Summary
Vi beskriver ett protokoll för att bedöma dos-responskurvor för extrakraniell stimulering i termer av mätningar av hjärnans elektriska fält och ett relevant biomarkör-cerebralt blodflöde. Eftersom detta protokoll innebär invasiv elektrodplacering i hjärnan behövs generell anestesi, där spontan andning föredras snarare än kontrollerad andning.
Abstract
Detektion av cerebral blodflödesrespons (CBF) på olika former av neuronal aktivering är avgörande för att förstå dynamisk hjärnfunktion och variationer i substrattillförseln till hjärnan. Denna artikel beskriver ett protokoll för att mäta CBF-svar på transkraniell växelströmsstimulering (tACS). Dos-responskurvor uppskattas både från CBF-förändringen som sker med tACS (mA) och från det intrakraniella elektriska fältet (mV/mm). Vi uppskattar det intrakraniella elektriska fältet baserat på de olika amplituderna som mäts av glasmikroelektroder i varje sida av hjärnan. I den här artikeln beskriver vi den experimentella uppställningen, som innebär att man använder antingen bilaterala laserdopplerprober (LD) eller laserfläckavbildning (LSI) för att mäta CBF; Som ett resultat kräver denna inställning anestesi för elektrodplacering och stabilitet. Vi presenterar en korrelation mellan CBF-responsen och strömmen som en funktion av ålder, och visar en signifikant större respons vid högre strömmar (1,5 mA och 2,0 mA) hos unga kontrolldjur (12-14 veckor) jämfört med äldre djur (28-32 veckor) (p < 0,005 skillnad). Vi visar också en signifikant CBF-respons vid elektriska fältstyrkor <5 mV/mm, vilket är en viktig faktor för eventuella studier på människa. Dessa CBF-svar påverkas också starkt av användningen av anestesi jämfört med vakna djur, andningskontrollen (dvs. intuberad kontra spontan andning), systemiska faktorer (dvs. CO2) och lokal ledning i blodkärlen, som medieras av pericyter och endotelceller. På samma sätt kan mer detaljerade avbildnings-/inspelningstekniker begränsa fältstorleken från hela hjärnan till endast ett litet område. Vi beskriver användningen av extrakraniella elektroder för applicering av tACS-stimulering, inklusive både hemmagjorda och kommersiella elektroddesigner för gnagare, samtidig mätning av CBF och intrakraniellt elektriskt fält med hjälp av bilaterala DC-inspelningselektroder av glas, och avbildningsmetoderna. Vi tillämpar för närvarande dessa tekniker för att implementera ett slutet format för att förstärka CBF i djurmodeller av Alzheimers sjukdom och stroke.
Introduction
Transkraniell elektrisk stimulering (tES; med sinusvågsstimulering, tACS) är en vanlig, extern, icke-invasiv metod för hjärnneuromodulering 1,2. Tidigare antog vi att vid vissa doser kan tES (och särskilt tACS) öka det cerebrala blodflödet (CBF) i de underliggande hjärnregionerna3. Vidare kan det finnas ett dos-responsförhållande mellan antingen den tillförda externa strömmen eller det intrakraniella elektriska fältet och de resulterande CBF-responserna. De flesta kliniska stimuleringsprotokoll har dock fokuserat på en maximal bekväm hudstimuleringsnivå (dvs. ~ 2 mA) under schemalagda tidsperioder (dvs. 30-45 min) som ett behandlingsprotokoll 4,5. Hos gnagare är det möjligt att använda invasiva, extrakraniella hjärnelektroder som appliceras direkt på skallen för att undersöka de elektriska fält i hjärnan som induceras av tES6. Målet med detta tillvägagångssätt är därför att bestämma effekterna av intensiteten av tACS vid relevanta frekvenser på CBF-förändringar i termer av dos-responsförhållandet. Denna dos-responskurva är baserad på en kortvarig fysiologisk biomarkör-direkt mätning av CBF i förhållande till det elektriska fält som hjärnan utsätts för. Vi har tidigare visat att det vid större amplituder, vanligtvis utanför området för elektriska fält i hjärnan inducerade av tACS kliniskt, finns en nästan linjär korrelation mellan det inducerade elektriska fältet och CBF i cortex3. Stimulering av mindre fält (dvs. 1-5 mV/mm intensitet) kan dock vara mer relevant och genomförbar för användning på människor; därför har vi modifierat våra tekniker för att upptäcka mindre CBF-förändringar.
Denna artikel beskriver ett protokoll för att analysera effekterna av tES alternerande sinusströmmar (tACS) med lägre fältstyrka på CBF (dvs. 0,5-2,0 mA ström, 1-5 mV/mm elektriskt fält), som kan tolereras av vakna gnagare5. Detta protokoll involverar användning av ny laserspeckelavbildning under tACS, såväl som dubbla intrakraniella glaselektroder, för att bestämma både spridningen av aktiv tACS i hjärnan (som övervakas av CBF) och den intrakraniella elektriska fältintensiteten, som visas både som ett diagram och ett faktiskt experimentellt fotografi (figur 1). Det finns många möjliga fysiologiska effekter av tES i hjärnan, inklusive direkt neuronal modulering, neural plasticitet och astrocytaktivering 7,8. Även om CBF har mätts med tDCS 9,10 var dessa mätningar långsamma, indirekta och otillräckliga för att bedöma dos-responsfunktionen i hjärnan. Genom att använda lämpliga kortvariga biomarkörer (t.ex. CBF, elektriska fält) och snabba på/av-sekvenser av tACS kan vi nu uppskatta dos-responsfunktionen mer exakt. Vidare kan vi tillämpa olika tekniker för att mäta CBF, inklusive både fokallaserdopplerprober (LD) och laserspeckelavbildning (LSI) med definierade intresseområden.
Figur 1: Transkraniell stimulering och fotografiskt exempel . (A) Diagram över den transkraniella stimuleringsinställningen. Diagrammet visar en musskalle med koronala och sagittala suturer. De transkraniella elektroderna placeras lateralt och symmetriskt på skallen och monteras med kirurgiskt lim och ledande pasta mellan elektroderna och skallen. Dessa elektroder är anslutna till en människokompatibel stimuleringsanordning med konstant ström, som kan specificera stimuleringens frekvens, amplitud och varaktighet. För bedömning av intrakraniella elektriska fält placeras bilaterala glaselektroder (~2 MΩ) i hjärnbarken (dvs. inom 1 mm från den inre aspekten av skallen genom små borrhål), och dessa är förseglade med mineralolja och har AgCl-jord i nackmuskeln (visas som större trådar i mitten begravda i den subkutana halsvävnaden). Dessa glaselektroder är anslutna till en DC-förstärkare och deras utgångar spelas in via en digitaliserare med minst fyra kanaler. Bilaterala laserdopplersonder placeras också på skallen för inspelningar. Hela skallen avbildas också med antingen en laserfläckavbildningsenhet eller en högupplöst (minst 1 024 x 1 024 pixlar, 12-14 bitars pixeldjup) kyld kamera för inbyggd optisk signaldetektering. Den isosbestiska hemoglobinfrekvensen väljs vanligtvis (dvs. 562 nm) för belysning för blodflödesavbildning. (B) En närbild av ett verkligt experiment, som visar de bilaterala laserdopplersonderna (till vänster), de (bilaterala) intrakraniella glasregistrerande mikroelektroderna placerade genom gradhålen, och med tACS-stimulerande elektroder i sidled. Förkortning: tACS = transkraniell växelströmsstimulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Som ett sätt att bedöma mekanismerna kan vi också undersöka interaktioner med andra fysiologiska processer som också förändrar CBF, såsom K+-inducerad spridningsdepolarisering11. Vidare, snarare än schemalagda sessioner på regelbundna tider, är det också möjligt att utveckla ett slutet system baserat på ytterligare biomarkörer för en mängd olika sjukdomar, vilket har föreslagits för epilepsibehandling12 (dvs. kliniska Neuropace-enheter). Till exempel är hjärnstimulering med sluten slinga för Parkinsons sjukdom vanligtvis baserad på de inneboende, onormala lokala fältpotentialerna (LFP) som är inneboende i denna sjukdom i frånvaro av tillräckligt med dopamin (vanligtvis β-bands-LFP)13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Duke University eller motsvarande lokala myndighet som reglerar forskning som involverar djur. Se materialtabellen för detaljer om alla material, instrument och utrustning som används i detta protokoll.
1. Förberedelse av instrumentet
- Se till att alla nödvändiga föremål och kirurgiska instrument är på plats (Figur 2): rengöringslösning för hårbotten (alkoholkuddar), tejp, pincett, sax och en borr för att placera de små (0.5 mm) borrhålen.
- Förbered elektroderna för användning av skallen och se till att eventuellt kirurgiskt lim har rengjorts från dem om de har använts tidigare.
- Kontrollera impedansen hos dessa tACS-elektroder direkt innan du applicerar dem på skallen. För detta, använd den inbyggda mätfunktionen i tACS-stimulatorn med båda elektroderna placerade i ett saltvattenbad.
OBS: Den föredragna impedansen är <5 KΩ per elektrodpar för att tillåta tillräcklig ström att passera över skallen. Stimulatorn kontrollerar impedansen innan den levererar konstantströmspulser och ger värdet direkt.
Figur 2: Ett fotografi av den instrumentering som krävs, inklusive dissekeringsinstrument och sax, för att förbereda den extrakraniella stimuleringen. 1. Mikrodissekerande sax, 11,5 cm; 2. Tång, 11,5 cm, lätt kurva, tandad; 3. Dumont #7 pincett, böjd; 4. Dumont #5 pincett; 5. Mikrokyrett, 13 cm; 6. Toppar; 7. Kirurgisk tejp; 8. Alkoholkuddar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Förberedelse av djuret för operation
OBS: För dessa experiment använde vi 14 C57BL/6 kontrollmöss mellan 12 veckor och 33 veckors ålder, varav fem var hanar och nio var honor.
- Bedöva djuret i en induktionskammare med isofluran i 30 % O2 vid ~1,5 L/min, med ~4 % initialt för att inducera och ~1,25 %-1,5 % för att bibehålla en anestesinivå med spontan andning och tillräcklig för att eliminera svansklämningsresponsen.
- Överför djuret till den stereotaktiska ramen efter induktion och fäst sedan huvudet i noskonen och öronstängerna för den efterföljande elektrodappliceringen och borrhålsproceduren (Figur 1 och Figur 3).
- Anslut noskonen på den stereotaktiska ramen till förångaren via ett inlopp och till ett utlopp för att avlägsna eventuella isofluranrester genom ett reningssystem (t.ex. kol eller vakuum). Se till att det inte finns några luftläckor från näskonen, både för att upprätthålla anestesinivån med isofluoran och för att förhindra oavsiktligt läckage till rumsluften (Figur 3).
- Kontrollera musens position i den stereotaktiska ramen, inklusive noskonens position, för att möjliggöra spontan andning utan intubation, samt lämplig anestesiåterhämtning och rensning för att skydda forskningspersonalen (figur 3).
- Placera sonderna för att mäta puls, pulssyremättnad (puls OX), blodtryck och temperatur på djuret; Se till att den minsta pulssyresättningen är 90 % och att pulsen är >450/min (larmets nedre gräns visas som 380 pulser/min). Anteckna dessa parametrar under proceduren med jämna mellanrum eller kontinuerligt, beroende på registreringssystemet (figur 3).
- Innan ingreppet påbörjas ska du kontrollera djurets sederingsnivå med hjälp av (t.ex.ample) ett tånyp för att kontrollera reflexerna. Om det inte finns någon reflex är sederingsnivån optimal, så länge djuret bibehåller spontan andning och tillräcklig pulssyresättning. Om det finns en reflex, öka tillförseln av isofluran för att fördjupa anestesinivån och kontrollera sedan reflexen igen. Observera och övervaka kontinuerligt djurets andningsfrekvens och justera isoflurantillförseln därefter.
- Raka hårbotten eller ta bort håret med hårborttagningskräm (rengör restkrämen med spritkuddar).
- Applicera ögonsalva och rengör sedan hårbotten aseptiskt med tre passager jod och alkohol före excision med sax.
Figur 3: En bild av djuret i den stereotaktiska ramen, med skallen exponerad och endast tACS-stimulatorelektroderna på plats (före gradhålets placering). Notera blodtrycksanordningen runt svansen och pulsoximetern på tassen, med avläsningen till vänster. Det finns rensningsrör för isofluran runt näskonen. Förkortning: tACS = transkraniell växelströmsstimulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Kirurgiskt ingrepp: Applicera de stimulerande elektroderna och göra gradhålen
- För en terminalstudie, ta bort hårbotten med en kirurgisk sax och exponera skallen ~3 mm från lambdoid suturen kaudalt och ~3 mm frontalt mot bregma för att exponera en del av den bakre frontala suturen. Punktisera hårbotten parietalt för att exponera den första delen av tinningmuskeln på båda sidor (Figur 3).
- Ta bort eventuell kvarvarande subkutan bindväv så att skallen är ren och torr för applicering av de stimulerande elektroderna.
- Applicera ledande gel eller pasta på den sida av elektroderna som kommer i kontakt med skallen och fäst elektroderna med kirurgiskt superlim runt kanten på intermittenta ställen.
OBS: Låt inte den ledande gelen störa det kirurgiska superlimmet för att möjliggöra en bättre bindning till skallens yta. Elektrodernas yttre yta kan också isoleras (från hårbotten om denna är stängd under en överlevnadsoperation) med kirurgiskt superlim. - Använd antingen kommersiella platta elektroder eller skapa interna elektroder med isolerad tråd med en diameter på 100 μm (lödd på plattan) och en 1 mm x 3 mm flexibel, isolerad (på en yta) kopparplatta skuren efter skallens storlek.
- Applicera lidokainpasta på tinningmuskeln och hårbotten på båda sidor utan att störa elektroderna för att minska muskel- och perifer nervaktivering.
- När de extrakraniella stimuleringselektroderna är på plats 4 mm lateralt på varje sida av skallen (mellan bregma och lambda), borra två 0,5 mm borrhål för glaselektroderna 2 mm på varje sida av mittlinjen, 4 mm från varandra, ortogonalt mot den sagittala suturen (Figur 1). Fyll dessa borrhål med steril mineralolja för att förhindra att ström tränger in i skallen från de extrakraniella elektroderna.
- Om så önskas för ett visst experiment för att inducera spridningsdepression (dvs. kaliuminducerad spridningsdepression [K+-SD]), lägg till, på höger sida av skallen, ett tredje 0,5 mm borrhål ~1,5 mm rostralt till koronalsuturen och ~1 mm lateralt till den bakre frontala suturen. Fyll detta gradhål med koksaltlösning för senare 1 M KCl-applicering för att inducera K+-SD.
- Testa impedansen hos de extrakraniella stimulerande elektroderna både före placeringen av borrhålet (och jämfört med samma elektroder placerade i ett saltvattenbad) och efter placeringen av borrhålet för att verifiera att gradhålen inte stör strömflödet in i hjärnan (dvs. se till att motståndet är oförändrat).
OBS: Impedansmätningen tillhandahålls direkt av stimuleringsanordningen. Generellt har vi funnit att den totala systemimpedansen (dvs. från de extrakraniella elektroderna över skallen/hjärnvägen, vanligtvis ~3 KΩ) är relativt konstant oavsett gradhål och glasmikroelektroder, vilket indikerar att det finns minimalt strömläckage direkt in i hjärnan genom gradhålen. - Placera elektroderna för kronisk transkraniell stimulering för kronisk stimulering på ett liknande sätt. I det här fallet, isolera elektrodernas yttre yta, stäng hårbotten och antingen tunnla de isolerade trådarna ut genom hårbotten eller dra dem till ett fast huvudsteg monterat på skallen.
4. Fysiologiskt förfarande
- Börja med de fysiologiska aspekterna av experimentet, när djuret är helt förberett för det fysiologiska experimentet utan överlevnad. Se till att anestesinivån är tillräcklig för både spontan andning och adekvata pulsnivåer av oxar, andningsvägar och puls.
- Mät CBF till följd av extrakraniell stimulering med en av följande två metoder.
- Placera musen under en laserfläckavbildningsenhet med eller utan intrakraniella registreringselektroder för att mäta det intrakraniella elektriska fältet under stimuleringsepisoder (figur 3).
- Överför djuret till ett fysiologiskt preparat för placering av bilaterala laserdopplersonder och intrakraniella elektroder för att mäta det intrakraniella elektriska fältet under stimuleringsepisoder (figur 1).
5. Placering av bilaterala laserdoppler- och glaselektroder
- Överför djuret till ett mikroskopsteg för applicering av bilaterala laserdopplersonder. Placera sonderna på toppen av skallens yta mellan de bilaterala gradhålen och koronasuturen (Figur 1).
- Fyll mikroelektroder av draget glas (~0,1 μM, 2-6 MΩ impedans) med 0,2 M NaCl och placera dem med en mikromanipulator i de två gradhålen placerade lateralt till sagittalsuturen 3,14 (figur 1).
OBS: Dessa gradhål är mellan de två symmetriska extrakraniella stimuleringselektroderna (Figur 1). - När de väl har förts in i hjärnan, se till att dessa glasmikroelektroder är ~1 mm i hjärnbarken. Utför djupprofiler på olika symmetriska djup. Fyll igen borrhålen med steril mineralolja för att isolera denna väg för strömflöde.
6. Stimuleringsförfarande och mätning av intensiteten hos transkraniell växelströmsstimulering (tACS) eller transkraniell likströmsstimulering (tDCS)
- Spela in kontinuerliga data från de dubbla laserdopplersonderna på skallen och de två intrakraniella mikroelektrodutgångarna (inspelade med en DC-förstärkare med huvudstages) med hjälp av ett digitaliseringssystem och programvara med minst fyra kanaler (med en samplingshastighet på 1 KHz). När alla värden har registrerats under en tillräckligt stabil baslinjetid (dvs. >10 min), testa den extrakraniella stimuleringen.
OBS: Figur 4 visar ett example av de fyra kanalerna med de två intrakraniella inspelningselektroderna i de övre kanalerna och CBF-svaret i de nedre kanalerna. - Applicera korta perioder av på/av-stimulering vid olika amplituder (dvs. 20-30 s, 0,5-2,0 mA, inom det tolerabla intervallet) för att få en tydlig baslinje före och efter stimulering (figur 4). Applicera stimuleringen mellan de två skallelektroderna på vardera sidan (figur 1) med hjälp av en kommersiell, människokompatibel stimuleringsanordning som levererar en konstant ström.
- Observera musen noga för muskelryckningar eller andra reaktioner på tACS, såsom en förändring i puls eller andning, för att skapa en övre tolerabilitetsgräns (vanligtvis ~2 mA).
- Fortsätt att övervaka impedansen över elektroderna med stimuleringsepoker för att säkerställa att denna är konstant.
- Tillsätt en liten mängd (2-3 μL) 1 M KCl till det främre borrhålet14 för att inducera spontana K+-SD-händelser. Dessa genererar ett stort CBF-svar och interaktioner mellan det K+-SD-inducerade CBF-svaret och CBF-svaret. Uppskatta tACS CBF-svaret, tillämpa tACS-stimuleringen både före och efter uppkomsten av SD.
- I slutet av experimentet utförs eutanasi genom en överdos av isofluran (5 %) och halshuggs sedan när andningen och hjärtslagen har upphört.
Figur 4: Data som visar fyra kanaler med rådata som svar på lågintensiv tACS. Data är ordnade med de två övre raderna som de intrakraniella, direkta DC-elektriska inspelningarna (märkta som ingång 1 [IN0] och ingång 2 [IN1]) och de nedre två raderna som de bilaterala laserdopplerinspelningarna av det cerebrala blodflödet. Observera att svaren är asymmetriska mellan höger (övre) och vänster (nedre) elektriska och cerebrala blodflödesspår. (A) En liten respons (16 % ökning av blodflödet) som svar på en 1,2 mV/mm 20 s stimulus (0,75 mA). (B) En större respons (21 % ökning av blodflödet) som svar på en stimulans på 1,4 mV/mm (1,0 mA). Förkortning: tACS = transkraniell växelströmsstimulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
7. Beräkning av det elektriska fältet
- Mät skillnaden i utsignalen från de två intrakraniella elektroderna med hjälp av skillnaden i halvvågen (en cykel) av de två registrerade sinusvågorna (de två övre spåren i figur 4). Dividera denna skillnad (mV) med avståndet mellan de två elektroderna (mm, här ~4 mm men direkt mätt i varje enskilt fall) för att komma fram till fältstyrkan (mV/mm)3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa resultat visas i figur 4, figur 5 och figur 6. Figur 4 visar ett exempel på de fyra kanalerna med de två intrakraniella inspelningselektroderna på de övre kanalerna och CBF-svaren på de nedre kanalerna. tACS är symmetrisk över skallen, men i allmänhet är den intrakraniella fältresponsen något asymmetrisk för applicerade växelströmmar, där den ena sidan visar en större respons än den andra (figur 4). CBF-svaret på tACS elektrisk stimulering3 är i allmänhet fasiskt vid högre amplituder (dvs. 0,75-2,0 mA, figur 4B) och mer konstant vid lägre amplituder (0,5-0,75 mA, figur 4A). Eftersom CBF-registreringarna (med antingen LSI- eller LD-mätningar) är brusiga och visar spontana fluktuationer, vid lägre amplituder, räknade vi i genomsnitt 5-10 epoker av tACS för att hjälpa till att minska de spontana fluktuationerna (Figur 4).
Figur 5 visar det cerebrala blodflödessvaret med hjälp av laserfläckavbildning. Den övre vänstra bilden visar en osubtraherad vy, medan de efterföljande bilderna till vänster är den direkta utmatningen från laserfläckavbildningsenheten. Bilderna till höger är skillnadsbilder som jämför före och efter stimuleringen. Den mellersta bilden till höger visar den diffusa skillnaden i cerebralt blodflöde som orsakas av stimuleringen. Grafen uppe till höger visar ett intresseområde mellan de stimulerande elektroderna med en tydlig ökning av intensiteten under stimuleringstiden.
Figur 5: Laserspeckelskallavbildning av det cerebrala blodflödet bilateralt under tACS vid 1,0 mA med en serie bilder som visar omfattningen av cerebral blodflödesförbättring. Den övre vänstra bilden visar en färgbild av musskallen vid baslinjen. skalstreck = 5 mm. Den övre högra serien visar responsen på 1,2 mV/mm stimulering över tid; Lägg märke till det ganska bullriga området av intresse bland bilderna. De vänstra bilderna är direkta färgflödesbilder från laserfläckavbildningen. De övre färgbilderna är före stimuleringen, de mellersta bilderna är under toppen av stimuleringen och de nedre bilderna är efter återgången till baslinjen. De rätta bilderna är differensbilder (med baslinjen subtraherad) som visar den diffusa karaktären hos den ökade CBF som svar på stimuleringen, vilket kan noteras jämnt i hela cortex (rött i mittenbilden, +15%); Den efterföljande återgången till baslinjen visas i de nedre bilderna. Färgskalestapeln visar förändringar på ±15 % skillnad. Förkortning: tACS = transkraniell växelströmsstimulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6A visar en jämförelse av det cerebrala blodflödessvaret som en funktion av ålder, med ett signifikant ökat svar hos de yngre djuren. Figur 6B visar att detta särskilt gäller för de större strömmarna, för vilka de yngre djuren visar en mycket mer robust respons än de äldre djuren.
Figur 6: Cerebrala blodflödessvar . (A) Förändringar i hjärnans blodflöde som en funktion av musens ålder. Notera den signifikant större responsen hos de yngre djuren (12-14 veckor) än hos de äldre djuren (28-33 veckor). (B) Dessa skillnader sträcker sig också till de högre strömnivåerna av tACS-stimulering; Vid 1,5 och 2,0 mA finns det faktiskt ett mycket större cerebralt blodflödessvar hos de yngre djuren. Det statistiska testet som användes var en icke-parametrisk jämförelse (rangsumma; n = 13 representativa experiment), med ett resultat på p < 0,005 för skillnaderna mellan de yngre och äldre grupperna. Förkortningar: tACS = transkraniell växelströmsstimulering; CBF = cerebralt blodflöde. Klicka här för att se en större version av denna figur.
CBF-svaret baserat på tACS-frekvensen kan också bedömas, med frekvensen som varierar från 5-6 Hz till 40 Hz, vilket används i många kroniska stimuleringsstudier; det maximala CBF-svaret inträffar vid 10-20 Hz.
Detta är de första resultaten av 13 experiment som utvärderade både en tACS-stimulator med konstant ström och en laserspeckelavbildningsenhet med möss i två olika åldersgrupper (12-14 veckor jämfört med 28-33 veckor). Dessa data visar på betydande förbättringar jämfört med de resultat som visas av Turner et al.3. I kliniska prover (dvs. människor) är den möjliga fältstyrkan mycket liten (dvs. <0,2-0,5 mV/mm) på grund av begränsningar och obehag i hårbotten, medan 1-5 mV/mm hos gnagare vanligtvis har uppskattats vara en aktiv, tolerabel respons (Figur 5).
Dessa resultat inkluderar de känsligare CBF-svaren från mindre betydande institut (figur 5), inklusive de transienta CBF-svaren på tACS. Figur 4 visar responsen på tACS vid användning av dubbla intrakraniella elektroder för att mäta den direkta hjärnresponsen (genom att mäta elektriska fältgradienter), såväl som små och stora CBF-svar. Vi experimenterar för närvarande med tACS med låg fältstyrka och jämför vår föredragna musmodell av Alzheimers sjukdom (CVN-AD modell15) med kontrolldjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll fokuserar på in vivo, bedövad mätning av CBF-svaret som en biomarkör för att uppskatta hjärnans svar på tES14. Långsiktiga biomarkörer för tES-svaret inkluderar histologiska behandlingseffekter, såsom förebyggande av eller förändringar i amyloid plackbildning (dvs. med gammastimulering vid 40 Hz i flera AD-modeller)16,17,18,19, men kortsiktiga biomarkörer är också till hjälp för att uppskatta de omedelbara fysiologiska effekterna och för att beräkna en dos-responskurva 3. Samma protokoll kan också användas för kronisk tES-stimulering över skallen, men de stimulerande trådarna skulle behöva dirigeras till en bekväm, intermittent anslutning för vaken stimulering.
Det första kritiska steget i protokollet innebär att bibehålla den låga impedansen hos de bilaterala stimulerande elektroderna och mäta denna impedans med varje stimuleringsepok. Den låga impedansen kan uppnås genom att använda tillräckligt med ledande pasta, isolering över skallen och mineralolja för eventuella borrhål (för att förhindra alternativa vägar in i kraniet). Vi har provat flera versioner av både kommersiella och hemmagjorda stimulerande elektroder, och det hemmagjorda tillvägagångssättet möjliggör mer kontroll över impedansen. En konstantströmsstimulator är avgörande för reproducerbarheten över elektroderna. Ytterligare kritiska steg inkluderar att upprätthålla DC-registreringarna med minimal drift över tid på uppmätta avstånd i hjärnan på ett fast djup för att uppskatta det intrakraniella fältet i hjärnbarken, samt att bedöma det cerebrala blodflödet med hjälp av antingen laserdopplersonder eller det laserfläckbaserade avbildningssystemet.
För samtidig mätning av den elektriska fältstyrkan och intrakraniella elektriska fält har vi också lagt till mikroelektrodinsättningstekniken för laserspeckelavbildningsanordningen med hjälp av vinklade manipulatorer. Laserspeckelanordningen möjliggör en mer omfattande bild av hela kraniet, medan laserdopplersonderna är mycket fokala och kanske inte ger representativa mätningar, särskilt direkt över ett blodkärl.
Även om dessa mer invasiva experiment utförs på sövda möss, är vår plan att utföra antingen schemalagd eller sluten slinga tACS på vakna djur i den nedre änden av stimuleringsamplituden (dvs. 0,5-1,0 mA; 1-3 mV/mm fältstyrka). Även om klinisk tES vanligtvis har utförts med hudelektroder, är stimuleringsnivån kraftigt begränsad av hudbiverkningar och huvudvärk till ~2 mA 4. Motsvarande elektroder hos människor skulle vara subgaleala elektroder med mindre direkt hudstimulering.
Jämfört med att använda hudmonterade elektroder är det lättare att påvisa förbättringar hos strokepatienter, till exempel genom att använda on-demand-stimulering med koordinerade implanterade vagusnervstimulerande elektroder och armaktivitet20. Faktum är att användningen av någon form av implanterad elektrod visar konsekventa och reproducerbara behandlingseffekter från dag till dag; Dessutom kan stimuleringen appliceras när som helst (dvs. inte på schemalagd basis, utan i förhållande till aktivitet), biverkningarna kan minskas när de kan förutsägas eller induceras, och stimuleringen kan förlängas så länge som behövs (dvs. månader till år). Detta är till exempel fallet för alla behandlingar med djup hjärnstimulering vid Parkinsons sjukdom, för vilka långtidsimplantation är både mycket genomförbar och väl tolererad.
Ett annat alternativ för en implanterad skallelektrod skulle kunna vara subgaleal stimulering (som vi utför på gnagare); Detta har faktiskt föreslagits för långtidsövervakning av epilepsi22,23. Subgaleal stimulering är mer fokuserad på skallen och hjärnan, kan eliminera många biverkningar av hudstimulering, kan tillåta ett bredare spektrum av strömmar (och därmed intrakraniella elektriska fältstorlekar) att användas, är reproducerbar från dag till dag (som alla implanterade elektroder) och visar låg impedans (dvs. 500 Ω jämfört med 5-10 KΩ för hudelektroder). När det gäller kronisk tES-stimulering finns det därför flera tES-alternativ som vanligtvis implementeras hos gnagare, och kliniskt kan det vara avgörande att ha en testbar, fysiologisk biomarkör för att möjliggöra behandlingseffekter under längre tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av följande anslag (till D.A.T.): NIA RO1 AG074999, NIA R21AG051103, VA I21RX002223 och VA I21 BX003023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pads | HenryShein | 112-6131 | |
| Baby mineral oil | Johnson & Johnson | ||
| BD 1 mL syringe | Becton Dikinson | REF 305699 | |
| C3 Flat Surface Electrodes | Neuronexus | ||
| C57BI mice | from NIH colonies | ||
| Copper skull electrods | In house preparation | ||
| Digidata 1440, Clampex | Axon Instruments | ||
| Dumont #5 forceps | FST | #5 | |
| Dumont #7 forceps curved | Dumont | RS-5047 | |
| Eye ointment | Major | LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter instrument Co. | Model P-87 | |
| Forceps 11.5 cm slight curve serrated | Roboz | RS-8254 | |
| Intramedic needle 23 G | Becton Dikinson | REF 427565 | |
| KCl 1 M | In house preparation | ||
| Laser Doppler Probes | Moor Instruments | 0.46 mm laser doppler probes | |
| Laser Speckle Imaging Device | RWD | RFLSI-ZW | |
| Micro curette 13 cm | FST | 10080-05 | |
| Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm | Roboz | RS-5914 | |
| Mouse anesthesia fixation | Stoelting | ||
| Neuroconn-DS | Neurocare | DC-Stimulator Plus | |
| PhysioSuite Monitoring | Kent Scientific | ||
| Q-tips | Fisherbrand | 22363167 | |
| Saline 0.9% NaCl solution | Baxter | 281322 | |
| Sensicam QE | PCO Instruments | ||
| Software | Axon Instruments Clampex | ||
| Surgical glue | Covetrus | 31477 | |
| Surgical tape | 3M Transpore | T9784 |
References
- Bestmann, S., Walsh, V.
- Bikson, M., et al. Rigor and reproducibility in research with transcranial electrical stimulation: An NIMH-sponsored workshop. Brain Stimulation. 11 (3), 465-480 (2018).
- Turner, D. A., Degan, S., Galeffi, F., Schmidt, S., Peterchev, A. V. Rapid, dose-dependent enhancement of cerebral blood flow by transcranial AC stimulation in mouse. Brain Stimulation. 14 (1), 80-87 (2020).
- Shah, S., Chhatbar, P. Y., Feld, J. A., Feng, W. Integrating tDCS into routine inpatient rehabilitation practice to boost post-stroke recovery. Brain Stimulation. 13 (4), 953-954 (2020).
- Voroslakos, M., et al. Direct effects of transcranial electric stimulation on brain circuits in rats and humans. Nature Communications. 9 (1), 483 (2018).
- Alekseichuk, I., Mantell, K., Shirinpour, S., Opitz, A. Comparative modeling of transcranial magnetic and electric stimulation in mouse, monkey, and human. Neuroimage. 194, 136-148 (2019).
- Tavakoli, A. V., Yun, K. Transcranial alternating current stimulation (tACS) mechanisms and protocols. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 214 (2017).
- Yavari, F., Jamil, A., Mosayebi Samani, M., Vidor, L. P., Nitsche, M. A. Basic and functional effects of transcranial electrical stimulation (tES)-An introduction. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 85, 81-92 (2018).
- Wachter, D., et al. Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat. Experimental Neurology. 227 (2), 322-327 (2011).
- Han, C. H., et al. Hemodynamic responses in rat brain during transcranial direct current stimulation: A functional near-infrared spectroscopy study. Biomedical Optics Express. 5 (6), 1812-1821 (2014).
- Ayata, C., Lauritzen, M. Spreading depression, spreading depolarizations, and the cerebral vasculature. Physiological Reviews. 95 (3), 953-993 (2015).
- Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation. Science. 337 (6095), 735-737 (2012).
- Hoang, K. B., Cassar, I. R., Grill, W. M., Turner, D. A. Biomarkers and stimulation algorithms for adaptive brain stimulation. Frontiers in Neuroscience. 11, 564 (2017).
- Turner, D., A, D. S., Hoffmann, U., Galleffi, F., Colton, C. A. CVN-AD Alzheimer's mice show premature reduction in neurovascular coupling in response to spreading depression and anoxia compared to aged controls. Alzheimer's and Dementia. 17 (7), 1109-1120 (2021).
- Colton, C. A., et al. mNos2 deletion and human NOS2 replacement in Alzheimer disease models. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 73 (8), 752-769 (2014).
- Castano-Prat, P., et al. Altered slow (<1 Hz) and fast (beta and gamma) neocortical oscillations in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease under anesthesia. Neurobiology of Aging. 79, 142-151 (2019).
- Etter, G., et al. Optogenetic gamma stimulation rescues memory impairments in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 10 (1), 5322 (2019).
- Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
- Martorell, A. J., et al. Multi-sensory gamma stimulation ameliorates Alzheimer's-associated pathology and improves cognition. Cell. 177 (2), 256-271 (2019).
- Dawson, J., et al. Vagus nerve stimulation paired with rehabilitation for upper limb motor function after ischaemic stroke (VNS-REHAB): A randomised, blinded, pivotal, device trial. Lancet. 397 (10284), 1545-1553 (2021).
- Hacker, M. L., et al. Deep brain stimulation in early-stage Parkinson disease: Five-year outcomes. Neurology. 95 (4), e393-e401 (2020).
- Duun-Henriksen, J., et al. A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings. Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).
- Haneef, Z., et al. Sub-scalp electroencephalography: A next-generation technique to study human neurophysiology. Clinical Neurophysiology. 141, 77-87 (2022).
