Summary
Antimikrobielle laboratoriefrakker forhindrer krysskontaminering av patogenakkumulering og utilsiktet bioutslipp. Her beskriver vi protokollen for å utvikle et hudvennlig antimikrobielt stoff ved hjelp av nano-urteinnkapsling og modifiserte standardtester for å nøyaktig evaluere effekten og egnetheten for typisk bruk av laboratoriebelegget.
Abstract
Laboratoriefrakker er mye brukt i biohazard laboratorier og helseinstitusjoner som beskyttende plagg for å forhindre direkte eksponering for patogener, søl og brannskader. Disse bomullsbaserte beskyttelsesfrakkene gir ideelle forhold for mikrobiell vekst og festesteder på grunn av deres porøse natur, fuktighetsholdende kapasitet og oppbevaring av varme fra brukerens kropp. Flere studier har vist overlevelse av patogene bakterier på sykehusklær og laboratoriefrakker, som fungerer som vektorer for mikrobiell overføring.
En vanlig tilnærming for å løse disse problemene er anvendelsen av antimikrobielle midler i tekstilbehandling, men bekymringer har blitt reist på grunn av toksisitet og miljøeffekter av mange syntetiske kjemikalier. Den pågående pandemien har også åpnet et vindu for undersøkelse av effektive antimikrobielle stoffer og miljøvennlige og toksisfrie formuleringer. Denne studien bruker to naturlige bioaktive forbindelser, karvacrol og tymol, innkapslet i kitosan nanopartikler, som garanterer effektiv beskyttelse mot fire humane patogener med opptil 4-log reduksjon (99, 99%). Disse patogenene oppdages ofte i laboratoriefrakker som brukes i biohazard-laboratorier.
De behandlede stoffene motsto også opptil 10 vaskesykluser med 90 % mikrobiell reduksjon, noe som er tilstrekkelig for tiltenkt bruk. Vi har gjort endringer i de eksisterende standard stofftestene for bedre å representere de typiske scenariene for bruk av laboratoriefrakk. Disse forbedringene muliggjør en mer nøyaktig evaluering av effektiviteten av antimikrobielle laboratoriefrakker og for simulering av skjebnen til eventuelle utilsiktede mikrobielle utslipp som må nøytraliseres innen kort tid. Videre studier anbefales for å undersøke akkumulering av patogener over tid på antimikrobielle laboratoriefrakker sammenlignet med vanlige beskyttelsesfrakker.
Introduction
Den beskyttende hvite pelsen er et obligatorisk personlig verneutstyr (PPE) i mikrobiologiske laboratorier og helseinstitusjoner, og den beskytter mot direkte eksponering for patogener, søl og brannskader. Disse bomullsfrakkene fremmer mikrobiell vekst på grunn av mange faktorer - det vevde stoffet gir festesteder og lufting, bomull og stivelse som brukes i produksjonsprosessen sammen med eksfolierte epitelceller fra brukerforsyningen næringsstoffer, og nærheten til brukeren gir varme og fuktighet. Akkumulering av mikrober på tekstiler kan også forårsake helseproblemer som allergi og nosokomial infeksjon, ubehagelig lukt og stoffforringelse1.
I motsetning til vanlige klær, blir beskyttelsesfrakker sjelden vasket eller desinfisert, som funnet i mange undersøkelser 2,3. Mange studier viser tegn på laboratoriefrakker som fungerer som en vektor for mikrobiell overføring og risikoen for nosokomiale infeksjoner i helsevesenet2,4, spesielt resistente stammer3 som meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA); Dermed reiser de helseproblemer av PPE, som er ment å beskytte mot mikrobiell forurensning. Det er ikke nok tverrsnittsstudier på laboratoriebeleggassosierte infeksjoner i sammenheng med Biosafety Level 2 (BSL-2) fasiliteter eller mikrobiologiske undervisningslaboratorier, men mange reguleringsmyndigheter begrenser bruken av laboratoriefrakker innenfor inneslutningsnivået. Imidlertid sliter mange akademiske institusjoner i Nord-Amerika med å oppfylle kravene på grunn av praktiske begrensninger, for eksempel hvitvasking og lagring inne i anlegget, hendelsene med å bruke laboratoriefrakker i offentlige områder som kafeteriaer og biblioteker er vanlige. En praktisk løsning på disse problemene er anvendelsen av antimikrobielle midler i tekstilbehandling.
Antimikrobielle stoffer blir stadig mer populære i sportsklær, aktivklær og sokker, hovedsakelig ment å redusere kroppslukt. Bruken av disse stoffene er imidlertid ikke vanlig i PPE-utvikling, bortsett fra noen sølvbelagte bomullsmasker og helseplagg5. Vi rapporterer utviklingen av et antimikrobielt stoff for laboratoriebelegg, som hemmer vanlige patogener som finnes i BSL-2-laboratorier og gir effektiv beskyttelse mot krysskontaminering av vanlige patogener.
For tiden er en rekke antimikrobielle stoffer og etterbehandlinger tilgjengelige i markedet, men de fleste av disse bruker tungmetallkolloidale partikler (f.eks. Sølv, kobber, sink), organometallikk eller syntetiske kjemikalier som triclosan og kvaternære ammoniumforbindelser, som ikke er miljøvennlige1 og kan føre til helseproblemer som hudirritasjon og allergi6. Noen syntetiske formuleringer utgjør bekymringer på grunn av ikke-målmikrober, for eksempel normal flora eller indusering av antimikrobiell resistens (AMR). US Food and Drug Administration (FDA) regulerer kommersielle antimikrobielle stoffer, som må være giftfri for brukeren og fri for økotoksisitet. Derfor er antimikrobielle stoffer basert på naturlige biocider som hemmer et bredt spekter av mikrober å foretrekke. Eteriske oljer (EOer) brukes mye som antimikrobielle og terapeutiske midler, men deres bruk i antimikrobiell etterbehandling er begrenset på grunn av deres holdbarhet 6,7,8. Basert på vår kunnskap og markedsundersøkelser om nano-urte etterbehandling8, er ingen urtebaserte antimikrobielle stoffer kommersielt tilgjengelig. Dette skyldes at syntetiske belegg er enkle å produsere og har lang holdbarhet. Noen nano-urtebelagte tekstiler som kun rapporteres for forskningsformål, inkluderer neem7, moringa 9 og karriblader9.
Den nåværende studien bruker to bioaktive komponenter ekstrahert fra oregano EOer, karvacrol og tymol, som er effektive mot et bredt spekter av bakterielle patogener og virus, men er generelt anerkjent som trygge for mennesker. Imidlertid er disse bioaktive komponentene flyktige, og derfor er deres antimikrobielle potensial kortvarig hvis de påføres direkte på stoffet. Nano-urte innkapsling er en prosess der bioaktive komponenter eller legemidler lastes inn i et polymert skall som beskytter kjernen mot miljøforringelse, og dermed forbedrer holdbarheten. I tillegg øker den lille størrelsen på polymerpartiklene, som vanligvis varierer fra 10 nm til 100 nm, effektiviteten av applikasjonen og bremser frigjøringen av de bioaktive forbindelsene på stoffet. Disse bioaktive forbindelsene brukes til forskjellige formål, for eksempel konserveringav mat 10, men ikke for tekstilbelegg.
Blant mange polymere innkapslingsmidler er kitosan en attraktiv kandidat på grunn av mange av dens egenskaper, som ikke-toksisitet, biologisk nedbrytbarhet, mukoadhesivitet og biokompatibilitet11. Det er et naturlig polysakkarid, oppnådd ved deacetyleringsprosessen fra kitin, som finnes i skjell og soppcellevegger. Den brukes i biokjemiske og matkonserveringsapplikasjoner som legemiddel- eller proteinlevering 11,12,13, kontrollert frigjøring 14 og antimikrobielle filmer 10. Chitosan er ikke lett løselig i vann, men danner en kolloidal suspensjon i sure medier. Bioaktive molekyler lastes inn i kitosan nanopartikler (NP) ved en enkel to-trinns ionisk geleringsmetode14,15,16. I denne prosessen danner hydrofobe bioaktive forbindelser som karvacrol og tymol en olje-i-vann-emulsjon, som støttes av et overflateaktivt middel, Tween 80. Deretter brukes en polyanionisk forbindelse, pentasodiumtripolyfosfat (TPP), til å danne tverrbindingene mellom aminogruppene langs polykationiske polymermolekyler og fosfatgrupper av TPP-molekyler for å stabilisere komplekset. Denne kompleksiseringsprosessen størkner de bioaktive forbindelsene i matrisen av kitosan, som deretter renses og belegges på bomullsprøver for å produsere antimikrobielt stoff.
Nano-formuleringene må først testes for antimikrobiell effektivitet i emulsjonsform før de påføres stoffet. Dette kan enkelt evalueres ved en kvalitativ metode, for eksempel Kirby-Bauer diskdiffusjon, brønndiffusjon, og sylinderplateanalysen. Imidlertid gir sylinderplateanalysen17 fleksibiliteten til å laste varierende volumer av formuleringen og sammenligne klaringssonen. I denne metoden lastes de antimikrobielle formuleringene i rustfritt stål sylindere og plasseres på et mykt agarlag, som inokuleres med testmikroorganismen eller patogenet. Diameteren av clearancesonen produsert mot testorganismen er proporsjonal med det hemmende potensialet til den antimikrobielle formuleringen, og kan derfor brukes som et alternativ til buljongfortynningsmetoder. Størrelsen på de klare sonene er imidlertid bare et komparativt eller kvalitativt mål innenfor en bestemt plate med mindre spesifikke standarder opprettholdes. Antimikrobielle midler virker mot patogenene enten ved å hemme deres vekst (biostatisk) eller drepe cellene (biocidal), som kan kvantifiseres ved henholdsvis minimum hemmende konsentrasjon (MIC) og minimum bakteriedrepende konsentrasjon (MBC). Imidlertid er effekten og oppførselen til de bioaktive kjemikaliene forskjellige i deres formuleringer (flytende tilstand) og når de er belagt på et substrat som et stoff18. Dette skyldes at flere faktorer spiller en rolle i effekten, for eksempel stabiliteten av adherens av antimikrobielle midler til stoffet, fuktighetsinnhold, substrattype og overholdelse av mikrober. Hvis det tiltenkte formålet bare er bakteriostatisk aktivitet, kan en kvalitativ analyse som "Parallel Streak Method"19 gi en relativt rask og enkel evaluering av diffusibel antimikrobiell formulering. Imidlertid, hvis de bakteriedrepende effektene skal bestemmes, kan "Vurdering av antibakterielle overflater på tekstilmaterialer"20 brukes, noe som gir loggreduksjon av det piggete patogenet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av nanopartikler
- Nano-urte innkapsling
- Tilbered 50 ml 1% (v/v) eddiksyre.
FORSIKTIG: Iseddik er irriterende, noe som kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Bruk en laboratoriefrakk i full lengde, nitrilhansker og vernebriller, og arbeid under en avtrekkshette. - Forbered kitosanoppløsning (1,2% w / v) ved å oppløse 0,6 g kitosanflak (middels molekylvekt) i 50 ml 1% eddiksyre (fremstilt ovenfor). Agiter over natten (O / N) ved romtemperatur (R / T) for å få en homogen emulsjon.
- Tilsett 0,5 g Tween 80 og rør (1000 rpm) ved 60 °C i 2 timer for å få en homogen løsning. Ta med oppløsningen til R / T før du tilsetter bioaktive forbindelser (karvacrol eller tymol).
- Tilsett 0,75 g carvacrol (eller tymol) dråpevis eller gradvis under omrøring (1000 rpm) blandingen i 20 minutter ved R / T. Vektforholdet mellom kitosan og bioaktiv forbindelse er 1:1,25.
- Tilsett 50 ml (0,5 % w/v) TPP dråpevis til blandingen under omrøring ved R/T. Fortsett omrøringen i 30 minutter for å få en homogen emulsjon.
- Forbered en negativ kontroll ved å følge samme prosedyre, men uten tilsetning av bioaktive forbindelser.
- Tilbered 50 ml 1% (v/v) eddiksyre.
- Rensing
- Sentrifuge emulsjonen ved 10 000 × g i 30 minutter ved 4 °C og samle de dannede NPene (pellet) etter dekantering av supernatanten. Reserver supernatanten for å teste innkapslingseffekten.
- Vask partiklene (fra trinn 1.2.1) med vandig Tween 80 (1 % v/v) med dobbelt så mye pellets som dannes for å fjerne ubundne eller frie bioaktive forbindelser. Sørg for å forstyrre pelleten ved å virvle til det dannes en homogen løsning i hvert vasketrinn.
- Vask partiklene (fra trinn 1.2.2) med avionisert vann to ganger for å bli kvitt urenheter.
- Rekonstituer NPene ved å resuspendere pelleten (fra trinn 1.2.3) i 30 ml avionisert vann. Oppbevar NP ved 4 °C i opptil 6 måneder.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause på dette stadiet.
- Karakterisering
- Fortynn NPene i avionisert vann til de ultrafiolette synlige (UV-Vis) avlesningene mellom 250 og 400 nm faller innenfor området (absorbans >1).
- Registrer UV-Vis-absorpsjonsspektrene til NP-ene over bølgelengder fra 250 til 400 nm ved hjelp av et UV-Vis-spektrofotometer.
- Oppbevar en alikot (1 ml) NP ved R / T i en rekke varigheter (f.eks. 1 til 6 måneder) og test den antimikrobielle effekten ved sylinderplatemetoden sammen med en fersk prøve.
- Belegg på stoff
- Påfør NP på et vevd bomullstoff ved hjelp av en pad-dry-cure metode 7,21.
- Dypp stoffprøvene i løsningen som inneholder NP blandet med et stoffbindemiddel i 3 minutter til det er gjennomvåt. Pass deretter fargeprøvene gjennom en laboratoriepadder med to ruller for å fjerne overflødig væske.
- Ovntørk fargeprøvene ved 100 °C i 30 min og herd ved 130 °C i 10 minutter.
- Til slutt, vask fargeprøvene i et ultralydbad i 15 minutter for å fjerne ubundne NPer.
MERK: Alternativt kan du følge den forenklede metoden som er beskrevet nedenfor.
- Skjær bomullsstoffet (eller labbeleggsprøver) i firkanter på 10 cm x 10 cm.
- Dypp de kuttede stykkene i 2 ml av den syntetiserte NP (10%) i en plastbeholder (12 cm x 12 cm) i 2 minutter ved R / T. Fjern overflødig væske ved lufttørking.
- Varmpress ved 100 °C i 3 minutter for å binde NP-ene.
- Fjern ubundne NP ved å skylle i vandige Tween 80 (2 % w/v) og tørk i ovnen ved 100 °C i 30 minutter.
MERK: Dette antimikrobielle stoffet kan lagres i 2 år ved R / T.
- Påfør NP på et vevd bomullstoff ved hjelp av en pad-dry-cure metode 7,21.
- Vask holdbarhet
- Klipp stoffet i 50 mm x 50 mm firkantede fargeprøver.
- Legg fargeprøvene i 50 ml varmt vann fra springen (40 °C) i en glass-/plastbeholder og tilsett to dråper vanlig vaskemiddel (ikke-antimikrobielt).
- Skyll på en gyngeplattformshaker eller magnetomrører i 30 min.
- Lufttørk eller inkuber ved 60 °C i 2 timer og test for antimikrobiell effekt.
2. Sylinderplateanalyse for screening av nanopartikler
- Forbered trypticase soyaagar (TSA), trypticase soyabuljong (TSB), antibiotikabaseagar (ABA) og antibiotikafrøagar (ASA), i henhold til produsentens instruksjoner, og steriliser mediet ved autoklavering ved 121 ° C ved 15 psi i 15 minutter.
- Subkultur mikrobene (fra lager) av interesse, som effekttestene utføres mot, på nytilberedte TSA-plater (eller andre passende medier) ved treveis strekplatemetode og inkubere for å produsere renhetsplater. (Anbefalte arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa og C. albicans.)
- Inokuler kulturen fra friske renhetsplater i TSB (10 ml rør) ved 35 °C O/N ved moderat risting (100-200 rpm).
- Aliquot 5,0 ml av smeltet ASA i hvert av reagensrørene. Antall rør tilsvarer antall testede mikroorganismer.
- Hell 20 ml presterilisert smeltet ABA i hver petrisklate (100 mm x 20 mm) aseptisk for å danne underlaget. Antall agarplater tilsvarer antall mikroorganismer som skal testes. Vent til mediene blir stivnet.
- Etter størkning av bunnlaget, inokuler hver smeltet ASA med en overnattingskultur fra trinn 2,3 (1,0 ml, forvarmet til 35 °C) og overfør umiddelbart innholdet (blanding av ASA og kultur) til overflaten av en ABA-plate. Virvle platen for å fordele det smeltede agarlaget jevnt. Sørg for at frølaget virker glatt og fritt for støt eller bobler.
- Plasser opptil seks sylindere i rustfritt stål (6 mm x 6 mm x 10 mm; preautoklavert), jevnt fordelt på et sekskantet mønster, per agarplate ved hjelp av en steril pinsett (figur 1).
- Legg sylindrene med syntetiserte NPer av forskjellige volumer (30 μL, 50 μL, 75 μL og 100 μL) som skal screenes for antimikrobielle effekter. Den negative kontrollen er den uten bioaktive forbindelser.
- Inkuber vanlige bakterielle patogener (f.eks. E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) ved 35 °C i 24 timer og sopparter (f.eks. C. albicans) ved R/T i 3 dager.
- Mål diameteren til den klare sonen og sammenlign effektiviteten til de syntetiserte NPene.
MERK: Denne testen kan brukes til å forhåndssjekke de beste NP-ene som skal belegges på stoffet.
3. Parallell strekmetode (modifisert fra AATCC 147)
- Materiell forberedelse
- Skjær det NP-behandlede stoffet i 50 mm x 25 mm fargeprøver.
- Forbered Mueller-Hinton agar (MHA), TSA og TSB, i henhold til produsentens instruksjoner, og steriliser mediet ved autoklavering ved 121 ° C ved 15 psi i 15 minutter.
- Subkultur mikrobene (fra lager) av interesse, som effekttestene utføres mot, på nytilberedte TSA-plater (eller andre egnede medier) ved treveis strekplatemetode og inkuberes ved 35 °C i 2 dager for bakterieflekker og ved R/T i 5 dager for soppstammer for å produsere renhetsplater. (Anbefalte arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa og C. albicans.)
- Spiking av mikrobielle kulturer
- Inokuler kulturen fra friske renhetsplater i TSB (10 ml rør) ved 35 °C O/N ved moderat risting (100-200 rpm).
- Fortynn O/N-kulturene til 1,5 × 108 kolonidannende enheter (CFU)/ml eller tilsvarende turbiditeten til 0,5 McFarland-standarden (vanligvis en 1/10 til 1/20 fortynning for de fleste sunne kulturer).
- Inokuler den fortynnede kulturen ovenfor ved hjelp av en 4 mm steril sløyfe som følger. Legg en løkke med buljongkultur og overfør den til overflaten av MHA-agarplaten ved å lage fem parallelle striper, hver 6 cm i lengde og 1 cm fra hverandre, i henhold til figur 2. Ikke fyll på sløyfen.
- Trykk stoffprøven forsiktig med en steril slikkepott over de fem stripene, slik at stoffet er i midten og berører alle fem streklinjene. Inkuber ved 35 °C i 24 timer.
- Kvalitativ evaluering av antimikrobiell effekt
- Undersøk den inkuberte platen for avbrudd av vekst langs stripene utover stoffets kanter (klar sone indikerer hemming av vekst).
- Beregn gjennomsnittsbredden på en hemmingssone langs streklinjen (W) på hver side av stoffprøven ved hjelp av ligning (1).
W = (T - D)/2 (1)
W = bredden på klar sone; T = total lengde på den klare sonen, inkludert fargeprøvebredden; D = bredden på stoffprøven (25 mm).
4. Kvantitativ loggreduksjonsmetode (modifisert fra AATCC 100)
- Eksperimentell forberedelse
- Klipp stoffet i 50 mm x 50 mm firkantede fargeprøver.
- Forbered TSA, TSB, Letheen buljong og fosfatbufret saltvann (PBS), i henhold til produsentens instruksjoner, og steriliser mediet ved autoklavering.
- Klargjøre O/N-kulturer av mikrober av interesse, som effekttestene utføres mot, ved å inokulere isolerte kolonier fra renhetsplater i steril TSB og inkubere ved 35 °C i 18-24 timer. (Anbefalte arter: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa og C. albicans.)
- Spiking av mikrobielle kulturer
- Fortynn O/N-kulturene til 1,5 × 108 CFU / ml eller tilsvarende turbiditeten til 0,5 McFarland-standarden (vanligvis en 1/10 til 1/20 fortynning for de fleste sunne kulturer).
- Bestem passende volum kulturer for spiking ved å måle stoffets væskeholdekapasitet som følger.
- Tilsett en serie volumer av den fortynnede buljongkulturen (f.eks. 100-500 μL) på stoffprøver (i separate petrisklater) og velg volumet slik at stoffprøven absorberer vannet helt og ikke etterlater gjenværende / fri væske. Væskeholdekapasiteten er forskjellig fra stoffets type og tykkelse. For vanlige bomullslaboratoriefrakker er det omtrent 200 μL.
- Pigg volumet (væskeholdingskapasiteten bestemt over [f.eks. 200 μL]) av hver kultur på fargeprøvene plassert i sterile petrisklater. Antall fargeprøver tilsvarer antall tester (f.eks. stoff testet umiddelbart og etter vask [og vaskesyklusene som er testet]), og de antimikrobielle effektene testet over kontakttiden (etter en angitt tid / dag [f.eks. 30 min, 2 timer, dag 1-3]).
MERK: Bruk en mikropipette med filterspisser for aerosoler (for å forhindre kontaminering av pipetten ved senere bruk) for å inokulere kulturene på fargeprøvene med jevn fordeling. - For den negative kontrollen bruker du samme type ubehandlede stoffprøver. Utfør den negative kontrollen for hver tilsvarende testmikrobiell art, kontaktperiode, forskjellige stoffer og vaskesykluser.
- Gjenoppretting av mikrober ved levedyktig plateantall
- La de inokulerte fargeprøvene (både behandlede og ubehandlede) lufttørke inne i petriskampene (lokkene på gløtt) ved R/T for den nødvendige kontaktperioden(e) som skal testes (f.eks. 0 min, 30 min, 60 min osv., eller til og med dager for langtidseffekter). Inkluder alltid en "0 min" for å representere en umiddelbar effekt og nøytraliserende effekt.
- Overfør fargeprøvene aseptisk til separate sterile sentrifugerør (50 ml) og skru lokkene tett.
- Tilsett Letheen-buljong (eventuelle relevante nøytraliserende buffere) for å lage en 1/100 fortynning (f.eks. 19,8 ml for en inokulum på 200 μL).
- Lukk sentrifugerørene med skrukorkene tett og virvel i 1 min på middels hastighet.
- Serielt fortynne suspensjonen med den sterile PBS i påfølgende 1/10 fortynninger, slik at koloniantallet i den "ubehandlede" gruppen blir for lavt til å telle (TLTC).
- Plate fortynningene (0,1 ml) på passende medieplater, som støtter veksten av mikroorganismen (f.eks. TSA for bakterier eller Sabouraud dextrose agar [SDA] for sopp) eller andre medier som optimaliserer veksten og gir god kontrast for å gjøre kolonitellingen nøyaktig.
- Inkuber bakterieplatene ved 35 °C i 2 dager og soppplatene ved R/T i 5 dager.
- Telle levedyktige CFUer direkte ved hjelp av en koloniteller eller ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (f.eks. CFU AI).
- Beregn den mikrobielle loggreduksjonen (R) som skyldes antimikrobielt stoff ved hjelp av ligning (2):
R =
× 100 (2)
A = loggverdi av antall CFUer gjenvunnet fra ubehandlet stoff; B = loggverdi av antall CFUer gjenvunnet fra behandlet stoff.
× 100 (2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innledende screening av de syntetiserte NPene
Etter to-trinns olje-i-vann-emulsjonsteknikk16 ble de bioaktive forbindelsene (karvacrol og tymol) vellykket innkapslet i kitosan. Dette ble bekreftet av UV-Vis-spektrofotometri for maksimal absorpsjon av de respektive bioaktive forbindelsene sammenlignet med kontrollene, som var kitosan NP uten bioaktive forbindelser. De konstituerte NPene var homogene og stabile over 12 måneder ved 4 °C. Den initiale screeningen av antimikrobiell effekt ble verifisert med sylinderplatemetoden (figur 1). Dette er en kvalitativ metode da clearancesonen påvirkes av flere faktorer, for eksempel agartykkelse, inokulumets styrke og konsentrasjonen av testprøvene. Mange enklere metoder, som Kirby-Bauer-diskdiffusjonsmetoden og brønndiffusjonsmetoden, kan brukes til dette formålet, men sylinderplatemetoden gir mulighet til å variere konsentrasjonene (figur 1A) ved å fortynne NPene, og hver sylinder kan holde testprøvevolumet opp til 200 μL. I tillegg danner agaroverlegget med kulturer en jevn inokulum, noe som gjør det mulig å bestemme de klare sonene med bedre presisjon17. Resultatene viste at de klare sonene står i forhold til de gradvis økende konsentrasjonene (figur 1A). Dette gir gyldighet til dataene og skiller dem fra artefakter eller unormale soner. Basert på størrelsen på de klare sonene (vanligvis over 20 mm), kan riktig konsentrasjon av NP velges for belegg. Eventuelle tidligere karakteriserte eller gamle NP-er, som ble lagret riktig (4 ° C), kan også verifiseres av de store sonene (figur 1B, C) før belegg på stoffet.
Kvalitativ screening av de behandlede stoffprøvene
Til tross for den antimikrobielle effektiviteten til de innkapslede NPene som er bekreftet av store klare soner, må de NP-belagte stoffene testes. Dette skyldes at de antimikrobielle midlene kan fungere annerledes når de påføres stoffet sammenlignet med deres opprinnelige formuleringer. Mange faktorer, for eksempel stoffets egenskaper (tykkelse, hydrofobicitet), beleggeffektivitet og nedbrytning av bioaktive forbindelser under belegg, påvirker effektiviteten20. Som sådan ble den parallelle strekmetoden brukt til å evaluere de antimikrobielle effektene av de behandlede stoffene kvalitativt. De negative kontrollene (ubehandlede stoffer) viste ingen antimikrobielle effekter av uavbrutt mikrobiell vekst langs alle fem streklinjer (figur 3 A,B). Det behandlede stoffet viste avbrutt mikrobiell vekst langs streklinjene (figur 3 C,D), noe som skyldtes de diffuse bioaktive forbindelsene fra stoffet. Den gjennomsnittlige bredden på de klare sonene var imidlertid lav (<5 mm) da testprøvene ble utsatt for 10 vaskesykluser før testing. Når inokulumkonsentrasjonene avtar langs de parallelle biffene fra første til femte strek (figur 2), er de klare sonene fremtredende i de påfølgende strekene. Hvis den første streken (høy inokulum) viser en klar sone, er stoffets antimikrobielle potensial vanligvis høyt. Noen uregelmessigheter, som den femte linjen i figur 3D, kan oppstå på grunn av testens kvalitative natur. Klar sone (avbrutt vekst) på grunn av bakteriostatisk aktivitet gir en indikasjon på det antimikrobielle potensialet, men gir ikke en tilstrekkelig sensitiv retningslinje18, som beregnes ved "log reduction test". Den parallelle strekmetoden er imidlertid nyttig for en relativt rask og enkel utført prosedyre for å screene et stort antall fargeprøver 6,7,20, spesielt når du tester for en vaskeholdbarhetstest over mange sykluser.
Kvantitativ analyse av de behandlede stoffprøvene
Logreduksjonstesten (også kjent som prosentvis reduksjonstest) viste en signifikant (<0,001) reduksjon av mikrobielle kulturer ved kontakt med det behandlede stoffet i 30 minutter (figur 4 og figur 5). De antimikrobielle stoffprøvene var signifikant effektive (>99%) mot en grampositiv bakterie (S. aureus), gramnegative bakterier (E. coli og P. aeruginosa) og en hudsoppart (C. albicans). Siden det ubehandlede stoffet (negativ kontroll) ikke hadde antimikrobiell aktivitet, var de gjenvunnede CFUene for mange til å telle til fortynning til utryddelse, opptil 106 fortynninger (figur 4). Antall CFUer gjenfunnet fra de behandlede stoffene ved "0" kontakttid (belagt umiddelbart etter inokulering og nøytralisering) var svært lik den for det ubehandlede stoffet, og data ble utelatt for enkelhets skyld. Nøytralisatoren som brukes (Letheen buljong) er effektiv til å nøytralisere effekten av fenolderivater som karvacrol og tymol. Sammenlignet med carvacrol NP viste tymol NP litt høyere antimikrobielle effekter mot alle fire mikrober (figur 5). Både tymol- og karvacrolbelagt stoff virket like effektivt mot tre mikrober (S. aureus, E. coli og C. albicans) med over en 4-log reduksjon (99,99%), unntatt P. aeruginosa, som varierte fra en 2,8- til en 3,2-log reduksjon (99,9). Dette var forventet, da P. aeruginosa er iboende resistent mot en rekke antimikrobielle stoffer22. Vaskeholdbarhetstesten viste at det behandlede stoffet var i stand til å vise effektiv antimikrobiell resistens (>99%) mot tre arter (S. aureus, E. coli og C. albicans) og moderat resistens mot P. aeruginosa etter 10 vaskesykluser.
Figur 1: Sylinderplateanalyse av syntetiserte nanopartikler med en rekke konsentrasjoner testet mot bakterier . (A) Seriefortynnede tymol-NP for en innledende screening mot E. coli som viser plassering av sylindere og klare soner etter 18 timers inkubasjon. Gradvis økende konsentrasjoner "o" til "r" resulterte i proporsjonalt høyere soner. Den klare sonen produsert av den høyeste konsentrasjonen er indikert med en rød sirkel. Den negative kontrollen (kitosan NP uten de bioaktive forbindelsene) er representert ved "t" og supernatanten ekstrahert under rensing er representert ved "s". (B) To av tre konsentrasjoner av carvacrol NP (12 måneder gammel, lagret ved 4 ° C) screenet for stoffbehandling som viser effektive soner (>20 mm) mot S. aureus. (C) Tre konsentrasjoner av tymol NP (12 måneder gammel, lagret ved 4 ° C) screenet for stoffbehandlingen som viser effektive soner mot S. aureus. Forkortelse: NP = nanopartikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett for metode for parallell strek. Plassering av en stoffprøve på Mueller-Hinton-agar inokulert med fem påfølgende parallelle striper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Resultater fra parallellstrekmetoden som viser klare soner for de behandlede stoffprøvene. Fargeprøvene ble plassert på toppen av inokulum (nederste rad) sammenlignet med ubehandlet (øverste rad). (A) Ubehandlet stoff mot S. aureus, (B) ubehandlet stoff mot C. albicans, (C) tymol NP-belagt stoff (etter 10 vaskesykluser) mot S. aureus, og (D) tymol NP-belagt stoff (etter 10 vaskesykluser) mot C. albicans. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Loggreduksjonsresultater av antimikrobielt stoff belagt med tymolinnkapslede kitosan nanopartikler testet agaisnt fire patogener. Laktoseagarplatene i panel B ble donert av Canadian Food Inspection Agency, som inkluderer etikettene på baksiden og ser ut som fargeprøver. Andre agarplater ble tilberedt i laboratoriet, uten etiketter. Stoffprøver ble ikke plassert oppå agarplatene, som i forsøket vist i figur 3. Snarere ble mikrobene gjenvunnet fra fargeprøvene (etter vortexing i PBS) og belagt. (A) S. aureus på blodagar, (B) E. coli på lilla laktoseagar, (C) P. aeruginosa på cetrimidagar, (D) C. albicans på SDA. Patogenene ble pigget på "ubehandlede" (øverste rad) og "behandlede" (nederste rad) fargeprøver i 30 minutter og gjenvunnet ved nøytralisering og fortynningsbelegg. Fortynningsforholdene vises mellom den behandlede og ubehandlede serien. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Logreduksjon av tre bakterier (S. aureus, E. coli og P. aeruginosa) og en sopp (C. albicans) på grunn av kontakt med antimikrobielle stoffer impregnert med to bioaktive forbindelser (karvacrol og tymol separat). Den antimikrobielle effekten svekkes etter vaskede sykluser (henholdsvis fem ganger og 10 ganger) for både karvacrol- og tymolbelagte stoffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den antimikrobielle effekten av biocider er konvensjonelt testet ved kvantitative analyser, for eksempel minimum hemmende konsentrasjon (MIC) og minimum bakteriedrepende konsentrasjon (MBC), hvor bakteriene er nedsenket i en antimikrobiell væske i 24 timer. Imidlertid er disse analysene ikke egnet for belagte stoffer, der væskegrensesnittet mangler og biocidene diffunderes sakte langs stofffibrene. Derfor har mange standard stofftester blitt etablert, for eksempel AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100 og JIS L 1902. En sammenligningsstudie av disse standardene av Pinho et al.23 anerkjenner at det ikke er konsensus om den mest egnede metoden som skal brukes. Denne studien endret protokollen litt for bedre å representere bruken av antimikrobielle laboratoriefrakker i biosikkerhetslaboratorier. Testmikroorganismene som ble brukt var artene som ofte ble oppdaget fra laboratoriefrakkene i BSL-2-laboratorier, basert på en tidligere studie (upublisert). De representerer også et bredt spekter av patogene mikrober som ofte brukes i farmasøytiske tester, for eksempel et grampositivt humant patogen (S. aureus), en gramnegativ indikatorart (E. coli), en svært resistent art (P. aeruginosa) og en dermal patogen sopp (C. albicans).
Den totale antimikrobielle effekten observert i denne studien (99,99 %) var høyere enn effekten rapportert i lignende studier 7,9,23,24, som varierte fra 80 % til 99 %. Måten eksperimentene ble utført på i de andre studiene (i henhold til AATCC 100)19 gir imidlertid en begrensning for å avgrense effekten, spesielt når effekten er 100 %. Den modifiserte protokollen med en serie på fem plater (figur 5) som ble brukt i denne studien, gjør det mulig å beregne loggreduksjonen med mer nøyaktighet. Ved inokulering av stoffprøvene ble inkubasjonen utført ved R/T i 30 minutter, sammenlignet med standard O/N-inkubasjon ved 37 °C. Modifikasjonen representerer bedre den typiske bruken av laboratoriebelegget ved R/T og eventuelle utilsiktede mikrobielle utslipp som må nøytraliseres innen kort tid (20-30 min) for å vurdere det antimikrobielle laboratoriebelegget effektivt. Vaskeholdbarhetstestene viser at den antimikrobielle effekten (>90%) forble etter 10 vaskesykluser. Den antimikrobielle retensjonen av stoffet er litt lavere sammenlignet med noen studier7,9, som ga effektivitet opptil 20-30 sykluser. Imidlertid vaskes beskyttende plagg som laboratoriefrakker, i motsetning til vanlige klær, sjelden2,3, og derfor vil 10 vaskesykluser være tilstrekkelig.
Valget av bioaktive forbindelser er avgjørende, da forbindelsen må være trygg for brukeren. Som sådan er mange giftige kjemikalier og irriterende stoffer ikke kompatible. EOer fra en rekke urteprodukter ble ekstrahert og screenet for deres egnethet som en ideell kandidat for nano-urteinnkapsling, med tanke på effekten mot de fire patogenene, flekker produsert på stoffet og et akseptabelt luktnivå. For eksempel viste granateple skall ekstrakt signifikante effekter mot patogener, men flekken var ikke akseptabelt for en hvit frakk. Imidlertid ble carvacrol og thymol funnet å være effektive med et akseptabelt nivå lukt i tekstil etterbehandling. Innkapslingseffekten var optimal når vektforholdet mellom kitosan og karvacrol (eller tymol) var 1:1,25, noe som var i samsvar med tidligere forskningsresultater10,16. Innkapslingen av EOene forenkles ved kryssbinding av polykationiske grupper (NH3+) av kitosanmolekyler og polyanioniske grupper (P3O10, 5-) avTPP-molekyler. Kryssbinderen TPP stabiliserer NP-ene, men for mye kryssbinder kan resultere i klumpede partikler. Innkapslingseffekten (EE) er avhengig av mange faktorer, for eksempel vektforholdet mellom polymer og EO, dispenseringshastigheten til EOene og temperaturen. Noen flyktige bioaktive forbindelser kan innkapsles effektivt under et kaldtvannsbad med is10. En enkel måte å teste EE på er å teste supernatanten, som vist i figur 1A. Hvis supernatanten er svært antimikrobiell på grunn av de ubundne EOene, vil EE være lav. Alle ingrediensene som brukes i prosessen er matkvalitetsmaterialer og trygge for brukeren og miljøet. Bare noen få studier eksisterer på urtebaserte NP-belagte stoffer som bruker EOs og kitosan eller naturlige polymerer. Denne studien har spesielt fokusert på utvikling og testing av antimikrobielt stoff for laboratoriefrakker og foreslår en effektiv løsning for å redusere mikrobiell forurensning i biosikkerhetslaboratorier. Videre studier anbefales for å verifisere effekten av det antimikrobielle stoffet i det virkelige liv ved å ta prøver av vanlige versus antimikrobielle laboratoriebelegg etter langvarig bruk i biohazard-laboratorier eller helseinstitusjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Millipore Sigma | 64-19-7 | |
| Antibiotic base agar | BD Difco | DF0270-17-4 | Also known as Antibiotic Medium 2 |
| Antibiotic seed agar | BD Difco | DF0263-17-3 | Also known as Antibiotic Medium 1 |
| Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood) | Donated by CFIA | ||
| Bromcresol Purple Lactose Agar | Donated by CFIA | ||
| Candida albicans | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 10231 | |
| Carvacrol | Millipore Sigma | 282197 (CAS# 499-75-2) | |
| Centrifuge Allergra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | Model # X-22R | Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time. |
| Chitosan Medium Molecular Weight (CS) | Millipore Sigma | 448877 (CAS # 9012-76-4) | |
| Clamshell Heat Press | Intiva | IM1200 | |
| Escherichia coli (E. coli) | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 23725 | |
| Incubator | Thermo Scientific | 1205M34 | |
| Letheen Broth | BD Difco | DF0681-17-7 | Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product. |
| Milli Q water | Millipore Sigma | ZR0Q16WW | Deionized water |
| Mueller-Hinton Agar | BD Difco | DF0252-17-6 | |
| Pentasodium tripolyphosphate (TPP) | Millipore Sigma | 238503 (CAS# 7758-29-4) | |
| Phospahte Buffered Saline (PBS) | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 9027 | |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD Difco | DF0109-17-1 | |
| Shaking incubator/ Thermo shaker | VWR | Model# SHKA2000 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC The Global Bioresource Center | ATTC 6538 | |
| Thymol | Millipore Sigma | T0501 (CAS# 89-83-8) | |
| Trypticase Soy Agar | BD Difco | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth | BD Difco | 215235 | |
| Tween 80 | Millipore Sigma | STS0204 (CAS # 9005-65-6) | |
| UV-Vis Spectrophometer | Thermo Scientific | GENESYS 30 (840-277000) |
References
- Schmidt-Emrich, S., et al. Rapid assay to assess bacterial adhesion on textiles. Materials. 9 (4), 249 (2016).
- Qaday, J., et al. Bacterial contamination of medical doctors and students white coats at Kilimanjaro Christian Medical Centre, Moshi, Tanzania. International Journal of Bacteriology. 2015, 507890 (2015).
- Treakle, A. M., et al. Bacterial contamination of health care workers' white coats. American Journal of Infection Control. 37 (2), 101-105 (2009).
- Wong, D., Nye, K., Hollis, P. Microbial flora on doctors' white coats. BMJ. 303 (6817), 1602-1604 (1991).
- Gouveia, I. C. Nanobiotechnology: A new strategy to develop non-toxic antimicrobial textiles for healthcare applications. Journal of Biotechnology. (150), 349 (2010).
- Joshi, M., Ali, S. W., Purwar, R., Rajendran, S. Ecofriendly antimicrobial finishing of textiles using bioactive agents based on natural products. Indian Journal of Fibre and Textile Research. 34, 295-304 (2009).
- Ahmed, H. A., Rajendran, R., Balakumar, C. Nanoherbal coating of cotton fabric to enhance antimicrobial durability. Elixir Applied Chemistry. 45, 7840-7843 (2012).
- Morais, D. S., Guedes, R. M., Lopes, M. A. Antimicrobial approaches for textiles: From research to market. Materials. 9 (6), 498 (2016).
- Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Development of advanced textile finishes using nano-emulsions from herbal extracts for organic cotton fabrics. Coatings. 11 (8), 939 (2021).
- Martínez-Hernández, G. B., Amodio, M. L., Colelli, G. Carvacrol-loaded chitosan nanoparticles maintain quality of fresh-cut carrots. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 41, 56-63 (2017).
- Zhang, H. L., Wu, S. H., Tao, Y., Zang, L. Q., Su, Z. Q. Preparation and characterization of water-soluble chitosan nanoparticles as protein delivery system. Journal of Nanomaterials. 2010, 1-5 (2010).
- Patel, R., Gajra, B., Parikh, R. H., Patel, G. Ganciclovir loaded chitosan nanoparticles: preparation and characterization. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 7 (6), 1-8 (2016).
- Merodio, M., Arnedo, A., Renedo, M. J., Irache, J. M. Ganciclovir-loaded albumin nanoparticles: characterization and in vitro release properties. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 251-259 (2001).
- Hsieh, W. C., Chang, C. P., Gao, Y. L. Controlled release properties of Chitosan encapsulated volatile Citronella Oil microcapsules by thermal treatments. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 53 (2), 209-214 (2006).
- Yoksan, R., Jirawutthiwongchai, J., Arpo, K. Encapsulation of ascorbyl palmitate in chitosan nanoparticles by oil-in-water emulsion and ionic gelation processes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 76 (1), 292-297 (2010).
- Keawchaoon, L., Yoksan, R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 84 (1), 163-171 (2011).
- Cazedey, E. C. L., Salgado, H. R. N. Development and validation of a microbiological agar assay for determination of orbifloxacin in pharmaceutical preparations. Pharmaceutics. 3 (3), 572-581 (2011).
- Jayapriya, S., Bagyalakshmi, G. Textile antimicrobial testing and standards. International Journal of Textile and Fashion Technology. 4 (1), 2250-2378 (2013).
- AATCC 100. Antibacterial Finishes on Textile Materials: Assessment of Developed from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 100. , (2004).
- AATCC 147. Antimicrobial Activity Assessment of Textile Materials: Parallel Streak Method from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 147. , (2004).
- Ortelli, S., Costa, A. L., Dondi, M. TiO2 nanosols applied directly on textiles using different purification treatments. Materials. 8 (11), 7988-7996 (2015).
- Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Frontiers in Microbiology. 2, 65 (2011).
- Pinho, E., Magalhães, L., Henriques, M., Oliveira, R. Antimicrobial activity assessment of textiles: standard methods comparison. Annals of Microbiology. 61 (3), 493-498 (2010).
- Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Novel antimicrobial finishing of organic cotton fabrics using nano-emulsions derived from Karanja and Gokhru plants. Textile Research Journal. 92 (23-24), 5015-5032 (2022).
