Het kuikenembryobrein gebruiken als model voor in vivo en ex vivo analyses van menselijk glioblastoomcelgedrag

Summary

Kuikenembryo's worden gebruikt voor het bestuderen van menselijke glioblastoom (GBM) hersentumoren in ovo en in ex vivo hersenschijfcoculturen. GBM-celgedrag kan worden geregistreerd door time-lapse-microscopie in ex vivo co-culturen en beide preparaten kunnen op het experimentele eindpunt worden geanalyseerd door gedetailleerde 3D-confocale analyse.

Abstract

Het kuikenembryo is een ideaal modelsysteem geweest voor de studie van de ontwikkeling van gewervelde dieren, met name voor experimentele manipulaties. Het gebruik van het kuikenembryo is uitgebreid voor het bestuderen van de vorming van menselijk glioblastoom (GBM) hersentumoren in vivo en de invasiviteit van tumorcellen in het omliggende hersenweefsel. GBM-tumoren kunnen worden gevormd door injectie van een suspensie van fluorescerend gelabelde cellen in de E5-middenhersenen (optisch tectum) ventrikel in ovo.

Afhankelijk van de GBM-cellen vormen zich willekeurig compacte tumoren in de ventrikel en in de hersenwand en dringen groepen cellen het hersenwandweefsel binnen. Dikke weefselsecties (350 μm) van vaste E15-tecta met tumoren kunnen immunogekleurd worden om te onthullen dat binnendringende cellen vaak langs bloedvaten migreren wanneer ze worden geanalyseerd door 3D-reconstructie van confocale z-stackbeelden. Levende E15 middenhersenen en voorhersenen plakjes (250-350 μm) kunnen worden gekweekt op membraaninzetstukken, waar fluorescerend gelabelde GBM-cellen kunnen worden geïntroduceerd op niet-willekeurige locaties om ex vivo co-culturen te bieden om celinvasie te analyseren, die ook langs bloedvaten kan optreden, gedurende een periode van ongeveer 1 week. Deze ex vivo co-culturen kunnen worden gevolgd door widefield of confocale fluorescentie time-lapse microscopie om het gedrag van levende cellen te observeren.

Co-gekweekte plakjes kunnen vervolgens worden gefixeerd, immunogekleurd en geanalyseerd door confocale microscopie om te bepalen of de invasie al dan niet plaatsvond langs bloedvaten of axonen. Bovendien kan het co-cultuursysteem worden gebruikt voor het onderzoeken van potentiële cel-celinteracties door aggregaten van verschillende celtypen en kleuren op verschillende precieze locaties te plaatsen en celbewegingen te observeren. Medicamenteuze behandelingen kunnen worden uitgevoerd op ex vivo culturen, terwijl deze behandelingen niet compatibel zijn met het in ovo-systeem . Deze twee complementaire benaderingen maken gedetailleerde en nauwkeurige analyses mogelijk van menselijk GBM-celgedrag en tumorvorming in een zeer manipuleerbare gewervelde hersenomgeving.

Introduction

In vitro studies van kankercelgedrag worden vaak gebruikt om potentiële mechanismen te ontleden die werken tijdens het meer complexe gedrag dat wordt waargenomen tijdens tumorvorming en celinvasie in in vivo xenograftmodellen. Bijvoorbeeld, met glioblastoom (GBM), hebben in vitro studies mechanismen blootgelegd van hoe L1CAM mogelijk werkt tijdens tumorvorming en herseninvasie in een nieuw kuikenembryo xenograft hersentumormodel 1,2,3,4,5. Hoewel in vitro en in vivo experimenten elkaar op nuttige manieren aanvullen, laten ze een aanzienlijke kloof achter in hoe de resultaten kunnen worden gecorreleerd. Mechanistische analyses van GBM-celmotiliteit op een schaal zijn bijvoorbeeld een zeer kunstmatige situatie, en in vivo xenograftmodellen kunnen alleen statische tijdpunt- of eindpuntanalyses van tumorvorming en celgedrag onthullen. In vivo studies met knaagdieren of kuikenembryo's lenen zich niet gemakkelijk voor het monitoren van celgedrag, terwijl de cellen hersenweefsel binnendringen in deze xenograftmodellen. Niettemin heeft het xenograftmodel van het kuikenembryo aangetoond dat het adhesie-eiwit L1CAM een stimulerende rol speelt in het invasieve vermogen van menselijke T98G GBM-cellen ^2,5.

Een geschikte oplossing voor dit probleem kan worden bereikt door zowel in vivo als in vitro methoden te overbruggen met behulp van een organotypisch hersenschijfcultuurmodel, een ex vivo model genoemd. In dit ex vivo model kan levend hersenweefsel tot een paar weken op een dikte van enkele honderden micron worden gehouden, waardoor het mogelijk is om kankercellen te implanteren, hun gedrag in het werkelijke weefsel in de loop van de tijd te observeren en vervolgens een meer gedetailleerde markeranalyse uit te voeren op het eindpunt van het experiment.

Een populaire organotypische plakkweekmethode is geweest om een enkele honderden micron dikke hersenschijf bovenop een doorschijnend of transparant poreus membraan te kweken, waardoor het weefsel wordt blootgesteld aan lucht, maar voedingsmedia het weefsel van onder het membraan kunnen ondersteunen (zie Stoppini et ^al.6). Verschillende variaties van deze methode zijn gebruikt voor verschillende studies, waaronder het gebruik van verschillende media of verschillende membraaninzetstukken. Verschillende membraaninzetstukken omvatten een 30 mm diameter, poreuze (0,4 μm) membraaninzetstukken in een 35 mm kweekschal⁶, en celkweekinzetstukken (0,4 μm) voor 6-putplaten⁷. Verschillende media omvatten 50% MEM / HEPES + 25% warmte-geïnactiveerd paardenserum + 25% Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS)⁸, 50% gereduceerde serummedia + 25% paardenserum + 25% HBSS⁹, evenals andere. Als een doorschijnend of transparant membraan wordt gebruikt samen met fluorescerend gelabelde GBM-cellen, kunnen dergelijke culturen van onderaf worden afgebeeld met behulp van een omgekeerde widefield- of confocale fluorescentiemicroscoop 10,11,12,13,14,15.

Hoewel veel in vivo orthotopische hersentumor xenograft en ex vivo organotypische hersenschijfcultuurmodellen zijn vastgesteld met behulp van knaagdieren, zoals hierboven aangehaald, is het kuikenembryo (Gallus gallus) onderbenut voor deze doeleinden. Er is echter aangetoond dat het kuikenembryo kan worden gebruikt als een in vivo orthotopisch xenograftmodel voor de studie van zowel menselijke als rattenglioominvasie ^1,2,5. Xenogetransplanteerde cellen in kuikenembryohersenen hebben invasiepatronen vertoond die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in knaagdiermodellen, wat het gebruik van kuikenembryo's als een in vivo model voor GBM-tumorcelanalyse verder ondersteunt. Kuikenembryo's zijn ook goedkoop, kunnen gemakkelijker worden onderhouden dan knaagdieren (d.w.z. in hun eierschalen in een laboratoriumincubator) en zijn veel gemakkelijker om mee te werken, waardoor ze een aantrekkelijke optie zijn voor kortdurende in vivo GBM-studies. Een recent artikel heeft het gebruik van kuikenembryo hersenschijfculturen beschreven voor de vorming en groei van axonen tijdens de normale hersenontwikkeling waarbij de plakjes gedurende ten minste 7 dagen levensvatbaar waren¹⁶. Het gebruik van dergelijke kuikenembryo-hersenschijfculturen voor ex vivo analyse van GBM-celgedrag in een weefselomgeving ontbreekt echter. In dit artikel worden zowel de transplantatie van menselijke GBM-cellen en GBM-stamcellen (GSC's) in het vroege kuikenembryobrein in vivo, als de introductie van GBM-cellen op levende kuikenembryo-hersenschijfculturen ex vivo beschreven. Enkele representatieve voorbeelden van de resulterende tumoren en celinvasiepatronen verkregen uit deze preparaten worden ook gegeven.

Protocol

Er was geen goedkeuring of goedkeuring nodig aan de Universiteit van Delaware om dit werk uit te voeren.

1. GBM-celinjectie in kuikenoptisch tectum

1. Voorbereiding van GSC's en GBM-cellen voor injectie
   1. Cultuur GSC's in de media van het SGR (tabel 1). In cultuur gevestigde GBM-cellijnen in GBM-media (tabel 1).
   2. Spoel de cellen op platen met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en plaats 1 ml trypsine-oplossing in een schaal van 10 cm. Laat 2-3 minuten in een celkweekincubator staan totdat de cellen beginnen los te komen.
   3. Inactiveer de trypsine door 10 ml geschikte serumbevattende kweekmedia toe te voegen aan de schaal van 10 cm en maak de cellen los door op en neer te pipetteren. Plaats de celsuspensie in een conische centrifugebuis van 15 ml.
   4. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   5. Zuig de media uit de celkorrel met behulp van een wegwerpbare fijne glazen pipet die is bevestigd aan een zijarmkolf en vacuümpomp. Resuspendeer de cellen in geschikte groeimedia tot een concentratie van 10.000 cellen per microliter en plaats ze in een microfugebuis of kleine schroefbuis op ijs.
   6. Meng de cellen met een kleine hoeveelheid steriele 1% Fast Green FCF-kleurstof (gebruik een verhouding van 5 μL kleurstof/100 μL celsuspensie).
2. Injectie van GBM-cellen in E5 optisch tectum in ovo. Zie aanvullende figuur 1.
   1. Incubeer de bevruchte kippeneieren in een bevochtigde broedmachine, met het puntige uiteinde naar beneden gericht, bij 37,5 °C (de 1e dag van incubatie is embryonale dag 0 [E0]). Steriliseer op de 6e dag van incubatie (E5) de eierschaal door te spuiten met 70% ethanol.
   2. Gebruik een eierkaars, traceer langs de omtrek van het luchtruim boven het embryo met een potlood en bedek het omlijnde gebied met transparante tape.
   3. Knip met een gebogen schaar voorzichtig rond het getraceerde gebied, zorg ervoor dat u niet in de embryonale membranen of bloedvaten snijdt en gooi de bovenkant van de eierschaal weg.
   4. Plaats een paar druppels zoutoplossing of celkweekmedia op het luchtruimtemembraan om het nat te maken, zodat het gemakkelijk loslaat. Prik met een fijne tang voorzichtig het luchtruimtemembraan over de bovenkant van het embryo, verwijder het en lokaliseer het hoofd van het kuikenembryo.
   5. Gebruik een fijne tang om het transparante amnionmembraan dat het embryo onmiddellijk omringt vast te pakken om het hoofd zo te positioneren dat het optische tectum met cellen kan worden geïnjecteerd. Gebruik met één hand de fijne tang om het vruchtwater vast te houden om het hoofd op zijn plaats te houden tijdens het injectieproces. Zorg ervoor dat u de extra-embryonale bloedvaten in het chorioallantoïsche membraan op de dooier niet beschadigt.
      OPMERKING: De bovenstaande procedure vergt enige oefening om het heldere amnionmembraan dat het embryo intiem omringt efficiënt te kunnen grijpen, omdat het onzichtbaar is totdat het wordt gegrepen en getrokken. Oefen met een fijne tang om het heldere vruchtwater te pakken dat het embryo onmiddellijk omringt.
   6. Houd het hoofd stabiel door het vruchtwatermembraan vast te pakken met een fijne tang. Injecteer met behulp van een glazen micropipette en een pneumatische picopomp ongeveer 50.000 cellen in 5 μL geschikte celkweekmedia in het optische tectum (5 μL is ongeveer 1/2 van een gevulde micropipette).
      OPMERKING: Zie Cretu et ^al.1 voor een afbeelding van een E5-embryo dat is geïnjecteerd met GBM-cellen gemengd met kleurstof.
   7. Plaats een paar druppels van 50 mg / ml ampicilline bovenop het embryo.
   8. Bedek het gat in de bovenkant van de eieren met doorzichtige tape en laat in de luchtbevochtiger tot E15 voor dissectie.

2. Dissectie van hersengebieden van E15-embryo's

OPMERKING: De dissectie van E15-hersenen hier voor fixatie is vergelijkbaar met die beschreven in stap 8.2 voor levende hersenplakken, maar de dissectie hier hoeft niet te worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.

1. Knip de tape rond de bovenkant van de schaal weg, zodat u toegang krijgt tot het embryo.
2. Onthoofd het embryo in de nek en plaats het hoofd in een schaal van 10 cm met steriele calcium- en magnesiumvrije Tyrodes (CMF Tyrode's) oplossing. Zie aanvullende figuur 2.
3. Verwijder met een fijne tang de huid die de hersenen bedekt om de onderliggende dura mater te onthullen. Verwijder de vormende schedelbotten aan de linker- en rechterkant van de hersenen. De vormende schedelbotten bedekken nog niet het grootste deel van de hersenen.
4. Gebruik voorzichtig een fijne puntige tang om door de hersenvliezen boven het centrum van de hersenen te scheuren en schil het naar elke kant om de hersenen bloot te leggen.
5. Gebruik een gebogen tang om de hersenen van onderaf te scheppen en voorzichtig uit de holte te trekken.
6. Ontleed de hersenen in zijn delen: voorhersenen, tecta, cerebellum.
7. Verwijder de bovenliggende pia mater van de tecta met een fijne tang. Merk op dat de pia zich gemakkelijk scheidt van de tecta, maar niet van de voorhersenen of het cerebellum. Verwijder de pia van de voorhersenen door deze aan te raken of op een klein stukje filterpapier te rollen.
8. Plaats de ontleedde hersengebieden in een kleine schaal.
9. Plaats de hersengebieden voor fixatie in een 24-well plaatput en fixeer in 2% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer. Laat minstens 24 uur staan bij 4 °C.
10. Spoel na fixatie het weefsel in 3x PBS gedurende ten minste 1 uur voordat het in agar wordt ingesloten.

3. Inbedden en snijden van geoogste hersengebieden

1. Verwarm een oplossing van 3,5% agar en 8% sucrose in PBS tot het gesmolten is en houd het op smelttemperatuur.
2. Gebruik een gebogen tang als een schep, pak voorzichtig het optische tectum of het voorhersenengebied van het kuikenembryo op en dep lichtjes op filterpapier om extra vloeistof te verwijderen om de hechting van de agar aan het buitenste hersenoppervlak te garanderen.
3. Gebruik een steriele transferpipet om de mal te vullen met een agaroplossing.
   OPMERKING: Een eenvoudige mal kan worden gemaakt door aluminiumfolie te vormen rond een object van de juiste grootte, zoals kleine rechthoekige metalen trillende weefselsnijdersblokken.
4. Plaats het hersengebied in agar en laat de agar volledig stollen.
5. Verwijder de aluminiumfolie rond de ingebedde hersenen en trim overtollige agar rond de zijkanten met behulp van een scheermesje of scalpel.
6. Plaats een druppel cyanoacrylaatlijm op het roestvrijstalen vierkant van de snijbak, plaats het agaroseblok met de hersenen op de lijm en laat de lijm 1 minuut hechten. Plaats de lade in de trillende tissuesnijder, draai de lade vast en vul de lade met voldoende PBS om de bovenkant van het agarblok te bedekken.
7. Snijd de hersenschijfjes op een trillende weefselsnijder met een dikte van 350 μm met behulp van een stalen scheermesje.
8. Terwijl hersenschijfjes worden gesneden en vrij in de snijbak drijven, gebruikt u een spatel om de plakjes op te scheppen en uit de schaal te verwijderen. Schuif het gedeelte voorzichtig van de spatel en in een gelabelde petrischaal van 10 cm met PBS, zodat de secties vrij zweven.
   OPMERKING: De agar rond de hersenschijf kan losraken als de hersenen niet voldoende zijn afgeveegd met filterpapier om overtollige vloeistof te verwijderen voordat deze wordt ingesloten. Als dit gebeurt, kan het hersenweefsel voorzichtig uit de gestolde agar worden verwijderd en opnieuw worden ingebed na een goede blotting van overtollige vloeistof.

4. Immunostaining hersenschijfjes met tumorcellen

1. Met behulp van een stereomicroscoop uitgerust met epifluorescentie, screent u individuele plakjes in de schaal van 10 cm één voor één op de aan- of afwezigheid van tumorcellen.
2. Bereid een voldoende hoeveelheid fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Triton X-100 en 5% normaal geitenserum (PBSTG) (zie tabel 1) voor immunostaining en spoel de plakjes die immunokleurig moeten zijn.
3. Half-fill putten in een 24-well plaat die zal worden gebruikt voor het kleuren van hersensecties met PBS.
4. Snijd de hoeken van agar rond de hersenschijfjes af met de rand van een spatel of een scalpel en plaats ze voorzichtig in de putjes met PBS.
5. Zuig de PBS aan en vervang deze door 350 μL primaire antilichaamkleuringsoplossing in PBSTG (bijv. 2 μg/ml UJ127 in PBSTG).
6. Incubeer gedurende 24 uur in een koude ruimte met zachte agitatie, zodat de plak vrij in de put kan bewegen.
7. Verwijder na 24 uur de primaire antilichaamoplossing en spoel 3 x 1 uur met PBSTG in een koude ruimte met roeren.
8. Wanneer u klaar bent met spoelen, incubeer dan in 350 μL/put secundaire antilichaamkleuringsoplossing in PBSTG (bijv. 1/200 verdunning van biotine-GAM in PBSTG). Incubeer gedurende 20 uur in een koude kamer met agitatie.
   OPMERKING: Als u de tertiaire stap achterwege laat en bij deze stap incubeert met het fluorochroombevattende secundaire antilichaam, moet u af en toe afdekken ter bescherming tegen licht tijdens de incubatie en vervolgens doorgaan naar stap 4.11.
9. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en spoel 3 x 1 uur in PBSTG in een koude ruimte met roeren.
10. Verwijder de PBSTG en incubeer in de tertiaire oplossing (bijv. 1:250 verdunning van Alexa Fluor 647 streptavidin in PBSTG). Indien gewenst, kleurt u de kernen in deze stap door 0,1 μg / ml bisbenzimide aan het mengsel toe te voegen. Incubeer gedurende 20 uur in een koude kamer met agitatie.
11. Verwijder de tertiaire oplossing en spoel 3 x 1 uur in PBSTG in een koude ruimte met roeren.
12. Laat in PBS totdat u klaar bent om op microscoopglaasjes te monteren.

5. Plakjes monteren op microscoopglaasjes

1. Bereid zoveel microscoopglaasjes voor als er secties zijn om te monteren.
2. Plaats voor elke dia een 50 mm lange strook van 10 mil (254 μm) dik vinyl elektrische tape op een stuk parafilm.
3. Gebruik een vierkante perforator van 1 cm x 1 cm en pons een gat door het midden van de elektrische tape en parafilm.
4. Trek de tape van de parafilm en plaats deze bovenop de microscoopglaas, zodat er ruimte overblijft voor labeltape op de dia.
5. Plaats met behulp van een micropipet een of twee druppels anti-fade montagemedia in het vierkante gat in het midden van de elektrische tape.
6. Gebruik een gebogen spatel om het gewenste trillende weefselsnijdergedeelte van de PBSTG op te tillen en voer vocht grondig af met een schoon laboratoriumdoekje of stuk filterpapier.
7. Raak de rand van de plak aan op de druppel van de houder en gebruik een andere spatel om de sectie voorzichtig in het montagemedium te schuiven.
8. Bedek het gedeelte met nog een paar druppels montagemiddel en plaats voorzichtig een afdekplaat van 24 mm x 30 mm (# 1,5 dikte) bovenop de sectie en het montant.
9. Sluit de randen van de coverslip af met nagellak om deze op zijn plaats te houden.

6. Confocale microscopie van vaste hersenplakken

1. Gebruik widefieldfluorescentie om fluorescerende tumoren in de gemonteerde hersenschijf te vinden met behulp van de juiste objectieve lens en filterset (s).
   OPMERKING: Sommige tumoren kunnen vrij groot zijn en zijn gemakkelijk zichtbaar met het 4x-objectief, terwijl afzonderlijke cellen mogelijk het 10x-objectief vereisen.
2. Schakel over op confocale microscopie met behulp van een geschikte objectieflens, laser(s), pinhole-grootte en detectorinstellingen. Om dit protocol te volgen, gebruikt u een 20x objectief (numeriek diafragma [N.A.] = 0.75) voor routinematige beeldvorming en een 60x olieobjectief (N.A. = 1.40) voor beeldvorming met hoge resolutie.
3. Stel boven- en ondergrenzen in van de z-as en stapgrootte (voor de specifieke situatie volgens de instructies van de confocale microscoopfabrikant) voor het verkrijgen van optische secties. Schaf een z-stack van optische secties aan.
4. Gebruik de confocale microscoopsoftware om een 3D-volumeweergave van de tumor te maken, volgens de instructies van de fabrikant.

7. Sferoïde voorbereiding

1. Het maken van poly (2-hydroxyethylmethacrylaat) (poly-HEMA) platen
   1. Maak een oplossing van 10 μg/ml poly-HEMA in 95% ethanol en bedek 35 mm petrisalen (of celkweekschalen) met 1 ml van deze oplossing.
   2. Laat de gerechten op een wip zitten die een nacht bij kamertemperatuur onbedekt is om een coating van het schoteloppervlak te ontwikkelen.
      OPMERKING: Het oplosmiddel zal verdampen en een doorschijnende coating op de schaal achterlaten, die ongelijk kan lijken, maar dit heeft geen invloed op het vermogen om celsferoïden te maken.
   3. Steriliseer na het drogen de open schalen onder UV-licht gedurende 1 uur in een bioveiligheidskast. Vervang de deksels na sterilisatie. De gecoate schalen zijn nu klaar voor gebruik.
2. Fluorescerende DiD-kleuring voor time-lapse microscopie
   OPMERKING: Deze sectie is voor het kleuren van afzonderlijke cellen met DiD-fluorescerende kleurstof om te worden gebruikt om sferoïden te maken, wat de visualisatie van celmotiliteit optimaliseert voor live time-lapse-beeldvorming.
   1. Suspensie van de cellen in een serumvrij kweekmedium.
   2. Voeg 5 μL DiD-bouillon/ml celsuspensie toe en meng voorzichtig door pipetteren. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
   3. Centrifugeer de geëtiketteerde celsuspensie bij 800 × g bij 5 °C gedurende 5 minuten.
   4. Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in warme media om te spoelen.
   5. Herhaal deze centrifugatie en spoel stap nog twee keer af.
      OPMERKING: Ga desgewenst verder met stap 7.3.6 om direct na dit proces sferoïden te maken.
3. Celsferoïden maken
   1. Warm 0,25% trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing op tot 37 °C.
   2. Kweek GSC's in GSC media¹⁷ (tabel 1) en U-118 maligne gloima (MG) cellen in U-118 kweekmedium (zie tabel 1). Gebruik een confluente schaal van 10 cm voor de bereiding van één 35 mm plaat met sferoïden. Voeg bFGF (10 ng/ml eindconcentratie) en TGF-α (20 ng/ml eindconcentratie) groeifactoren toe aan GSC's in eerste instantie en vervolgens om de 3 dagen.
      OPMERKING: De cellen die in de huidige studie werden gebruikt, waren groene GSC15-2 / K72, groene GSC16-4 / K72, rode U-118 / L1LE / mCherry2x en rode U-118 / 1879 / mCherry2x. Eén plaat sferoïden zou voldoende moeten zijn voor twee 6-well platen van hersenplakken op membraaninzetstukken.
   3. Spoel de cellen op de platen met steriele PBS en plaats 1 ml trypsine-oplossing op een schaal van 10 cm. Plaats in de celkweekincubator gedurende 2-3 minuten totdat de cellen beginnen los te komen.
   4. Inactiveer de trypsine door 10 ml geschikte serumbevattende kweekmedia toe te voegen aan de schaal van 10 cm en maak de cellen los door op en neer te pipetteren. Plaats de celsuspensie in een conische centrifugebuis van 15 ml.
   5. Pellet de cellen door centrifugeren bij 800 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   6. Zuig de media uit de celkorrel en resuspensie de cellen in 10 ml media.
   7. Plaats 2 ml celsuspensie op elke schaal met poly-HEMA-coating van 35 mm en voeg 2 ml meer geschikte media toe om 4 ml totale media per gerecht te verkrijgen. Als u GSC's gebruikt, voegt u groeifactoren toe.
   8. Incubeer de cellen in een celincubator totdat de aggregaten een grootte van 100-200 μm bereiken, wat 1-2 dagen kan zijn, afhankelijk van de dichtheid van de cellen die zijn verguld.

8. Levende kuiken embryo hersendissectie en vibrerende weefselsnijder snijden

1. Voorbereiding op dissectie
   1. Bereid een 6-well polyester membraaninzetplaat met 1 ml hersenschijfkweekmedia (zie tabel 1) onder de membraaninzet.
   2. Steriliseer het werkgebied en gereedschap met 70% ethanol.
   3. Plaats de 6-well insertplaat op ijs terwijl de dissectie plaatsvindt.
   4. Bereid 100 ml trilweefselsnijder snijmedia (tabel 1) en plaats op ijs.
   5. Plaats een injectieflacon met 4% laagsmeltende agarose in PBS in een waterbad totdat deze smelt tot een vloeistof (ongeveer 50 °C).
   6. Vul de vibrerende tissue slicer tub met ijs.
2. Aseptische E14/15 kuiken embryo hersendissectie
   1. Gebruik een eierkaars, traceer langs de omtrek van de luchtzak boven het E14- of E15-embryo met een potlood en bedek het omlijnde gebied met transparante tape.
   2. Knip met een gebogen of fijne schaar voorzichtig rond het getraceerde gebied, zorg ervoor dat u niet in het embryomembraan of de bloedvaten snijdt en gooi het bovenste stuk van de schaal weg.
   3. Verwijder met een gebogen tang het luchtruimtemembraan over de bovenkant van het embryo en lokaliseer het hoofd van het kuikenembryo.
   4. Onthoofd het embryo en plaats het hoofd in een schaal van 10 cm met koude steriele CMF-oplossing. Zie aanvullende figuur 2.
   5. Verwijder met een steriele fijne tang de huid die de hersenen bedekt om de onderliggende dura mater te onthullen. Verwijder de vormende schedelbotten aan de linker- en rechterkant van de hersenen. De vormende schedelbotten bedekken nog niet het grootste deel van de hersenen.
   6. Gebruik voorzichtig een fijne puntige tang (# 5 of # 55) om door de hersenvliezen boven het centrum van de hersenen te scheuren en schil deze naar elke kant om de hersenen te ontbloten.
   7. Schep met een fijne gebogen tang de hersenen van de onderkant naar voren en trek hem voorzichtig uit de holte.
   8. Ontleed de hersenen in zijn drie hoofddelen: voorhersenen, middenhersenen (optische tecta), cerebellum. Raadpleeg indien nodig een atlas van de ontwikkeling van kuikens.
   9. Verwijder de bovenliggende pia mater van de tecta met een fijne tang.
      OPMERKING: De pia scheidt zich gemakkelijk van de tecta, maar niet van de voorhersenen of het cerebellum. De pia kan uit de voorhersenen worden verwijderd door deze aan te raken of op steriel gaas te rollen.
   10. Leg de ontleedde hersengebieden in een kleine steriele schaal op ijs.
3. Inbedding en snijding van de hersenen
   1. Gebruik een gebogen tang als een schep, pak voorzichtig het optische tectum of het voorhersenengebied op en dep lichtjes op steriel gaas om extra vloeistof te verwijderen om hechting van de agarose aan het buitenste hersenoppervlak te garanderen.
   2. Vul de mal met behulp van een steriele transferpipet met laagsmeltende agarose. Bereid een eenvoudige mal voor door aluminiumfolie te vormen rond een object van de juiste grootte. Het kleine rechthoekige metalen vibrerende weefselsnijblok wordt routinematig gebruikt als object. Zie aanvullende figuur 3.
   3. Plaats het hersengebied snel in agarose en laat het stollen (ongeveer 4-5 min) op ijs.
      OPMERKING: De hersenen kunnen naar de bodem van de mal zinken voordat de agarose verhardt. Als dit gebeurt, wacht dan 1 minuut om de agar te laten uitzetten en plaats vervolgens het hersengebied in de agarose. Probeer het hersengebied direct in het midden van de agarose op te hangen.
   4. Verwijder de aluminiumfolie rond de ingebedde hersenen in de gestolde agarose en snijd overtollige agarose langs de zijkanten af met een steriel scheermesje of scalpel.
   5. Plaats een druppel cyanoacrylaatlijm op het roestvrijstalen vierkant van de snijschaal / -schaal, plaats het agaroseblok met de hersenen en laat de lijm 1 minuut hechten. Plaats de schaal/schaal in de trilzaksnijder, draai de lade vast en vul deze met snijmedia om de bovenkant van het agaroseblok te bedekken.
   6. Snijd de secties op een trillende weefselsnijder op 250-350 μm met een saffiermes, waarvan is gemeld dat het resulteert in minder schade aan levend weefsel dan een stalen scheermesje.
   7. Terwijl hersenschijfjes worden gesneden en vrij in de snijbak drijven, gebruikt u een steriele spatel om de plak op te scheppen en uit de schaal te verwijderen. Schuif het gedeelte voorzichtig van de spatel en op een membraaninzetstuk met behulp van een andere steriele spatel.
      OPMERKING: Normaal gesproken kunnen twee of drie hersenschijfjes op elke membraaninzet worden geplaatst, indien gewenst. De agarose rond de hersenschijf kan losraken als de hersenen niet voldoende zijn afgeveegd met steriel gaas om overtollige vloeistof te verwijderen. Als dit na voldoende blotting voor het insluiten nog steeds gebeurt, pak dan voorzichtig het plakje op zonder de omringende agarose en schuif het op de membraaninzet.
   8. Plaats de 6-well plaat van hersenplakken op membraaninzetstukken in de celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO₂.
   9. Gebruik de dag na het plateren een steriele Pasteur-pipet om de media van onder de insert te zuigen (er zijn openingen in de zijkanten van de inserts om een pipet toegang te geven tot de media eronder). Voeg 1 ml vers gesneden media toe aan elk putje onder het membraaninzetstuk. Blijf daarna om de dag van media veranderen.
   10. Wacht een paar dagen totdat de hersenschijfjes stevig aan de membraaninzetstukken hechten en enigszins lijken af te vlakken. Dit is een teken dat de plakjes levensvatbaar zijn en klaar voor de introductie van GBM-cellen.

9. GBM-celintroductie op hersenplakken

1. Sferoïde methode
   1. Nadat de celsferoïden 150-200 μm groot zijn geworden, gebruikt u een micropipet van 20 μL die is ingesteld op 5 μL om één tot meerdere sferoïden uit hun kweekschaal te verwijderen. Zie aanvullende figuur 3.
   2. Verwijder de media voorzichtig met sferoïden op de gewenste hersenschijf.
      OPMERKING: De celsferoïden moeten zichtbaar zijn in de pipetpunt. Door een duidelijke pipetpunt te gebruiken, zijn ze gemakkelijker te zien in de punt. Als de sferoïde van de hersenschijf valt wanneer de vloeistof vrijkomt, moet een met ethanol gesteriliseerde wimper die op een dunne houten applicatorstok is gelijmd, worden gebruikt om de sferoïde voorzichtig terug op de hersenschijf te duwen.
   3. Laat de sferoïden gedurende 2-5 dagen op de hersenschijfjes groeien.
      OPMERKING: De beperking hier lijkt de uiteindelijke afbraak van bloedvaten en hersencellen in de plak te zijn. Gedegradeerde bloedvaten verschijnen als discontinue ballen in de plak wanneer ze worden gekleurd voor laminine.
2. Biopsie ponsmethode
   1. Laat de hersenschijfjes hechten door af te vlakken op de membraaninzet (kan 2-5 dagen duren in cultuur).
   2. Ontdooi de celmatrix op ijs.
   3. Sluit in de bioveiligheidskast voor celkweek een steriele biopsiepons met een diameter van 1 mm aan op een vacuümaspiratorbuis.
   4. Raak de hersenschijf voorzichtig aan met de biopsiepons om een gat van 1 mm in het midden van de hersenschijf te maken.
      OPMERKING: Het weefsel in de biopsiepons wordt door het vacuüm in de pons geaspireerd.
   5. Bereid een celmatrixsuspensie voor door een 60% -70% confluente schaal van 10 cm cellen te trypsiniseren en opnieuw te suspenderen in 10 ml media; meng vervolgens 1 ml van die suspensie met 100 μL matrix.
   6. Plaats met behulp van een micropipet van 20 μL 1 μL van het celmatrixmengsel in elk gat in de hersenschijfjes.
   7. Nadat de plaatsing van het celmengsel is voltooid, plaatst u de schaal met hersenplakken met ingebedde cellen terug in de couveuse en laat u de matrix stollen en de cellen mogelijk de omliggende hersenschijf binnendringen.

10. Widefield fluorescentie time-lapse microscopie

1. Plaats verwijderbare tape rond de rand van de 6-putplaat om verdamping van de media te voorkomen, waardoor er aan één kant een kleine opening overblijft voor gasuitwisseling.
2. Plaats de platen in een aangepaste kweekkamer op een instelbaar geautomatiseerd podium op een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop.
   OPMERKING: De kamer werd op atmosferische omstandigheden van 5% CO₂ en 95% lucht gehouden met behulp van een gasinjectieregelaar en de temperatuur werd op 37 °C gehouden met een warmeluchttemperatuurregelaar en een temperatuurgeregelde fase-inzetstuk. Zie Fotos et ^al.18 voor details over het systeem dat hier wordt gebruikt.
3. Maak met behulp van geschikte microscoopbesturingssoftware een time-lapse-acquisitieschema dat eens per 10 minuten gedurende 20 uur fluorescerende beelden van de interessegebieden verzamelt.
   OPMERKING: Als een groen fluorescerend label wordt gebruikt in cellen (bijv. Groen fluorescerend eiwit [GFP]), gebruik dan de minimale hoeveelheid blauw excitatielicht die nodig is om de cellen te visualiseren om fototoxiciteit te voorkomen. Rode (bijv. mCherry) en verrode (bijv. DiD) labels lijken dit potentiële probleem niet te hebben vanwege excitatie met een langere golflengte.

11. Immunostaining hersenschijfjes na time-lapse microscopie

OPMERKING: Dit immunostaining-protocol is geoptimaliseerd voor het kleuren van bloedvaten met laminine en kernen met bisbenzimide. Gebruik geschikte antilichamen voor het gewenste molecuul of de gewenste moleculen van belang.

1. Zuig de media van onder de membraaninzet met behulp van een Pasteur-pipet en plaats 1 ml 2% PFA in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer onder de insert en 1 ml bovenop de insert om de hersenschijf te bedekken. Laat de plakjes een nacht vastzetten bij 4 °C.
2. Verwijder het fixatief van onder de membraaninzet en eventuele fixatieve achterblijvers op de hersenschijf (fixatief heeft de neiging om door het membraaninzetstuk in de put eronder te lekken).
3. Verwijder de insert met plakjes uit de 35 mm put en leg ze in een grotere plastic schaal.
4. Bereid een plaat met 24 putten voor door 350 μL PBS toe te voegen aan zoveel putjes als er hersenschijfjes zijn (één plak / put bij immunostaining).
   1. Verwijder met een dunne spatel voorzichtig de agarose rond de hersenschijf zonder de hersenschijf los te maken van de membraaninzet. Zorg ervoor dat de agarose gemakkelijk loskomt van de buitenrand van de hersenschijf. Zo niet, laat de agarose dan vastzitten aan de hersenschijf.
   2. Snijd met een scherp scalpel door het membraan rond de hersenschijf totdat het plakje met het onderliggende membraan vrij is van de rest van het inzetstuk. Pak het membraan op met de bijgevoegde hersenschijf, gebruik een fijne tang om het membraan te grijpen en plaats het in een put van de 24-putplaat in PBS.
5. Spoel de plakjes 3x met PBS gedurende 1 uur af in de koelruimte met constant zacht roeren of schommelen, zodat het plakje in de put beweegt.
6. Bereid tijdens het spoelen de primaire antilichaamoplossing voor.
   1. Verdun anti-laminine tot 2 μg/ml in PBSTG (zie tabel 1).
7. Verwijder de PBS uit de putjes en incubeer 's nachts in een primaire antilichaamoplossing in een koude kamer met zachte agitatie.
8. Na ten minste 20 uur incubatie, zuig de primaire antilichaamoplossing op en spoel de secties 3x gedurende 1 uur in PBSTG.
9. Bereid tijdens het spoelen de secundaire antilichaamoplossing voor.
   1. Verdun fluorescerend-GAM met het specifieke fluorochroom dat nodig is tot een verdunning van 1:200 in PBSTG, samen met een concentratie bisbenzimide van 0,1 μg/ml.
   2. Verwijder PBSTG en incubeer 's nachts in een koude kamer met agitatie in de fluorescerende secundaire antilichaamoplossing.
   3. Verwijder het secundaire antilichaam en spoel 2x meer dan 1 uur in PBSTG en 1x meer dan 1 uur in PBS.
   4. Laat in PBS totdat u klaar bent om op microscoopglaasjes (sectie 5) te monteren en te bekijken.

Representative Results

Hier worden meerdere figuren gepresenteerd om enkele representatieve resultaten te laten zien die werden verkregen door het uitvoeren van in vivo injecties in het optische tectum (figuur 1 en figuur 2), het kweken van levende hersenplakken en het beoordelen van hun levensvatbaarheid (figuur 3), het creëren van ex vivo hersenschijfculturen en het implanteren van fluorescerend gelabelde cellen met behulp van de biopsieponsmethode (figuur 4), het genereren van celsferoïden door cellen op poly-HEMA te kweken (figuur 5 ), het creëren van ex vivo hersenschijfcoculturen met celsferoïden en het registreren van het invasieve celgedrag met behulp van 4D confocale time-lapse microscopie (figuur 6), en het analyseren van invasief celgedrag van sferoïden ten opzichte van bloedvaten in vaste hersenschijfpreparaten (figuur 7 en figuur 8). Deze resultaten zijn geenszins uitputtend, maar bieden eerder goede voorbeelden van wat kan worden verkregen met behulp van het kuikenembryobrein als xenograftmodel voor menselijk GBM-onderzoek.

Figuur 1 toont enkele representatieve resultaten van tumoren die zich in vivo in het optische tectum vormden na de injectie van GSC's die GFP tot expressie brachten. GSC's hechten zich aan het ventriculaire oppervlak en vormen invasieve tumoren in de hersenwand. GSC's bevinden zich duidelijk in de buurt van bloedvaten en lijken erlangs te migreren. Films van roterende 3D-volumeweergaven van vaste en immunogekleurde plakjes in vivo GSC-tumoren worden gegeven in Supplementary Video S1, Supplementary Video S2, Supplementary Video S3 en Supplementary Video S4. In dit experiment werden vier kleuren gebruikt om vijf kenmerken te identificeren (groene GSC's, witte kernen, witte bloedvaten, blauw integrine alfa-6 en rood Sox2 of rood nestine).

Figuur 2 toont enkele representatieve resultaten van tumoren die zich in vivo in het optische tectum vormden na de injectie van GSC's die GFP tot expressie brachten gemengd met U-118/L1LE-cellen² die mCherry tot expressie brachten als gevolg van retrovirale vectortransductie. Deze experimenten onthulden dat toen deze tumoren zich vormden uit een gemengde celsuspensie, sortering plaatsvond zodanig dat GSC's zich in de periferie of het centrum bevonden, terwijl U-118-cellen een binnenkern of een buitenste cortex vormden, afhankelijk van de specifieke GSC-lijn.

Figuur 3 toont de levensvatbaarheidsresultaten van ex vivo hersenschijfculturen. Na 1 week in cultuur onthulden fixatie en immunostaining voor laminine veel intacte bloedvaten en de expressie van Sox2, die beide hier werden gebruikt om de levensvatbaarheid van de hersenschijf aan te tonen. Hieruit bleek dat hersenplakken van kuikenembryo's gedurende ongeveer 2 weken op membraaninzetstukken konden worden gekweekt en levensvatbaar bleven met normaal lijkende bloedvaten en transcriptiefactorexpressie.

Figuur 4 toont de resultaten van het introduceren van "pluggen" van rode U-118/L1LE/mCherry-cellen (gemengd met matrix) in ex vivo hersenplakken na het creëren van holtes in de plakjes met behulp van de biopsieponsmethode. U-118-cellen drongen duidelijk het hersenweefsel binnen, soms uitgebreid en vaak langs bloedvaten. De celinvasie was echter niet uniform rond de omtrek van de geïntroduceerde cellen. Bloedvaten leken soms ook beschadigd of afwezig in bepaalde plakjes, vermoedelijk als gevolg van het toegevoegde trauma van de stootmethode of de tijdsduur in cultuur. Hieruit bleek dat de biopsie pons/cel plug methode gebruikt kon worden om GBM cellen te introduceren op specifieke locaties in een gekweekte ex vivo hersenschijf, waarna de cellen de hersenschijf binnendringen.

Figuur 5 toont levende sferoïden in cultuur en verschillende voorbeelden van widefieldfluorescentie van levende GBM-celsferoïden die op ex vivo hersenplakken worden geïntroduceerd voor time-lapse-experimenten. Filmpjes van celinvasie van de sferoïden in de hersenschijf worden gegeven in Supplementary Video S5 en Supplementary Video S6 . Dit toonde aan dat celsferoïden een andere succesvolle methode zijn om GBM-cellen of GSC's te introduceren op specifieke locaties van een ex vivo hersenschijf, en invasief celgedrag kan worden gevolgd door widefield fluorescentiemicroscopie, hoewel de resolutie van individuele cellen slecht kan zijn.

Figuur 6 toont statische beelden van confocale time-lapse experimenten van live GSC16-4/GFP en U-118/L1LE/mCherry celinvasie in hersenplakken. Confocale z-stack beelden werden elke 10 minuten verkregen gedurende een periode van 20 uur in een multi-point time-lapse experiment. Filmpjes van celinvasie van de sferoïden in hersenplakken die in de loop van de tijd als confocale z-stacks zijn genomen, worden gepresenteerd in Supplementary Video S7, Supplementary Video S8, Supplementary Video S9, Supplementary Video S10 en Supplementary Video S11. Dit experiment toonde aan dat confocale time-lapse beeldvorming superieur was aan widefield fluorescentie voor het volgen van individueel celinvasief gedrag. De U-118/L1LE-cellen waren onder deze omstandigheden merkbaar invasiever dan de GSC's. Dit is zelfs duidelijk te zien in de statische beelden, waarbij de GSC's centraler worden geplaatst en de U-118-cellen meer verspreid zijn.

Figuur 7 toont verschillende voorbeelden van ex vivo hersenschijf/sferoïde preparaten, waarbij twee verschillende afzonderlijk gelabelde sferoïden (U-118/L1LE/mCherry sferoïden en GSC16-4/GFP sferoïden) op hersenplakken werden geplaatst, gedurende enkele dagen werden gekweekt en vervolgens gefixeerd, immunogekleurd voor laminine en in beeld gebracht door optische doorsnede op een confocale microscoop. Hieruit bleek dat beide celtypen de hersenschijf binnendrongen en langs bloedvaten reisden. Toen de verschillende soorten sferoïden dicht genoeg bij elkaar lagen om met elkaar in contact te komen, leek er weinig of geen invasie van het ene celtype in de sferoïde van het andere celtype te zijn, en de sferoïden bleven gescheiden.

Figuur 8 toont verschillende voorbeelden van ex vivo hersenschijf/sferoïde preparaten waarbij "mixed-cell type" sferoïden gegenereerd in cultuur met behulp van twee verschillend gelabelde celtypen (U-118/L1LE/mCherry gemengd met GSC16-4/GFP) op hersenplakken werden geplaatst, gedurende enkele dagen werden gekweekt en vervolgens werden gefixeerd, immunogekleurd voor laminine en in beeld gebracht door optische doorsnede op een confocale microscoop. Hieruit bleek dat de rode U-118/L1LE/mCherry-cellen uit de sferoïden migreerden en zich veel duidelijker verspreidden dan de groene GSC16-4/GFP-cellen, die de neiging hadden om in klonten in de buurt van het midden van de sferoïden te blijven. Bovendien werden U-118/L1LE/mCherry-cellen ook gekleurd met DiD, zodat de twee afzonderlijke labels (mCherry en DiD) direct konden worden vergeleken in de vaste ex vivo preparaten. Het DiD-label kon nog steeds worden gedetecteerd, zelfs in afzonderlijke cellen die de hersenschijf waren binnengedrongen; Dit was echter als intracellulaire puncta.

Figuur 1: Tumoren bij E15 als gevolg van injectie van GSC's in E5 optisch tectum in vivo. GSC's zijn groen vanwege GFP-expressie. GSC15-2-cellen worden weergegeven in de panelen A, C en E en GSC16-4-cellen worden weergegeven in de panelen B, D en F. (A) Lage vergrotingsweergave van het optische tectum met een tumor in de buurt van de ventrikel (V). Sox2-kleuring wordt weergegeven in rood, waardoor de meeste kernen van OT-cellen worden gekleurd. (B) Vergelijkbaar beeld met A, maar met GSC16-4-cellen die ook zijn gekleurd voor nestine in rood, die geel of wit in de afbeelding kunnen lijken als gevolg van kleurmenging en beeldbelichting. OT-kernen lijken wit als gevolg van tegenkleuring met bisbenzimide. (C-F) Verschillende perspectieven van volume renders gegenereerd uit z-stacks met behulp van een 60x olie onderdompeling doelstelling. Celkernen lijken wit als gevolg van bisbenzimidekleuring en sommige lijken rood in panelen C en E als gevolg van immunostaining voor Sox2. Rode kleuring in panelen D en F is van kleuring voor nestin. Merk op dat als gevolg van "Alpha Blending" voor volumeweergaven in de confocale microscoopsoftware, kleuren niet overvloeien zoals ze zouden doen met behulp van een projectie met maximale intensiteit, en de meest voorkomende kleur overheerst en verdoezelt de minder intense kleur. Bloedvaten zijn wit gekleurd als gevolg van immunostaining voor laminine. GSC marker integrine alpha-6 kleuring wordt weergegeven in blauw, en verschijnt punctate op GSC oppervlakken. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergaven. Video's van rotaties van volumeweergaven in panelen C-F worden gepresenteerd in Aanvullende video S1, aanvullende video S2, aanvullende video S3 en aanvullende video S4. Schaalstaven = 500 μm (A,B). Afkortingen: GSCs = glioblastoma stamcellen; OT = optisch tectum; GFP = groen fluorescerend eiwit; BV = bloedvat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Tumoren bij E15 als gevolg van een mengsel van GSC's en U-118 GBM-cellen geïnjecteerd in E5 optisch tectum. GSC's zijn groen als gevolg van GFP-expressie en U-118 / L1LE-cellen zijn rood als gevolg van mCherry-expressie. GSC15-2 worden weergegeven in panelen A-D en GSC16-4 worden weergegeven in panelen E en F. (A) Confocale enkele z-vlak met lage vergroting van een gemengde celtumor (pijl) in de buurt van de ventrikel. Kernen zijn wit gekleurd met bisbenzimide. (B) Hogere vergroting (10x objectief) van tumor getoond in A met invasie van rode U-118-cellen in de OT nabij het ventriculaire oppervlak. (C) Een iets ander vlak van optische doorsnede dan dat in A met de tumor (pijl) dieper ingebed in de OT-wand. (D) Maximale projectie (20x objectief) van meerdere z-vlakken van de tumor in C met details van de gesorteerde cellen in de tumor. (E) Single z-plane beeld (20x objectief) van een gemengde tumor met GSC16-4-cellen, waaruit blijkt dat sortering in de tumor plaatsvond in een tegenovergesteld patroon van GSC15-2-cellen, waarbij de groene GSC's een dunne en gelijkmatige cortex rond de rode U-118-cellen creëerden. Het aanhechtingsgebied van de tumor aan de OT-wand wordt in dit z-vlak niet getoond. Let op het gebied van de tumor waar er een discontinuïteit is van de GSC-cortex met U-118 / L1LE-cellen die uitpuilen (pijl). Immunostaining voor L1CAM wordt weergegeven in blauw. (F) Dezelfde afbeelding als in E, maar toont alleen de groene GSC's en blauwe L1CAM-kleuring. Schaalstaven = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). Afkortingen: GSCs = glioblastoma stamcellen; OT = optisch tectum; GFP = groen fluorescerend eiwit; V = ventrikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Levensvatbaarheid van ex vivo optische tectum plakjes na 1 week in cultuur. E14 optische tectum plakjes werden gedurende 1 week gekweekt op membraaninzetstukken en vervolgens gefixeerd en immunogekleurd. In A en B zijn confocale beelden (10x objectief) te zien van een hersenschijf gekleurd voor kernen met bisbenzimide (A) en immunogekleurd voor laminine (B), die duidelijk normale, intacte bloedvaten laat zien die optisch in verschillende configuraties zijn gesneden op grond van de lamininekleuring. (C) Een confocaal beeld dat vergelijkbaar is met dat in de panelen A en B, waar kernen en lamininekleuring beide zichtbaar zijn. (D) Een confocale afbeelding met een hogere vergroting (60x olieobjectief) met details van nucleaire en lamininekleuring. (E) Maximaal projectiebeeld van confocale z-stack (20x objectief) van hersenschijf gekleurd voor Sox2-transcriptiefactor in rood en totale kernen met bisbenzimide in wit. Merk op dat de meeste kernen Sox2-kleuring vertonen, zoals in vivo weergegeven (zie figuur 1). Schaalstaven = 100 μm (A,B,C,E), 25 μm (D). Afkorting: P = pial surface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: U-118/mCherry cellen geplaatst in een ex vivo hersenschijf via de biopsie punch methode. Holtes werden gemaakt in hersenplakken met behulp van een 1 mm biopsiepons, en vervolgens werden rode U-118 / L1LE / mCherry-cellen gemengd met matrix geïmplanteerd als een "plug". Na enkele dagen werden de hersenplakken gefixeerd, immunogekleurd voor laminine en gemonteerd op dia's voor confocale microscoopanalyse. Panelen A en C tonen lage vergroting, confocale, enkele z-vlak beelden (4x objectief) van de resulterende "tumor" en omliggende cellen die de hersenschijf binnendrongen. (B) Een volumeweergave van een z-stack van het preparaat in paneel A bij een hogere vergroting (20x objectief), met uitgebreide invasie van U-118-cellen (pijl). (D) Afbeelding toont een vergelijkbare volumeweergave van het onderste deel van de uitgebreid binnendringende cellen die in paneel C worden getoond. Lamininekleuring wordt in het groen weergegeven, maar er zijn geen duidelijke bloedvaten zichtbaar. (E) Afbeelding toont een deel van een celplug en een groep cellen die de hersenschijf zijn binnengedrongen, samen met lamininekleuring voor bloedvaten in blauw. (F) Een hogere vergroting van de binnendringende cellen weergegeven in paneel E, en cellen zijn duidelijk te zien uitgelijnd langs bloedvaten (pijlen). Alle panelen tonen witte nucleaire tegenkleuring met bisbenzimide. Schaalstaven = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). De schaal voor de deelvensters B en D bevindt zich langs de volumerenderassen. Afkorting: OT = optic tectum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Levende celsferoïden in cultuur en widefield fluorescentiebeelden van levende GBM-cellen in ex vivo hersenplakken. In de panelen A en B worden fasecontrastbeelden getoond (met behulp van een 10x-objectief op een omgekeerde microscoop) van U-118 / L1LE GBM-cellen (A) en GSC's (B) die groeien als sferoïden (pijlen). Op de achtergrond van paneel A is de onscherpe oneffenheid van de poly-HEMA-coating te zien die op de celkweekschaal kan voorkomen. Getoond in panelen C-F zijn widefield fluorescentiebeelden van U-118 / L1LE-celsferoïden en binnendringende cellen (pijlen) tijdens een time-lapse-experiment om het live-gedrag van invasie in de ex vivo-plakjes te volgen (met behulp van een 20x-objectief op een aangepast time-lapse-microscoopsysteem¹⁸). In panelen C en E zijn de cellen gekleurd met de verrode fluorescerende membraankleurstof DiD, en in panelen D en F worden de cellen afgebeeld via hun rode mCherry-expressie. Schaalstaven = 100 μm. Video's van widefield fluorescentie time-lapse experimenten getoond in panelen C en D bevinden zich respectievelijk in Supplementary Video S5 en Supplementary Video S6. Afkortingen: GBM = glioblastoom; GSC's = GBM-stamcellen; S = sferoïde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Volumeweergavebeelden van confocale 4D-time-lapse van live GSC's en GBM-cellen. In alle panelen worden de eindpuntafbeeldingen getoond van vijf verschillende gemengde celsferoïde engraftments op afzonderlijke hersenplakken. Voor panelen A-E werden confocale z-stack beelden verkregen in stappen van 10 μm om de 10 minuten gedurende een periode van 20 uur. Preparaten omvatten hersenplakken met geïmplanteerde gemengde celsferoïden van rode U-118 / L1LE / mCherry-cellen en groene GSC16-4 / GFP-cellen. Confocale beelden werden genomen terwijl hersenplakken werden gekweekt op membraaninzetstukken in een 6-well plastic celkweekschaal met behulp van een extra lange werkafstand (ELWD) 20x objectieflens (0,45 NA), die de benodigde extra werkafstand bood. Volume renders werden gegenereerd met behulp van confocale microscoop software "Alpha Blending", die een schijnbaar 3D-effect geeft. Time-lapse-video's van deze confocale volumeweergaven in de loop van de tijd worden gepresenteerd in Aanvullende video S7, aanvullende video S8, aanvullende video S9, aanvullende video S10 en aanvullende video S11. Afkortingen: GBM = glioblastoom; GSC's = GBM-stamcellen; GFP = groen fluorescerend eiwit; NA = numeriek diafragma. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Confocale beelden van vaste hersenplakken met invasieve GBM-cellen van sferoïden van verschillende celtypen. Groene sferoïden waren samengesteld uit GSC16-4/GFP-cellen en rode sferoïden uit U-118/L1LE/mCherry-cellen. Getoond in panelen A-F zijn verschillende weergaven van hersenplakken, waarop meerdere rode en groene sferoïden gedurende enkele dagen werden gekweekt vóór fixatie en immunostaining voor laminine (blauw). Panelen A-C zijn van dezelfde OT-slice waar A werd genomen met een 4x objectief, en panelen B en C zijn hogere vergrotingsvolume renders (20x objectief) van cellen die de hersenschijf binnendrongen van twee van de sferoïden getoond in paneel A. Beide celtypen drongen duidelijk weefsel binnen langs bloedvaten. Paneel D toont een volumeweergave (20x objectief) van een ander hersensegment waar twee verschillende sferoïden zich dicht bij elkaar bevonden, en cellen van beide worden gezien die langs hetzelfde bloedvat migreren dat zich tussen hen bevindt (pijl). Paneel E is een volumeweergave met een hoge vergroting (60x olieobjectief) die onthult dat de groene cellen langs het buitenoppervlak van het bloedvat migreren, terwijl de rode cel in het bloedvat migreert (pijl). De inzet toont een enkele z-vlak optische sectie, waarbij de rode cel duidelijk omgeven is door blauwe kleuring van het bloedvat (pijl), en de groene cel zich duidelijk buiten het bloedvat bevindt. Schaalbalk in inzet = 50 μm. Paneel F toont een volumeweergave (10x objectief) van een voorhersenensegment met twee nauw tegenover elkaar geplaatste verschillend gekleurde sferoïden. Er vond weinig of geen celinvasie plaats van de ene sferoïde in de andere, en er bestond een scherpe grens tussen hen. Panelen A, B, C en E tonen ook witte nucleaire tegenkleuring met bisbenzimide. Schaalbalk = 500 μm (A). Schalen voor panelen B-F bevinden zich langs de volumerenderassen. Afkortingen: GBM = glioblastoom; GSC's = GBM-stamcellen; GFP = groen fluorescerend eiwit; OT = optisch tectum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Confocale beelden van vaste hersenplakken met invasieve GBM-cellen van gemengde celsferoïden en sferoïden gelabeld met DiD. Panelen A-D tonen volumeweergaven van hersenplakken die gemengde celsferoïden bevatten die zijn samengesteld uit groene GSC16-4 / GFP-cellen en rode U-118 / L1LE / mCherry-cellen. Talrijke rode U-118-cellen verspreidden zich van de sferoïden en drongen de hersenschijf in alle richtingen binnen, terwijl de groene GSC's zich niet verspreidden en op de centrale locaties van de sferoïden bleven. De panelen E en F tonen een ex vivo plakpreparaat met rode U-118/L1LE/mCherry-sferoïden, ook gelabeld met verrode membraankleurstof DiD (weergegeven als blauw). Na fixatie werd de plak immunogekleurd voor laminine in het groen. Het DiD-label was zichtbaar in rode bloedcellen als punctaatkleuring (pijlen) en was zelfs zichtbaar in cellen die zich vanuit de sferoïden langs bloedvaten hadden verspreid. Nucleaire tegenkleuring met bisbenzimide is in deze figuur niet weergegeven, zodat de andere kleuring duidelijker zichtbaar is. Schaalstaven = 100 μm (E,F). Afkortingen: GBM = glioblastoom; GSC's = GBM-stamcellen; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Medium/oplossing	Compositie
GSC-media	1:1 mengsel van DMEM/F12, 1% foetaal runderserum (FBS), 15 mM HEPES buffer, 2 mM L-glutamine, 100 μg/ml penicilline-streptomycine (pen/streptomycine), 2% B27 supplement zonder vitamine A en 2,5 μg/ml heparine.
GBM-media	DMEM (hoge glucose), 10% FBS, pen/streptokokken en 2 mM L-glutamine.
Fixatiebuffer	2% PFA in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer
Insluitmedium	3,5% agar en 8% sucrose in PBS
Pbstg	0,1% Triton X-100 + 5% normaal geitenserum (NGS) in PBS
U-118 MG celkweekmedium	DMEM + 10% FBS + pen/streptokokken + L-glutamine
brain slice cultuur media	50% MEM + 25% HBSS + 25% Paardenserum + B27 + pen/streptokokken + L-glut + 15 mM HEPES buffer
trillende weefselsnijder snijmedia	Medium 199 + pen/strep + 15 mM HEPES buffer

Tabel 1: Samenstelling van de media en buffers die in dit protocol worden gebruikt.

Aanvullende figuur 1: Injectie in E5 optisch tectum. (A) Nadat een gat in de eierschaal boven het luchtruim is gesneden en het membraan van de luchtruimte is bevochtigd met zoutoplossing of media, wordt het membraan met een fijne tang verwijderd. (B) Om cellen in het optische tectum te injecteren, wordt het amnion geknepen en vastgehouden met een fijne tang om het hoofd zo te positioneren dat het optische tectum toegankelijk is.  Vervolgens wordt de micropipette in het optische tectum ingebracht en worden er cellen onder druk in geïnjecteerd. (C) Na injectie van cellen worden enkele druppels ampicilline-oplossing bovenop het embryo toegevoegd met behulp van een spuit en een fijne naald. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Dissectie van E15-hersengebieden. (A) Na onthoofding wordt de E15-embryokop in een schaal met steriele CMF-oplossing geplaatst. (B) De huid boven de hersenen wordt vervolgens verwijderd met een fijne tang. (C ) De twee schedelbeenderen worden vervolgens verwijderd van de twee voorhersenen (FB) hemisferen. (D) Het bindweefsel dura wordt vervolgens voorzichtig verwijderd uit de omgeving van de voorhersenen (FB), het optische tectum en het cerebellum. (E) De hele hersenen worden vervolgens van het hoofd verwijderd door het voorzichtig van onderaf uit de hersenholte te scheppen met behulp van een gebogen tang. (F ) Getoond is het dorsale beeld van de gehele verwijderde hersenen met voorhersenen (FB), optisch tectum (OT) en cerebellum (CB). (G ) De geïsoleerde hersenen worden vervolgens ontleed in voorhersenen (FB), optische tectum (OT) hemisferen en cerebellum (CB) met behulp van een fijne schaar. (H ) Het delicate bindweefsel pia wordt vervolgens gemakkelijk verwijderd uit de optische tectum (OT) hemisferen met behulp van een fijne tang. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Inbedding en slicing E15 optisch tectum en plaatsing van celsferoïden. (A) Een oogdicht tectum wordt ondergedompeld in laagsmeltende agarose met behulp van een gebogen tang. (B) Nadat de agarose op ijs is uitgehard, wordt het blok met het optische tectum bijgesneden en op het roestvrijstalen voetstuk in de snijschaal/-bak gelijmd. (C) Nadat de lijm is opgedroogd, wordt de snijschaal/-schaal in de klauwplaat van de trillende weefselsnijder geplaatst en gevuld met koude snijmedia.  Plakjes worden vervolgens met het saffiermes uit het ondergedompelde weefselblok gesneden.  Gesneden plakjes drijven in de schaal/schaal en kunnen worden verwijderd met een spatel.  (D) Gesneden plakjes worden uit de schaal/schaal verwijderd en direct op membraaninzetstukken met onderliggende plakkweekmedia in een meerputplaat geplaatst. (E) Nadat celsferoïden zijn gekweekt op met poly-HEMA gecoate schalen, wordt een sferoïde in een minimale hoeveelheid media uit de schaal verwijderd met behulp van een micropipettor van 20 μL. (F) De geïsoleerde sferoïde wordt vervolgens rechtstreeks op de hersenschijf geplaatst in de minimale media. (G) Als de sferoïde van de hersenschijf valt als gevolg van de stroom van de media, kan deze terug op de hersenschijf worden geduwd met behulp van een wimper die op een houten applicatorstok is gelijmd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video S1: Video van weergave met een hoog vergrotingsvolume van een kleine GSC15-2-tumor bij E15. GSC's zijn groen vanwege GFP-expressie. Video komt overeen met figuur 1C en toont GSC15-2 cellen. De video toont rotatie van een volumeweergave gegenereerd uit een z-stack met behulp van een 60x olie-onderdompelingsobjectief. Celkernen lijken wit als gevolg van bisbenzimidekleuring en sommige lijken rood als gevolg van immunokleuring voor Sox2. Merk op dat als gevolg van "Alpha Blending" voor volumeweergaven in de confocale microscoopsoftware, kleuren niet overvloeien zoals ze zouden doen met behulp van een projectie met maximale intensiteit, en de meest intense kleur overheerst en verdoezelt de minder intense kleur. Bloedvaten zijn wit gekleurd als gevolg van immunostaining voor laminine. GSC marker integrine alpha-6 kleuring wordt weergegeven in blauw en verschijnt punctate op groene GSC oppervlakken. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S2: Video van weergave van het hoge vergrotingsvolume van de kleine GSC16-4-tumor bij E15. GSC's zijn groen vanwege GFP-expressie. Video komt overeen met figuur 1D en toont GSC16-4-cellen. De video toont rotatie van een volumeweergave gegenereerd uit een z-stack met behulp van een 60x olie-onderdompelingsobjectief. Celkernen lijken wit als gevolg van bisbenzimidekleuring en sommige GSC's lijken rood als gevolg van immunostaining voor nestine. Merk op dat als gevolg van "Alpha Blending" voor volumeweergaven in de confocale microscoopsoftware, kleuren niet overvloeien zoals ze zouden doen met behulp van een projectie met maximale intensiteit, en de meest intense kleur overheerst en verdoezelt de minder intense kleur. Bloedvaten zijn wit gekleurd als gevolg van immunostaining voor laminine. GSC marker integrine alpha-6 kleuring wordt weergegeven in blauw en verschijnt punctate op groene GSC oppervlakken. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S3: Video van weergaven met een hoog vergrotingsvolume van kleine GSC15-2-tumor bij E15. GSC's zijn groen vanwege GFP-expressie. Video komt overeen met figuur 1E en toont GSC15-2 cellen. De video toont rotatie van een volumeweergave gegenereerd uit een z-stack met behulp van een 60x olie-onderdompelingsobjectief. Celkernen lijken wit als gevolg van bisbenzimidekleuring en sommige lijken rood als gevolg van immunokleuring voor Sox2. Merk op dat als gevolg van "Alpha Blending" voor volumeweergaven in de confocale microscoopsoftware, kleuren niet overvloeien zoals ze zouden doen met behulp van een projectie met maximale intensiteit, en de meest intense kleur overheerst en verdoezelt de minder intense kleur. Bloedvaten zijn wit gekleurd als gevolg van immunostaining voor laminine. GSC marker integrine alpha-6 kleuring wordt weergegeven in blauw en verschijnt punctate op groene GSC oppervlakken. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S4: Video van weergaven met een hoog vergrotingsvolume van kleine GSC16-4-tumoren bij E15. GSC's zijn groen vanwege GFP-expressie. Video komt overeen met figuur 1F en toont GSC16-4 cellen. De video toont rotatie van een volumeweergave gegenereerd uit een z-stack met behulp van een 60x olie-onderdompelingsobjectief. Celkernen lijken wit als gevolg van bisbenzimidekleuring en sommige lijken rood als gevolg van immunostaining voor nestine. Merk op dat als gevolg van "Alpha Blending" voor volumeweergaven in de confocale microscoopsoftware, kleuren niet overvloeien zoals ze zouden doen met behulp van een projectie met maximale intensiteit, en de meest intense kleur overheerst en verdoezelt de minder intense kleur. Bloedvaten zijn wit gekleurd als gevolg van immunostaining voor laminine. GSC marker integrine alpha-6 kleuring wordt weergegeven in blauw en verschijnt punctate op groene GSC oppervlakken. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S5: Video van levende GBM-cellen in ex vivo hersenschijf. Video komt overeen met figuur 5C en toont breedveldfluorescentiebeelden van U-118 / L1LE-celsferoïden en binnendringende cellen tijdens een time-lapse-experiment om het live-gedrag van invasie in de ex vivo-plak te volgen (met behulp van een 20x-objectief op een aangepast time-lapse-microscoopsysteem). De U-118/L1LE-cellen waren gekleurd met de verrode fluorescerende membraankleurstof DiD. Beelden werden verkregen met een monochrome camera. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S6: Video van levende GBM-cellen in ex vivo hersenschijf. Video komt overeen met figuur 5D en toont breedveldfluorescentiebeelden van U-118 / L1LE-celsferoïden en binnendringende cellen tijdens een time-lapse-experiment om het live-gedrag van invasie in de ex vivo-plak te volgen (met behulp van een 20x-objectief op een aangepast time-lapse-microscoopsysteem). De cellen werden in beeld gebracht via hun rode mCherry-expressie. Beelden werden verkregen met een monochrome camera. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S7: Video van volumeweergavebeelden van confocale 4D-time-lapse van live GSC's en GBM-cellen. Video komt overeen met figuur 6A. Confocale z-stack beelden werden verkregen met stappen van 10 μm om de 10 minuten gedurende een periode van 20 uur. Het preparaat was van een hersenschijf met geïmplanteerde gemengde celsferoïden van rode U-118/L1LE/mCherry-cellen en groene GSC16-4/GFP-cellen. Confocale beelden werden genomen terwijl de hersenschijf werd gekweekt op een membraaninzetstuk in een 6-well plastic celkweekschaal met behulp van een ELWD 20x objectieflens (0,45 NA), die de benodigde extra werkafstand bood. De volumeweergave werd gegenereerd met behulp van de confocale microscoopsoftware "Alpha Blending", die een schijnbaar 3D-effect geeft. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. De video kan het beste worden waargenomen door de schuifregelaar voor videovoortgang in de videospeler handmatig heen en weer te slepen om de celbeweging te observeren in plaats van de videospeler op zijn normale lage snelheid te laten doorgaan. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S8: Video van volume render beelden van confocale 4D time-lapse van live GSCs en GBM cellen. Video komt overeen met figuur 6B. Confocale z-stack beelden werden verkregen met stappen van 10 μm om de 10 minuten gedurende een periode van 20 uur. Het preparaat was van een hersenschijf met geïmplanteerde gemengde celsferoïden van rode U-118/L1LE/mCherry-cellen en groene GSC16-4/GFP-cellen. Confocale beelden werden genomen terwijl de hersenschijf werd gekweekt op een membraaninzetstuk in een 6-well plastic celkweekschaal met behulp van een ELWD 20x objectieflens (0,45 NA), die de benodigde extra werkafstand bood. De volumeweergave werd gegenereerd met behulp van de confocale microscoopsoftware "Alpha Blending", die een schijnbaar 3D-effect geeft. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. De video kan het beste worden waargenomen door de schuifregelaar voor videovoortgang in de videospeler handmatig heen en weer te slepen om de celbeweging te observeren in plaats van de videospeler op zijn normale lage snelheid te laten doorgaan. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S9: Video van volumeweergavebeelden van confocale 4D-time-lapse van live GSC's en GBM-cellen. Video komt overeen met figuur 6C. Confocale z-stack beelden werden verkregen met stappen van 10 μm om de 10 minuten gedurende een periode van 20 uur. Het preparaat was van een hersenschijf met geïmplanteerde gemengde celsferoïden van rode U-118/L1LE/mCherry-cellen en groene GSC16-4/GFP-cellen. Confocale beelden werden genomen terwijl de hersenschijf werd gekweekt op een membraaninzetstuk in een 6-well plastic celkweekschaal met behulp van een ELWD 20x objectieflens (0,45 NA), die de benodigde extra werkafstand bood. De volumeweergave werd gegenereerd met behulp van de confocale microscoopsoftware "Alpha Blending", die een schijnbaar 3D-effect geeft. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. De video kan het beste worden waargenomen door de schuifregelaar voor videovoortgang in de videospeler handmatig heen en weer te slepen om de celbeweging te observeren in plaats van de videospeler op zijn normale lage snelheid te laten doorgaan. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S10: Video van volume render beelden van confocale 4D time-lapse van live GSCs en GBM cellen. Video komt overeen met figuur 6D. Confocale z-stack beelden werden verkregen met stappen van 10 μm om de 10 minuten gedurende een periode van 20 uur. Het preparaat was van een hersenschijf met geïmplanteerde gemengde celsferoïden van rode U-118/L1LE/mCherry-cellen en groene GSC16-4/GFP-cellen. Confocale beelden werden genomen terwijl de hersenschijf werd gekweekt op een membraaninzetstuk in een 6-well plastic celkweekschaal met behulp van een ELWD 20x objectieflens (0,45 NA), die de benodigde extra werkafstand bood. De volumeweergave werd gegenereerd met behulp van de confocale microscoopsoftware "Alpha Blending", die een schijnbaar 3D-effect geeft. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. De video kan het beste worden waargenomen door de schuifregelaar voor videovoortgang in de videospeler handmatig heen en weer te slepen om de celbeweging te observeren in plaats van de videospeler op zijn normale lage snelheid te laten doorgaan. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video S11: Video van volume render beelden van confocale 4D time-lapse van live GSCs en GBM cellen. Video komt overeen met figuur 6E. Confocale z-stack beelden werden verkregen met stappen van 10 μm om de 10 minuten gedurende een periode van 20 uur. het preparaat omvatte een hersenschijf met geïmplanteerde gemengde celsferoïden van rode U-118 / L1LE / mCherry-cellen en groene GSC16-4 / GFP-cellen. Confocale beelden werden genomen terwijl de hersenschijf werd gekweekt op een membraaninzetstuk in een 6-well plastic celkweekschaal met behulp van een ELWD 20x objectieflens (0,45 NA), die de benodigde extra werkafstand bood. De volumeweergave werd gegenereerd met behulp van de confocale microscoopsoftware "Alpha Blending", die een schijnbaar 3D-effect geeft. Micronschalen worden weergegeven langs de randen van de volumeweergave. De video kan het beste worden waargenomen door de schuifregelaar voor videovoortgang in de videospeler handmatig heen en weer te slepen om de celbeweging te observeren in plaats van de videospeler op zijn normale lage snelheid te laten doorgaan. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussion

Kritieke stappen in het protocol voor de injectie van cellen in de ventrikel van de middenhersenen (optisch tectum) omvatten het niet beschadigen van de bloedvaten in het chorioallantoïsche membraan in het ei of rond het embryo voor en tijdens de injectie, hoewel het amnionmembraan onmiddellijk rond het embryo voorzichtig kan worden getrokken en vastgehouden om het hoofd te positioneren bij het injecteren van de cellen in de middenhersenen. Het amnion is relatief taai en kan met een fijne tang worden getrokken om het hoofd te positioneren en stabiel te houden met één hand, voor de injectie van cellen met de andere hand in het optische tectum, de grote, ronde structuur in het midden van de hersenen. Over het algemeen varieert de levensvatbaarheid van geïnjecteerde embryo's van 25% tot 75%, afhankelijk van onbekende factoren, en vrijwel elk embryo dat overleeft, bevat ten minste een kleine tumor in het optische tectum. Kritieke stappen bij het genereren van levensvatbare hersenplakken omvatten het vlekken van het weefsel van overtollige vloeistof, zodat de agarose zich tijdens het snijden aan de hersenen hecht en om weefsel en plakjes koud te houden totdat ze op het membraan worden geplaatst. Omdat verschillende celtypen sferoïden verschillend vormen (in snelheid en grootte), moeten de vergulde celdichtheid op poly-HEMA-platen en de tijdsduur voor het oogsten van sferoïden voor elk celtype worden geoptimaliseerd.

Het werk hier is niet onderworpen aan een formele longitudinale studie van de levensvatbaarheid van hersenschijven. Yang et al. gebruikten kuikenembryo hersenschijfculturen vergelijkbaar met de hier gebruikte culturen en toonden een goede levensvatbaarheid van de plakjes gedurende ten minste 7 dagen¹⁶. Eerder werk toonde aan dat wanneer OT-weefsel in suboptimale media werd bewaard, veel pyknotische kernen in het weefsel verschenen, die niet voorkwamen in de plakjes in het werk hier. Bovendien, wanneer plakjes degenereren in suboptimale omstandigheden, fragmenteren de bloedvaten en verschijnen ze als rijen laminine-positieve bolletjes (niet weergegeven). Hoewel de levensvatbaarheid hier dus niet is gecontroleerd met methoden zoals elektrofysiologie of actieve caspase-3-expressie, verscheen hier geen van de indicatoren van celdood die werden gezien onder suboptimale kweekomstandigheden.

De OT is gericht op in vivo hersentumorexperimenten omdat het het gemakkelijkst geïnjecteerde gebied is met de grootste ventrikel. Op E5, de laatste dag dat het embryo klein genoeg is om boven op de dooier toegankelijk te blijven, moeten injecties in een ventrikel worden gemaakt, omdat alle hersengebieden niets meer zijn dan een dunne ventriculaire zone. Niettemin resulteren deze injecties met succes in ingebedde tumoren met cellen die het hersenparenchym binnendringen. Soms worden resulterende tumoren gevonden in de voorhersenen of het cerebellum, maar dit komt niet vaak voor. Ex vivo plakjes E15 optisch tectum zijn hier voornamelijk gebruikt voor experimenten, zodat de ex vivo co-cultuur resultaten kunnen worden gecorreleerd met de in vivo injectie-experimenten. Voorhersenenplakken zijn echter ook geschikt en hebben een groter oppervlak en een zeer dunne ventrikel in vergelijking met het optische tectum, waardoor de voorhersenen meer geschikt kunnen zijn voor ex vivo co-culturen die niet worden gecorreleerd met in vivo injecties.

Hier is aangetoond dat in vivo injecties, gevolgd door weefselfixatie, vibrerende weefselsnijderssecties en immunostaining voor laminine en andere markers, resulteerden in hogeresolutiebeelden van GBM-cellen en GSC's in hersenweefsel in de nabijheid van bloedvaten. De mogelijkheid om de onderlinge relaties tussen tumorcellen en bloedvaten te bepalen, werd aanzienlijk vergemakkelijkt door 3D-volumeweergaven te maken van z-stapels confocale optische secties met behulp van de confocale software en de instructies van de fabrikant. Time-lapse beeldvorming met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie van GFP-, mCherry- en DiD-gelabelde cellen was mogelijk; migrerende cellen die zich in de nabijheid van de zeer fluorescerende sferoïden bevonden, werden echter soms verduisterd door de "gloed" van de sferoïde. Dit ongewenste effect kan enigszins worden geminimaliseerd door de belichtingstijden voor het verzamelen van widefield-afbeeldingen zorgvuldig aan te passen. Time-lapse beeldvorming met behulp van confocale z-stacks in de loop van de tijd (4D) elimineerde de onscherpe gloed van de sferoïden en resulteerde in scherp gedefinieerde migrerende cellen met een donkere achtergrond. Dit werd niet beschreven in het protocol, maar werd op dezelfde manier uitgevoerd als widefield time-lapse imaging, die werd uitgevoerd terwijl hersenplakken zich op de transparante membraaninzetstukken in een 6-well plastic plaat bevonden. Hoewel confocale time-lapse beeldvorming resulteert in duidelijk duidelijkere beelden van individuele cellen en hun gedrag, is een multi-point time-lapse experiment dat z-stacks van 10 z-vlakken / punt verzamelt, met intervallen van 10 minuten over een periode van 20 uur, een uitgebreid gebruik van de scankopgalvanometers. Omdat dit de levensduur van de galvanometers aanzienlijk zou kunnen verkorten, wordt deze methode oordeelkundig gebruikt.

Hoewel het kuikenembryosysteem zeer geschikt is voor zowel in vivo injectie als ex vivo co-cultuur experimenten die GBM celgedrag onderzoeken, zijn er verschillende beperkingen aan dit modelsysteem. Zoals met elk xenograftsysteem, is de omgeving waarin menselijke cellen worden geïmplanteerd niet het menselijk brein, maar GBM-celgedrag lijkt dat na te bootsen in knaagdiermodellen en bij menselijke patiënten. Na het uitvoeren van in vivo injectie-experimenten op E5, worden tumoren normaal gesproken gedurende 10 dagen gevormd, tot E15. Dit is duidelijk niet genoeg tijd om alle aspecten van tumorigenese en celinvasie te bestuderen. Het is hier echter aangetoond dat solide tumoren zich vormen in het hersenparenchym, cellen interageren en zich herschikken binnen de tumor, en significante herseninvasie vindt zowel langs bloedvaten als diffuus plaats binnen deze relatief korte periode. Een andere beperking van het in vivo kuikenembryosysteem is dat het niet geschikt is voor medicamenteuze of andere behandelingen vanwege de grote dooier en de extra-embryonale bloedsomloop die werkt tijdens de ontwikkeling van kuikenembryo's. Topische vloeibare medicamenteuze behandelingen zouden resulteren in een zeer variabele en onbekende concentratie in de hersenen als gevolg van diffusie weg van het embryo in de veel grotere dooiermassa. Evenzo zou intraveneuze injectie van geneesmiddelen in de zeer delicate extra-embryonale bloedsomloop lekken of diffunderen uit de bloedvaten en ook resulteren in onbekende concentraties in de hersenen. Dit is een van de belangrijkste redenen dat de ex vivo slice culture-methode werd aangenomen - zodat niet alleen celgedrag kon worden waargenomen en gevolgd via time-lapse-microscopie, maar ook zodat behandelingen die succesvol zijn geweest in het veranderen van GBM-celgedrag in een schaal⁴ konden worden getest in een meer relevante hersenweefselomgeving.

De ontwikkeling van het orthotopische hersentumormodelsysteem van het kuikenembryo wordt gezien als een belangrijke aanvulling op de systemen en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor de studie van GBM-tumorvorming en invasief celgedrag. Bevruchte kippeneieren zijn waarschijnlijk gemakkelijk beschikbaar in de meeste gebieden, ze zijn goedkoop in vergelijking met knaagdieren, er zijn geen kosten voor dierverzorging, de embryo's zijn zeer veerkrachtig en resistent tegen infecties (d.w.z. het meeste werk wordt gedaan op een bench), de embryo's zijn zeer manipuleerbaar en kunnen worden gekweekt in schaalloze cultuur¹⁹, en kuikenembryo's worden niet beschouwd als gewervelde dieren en vereisen dus geen IACUC-goedkeuring door NIH-richtlijnen (institutionele vereisten kan variëren). Deze meervoudige voordelen maken het kuikenembryosysteem dus zeer aantrekkelijk als men hun vragen en experimenten beperkt tot die welke binnen zijn beperkingen vallen. Meerdere GBM-celstudies zijn uitgevoerd door anderen met behulp van het kuikenembryo, maar deze hebben bijna uitsluitend het chorioallantoïsche membraan (CAM) van het embryo 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 en ledemaatknop ³⁰ gebruikt, en niet de hersenen. Er is ook een rapport geweest dat medulloblastoom implanteert in de kuikenhersenen op E2³¹. Ongetwijfeld zou het gebruik van het kuikenembryo als een orthotopisch xenograft-modelsysteem, zoals hier beschreven, resultaten moeten opleveren die veel zinvoller zijn voor de menselijke GBM-tumorbiologie dan studies met behulp van de CAM.

Hoewel deze studies pas zijn begonnen om het kuikenembryo hersentumormodelsysteem volledig te gebruiken voor studies van menselijk GBM-cel- en GSC-gedrag, wordt gehoopt dat anderen het gebruik zullen uitbreiden en verdere potentiële toepassingen zullen vinden. Men zou zich kunnen voorstellen dat dit systeem niet alleen mechanismen zal blootleggen die GBM-tumorvorming en celgedrag reguleren, maar ook preklinisch testen van specifieke geneesmiddelen en stoffen op de cellen van specifieke patiënten mogelijk zal maken. Als bijvoorbeeld hersenschijfculturen van tevoren waren opgezet, konden tumorcellen, stukjes van chirurgische tumorresecties of van de patiënt afgeleide GBM-organoïden³² direct in ex vivo co-cultuur worden geplaatst en konden verschillende behandelingen binnen enkele dagen worden beoordeeld. Evenzo kunnen gedissocieerde patiëntcellen rechtstreeks in E5-middenhersenen in ovo worden geïnjecteerd om hun vermogen om tumoren te vormen en hersenparenchym binnen te dringen te beoordelen. Daarom wordt gehoopt dat de beschrijvingen van de methoden en representatieve resultaten hier het toegenomen gebruik van dit zeer onderbenutte systeem voor onderzoek naar hersenkanker zullen vergemakkelijken en aanmoedigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch	Birabira	N/A
1 mm biopsy punch pen	Robbins Instruments	20335
6 well insert plate (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
15 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-12
24 well plate	Corning Costar	3526
50 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-146
Aluminum foil	ReynoldsWrap	N/A
Ampicillin	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127	Santa Cruz Biotechnology	sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 supplement without vitamin A	GIBCO	17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	nuclear stain
Cell culture incubator	Forma		standard humidified CO2 incubator
Centrifuge	Beckman Coulter
Confocal microscope	Nikon Instruments	C2si+	With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses	Nikon Instruments		Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software	Nikon Instruments	NIS Elements	Version 5.2
Curved foreceps	World Precision Intruments	504478
Curved scissors	Fine Science Tools
Curved spatula	Fisher Scientific	14-375-20
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270
DiD far red fluorescent dye	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
egg incubator	Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm)	Scotch	N/A
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fast green FCF dye	Avocado Research Chemicals	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
filter paper	Fisher Scientific
Gauze	Dynarex	3353
Glass Capillaries for microinjection	World Precision Instruments	TW100-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP228-1	for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells)	Not applicable		Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometer	Hausser scientific
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H0887
Horse Serum (HI)	Gibco	26050-088
Human FGF-2	BioVision	4037-1000
Human TGF-α	BioVision	4339-1000
Inverted phase contrast microscope	Nikon Instruments	TMS	for routine viewing of cultured cells
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Laboratory film	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pen:Strep	Gemini Bio-products	400-110
Low-melt agarose	Fisher Scientific	BP1360	for embedding live brains
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL)	Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL)	Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH2PO4 + H2O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
Normal goat serum	Millipore Sigma	526-M
N-propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130	for mounting media
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish	Becton Dickinson	351008
pneumatic picopump	World Precision Intruments	PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
razor blade- double edge	PACE		for cutting fixed brain slices
sapphire knife	Delaware Diamond Knives		for cutting live brain slices
Scalpel	TruMed	1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11652
Specimen chamber for vibratome	custom-made
Stereo Dissecting Microscope	Nikon Instruments	SMZ1500	Equipped with epifluorescence
straight foreceps	World Precision Intruments	500233
straight scissors	Fine Science Tools
Sucrose	Mallinckrodt	7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence)	Nikon Instruments	TE2000-E	With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm	Becton Dickinson	353004	for cell culturing
Transfer pipette	American Central Scientific Co.	FFP011
Transparent tape	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line	ATCC	HTB-15	Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Vibrating tissue slicer	Vibratome	3000	for cutting live and fixed brain slices