол и тимол эффективны при приемлемом уровне запаха в текстильной отделке. Эффективность инкапсуляции была оптимальной, когда весовое отношение хитозана к карвакролу (или тимолу) составляло 1:1,25, что согласовывалось с результатами предыдущих исследований10,16. Инкапсуляции ЭО способствует сшивание поликатионных групп (NH3+) молекул хитозана и полианионных групп (P3, O, 10, 5-) молекул TPP. Сшивающий агент TPP стабилизирует НЧ, но слишком большое количество сшивающего агента может привести к образованию слипшихся частиц. Эффективность инкапсуляции (EE) зависит от многих факторов, таких как весовое отношение полимера к ЭО, скорость дозирования ЭО и температура. Некоторые летучие биологически активные соединения могут быть эффективно инкапсулированы под холодной водяной баней со льдом10. Одним из простых способов проверки EE является тестирование надосадочной жидкости, как показано на рисунке 1A. Если надосадочная жидкость обладает высокой антимикробной способностью из-за несвязанных ЭО, ЭЭ будет низким. Все ингредиенты, используемые в процессе, являются пищевыми материалами и безопасны для пользователя и окружающей среды. Существует лишь несколько исследований тканей с покрытием NP на травяной основе, в которых используются ЭО и хитозан или природные полимеры. В этом исследовании особое внимание уделяется разработке и тестированию антимикробной ткани для лабораторных халатов и предлагается эффективное решение для снижения микробного загрязнения в лабораториях биобезопасности. Рекомендуется провести дальнейшие исследования для проверки эффективности антимикробной ткани в реальной жизни путем отбора проб обычных и противомикробных лабораторных халатов после длительного использования в лабораториях биологической опасности или медицинских учреждениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов у авторов отсутствует.

Acknowledgments

Это исследование было профинансировано «Прикладными исследованиями, инновациями и предпринимательскими услугами» (ARIES), Centennial College, Канада.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Millipore Sigma 64-19-7
Antibiotic base agar BD Difco DF0270-17-4 Also known as Antibiotic Medium 2
Antibiotic seed agar BD Difco DF0263-17-3 Also known as Antibiotic Medium 1
Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood) Donated by CFIA
Bromcresol Purple Lactose Agar Donated by CFIA
Candida albicans ATCC The Global Bioresource Center ATTC 10231
Carvacrol Millipore Sigma 282197 (CAS# 499-75-2)
Centrifuge  Allergra X-22R Centrifuge Beckman Coulter Model # X-22R Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time.
Chitosan Medium Molecular Weight (CS) Millipore Sigma 448877 (CAS # 9012-76-4)
Clamshell Heat Press Intiva IM1200
Escherichia coli (E. coli) ATCC The Global Bioresource Center ATTC 23725
Incubator Thermo Scientific 1205M34
Letheen Broth BD Difco DF0681-17-7 Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product.
Milli Q water Millipore Sigma ZR0Q16WW Deionized water
Mueller-Hinton Agar BD Difco DF0252-17-6
Pentasodium tripolyphosphate (TPP) Millipore Sigma 238503 (CAS# 7758-29-4)
Phospahte Buffered Saline (PBS) Thermo Scientific AM9624
Pseudomonas aeruginosa ATCC The Global Bioresource Center ATTC 9027
Sabouraud Dextrose Agar BD Difco DF0109-17-1
Shaking incubator/ Thermo shaker VWR Model# SHKA2000
Staphylococcus aureus ATCC The Global Bioresource Center ATTC 6538
Thymol Millipore Sigma T0501 (CAS# 89-83-8)
Trypticase Soy Agar BD Difco 236950
Trypticase Soy Broth BD Difco 215235
Tween 80 Millipore Sigma STS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-Vis Spectrophometer Thermo Scientific GENESYS 30 (840-277000)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt-Emrich, S., et al. Rapid assay to assess bacterial adhesion on textiles. Materials. 9 (4), 249 (2016).
  2. Qaday, J., et al. Bacterial contamination of medical doctors and students white coats at Kilimanjaro Christian Medical Centre, Moshi, Tanzania. International Journal of Bacteriology. 2015, 507890 (2015).
  3. Treakle, A. M., et al. Bacterial contamination of health care workers' white coats. American Journal of Infection Control. 37 (2), 101-105 (2009).
  4. Wong, D., Nye, K., Hollis, P. Microbial flora on doctors' white coats. BMJ. 303 (6817), 1602-1604 (1991).
  5. Gouveia, I. C. Nanobiotechnology: A new strategy to develop non-toxic antimicrobial textiles for healthcare applications. Journal of Biotechnology. (150), 349 (2010).
  6. Joshi, M., Ali, S. W., Purwar, R., Rajendran, S. Ecofriendly antimicrobial finishing of textiles using bioactive agents based on natural products. Indian Journal of Fibre and Textile Research. 34, 295-304 (2009).
  7. Ahmed, H. A., Rajendran, R., Balakumar, C. Nanoherbal coating of cotton fabric to enhance antimicrobial durability. Elixir Applied Chemistry. 45, 7840-7843 (2012).
  8. Morais, D. S., Guedes, R. M., Lopes, M. A. Antimicrobial approaches for textiles: From research to market. Materials. 9 (6), 498 (2016).
  9. Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Development of advanced textile finishes using nano-emulsions from herbal extracts for organic cotton fabrics. Coatings. 11 (8), 939 (2021).
  10. Martínez-Hernández, G. B., Amodio, M. L., Colelli, G. Carvacrol-loaded chitosan nanoparticles maintain quality of fresh-cut carrots. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 41, 56-63 (2017).
  11. Zhang, H. L., Wu, S. H., Tao, Y., Zang, L. Q., Su, Z. Q. Preparation and characterization of water-soluble chitosan nanoparticles as protein delivery system. Journal of Nanomaterials. 2010, 1-5 (2010).
  12. Patel, R., Gajra, B., Parikh, R. H., Patel, G. Ganciclovir loaded chitosan nanoparticles: preparation and characterization. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 7 (6), 1-8 (2016).
  13. Merodio, M., Arnedo, A., Renedo, M. J., Irache, J. M. Ganciclovir-loaded albumin nanoparticles: characterization and in vitro release properties. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 251-259 (2001).
  14. Hsieh, W. C., Chang, C. P., Gao, Y. L. Controlled release properties of Chitosan encapsulated volatile Citronella Oil microcapsules by thermal treatments. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 53 (2), 209-214 (2006).
  15. Yoksan, R., Jirawutthiwongchai, J., Arpo, K. Encapsulation of ascorbyl palmitate in chitosan nanoparticles by oil-in-water emulsion and ionic gelation processes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 76 (1), 292-297 (2010).
  16. Keawchaoon, L., Yoksan, R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 84 (1), 163-171 (2011).
  17. Cazedey, E. C. L., Salgado, H. R. N. Development and validation of a microbiological agar assay for determination of orbifloxacin in pharmaceutical preparations. Pharmaceutics. 3 (3), 572-581 (2011).
  18. Jayapriya, S., Bagyalakshmi, G. Textile antimicrobial testing and standards. International Journal of Textile and Fashion Technology. 4 (1), 2250-2378 (2013).
  19. AATCC 100. Antibacterial Finishes on Textile Materials: Assessment of Developed from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 100. , (2004).
  20. AATCC 147. Antimicrobial Activity Assessment of Textile Materials: Parallel Streak Method from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 147. , (2004).
  21. Ortelli, S., Costa, A. L., Dondi, M. TiO2 nanosols applied directly on textiles using different purification treatments. Materials. 8 (11), 7988-7996 (2015).
  22. Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Frontiers in Microbiology. 2, 65 (2011).
  23. Pinho, E., Magalhães, L., Henriques, M., Oliveira, R. Antimicrobial activity assessment of textiles: standard methods comparison. Annals of Microbiology. 61 (3), 493-498 (2010).
  24. Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Novel antimicrobial finishing of organic cotton fabrics using nano-emulsions derived from Karanja and Gokhru plants. Textile Research Journal. 92 (23-24), 5015-5032 (2022).

Tags

Биология выпуск 194
Антимикробная ткань с использованием нано-травяной инкапсуляции эфирных масел
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Subair, S., Singh, N., Maru, M.,… More

Subair, S., Singh, N., Maru, M., Prakash, S., Hasanar, M. An Antimicrobial Fabric Using Nano-Herbal Encapsulation of Essential Oils. J. Vis. Exp. (194), e65187, doi:10.3791/65187 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter