Summary
병아리 배아는 ovo에서 인간 교모세포종(GBM) 뇌종양을 연구하는 데 사용되며 생체 외 뇌 절편 공동 배양. GBM 세포 거동은 생체 외 공동 배양에서 타임랩스 현미경으로 기록할 수 있으며, 두 제제 모두 상세한 3D 공초점 분석을 통해 실험 종점에서 분석할 수 있습니다.
Abstract
병아리 배아는 척추동물 발달 연구, 특히 실험적 조작을 위한 이상적인 모델 시스템이었습니다. 병아리 배아의 사용은 생체 내에서 인간 교모세포종(GBM) 뇌종양의 형성 및 주변 뇌 조직으로의 종양 세포의 침습성을 연구하기 위해 확장되었다. GBM 종양은 난소의 E5 중뇌(시신경) 심실에 형광 표지된 세포의 현탁액을 주입함으로써 형성될 수 있습니다.
GBM 세포에 따라 조밀한 종양이 심실과 뇌벽 내에서 무작위로 형성되고 세포 그룹이 뇌벽 조직을 침범합니다. 종양이 있는 고정된 E15 tecta의 두꺼운 조직 절편(350μm)을 면역염색하여 공초점 z-스택 이미지의 3D 재구성으로 분석할 때 침입 세포가 종종 혈관을 따라 이동한다는 것을 밝힐 수 있습니다. 살아있는 E15 중뇌 및 전뇌 절편(250-350 μm)은 막 삽입물에서 배양할 수 있으며, 여기서 형광 표지된 GBM 세포를 비무작위 위치에 도입하여 약 1주일 동안 혈관을 따라 발생할 수 있는 세포 침습을 분석하기 위한 생체 외 공동 배양을 제공할 수 있습니다. 이러한 생체 외 공동 배양은 광시야 또는 컨포칼 형광 타임랩스 현미경으로 모니터링하여 살아있는 세포 거동을 관찰할 수 있습니다.
그런 다음 공동 배양된 조각을 고정, 면역 염색 및 공초점 현미경으로 분석하여 침윤이 혈관 또는 축삭을 따라 발생했는지 여부를 결정할 수 있습니다. 또한 공동 배양 시스템은 서로 다른 정확한 위치에 서로 다른 세포 유형 및 색상의 응집체를 배치하고 세포 움직임을 관찰하여 잠재적인 세포-세포 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 약물 치료는 생체 외 배양에서 수행할 수 있지만 이러한 처리는 생체 내 시스템과 호환되지 않습니다. 이 두 가지 보완적인 접근 방식을 통해 고도로 조작 가능한 척추동물 뇌 환경에서 인간 GBM 세포 행동과 종양 형성에 대한 상세하고 정확한 분석이 가능합니다.
Introduction
암세포 행동에 대한 시험관 내 연구는 종종 생체 내 이종 이식 모델에서 종양 형성 및 세포 침습 동안 관찰되는 보다 복잡한 행동 동안 작동하는 잠재적 메커니즘을 해부하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 교모세포종(GBM)의 경우 시험관 내 연구는 새로운 병아리 배아 이종이식 뇌종양 모델 1,2,3,4,5에서 종양 형성 및 뇌 침습 동안 L1CAM이 잠재적으로 어떻게 작동하는지에 대한 메커니즘을 밝혀냈습니다. 시험관 내 실험과 생체 내 실험은 유용한 방식으로 서로를 보완하지만 결과의 상관 관계를 어떻게 알 수 있는지에 상당한 격차를 남깁니다. 예를 들어, 접시에서 GBM 세포 운동성에 대한 기계론적 분석은 매우 인위적인 상황이며, 생체 내 이종이식 모델은 종양 형성 및 세포 거동에 대한 정적 시점 또는 종말점 분석만 나타낼 수 있습니다. 설치류 또는 병아리 배아를 사용한 생체 내 연구는 세포가 이러한 이종 이식 모델에서 뇌 조직을 침범하는 동안 세포 행동을 모니터링하는 데 쉽게 적합하지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 병아리 배아 이종이식 모델은 부착 단백질 L1CAM이 인간 T98G GBM 세포의 침습 능력에서 자극 역할을 한다는 것을 입증하였다 2,5.
이 문제에 대한 적절한 해결책은 생체 외 모델이라고 하는 기관형 뇌 절편 배양 모델을 사용하여 생체 내 및 시험관 내 방법 모두를 연결함으로써 도달할 수 있습니다. 이 생체 외 모델에서 살아있는 뇌 조직은 최대 몇 주 동안 수백 미크론의 두께로 유지될 수 있으므로 암세포를 이식하고 시간이 지남에 따라 실제 조직에서 암세포의 행동을 관찰한 다음 실험 종점에서 보다 자세한 마커 분석을 수행할 수 있습니다.
널리 사용되는 기관형 절편 배양 방법은 반투명 또는 투명한 다공성 막 위에 수백 미크론 두께의 뇌 절편을 배양하여 조직을 공기에 노출시키면서도 영양 배지가 막 아래에서 조직을 지탱할 수 있도록 하는 것입니다(Stoppini et al.6 참조). 이 방법의 다양한 변형은 다른 매체 또는 다른 멤브레인 삽입물을 사용하는 것을 포함하여 다른 연구에 사용되었습니다. 다양한 멤브레인 삽입물에는 직경 30mm, 35mm배양 접시에 다공성(0.4μm) 멤브레인 삽입물(6), 6웰 플레이트용 세포 배양 삽입물(0.4μm)이 포함됩니다(7). 다른 배지에는 50% MEM/HEPES + 25% 열 비활성화 말 혈청 + 25% 행크스 균형 소금 용액(HBSS)8, 50% 감소 혈청 배지 + 25% 말 혈청 + 25% HBSS9 등이 있습니다. 반투명 또는 투명 멤브레인이 형광 표지된 GBM 세포와 함께 사용되는 경우, 이러한 배양물은 반전된 광시야 또는 공초점 형광 현미경10,11,12,13,14,15를 사용하여 아래에서 이미지화할 수 있습니다.
설치류를 사용하여 많은 생체 내 동소 뇌종양 이종이식 및 생체외 기관형 뇌 절편 배양 모델이 확립되었지만, 위에서 인용한 바와 같이 병아리 배아(Gallus gallus)는 이러한 목적에 충분히 활용되지 않았습니다. 그러나, 병아리 배아는 인간 및 래트 신경아교종 침윤 둘 다의 연구를 위한 생체내 동소성 이종이식 모델로서 사용될 수 있는 것으로 입증되었다 1,2,5. 병아리 배아 뇌에 이종 이식된 세포는 설치류 모델에서 관찰된 것과 유사한 침습 패턴을 나타내어 GBM 종양 세포 분석을 위한 생체 내 모델로 병아리 배아의 사용을 더욱 뒷받침합니다. 병아리 배아는 또한 저렴하고 설치류보다 더 쉽게 유지 관리할 수 있으며(즉, 실험실 인큐베이터의 달걀 껍질에서) 작업하기가 훨씬 쉬워 단기 생체 내 GBM 연구에 매력적인 옵션이 됩니다. 최근 논문에서는 병아리 배아 뇌 절편 배양을 정상적인 뇌 발달 동안 축삭의 형성과 성장에 사용하는 방법을 설명했으며, 이 배양액은 최소 7일 동안 생존할 수 있었다16. 그러나, 조직 환경에서 GBM 세포 행동의 생체 외 분석을 위한 이러한 병아리 배아 뇌 절편 배양물의 사용은 부족하다. 이 기사에서는 생체 내에서 초기 병아리 배아 뇌에 인간 GBM 세포와 GBM 줄기 세포(GSC)를 이식하는 것과 생체 외 살아있는 병아리 배아 뇌 조각 배양에 GBM 세포를 도입하는 방법을 모두 설명합니다. 이들 제제로부터 얻어진 종양 및 세포 침윤 패턴의 몇몇 대표적인 예가 또한 제공된다.
Protocol
이 작업을 수행하기 위해 델라웨어 대학교에서 허가나 승인이 필요하지 않았습니다.
1. 병아리 시신경에 GBM 세포 주입
- 주사용 GSC 및 GBM 세포의 제조
- GSC 배지에서 GSC를 배양합니다(표 1). GBM 배지에서 확립된 GBM 세포주를 배양하였다(표 1).
- 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트의 세포를 헹구고 트립신 용액 1mL를 10cm 접시에 넣습니다. 세포가 분리되기 시작할 때까지 세포 배양 인큐베이터에 2-3분 동안 그대로 두십시오.
- 10cm 접시에 적절한 혈청 함유 배양액 10mL를 추가하여 트립신을 비활성화하고 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리합니다. 세포 현탁액을 15mL 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
- 4°C에서 5분 동안 800 × g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다.
- 측면 암 플라스크 및 진공 펌프에 부착된 일회용 미세 유리 피펫을 사용하여 세포 펠릿에서 배지를 흡인합니다. 적절한 성장 배지에서 세포를 마이크로리터당 10,000개 세포 농도로 재현탁하고 얼음 위의 미세분리기 튜브 또는 작은 스크류탑 튜브에 넣습니다.
- 세포를 소량의 멸균 1% Fast Green FCF 염료(염료 5μL/세포 현탁액 100μL의 비율 사용)와 혼합합니다.
- 난소의 E5 시신경에 GBM 세포 주입. 보충 그림 1을 참조하십시오.
- 수정란을 가습된 계란 인큐베이터에서 뾰족한 끝이 아래를 향하도록 37.5°C에서 배양합니다( 배양 1일째 는 배아 0일[E0]). 배양 6일째(E5)에 70% 에탄올을 뿌려 달걀 껍질을 살균합니다.
- 달걀 캔들러를 사용하여 배아 위의 공기 공간 둘레를 연필로 추적하고 윤곽이 그려진 부분을 투명 테이프로 덮습니다.
- 구부러진 가위를 사용하여 배아 막이나 혈관을 자르지 않도록 조심하면서 추적 부위를 부드럽게 자르고 달걀 껍질의 상단을 버립니다.
- 식염수 또는 세포 배양 배지 몇 방울을 공기 공간 멤브레인에 떨어뜨려 쉽게 분리되도록 적십니다. 가는 집게를 사용하여 배아 상단의 공기 공간 막을 조심스럽게 뚫고 제거한 다음 병아리 배아의 머리를 찾습니다.
- 미세한 집게를 사용하여 배아를 즉시 둘러싸고 있는 투명한 양막을 잡고 시신경에 세포를 주입할 수 있도록 머리를 배치합니다. 한 손으로 미세한 집게를 사용하여 양막을 잡고 주사 과정에서 머리를 제자리에 유지합니다. 노른자위의 chorioallantoic 막에있는 배아 외 혈관을 손상시키지 않도록주의하십시오.
참고: 위의 절차는 배아를 밀접하게 둘러싸고 있는 투명한 양막이 잡히고 당겨질 때까지 보이지 않기 때문에 효율적으로 잡을 수 있도록 약간의 연습이 필요합니다. 미세한 집게를 사용하여 배아를 바로 둘러싸고 있는 투명한 양막을 잡는 연습을 하십시오. - 미세한 집게로 양막을 잡고 머리를 안정적으로 잡습니다. 유리 마이크로피펫과 공압 피코펌프를 사용하여 5μL의 적절한 세포 배양 배지에 약 50,000개의 세포를 시신경에 주입합니다(5μL는 채워진 마이크로피펫의 약 1/2).
참고: 염료와 혼합된 GBM 세포가 주입된 E5 배아의 이미지는 Cretu et al.1 을 참조하십시오. - 배아 위에 50mg/mL 암피실린 몇 방울을 떨어뜨립니다.
- 계란 상단의 구멍을 투명 테이프로 덮고 해부를 위해 E15까지 가습기에 그대로 두십시오.
2. E15 배아에서 뇌 영역의 해부
참고: 고정을 위한 E15 뇌의 해부는 살아있는 뇌 조각에 대해 8.2단계에서 설명한 것과 유사하지만 여기에서 해부는 무균 상태에서 수행할 필요가 없습니다.
- 배아에 접근할 수 있도록 껍질 상단 주위의 테이프를 잘라냅니다.
- 목에서 배아의 목을 베고 칼슘 및 마그네슘이 없는 멸균 티로데스(CMF Tyrode's) 용액이 담긴 10cm 접시에 머리를 넣습니다. 보충 그림 2를 참조하십시오.
- 미세한 집게를 사용하여 뇌를 덮고 있는 피부를 벗겨내어 밑에 있는 경막을 드러냅니다. 뇌의 왼쪽과 오른쪽에 형성되는 두개골 뼈를 제거하십시오. 형성되는 두개골 뼈는 아직 뇌의 대부분을 덮지 않습니다.
- 가늘고 뾰족한 집게를 사용하여 뇌 중앙에 있는 수막을 부드럽게 찢고 양쪽으로 떼어내어 뇌를 드러냅니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 뇌를 아래에서 퍼내고 부드럽게 구멍에서 빼냅니다.
- 뇌를 전뇌, tecta, 소뇌의 부분으로 해부하십시오.
- 가는 집게를 사용하여 tecta에서 위에 놓인 pia mater를 제거합니다. pia는 tecta에서 쉽게 분리되지만 전뇌 또는 소뇌에서는 분리되지 않습니다. 전뇌에서 피아를 만지거나 작은 여과지 조각으로 굴려서 제거하십시오.
- 해부 된 뇌 영역을 작은 접시에 넣으십시오.
- 고정을 위한 뇌 영역을 24웰 플레이트 웰에 놓고 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액에 2% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다. 4 °C에서 최소 24시간 동안 그대로 두십시오.
- 고정 후 한천에 포매하기 전에 최소 1시간 동안 3x PBS로 조직을 헹굽니다.
3. 수확된 뇌 영역 삽입 및 슬라이싱
- PBS 중의 3.5% 한천 및 8% 자당의 용액을 용융될 때까지 예열하고 용융 온도로 유지한다.
- 구부러진 집게를 국자로 사용하여 병아리 배아 뇌의 시신경 구조나 전뇌 영역을 부드럽게 집어들고 여과지에 약간 닦아서 한천이 외부 뇌 표면에 부착되도록 여분의 액체를 제거합니다.
- 멸균 이송 피펫을 사용하여 금형을 한천 용액으로 채 웁니다.
알림: 작은 직사각형 금속 진동 조직 슬라이서 블록과 같이 적절한 크기의 물체 주위에 알루미늄 호일을 형성하여 간단한 금형을 만들 수 있습니다. - 뇌 부위를 한천에 넣고 한천이 완전히 굳도록 합니다.
- 내장된 뇌 주위에서 알루미늄 호일을 제거하고 면도날이나 메스를 사용하여 측면 주변의 과도한 한천을 다듬습니다.
- 슬라이싱 트레이의 스테인리스 스틸 사각형에 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 떨어뜨리고 뇌가 있는 아가로스 블록을 접착제 위에 놓고 접착제가 1분 동안 접착되도록 합니다. 트레이를 진동 티슈 슬라이서 척에 넣고 조이고 한천 블록의 상단을 덮을 만큼 충분한 PBS로 트레이를 채웁니다.
- 강철 면도날을 사용하여 350μm 두께의 진동 조직 슬라이서에서 뇌 조각을 자릅니다.
- 브레인 슬라이스가 잘려져 슬라이스 트레이에 자유롭게 떠 있을 때 주걱을 사용하여 트레이에서 슬라이스를 퍼내고 제거합니다. 주걱에서 섹션을 부드럽게 밀어 PBS가 있는 라벨이 붙은 10cm 페트리 접시에 넣어 섹션이 자유롭게 떠 있도록 합니다.
참고: 삽입하기 전에 과도한 액체를 제거하기 위해 뇌가 여과지로 충분히 코팅되지 않으면 뇌 조각을 둘러싼 한천이 분리될 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 뇌 조직을 응고 된 한천에서 부드럽게 제거하고 과도한 액체를 적절하게 블로핑 한 후 다시 삽입 할 수 있습니다.
4. 종양 세포로 뇌 절편을 면역염색
- 에피형광이 장착된 실체 현미경을 사용하여 종양 세포의 존재 여부에 대해 10cm 접시의 개별 슬라이스를 하나씩 스크리닝합니다.
- 면역염색을 위해 충분한 양의 인산완충식염수를 0.1% Triton X-100 및 5% 일반 염소 혈청(PBSTG)( 표 1 참조)으로 준비하고, 면역염색할 슬라이스를 헹굽니다.
- PBS로 뇌 섹션을 염색하는 데 사용할 24웰 플레이트의 웰을 반쯤 채웁니다.
- 주걱이나 메스의 가장자리로 뇌 조각 주위의 한천 모서리를 잘라내어 PBS가 들어있는 우물에 부드럽게 넣습니다.
- PBS를 흡인하고 PBSTG에서 350μL의 1차 항체 염색 용액(예: PBSTG의 2μg/mL UJ127)으로 교체합니다.
- 차가운 방에서 24시간 동안 부드럽게 저어주어 슬라이스가 우물 내에서 자유롭게 움직이는 것을 볼 수 있도록 합니다.
- 24시간 후, 1차 항체 용액을 제거하고 교반하면서 차가운 방에서 PBSTG로 3 x 1시간 헹굽니다.
- 헹굼이 끝나면 PBSTG에서 350μL/웰의 2차 항체 염색 용액에서 배양합니다(예: PBSTG에서 비오틴-GAM의 1/200 희석). 교반과 함께 차가운 방에서 20 시간 동안 배양하십시오.
참고: 3차 단계를 앞두고 이 단계에서 형광색소 함유 2차 항체와 함께 배양하는 경우 지금 배양 중에 빛을 보호하기 위해 덮개를 씌운 다음 4.11단계로 건너뜁니다. - 2차 항체 용액을 제거하고 교반하면서 차가운 방에서 PBSTG에서 3 x 1시간 동안 헹굽니다.
- PBSTG를 제거하고 3차 용액에서 배양합니다(예: PBSTG에서 Alexa Fluor 647 스트렙타비딘의 1:250 희석). 원하는 경우 혼합물에 0.1μg/mL 비스벤지미드를 추가하여 이 단계에서 핵을 염색합니다. 교반과 함께 차가운 방에서 20 시간 동안 배양하십시오.
- 3차 용액을 제거하고 교반하면서 차가운 방에서 PBSTG에서 3 x 1시간 동안 헹굽니다.
- 현미경 슬라이드에 장착할 준비가 될 때까지 PBS에 그대로 둡니다.
5. 현미경 슬라이드에 슬라이스 장착
- 장착할 섹션이 있는 만큼의 현미경 슬라이드를 준비합니다.
- 각 슬라이드에 대해 50mm 길이의 10mil(254μm) 두께의 비닐 전기 테이프 스트립을 파라필름 조각에 놓습니다.
- 1cm x 1cm 크기의 정사각형 구멍 펀치를 사용하여 전기 테이프와 파라필름의 중앙에 구멍을 뚫습니다.
- 파라필름에서 테이프를 떼어내고 현미경 슬라이드 위에 놓고 슬라이드에 라벨을 붙일 수 있는 공간을 남겨 둡니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 전기 테이프 중앙의 사각형 구멍에 페이드 방지 마운팅 매체 한두 방울을 떨어뜨립니다.
- 구부러진 주걱을 사용하여 PBSTG에서 원하는 진동 조직 슬라이서 섹션을 들어 올리고 깨끗한 실험실 물티슈나 여과지로 습기를 완전히 제거합니다.
- 슬라이스의 가장자리를 마운팅 용지 드롭에 대고 다른 주걱을 사용하여 섹션을 마운팅 미디어에 부드럽게 밀어 넣습니다.
- 마운팅제를 몇 방울 더 떨어뜨려 섹션을 덮고 섹션과 마운팅 위에 24mm x 30mm(#1.5 두께) 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
- 커버슬립의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 제자리에 고정합니다.
6. 고정된 뇌 절편의 공초점 현미경
- 광시야 형광을 사용하여 적절한 대물 렌즈와 필터 세트를 사용하여 장착된 뇌 절편에서 형광 종양을 찾습니다.
참고: 일부 종양은 상당히 클 수 있으며 4x 대물렌즈로 쉽게 볼 수 있는 반면, 단일 세포는 10x 대물렌즈가 필요할 수 있습니다. - 적절한 대물 렌즈, 레이저, 핀홀 크기 및 검출기 설정을 사용하여 컨포칼 현미경으로 전환합니다. 이 프로토콜을 따르려면 일반 이미징에 20x 대물렌즈(개구수 [N.A.] = 0.75)를 사용하고 고해상도 이미징에 60x 오일 대물렌즈(N.A. = 1.40)를 사용합니다.
- 광학 단면을 획득하기 위한 z축의 상한 및 하한과 스텝 크기(컨포칼 현미경 제조업체의 지침에 따른 특정 상황)를 설정합니다. 광학 단면의 z-스택을 획득합니다.
- 컨포칼 현미경 소프트웨어를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 종양의 3D 볼륨 렌더링을 생성합니다.
7. 스페로이드 준비
- 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(poly-HEMA) 플레이트 생성
- 95% 에탄올에 10μg/mL 폴리-HEMA 용액을 만들고 이 용액 1mL로 35mm 페트리 접시(또는 세포 배양 접시)를 코팅합니다.
- 접시를 실온에서 밤새 덮지 않은 로커에 놓아 접시 표면의 코팅을 만듭니다.
알림: 용매가 증발하여 접시에 반투명 코팅이 남게 되어 고르지 않게 보일 수 있지만 이는 세포 스페로이드를 만드는 능력에 영향을 미치지 않습니다. - 건조 후 생물 안전 캐비닛에서 자외선 아래에서 열린 접시를 1 시간 동안 멸균하십시오. 멸균 후 뚜껑을 교체하십시오. 이제 코팅된 접시를 사용할 준비가 되었습니다.
- 타임랩스 현미경을 위한 형광 DiD 염색
참고: 이 섹션은 스페로이드를 만드는 데 사용되는 DiD 형광 염료로 단일 세포를 염색하기 위한 것으로, 실시간 타임랩스 이미징을 위해 세포 운동성의 시각화를 최적화합니다.- 무혈청 배양 배지에 세포를 현탁합니다.
- 5 μL의 DiD stock/mL의 세포 현탁액을 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 37°C에서 20분 동안 배양한다.
- 표지된 세포 현탁액을 800 × g 에서 5°C에서 5분 동안 원심분리한다.
- 상청액을 흡인하고 따뜻한 매체에 세포를 다시 현탁하여 헹굽니다.
- 이 원심분리를 반복하고 헹굼 단계를 두 번 더 반복합니다.
참고: 원하는 경우 7.3.6단계로 건너뛰어 이 프로세스 직후에 스페로이드를 만듭니다.
- 세포 스페로이드 만들기
- 0.25% 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 37°C로 예열합니다.
- GSC 배지17(표 1)에서 GSC를 배양하고 U-118 배지에서 U-118 악성 사구종(MG) 세포를 배양합니다(표 1 참조). 10mm 스페로이드 플레이트 1개를 준비하기 위해 합류성 35cm 접시를 사용하십시오. bFGF(10ng/mL 최종 농도) 및 TGF-α(20ng/mL 최종 농도) 성장 인자를 GSC에 처음 추가한 다음 3일마다 추가합니다.
참고: 현재 연구에 사용된 세포는 녹색 GSC15-2/K72, 녹색 GSC16-4/K72, 빨간색 U-118/L1LE/mCherry2x 및 빨간색 U-118/1879/mCherry2x였습니다. 스페로이드 한 판은 멤브레인 삽입물에 뇌 절편 6웰 플레이트 2개에 충분해야 합니다. - 멸균 PBS로 플레이트의 세포를 헹구고 트립신 용액 1mL를 10cm 접시에 놓습니다. 세포가 분리되기 시작할 때까지 세포 배양 인큐베이터에 2-3분 동안 두십시오.
- 10cm 접시에 적절한 혈청 함유 배양액 10mL를 추가하여 트립신을 비활성화하고 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리합니다. 세포 현탁액을 15mL 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
- 4°C에서 5분 동안 800 × g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화한다.
- 세포 펠릿에서 배지를 흡인하고 배지 10mL에 세포를 재현탁합니다.
- 각 35mm 폴리-HEMA 코팅 접시에 2mL의 세포 현탁액을 놓고 적절한 배지 2mL를 더 추가하여 접시당 총 배지 4mL를 얻습니다. GSC를 사용하는 경우 성장 인자를 추가합니다.
- 응집체가 100-200 μm의 크기에 도달 할 때까지 세포 배양기에서 세포를 배양하며, 이는 도금 된 세포의 밀도에 따라 1-2 일이 될 수 있습니다.
8. 살아있는 병아리 배아 뇌 해부 및 진동 조직 슬라이서 슬라이싱
- 해부 준비
- 멤브레인 삽입물 아래에 1mL의 뇌 절편 배양 배지( 표 1 참조)가 있는 6웰 폴리에스터 멤브레인 삽입 플레이트를 준비합니다.
- 작업 영역과 도구를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
- 해부가 진행되는 동안 6웰 인서트 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.
- 100mL의 진동 조직 슬라이서 슬라이싱 매체(표 1)를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.
- PBS 중의 4% 저용융 아가로스의 바이알을 액체로 녹을 때까지 수조에 넣는다(대략 50°C).
- 진동하는 티슈 슬라이서 욕조에 얼음을 채웁니다.
- 무균 E14/15 병아리 배아 뇌 해부
- 달걀 캔들러를 사용하여 연필로 E14 또는 E15 배아 위의 공기 주머니 둘레를 따라 추적하고 윤곽이 그려진 부분을 투명 테이프로 덮습니다.
- 구부러진 가위 또는 가는 가위를 사용하여 배아막이나 혈관이 절단되지 않도록 주의하면서 추적 부위 주변을 부드럽게 자르고 껍질의 윗부분을 버립니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 배아 상단의 공기 공간 막을 제거하고 병아리 배아의 머리를 찾습니다.
- 배아를 참수하고 차가운 멸균 CMF 용액으로 10cm 접시에 머리를 놓습니다. 보충 그림 2를 참조하십시오.
- 멸균 미세 집게를 사용하여 뇌를 덮고 있는 피부를 벗겨내어 밑에 있는 경막을 드러냅니다. 뇌의 왼쪽과 오른쪽에 형성되는 두개골 뼈를 제거하십시오. 형성되는 두개골 뼈는 아직 뇌의 대부분을 덮지 않습니다.
- 미세하고 뾰족한 집게(#5 또는 #55)를 부드럽게 사용하여 뇌 중앙에 있는 수막을 찢고 양쪽으로 껍질을 벗겨 뇌를 드러냅니다.
- 가늘게 구부러진 집게를 사용하여 뇌를 아래쪽 앞쪽에서 위로 떠서 구멍에서 부드럽게 빼냅니다.
- 뇌를 전뇌, 중뇌(시신경), 소뇌의 세 가지 주요 부분으로 나눕니다. 필요한 경우 병아리 발달 지도를 참조하십시오.
- 가는 집게를 사용하여 tecta에서 위에 놓인 pia mater를 제거합니다.
참고: 피아는 지각에서 쉽게 분리되지만 전뇌나 소뇌에서는 분리되지 않습니다. 피아는 전뇌를 만지거나 멸균 거즈로 굴려서 전뇌에서 제거 할 수 있습니다. - 해부된 뇌 영역을 얼음 위의 작은 멸균 접시에 넣습니다.
- 뇌 삽입 및 슬라이싱
- 구부러진 집게를 국자로 사용하여 시신경 또는 전뇌 영역을 부드럽게 집어 들고 멸균 거즈에 약간 두드려 여분의 액체를 제거하여 아가로오스가 외부 뇌 표면에 부착되도록 합니다.
- 멸균 이송 피펫을 사용하여 저융점 아가로스로 금형을 채웁니다. 적절한 크기의 물체 주위에 알루미늄 호일을 형성하여 간단한 금형을 준비합니다. 작은 직사각형 금속 진동 조직 슬라이서 블록은 일상적으로 개체로 사용됩니다. 보충 그림 3을 참조하십시오.
- 뇌 영역을 아가로스에 빠르게 넣고 얼음 위에서 굳히십시오 (약 4-5 분).
알림: 아가로오스가 굳기 전에 뇌가 곰팡이 바닥으로 가라앉을 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 한천이 굳기 시작할 때까지 1분 정도 기다린 다음 뇌 영역을 아가로스에 넣습니다. 용설의 중간에 뇌 영역을 직접 매달아 놓으십시오. - 응고된 아가로스에 내장된 뇌 주위에서 알루미늄 호일을 제거하고 멸균 면도날 또는 메스를 사용하여 측면 주변의 과잉 아가로스를 다듬습니다.
- 슬라이싱 접시/트레이의 스테인리스 스틸 사각형에 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 놓고 아가로스 블록을 뇌에 놓고 접착제가 1분 동안 접착되도록 합니다. 접시/트레이를 진동 티슈 슬라이서 척에 넣고 조이고 트레이에 슬라이스 매체를 채워 아가로스 블록의 상단을 덮습니다.
- 사파이어 나이프를 사용하여 250-350 μm에서 진동 조직 슬라이서의 섹션을 절단하는데, 이는 강철 면도날보다 살아있는 조직 손상이 적은 것으로 보고되었습니다.
- 뇌 조각이 잘려서 슬라이스 트레이에 자유롭게 떠 있을 때 멸균 주걱을 사용하여 슬라이스를 퍼내고 트레이에서 꺼냅니다. 다른 멸균 주걱을 사용하여 주걱에서 섹션을 부드럽게 밀어 멤브레인 삽입물에 넣습니다.
참고: 일반적으로 원하는 경우 두 개 또는 세 개의 뇌 조각을 각 멤브레인 삽입물에 배치할 수 있습니다. 뇌 슬라이스를 둘러싸고 있는 용가로체는 뇌가 과도한 액체를 제거하기 위해 멸균 거즈로 충분히 블롯지되지 않으면 분리될 수 있습니다. 포매하기 전에 충분한 블로팅 후에도 이것이 계속 발생하면 주변 아가로스 없이 슬라이스를 부드럽게 집어 멤브레인 삽입물 위로 밀어 넣습니다. - 뇌 절편의 6-웰 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 세포 배양 인큐베이터의 막 삽입물에 놓습니다.
- 도금 다음 날, 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 인서트 아래에서 매질을 흡인합니다(피펫이 아래 매질에 접근할 수 있도록 인서트 측면에 틈이 있음). 멤브레인 삽입물 아래의 각 웰에 1mL의 신선한 슬라이스 배지를 추가합니다. 그 이후에는 격일로 미디어를 계속 변경하십시오.
- 뇌 조각이 멤브레인 삽입물에 단단히 부착되고 다소 평평해질 때까지 며칠을 기다리십시오. 이것은 슬라이스가 실행 가능하고 GBM 셀을 도입할 준비가 되었다는 신호입니다.
9. 뇌 조각에 GBM 세포 도입
- 스페로이드 방식
- 세포 스페로이드의 크기가 150-200μm에 도달한 후 5μL로 설정된 20μL 마이크로피펫을 사용하여 배양 접시에서 하나 또는 여러 개의 스페로이드를 제거합니다. 보충 그림 3을 참조하십시오.
- 스페로이드가 있는 매체를 원하는 뇌 조각으로 부드럽게 배출합니다.
알림: 세포 스페로이드는 피펫 팁에서 볼 수 있어야 합니다. 투명한 피펫 팁을 사용하면 팁에서 더 쉽게 볼 수 있습니다. 액체가 방출될 때 스페로이드가 뇌 절편에서 떨어지면 얇은 나무 어플리케이터 스틱에 붙인 에탄올 멸균 속눈썹을 사용하여 스페로이드를 뇌 절편으로 부드럽게 밀어 넣어야 합니다. - 스페로이드가 2-5일 동안 뇌 조각에서 배양되도록 합니다.
참고: 여기의 한계는 슬라이스의 혈관과 뇌 세포의 궁극적인 분해인 것 같습니다. 분해된 혈관은 라미닌으로 염색될 때 슬라이스에서 불연속적인 공으로 나타납니다.
- 생검 펀치 방법
- 멤브레인 삽입물에서 평평하게 보이도록 뇌 조각이 부착되도록 합니다(배양에 2-5일이 소요될 수 있음).
- 얼음 위에서 세포 매트릭스를 해동하십시오.
- 세포 배양 생물 안전 캐비닛에서 멸균 1mm 직경의 생검 펀치를 진공 흡인기 튜브에 연결합니다.
- 생검 펀치로 뇌 절편을 부드럽게 터치하여 뇌 절편 중앙에 1mm 구멍을 만듭니다.
참고: 생검 펀치의 조직은 진공에 의해 펀치로 흡인됩니다. - 세포의 60%-70% 합류 10cm 접시를 트립신화하고 10mL의 배지에 재현탁하여 세포 매트릭스 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 해당 현탁액 1mL를 매트릭스 100μL와 혼합합니다.
- 20 μL 마이크로피펫을 사용하여 1 μL의 세포 매트릭스 혼합물을 뇌 조각의 각 구멍에 넣습니다.
- 세포 혼합물 배치가 완료된 후 세포가 내장된 뇌 조각 접시를 다시 인큐베이터에 넣고 매트릭스가 응고되고 세포가 주변 뇌 조각을 잠재적으로 침범할 수 있도록 합니다.
10. 광시야 형광 타임랩스 현미경
- 매체의 증발을 방지하기 위해 6웰 플레이트의 가장자리 주위에 제거 가능한 테이프를 붙이고 가스 교환을 위해 한쪽에 작은 간격을 둡니다.
- 맞춤형 배양 챔버에 플레이트를 도립 epifluorescence 현미경의 조정 가능한 자동 스테이지에 놓습니다.
참고: 챔버는 가스 분사 컨트롤러를 사용하여 5%CO2 및 95% 공기의 대기 조건에서 유지되었고, 온도는 온풍 온도 컨트롤러 및 온도 제어 스테이지 인서트를 사용하여 37°C로 유지되었습니다. 여기에 사용된 시스템에 대한 자세한 내용은 Fotos et al.18 을 참조하십시오. - 적절한 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 20시간 동안 10분마다 한 번씩 관심 영역의 형광 이미지를 수집하는 타임랩스 획득 일정을 만듭니다.
참고: 녹색 형광 라벨이 세포에 사용되는 경우(예: 녹색 형광 단백질[GFP]) 광독성을 방지하기 위해 세포를 시각화하는 데 필요한 최소한의 청색 여기 빛을 사용하십시오. 적색(예: mCherry) 및 원적색(예: DiD) 라벨은 더 긴 파장 여기로 인해 이러한 잠재적인 문제가 없는 것으로 보입니다.
11. 타임랩스 현미경 검사 후 뇌 절편 면역염색
참고: 이 면역염색 프로토콜은 라미닌으로 혈관을 염색하고 비스벤지미드로 핵을 염색하는 데 최적화되어 있습니다. 원하는 관심 분자에 적절한 항체를 사용하십시오.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 멤브레인 삽입물 아래에서 배지를 흡인하고 삽입물 아래의 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액에 2% PFA 1mL를 넣고 삽입물 위에 1mL를 넣어 뇌 절편을 덮습니다. 슬라이스를 4 °C에서 밤새 고정시킵니다.
- 멤브레인 삽입물 아래에서 고정액을 제거하고 뇌 절편에 남아 있는 고정액을 제거합니다(고정액은 멤브레인 삽입물을 통해 아래 우물로 누출되는 경향이 있음).
- 35mm 웰에서 슬라이스가 있는 인서트를 제거하고 더 큰 플라스틱 접시에 넣습니다.
- 350μL의 PBS를 뇌 절편(면역염색 시 한 조각/우월)의 수만큼 웰에 추가하여 24웰 플레이트를 준비합니다.
- 얇은 주걱을 사용하여 막 삽입물에서 뇌 절편을 분리하지 않고 뇌 절편 주위에서 아가로스를 부드럽게 제거합니다. 아가로스가 뇌 조각의 바깥 쪽 가장자리에서 쉽게 분리되는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 아가로스를 뇌 조각에 부착하십시오.
- 날카로운 메스를 사용하여 밑에 있는 막이 있는 절편이 삽입물의 나머지 부분에서 자유로워질 때까지 뇌 절편 주위의 막을 자릅니다. 미세한 집게를 사용하여 뇌 절편이 부착된 막을 집어 들고 PBS의 24웰 플레이트의 우물에 넣습니다.
- 차가운 방에서 PBS로 3 시간 동안 슬라이스를 1 시간 이상 헹구어 슬라이스가 우물 내에서 움직이도록합니다.
- 헹구는 동안 1 차 항체 용액을 준비하십시오.
- PBSTG에서 항라미닌을 2μg/mL로 희석합니다( 표 1 참조).
- 웰로부터 PBS를 제거하고, 1차 항체 용액 중에서 하룻밤 동안 온화하게 교반하면서 차가운 방에서 인큐베이션한다.
- 최소 20시간의 배양 후, 1차 항체 용액을 흡인하고 PBSTG에서 1시간 동안 절편을 3배 헹굽니다.
- 헹구는 동안 2 차 항체 용액을 준비하십시오.
- 0.1μg/mL 농도의 비스벤지미드와 함께 PBSTG에서 1:200 희석에 필요한 특정 형광색으로 형광 GAM을 희석합니다.
- PBSTG를 제거하고 형광 2차 항체 용액을 교반하면서 차가운 방에서 밤새 배양합니다.
- 2차 항체를 제거하고 PBSTG에서 1시간에 걸쳐 2배, PBS에서 1시간에 걸쳐 1배 헹굽니다.
- 현미경 슬라이드(섹션 5)에 장착할 준비가 될 때까지 PBS에 그대로 두고 view.
Representative Results
여기에 제시된 여러 그림은 시신경에 생체 내 주입을 수행하고(그림 1 및 그림 2), 살아있는 뇌 절편을 배양하고 생존력을 평가하고(그림 3), 생체 외 뇌 절편 배양을 만들고, 생검 펀치 방법을 사용하여 형광 표지된 세포를 이식하고(그림 4), poly-HEMA에서 세포를 배양하여 세포 스페로이드를 생성(그림 5), 세포 스페로이드와 생체 외 뇌 절편 공동 배양을 만들고 4D 컨포칼 타임랩스 현미경을 사용하여 침습성 세포 거동을 기록하고(그림 6), 고정된 뇌 절편 제제에서 혈관을 기준으로 스페로이드의 침습성 세포 거동을 분석합니다(그림 7 및 그림 8). 이러한 결과는 결코 완전한 것이 아니라 인간 GBM 연구를 위한 이종이식 모델로 병아리 배아 뇌를 사용하여 얻을 수 있는 좋은 예를 제공합니다.
도 1은 GFP를 발현하는 GSCs의 주입 후 생체 내에서 시신경에 형성된 종양의 대표적인 결과를 보여준다. GSC는 심실 표면에 부착되어 뇌벽에 침윤성 종양을 형성합니다. GSC는 분명히 혈관 근처에 있으며 혈관을 따라 이동하는 것으로 보입니다. 생체 내 GSC 종양의 고정 및 면역염색 슬라이스의 회전 3D 볼륨 렌더링 동영상은 보충 비디오 S1, 보충 비디오 S2, 보충 비디오 S3 및 보충 비디오 S4에 제공됩니다. 이 실험에서는 5가지 특징(녹색 GSC, 흰색 핵, 흰색 혈관, 파란색 인테그린 알파-6 및 빨간색 Sox2 또는 빨간색 네스틴)을 식별하기 위해 4가지 색상을 사용했습니다.
도 2는 레트로바이러스 벡터 형질도입으로 인해 mCherry를 발현하는 U-118/L1LE 세포2와 혼합된 GFP를 발현하는 GSC를 주사한 후 생체 내 시신경에 형성된 종양의 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 실험은 이러한 종양이 혼합 세포 현탁액으로 형성됨에 따라 GSC가 말초 또는 중심에 존재하는 반면 U-118 세포는 특정 GSC 라인에 따라 내부 코어 또는 외부 피질로 구성되도록 분류가 발생했음을 보여주었습니다.
도 3 은 생체 외 뇌 절편 배양의 생존율 결과를 나타낸 것이다. 배양 1주일 후, 라미닌에 대한 고정 및 면역염색은 많은 온전한 혈관과 Sox2의 발현을 밝혀냈으며, 둘 다 뇌 절편의 생존력을 입증하기 위해 여기에서 사용되었습니다. 이것은 병아리 배아 뇌 절편이 약 2주 동안 막 삽입물에서 배양될 수 있고 정상적으로 보이는 혈관 및 전사 인자 발현으로 생존할 수 있음을 보여주었습니다.
그림 4 는 생검 펀치 방법을 사용하여 조각에 공동을 만든 후 빨간색 U-118/L1LE/mCherry 세포(매트릭스와 혼합됨)의 "플러그"를 생체 외 뇌 조각에 도입한 결과를 보여줍니다. U-118 세포는 분명히 뇌 조직을 침범했으며, 때로는 광범위하게, 그리고 종종 혈관을 따라 침범했습니다. 그러나, 세포 침윤은 도입된 세포의 둘레 주위에서 균일하지 않았다. 혈관은 때때로 특정 조각에서 손상되거나 없는 것처럼 보였는데, 아마도 펀치 방법의 추가 외상이나 배양 시간 때문일 것입니다. 이것은 생검 펀치/세포 플러그 방법을 사용하여 배양된 생체 외 뇌 절편의 특정 위치에 GBM 세포를 도입한 후 세포가 뇌 절편을 침범할 수 있음을 보여주었습니다.
그림 5 는 배양 중인 살아있는 스페로이드와 타임랩스 실험을 위해 생체 외 뇌 절편에 도입된 살아있는 GBM 세포 스페로이드의 광시야 형광의 몇 가지 예를 보여줍니다. 스페로이드에서 뇌 절편으로의 세포 침범 동영상은 보충 비디오 S5 및 보충 비디오 S6 에 나와 있습니다. 이것은 세포 스페로이드가 생체 외 뇌 절편의 특정 위치에 GBM 세포 또는 GSC를 도입하는 또 다른 성공적인 방법이며, 개별 세포의 해상도가 낮을 수 있지만 광시야 형광 현미경으로 침습성 세포 거동을 모니터링할 수 있음을 보여주었습니다.
그림 6은 살아있는 GSC16-4/GFP 및 U-118/L1LE/mCherry 세포가 뇌 조각으로 침입하는 공초점 타임랩스 실험의 정적 이미지를 보여줍니다. 공초점 z-스택 이미지는 다지점 타임랩스 실험에서 20시간 동안 10분마다 획득되었습니다. 시간이 지남에 따라 스페로이드에서 공초점 z-스택으로 촬영된 뇌 조각으로의 세포 침범 동영상은 보충 비디오 S7, 보충 비디오 S8, 보충 비디오 S9, 보충 비디오 S10 및 보충 비디오 S11에 제공됩니다. 이 실험은 컨포칼 타임랩스 이미징이 개별 세포 침습 행동을 추적하는 데 광시야 형광보다 우수하다는 것을 보여주었습니다. U-118/L1LE 세포는 이러한 조건에서 GSC보다 눈에 띄게 더 침습적이었습니다. 이것은 GSC가 더 중앙에 위치하고 U-118 셀이 더 분산되어 있는 정적 이미지에서도 분명합니다.
그림 7 은 생체 외 뇌 절편/스페로이드 제제의 몇 가지 예를 보여주며, 별도로 표지된 두 개의 서로 다른 스페로이드(U-118/L1LE/mCherry 스페로이드 및 GSC16-4/GFP 스페로이드)를 뇌 절편에 배치하고 며칠 동안 성장시킨 후 고정하고 라미닌에 대해 면역염색한 후 컨포칼 현미경에서 광학 절편으로 이미지화했습니다. 이것은 두 세포 유형 모두 뇌 조각을 침범하여 혈관을 따라 이동한다는 것을 보여주었습니다. 서로 다른 유형의 스페로이드가 서로 접촉할 수 있을 만큼 가까웠을 때, 한 세포 유형이 다른 세포 유형의 스페로이드로 침입하는 경우는 거의 없는 것으로 보였고 스페로이드는 분리된 상태로 유지되었습니다.
그림 8 은 서로 다르게 표지된 두 가지 세포 유형(U-118/L1LE/mCherry와 GSC16-4/GFP가 혼합된 것)을 사용하여 배양에서 생성된 "혼합 세포 유형" 스페로이드를 뇌 절편에 배치하고, 며칠 동안 성장시킨 다음, 고정하고, 라미닌에 대해 면역염색하고, 컨포칼 현미경에서 광학 절편으로 이미지화한 생체 외 뇌 절편/스페로이드 제제의 몇 가지 예를 보여줍니다. 이것은 적색 U-118/L1LE/mCherry 세포가 스페로이드 밖으로 이동하여 스페로이드 중심 근처의 덩어리로 남아 있는 경향이 있는 녹색 GSC16-4/GFP 세포보다 훨씬 더 분명하게 분산되었음을 보여주었습니다. 또한 U-118/L1LE/mCherry 세포도 DiD로 염색하여 고정된 생체 외 제제에서 두 개의 개별 라벨(mCherry 및 DiD)을 직접 비교할 수 있었습니다. DiD 라벨은 뇌 조각을 침범 한 단일 세포에서도 여전히 검출 될 수 있습니다. 그러나 이것은 세포 내 점상과 같았습니다.
그림 1: 생체 내에서 E5 시신경에 GSC를 주입하여 발생하는 E15의 종양. GSC는 GFP 발현으로 인해 녹색입니다. GSC15-2 셀은 패널 A, C 및 E에 도시되어 있고, GSC16-4 셀은 패널 B, D 및 F에 도시되어 있다. (A) 심실 근처에 종양이 있는 시신경의 저배율 보기(V). Sox2 염색은 빨간색으로 표시되며, 이는 OT 세포의 핵 대부분을 염색합니다. (B) A와 유사한 이미지이지만 GSC16-4 세포가 빨간색으로 네스틴에 대해 염색되어 색상 혼합 및 이미지 노출로 인해 이미지에서 노란색 또는 흰색으로 나타날 수 있습니다. OT 핵은 비스벤지미드로 인한 대조염색으로 인해 흰색으로 나타납니다. (C-F) 60x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 z-스택에서 생성된 볼륨 렌더의 다양한 관점. 세포핵은 비스벤지미드 염색으로 인해 흰색으로 나타나고, 일부는 Sox2에 대한 면역염색으로 인해 패널 C 및 E에서 빨간색으로 나타납니다. 패널 D 및 F에서의 적색 염색은 네스틴에 대한 염색으로부터 발생한다. 컨포칼 현미경 소프트웨어의 볼륨 렌더링을 위한 "알파 블렌딩"으로 인해 색상은 최대 강도 투영을 사용할 때처럼 혼합되지 않으며 가장 널리 사용되는 색상이 우세하고 덜 강렬한 색상을 가립니다. 혈관은 라미닌에 대한 면역 염색으로 인해 흰색으로 염색됩니다. GSC 마커 인테그린 알파-6 염색은 청색으로 표시되고, GSC 표면에 점상으로 나타난다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 패널 C-F에서 볼륨 렌더의 회전 비디오는 보충 비디오 S1, 보충 비디오 S2, 보충 비디오 S3 및 보충 비디오 S4에 제공됩니다. 스케일 바 = 500 μm (A, B). 약어: GSCs = 교모세포종 줄기 세포; OT = 시신경; GFP = 녹색 형광 단백질; BV = 혈관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: E5 시신경에 주입된 GSC와 U-118 GBM 세포의 혼합물로 인한 E15의 종양. GSC는 GFP 발현으로 인해 녹색이고 U-118/L1LE 세포는 mCherry 발현으로 인해 빨간색입니다. GSC15-2는 패널 A-D에 표시되고 GSC16-4는 패널 E 및 F에 표시됩니다. (A) 심실 근처의 혼합 세포 종양(화살표)의 저배율 공초점 단일 z-평면. 핵은 비스벤지미드로 흰색으로 대조염색됩니다. (B) 적색 U-118 세포가 심실 표면 근처의 OT로 침범한 A에 나타난 종양의 더 높은 배율(10x 목표). (C) OT 벽에 더 깊숙이 박힌 종양(화살표)을 보여주는 A의 광학 단면과 약간 다른 평면. (D) 종양 내에서 분류된 세포의 세부 정보를 보여주는 C에서 종양의 다중 z-평면의 최대 투영(20x 목표). (E) GSC16-4 세포와 혼합된 종양의 단일 z-평면 이미지(20x 대물렌즈)로, 종양 내 분류가 GSC15-2 세포와 반대 패턴으로 발생했으며 녹색 GSC는 빨간색 U-118 세포를 둘러싸고 있는 얇고 균일한 피질을 생성함을 보여줍니다. OT 벽에 대한 종양의 부착 영역은 이 z-평면에 표시되지 않습니다. U-118/L1LE 세포가 부풀어 오른 GSC 피질의 불연속성이 있는 종양 영역에 주목하십시오(화살표). L1CAM에 대한 면역염색은 파란색으로 표시하였다. (F) E와 동일한 이미지이지만 녹색 GSC와 파란색 L1CAM 염색만 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). 약어: GSCs = 교모세포종 줄기 세포; OT = 시신경; GFP = 녹색 형광 단백질; V = 심실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 배양 1주일 후 생체 외 시신경 절편 절편의 생존력. E14 시신경 구조 절편을 멤브레인 삽입물에서 1주일 동안 배양한 후 고정하고 면역염색했습니다. A와 B에 표시된 것은 비스벤지미드(A)로 핵에 대해 염색되고 라미닌(B)에 대해 면역염색된 뇌 절편의 공초점 이미지(10x 대물렌즈)로, 라미닌 염색 덕분에 다양한 구성으로 광학적으로 절개된 정상적이고 손상되지 않은 혈관을 명확하게 보여줍니다. (C) 패널 A와 B에 표시된 것과 유사한 공초점 이미지로, 핵과 라미닌 염색이 모두 보입니다. (D) 핵 및 라미닌 염색의 세부 사항을 보여주는 고배율(60x 오일 대물렌즈) 컨포칼 이미지. (E) 빨간색의 Sox2 전사 인자와 흰색의 비스벤지미드가 있는 총 핵에 대해 염색된 뇌 절편의 공초점 z-스택(20x 대물렌즈)의 최대 투영 이미지. 대부분의 핵은 생체 내에서 표시된 것처럼 Sox2 염색을 나타냅니다(그림 1 참조). 스케일 바 = 100 μm (A,B,C,E), 25 μm (D). 약어: P = pial surface. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: U-118/mCherry 세포를 생검 펀치 방법을 통해 생체 외 뇌 절편에 배치했습니다. 1mm 생검 펀치를 사용하여 뇌 절편에 충치를 만든 다음 매트릭스와 혼합된 빨간색 U-118/L1LE/mCherry 세포를 "플러그"로 이식했습니다. 며칠 후, 뇌 절편을 고정하고, 라미닌에 대해 면역염색하고, 컨포칼 현미경 분석을 위해 슬라이드에 장착했습니다. 패널 A와 C는 뇌 조각을 침범한 결과 "종양"과 주변 세포의 저배율, 공초점, 단일 z-평면 이미지(4x 대물렌즈)를 보여줍니다. (B) U-118 세포의 광범위한 침입을 보여주는 더 높은 배율(20x 대물렌즈)에서 패널 A의 준비에서 z-스택의 볼륨 렌더링(화살표). (D) 이미지는 패널 C에 표시된 광범위하게 침입하는 셀의 하부의 유사한 볼륨 렌더링을 보여줍니다. 라미닌 염색은 녹색으로 표시되지만 명확한 혈관은 뚜렷하지 않습니다. (E) 이미지는 세포 플러그의 일부와 뇌 절편을 침범한 세포 그룹과 파란색의 혈관에 대한 라미닌 염색을 보여줍니다. (F) 패널 E에 도시된 침윤 세포의 더 높은 배율, 및 세포가 혈관을 따라 정렬된 것을 명확하게 볼 수 있다(화살표). 모든 패널은 비스벤지미드로 백색 핵 대조염색을 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). 패널 B와 D의 배율은 볼륨 렌더 축을 따라 조정됩니다. 약어: OT = optic tectum. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 배양 내 생세포 스페로이드 및 생체 외 뇌 절편에서 살아있는 GBM 세포의 광시야 형광 이미지. 패널 A와 B 는 스페로이드(화살표)로 성장하는 U-118/L1LE GBM 세포(A) 및 GSC(B)의 위상차 이미지(도립 현미경에서 10x 대물렌즈 사용)입니다. 패널 A의 배경에 표시된 것은 세포 배양 접시 상에서 발생할 수 있는 폴리-HEMA 코팅의 초점이 맞지 않는 불균일성이다. 패널 C-F에 표시된 것은 생체 외 슬라이스로의 침입의 실시간 거동을 모니터링하기 위한 타임랩스 실험 중 U-118/L1LE 세포 스페로이드 및 침입 세포(화살표)의 광시야 형광 이미지입니다(맞춤형 타임랩스 현미경 시스템18에서 20x 대물렌즈 사용). 패널 C와 E에서 세포는 원적외선 형광막 염료 DiD로 염색되고, 패널 D와 F에서는 세포가 적색 mCherry 발현을 통해 이미지화됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 패널 C 및 D에 표시된 광시야 형광 타임랩스 실험의 비디오는 각각 보충 비디오 S5 및 보충 비디오 S6에 있습니다. 약어: GBM = 교모세포종; GSCs = GBM 줄기 세포; S = 스페로이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 라이브 GSC 및 GBM 셀의 컨포칼 4D 타임랩스의 볼륨 렌더링 이미지. 모든 패널에는 별도의 뇌 절편에 있는 5개의 서로 다른 혼합 세포 스페로이드 생착의 종점 이미지가 표시됩니다. 패널 AE의 경우, 20시간 동안 10분마다 10μm 간격으로 공초점 z-스택 이미지를 획득했습니다. 준비에는 빨간색 U-118/L1LE/mCherry 세포와 녹색 GSC16-4/GFP 세포의 혼합 세포 스페로이드가 이식된 뇌 조각이 포함되었습니다. 필요한 추가 작동 거리를 제공하는 ELWD(Ultra-Long Working Distance) 20x 대물 렌즈(0.45 NA)를 사용하여 6웰 플라스틱 세포 배양 접시의 멤브레인 삽입물에서 뇌 조각을 배양하는 동안 공초점 이미지를 촬영했습니다. 볼륨 렌더링은 컨포칼 현미경 소프트웨어 "Alpha Blending"을 사용하여 생성되었으며, 이는 명백한 3D 효과를 제공합니다. 시간 경과에 따른 이러한 컨포칼 볼륨 렌더의 타임랩스 비디오는 보충 비디오 S7, 보충 비디오 S8, 보충 비디오 S9, 보충 비디오 S10 및 보충 비디오 S11에 제공됩니다. 약어: GBM = 교모세포종; GSCs = GBM 줄기 세포; GFP = 녹색 형광 단백질; NA = 개구수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 다양한 세포 유형의 스페로이드에서 추출한 침습성 GBM 세포가 있는 고정된 뇌 절편의 컨포칼 이미지. 녹색 스페로이드는 GSC16-4/GFP 세포로 구성되었고 빨간색 스페로이드는 U-118/L1LE/mCherry 세포로 구성되었습니다. 패널 A-F에 표시된 것은 라미닌(파란색)에 대한 고정 및 면역염색 전에 여러 개의 적색 및 녹색 스페로이드를 며칠 동안 배양한 뇌 절편에 대한 다양한 보기입니다. 패널 A-C는 A가 4x 대물렌즈로 촬영된 동일한 OT 슬라이스이고, 패널 B와 C는 패널 A에 표시된 두 개의 스페로이드에서 뇌 슬라이스를 침범한 세포의 더 높은 배율 볼륨 렌더링(20x 대물렌즈)입니다. 두 세포 유형 모두 혈관을 따라 조직을 침범했습니다. 패널 D는 두 개의 서로 다른 스페로이드가 서로 가깝게 위치하고, 두 개의 세포가 그들 사이에 위치한 동일한 혈관을 따라 이동하는 것을 볼 수 있는 다른 뇌 슬라이스의 볼륨 렌더링(20x 대물렌즈)을 보여줍니다(화살표). 패널 E는 녹색 세포가 혈관의 외부 표면을 따라 이동하는 반면 적색 세포는 혈관 내부로 이동하는 것을 보여주는 고배율(60x 오일 대물렌즈) 볼륨 렌더링입니다(화살표). 삽입된 부분은 단일 z-평면 광학 섹션을 보여주며, 여기서 빨간색 세포는 혈관의 파란색 염색(화살표)으로 명확하게 둘러싸여 있고 녹색 세포는 명확하게 혈관 외부에 있습니다. 삽입된 스케일 바 = 50μm. 패널 F는 서로 다른 색상의 스페로이드 두 개가 밀접하게 부착된 전뇌 슬라이스의 볼륨 렌더링(10x 대물렌즈)을 보여줍니다. 한 스페로이드에서 다른 스페로이드로 세포 침입이 거의 발생하지 않았으며 그들 사이에는 날카로운 경계가 존재했습니다. 패널 A, B, C 및 E는 또한 비스벤지미드를 사용한 백색 핵 대조 염색을 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm (A). 패널 B-F의 배율은 볼륨 렌더 축을 따라 있습니다. 약어: GBM = 교모세포종; GSCs = GBM 줄기 세포; GFP = 녹색 형광 단백질; OT = 시신경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 혼합 세포 스페로이드 및 DiD로 표지된 스페로이드의 침습성 GBM 세포가 있는 고정된 뇌 절편의 컨포칼 이미지. 패널 A-D는 녹색 GSC16-4/GFP 세포와 빨간색 U-118/L1LE/mCherry 세포로 구성된 혼합 세포 스페로이드를 포함하는 뇌 조각의 볼륨 렌더링을 보여줍니다. 수많은 적색 U-118 세포가 스페로이드에서 흩어져 모든 방향으로 뇌 조각을 침범한 반면, 녹색 GSC는 분산되지 않고 스페로이드의 중앙 위치에 남아 있었습니다. 패널 E와 F는 원적외선 막 염료 DiD(파란색으로 표시)로 표지된 빨간색 U-118/L1LE/mCherry 스페로이드를 사용한 생체 외 슬라이스 준비를 보여줍니다. 고정 후, 슬라이스를 녹색의 라미닌에 대해 면역염색하였다. DiD 라벨은 적혈구에서 점상 염색(화살표)으로 볼 수 있었고 혈관을 따라 스페로이드에서 분산된 세포에서도 볼 수 있었습니다. 비스벤지미드를 사용한 핵 대조염색은 이 그림에 표시되지 않으므로 다른 염색이 더 명확하게 보입니다. 스케일 바 = 100 μm (E,F). 약어: GBM = 교모세포종; GSCs = GBM 줄기 세포; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매체/용액 | 구성 | ||
| GSC 미디어 | DMEM/F12의 1:1 혼합물, 1% 소 태아 혈청(FBS), 15mM HEPES 완충액, 2mM L-글루타민, 100μg/mL 페니실린-스트렙토마이신(pen/strep), 비타민 A가 없는 2% B27 보충제 및 2.5μg/mL 헤파린. | ||
| GBM 미디어 | DMEM(고포도당), 10% FBS, 펜/연쇄상 구균 및 2mM L-글루타민. | ||
| 고정 버퍼 | 0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액의 2% PFA | ||
| 임베딩 매체 | PBS에서 3.5% 한천 및 8% 자당 | ||
| 증권 시세 표시기 | PBS의 0.1% Triton X-100 + 5% 정상 염소 혈청(NGS) | ||
| U-118 MG 세포 배양 배지 | DMEM + 10% FBS + 펜/연쇄상 구균 + L-글루타민 | ||
| 뇌 절편 배양 배지 | 50% MEM + 25% HBSS + 25% 말 혈청 + B27 + 펜/연쇄상 구균 + L-glut + 15mM HEPES 버퍼 | ||
| 진동 조직 슬라이서 슬라이싱 미디어 | 중간 199 + 펜/연쇄상 구균 + 15mM HEPES 버퍼 | ||
표 1: 이 프로토콜에 사용된 미디어 및 버퍼의 구성.
보충 그림 1: E5 광학 구조에 주입. (A) 공기 공간 위의 달걀 껍질에 구멍을 뚫고 공기 공간 멤브레인을 식염수 또는 배지로 적신 후 미세 집게로 멤브레인을 제거합니다. (B) 시신경에 세포를 주입하기 위해 양막을 꼬집고 미세한 집게로 잡아 시신경에 접근할 수 있도록 머리를 배치합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 시신경에 삽입하고 세포에 압력을 주입합니다. (C) 세포 주입 후 주사기와 미세 바늘을 사용하여 배아 위에 암피실린 용액 몇 방울을 추가합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: E15 뇌 영역의 해부. (A) 참수 후, E15 배아 머리를 멸균 CMF 용액이 담긴 접시에 넣습니다. (B) 그런 다음 미세한 집게를 사용하여 뇌 위에 있는 피부를 제거합니다. (C ) 그런 다음 두 개의 두개골 뼈가 두 개의 전뇌(FB) 반구 위에 있는 것에서 제거됩니다. (D) 결합 조직 경막은 전뇌 (FB), 시신경 및 소뇌 주변에서 부드럽게 제거됩니다. (E) 그런 다음 구부러진 집게를 사용하여 뇌강 아래에서 뇌강 밖으로 부드럽게 퍼내어 뇌 전체를 머리에서 제거합니다. (F ) 전뇌(FB), 시신경(OT) 및 소뇌(CB)가 있는 제거된 전체 뇌의 등쪽 모습이 표시됩니다. (G ) 그런 다음 분리된 뇌를 미세 가위를 사용하여 전뇌(FB), 시신경(OT) 반구 및 소뇌(CB)로 해부합니다. (H ) 섬세한 결합 조직 피아는 미세한 집게를 사용하여 시신경(OT) 반구에서 쉽게 제거됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: E15 광학 구조의 임베딩 및 슬라이싱과 세포 스페로이드 배치. (A) 하나의 시신경 지각 반구는 곡선 집게를 사용하여 저융점 아가로스에 잠겨 있습니다. (B) 아가로스가 얼음 위에서 굳은 후, 시신경을 포함하는 블록을 다듬어 슬라이싱 접시/트레이의 스테인리스 스틸 받침대에 접착합니다. (C) 접착제가 건조된 후 슬라이싱 접시/트레이를 진동 티슈 슬라이서의 척에 넣고 냉간 슬라이싱 매체로 채웁니다. 그런 다음 물에 잠긴 티슈 블록에서 사파이어 나이프로 슬라이스를 자릅니다. 자른 조각은 접시/쟁반에 뜨고 주걱을 사용하여 제거할 수 있습니다. (D) 절단된 슬라이스를 접시/트레이에서 제거하고 멀티웰 플레이트의 기본 슬라이스 배양 배지가 있는 멤브레인 삽입물에 직접 놓습니다. (E) 세포 스페로이드가 poly-HEMA 코팅 접시에서 성장한 후, 20μL 마이크로피펫터를 사용하여 최소량의 배지에서 스페로이드를 접시에서 제거합니다. (F) 분리된 스페로이드는 최소 매체의 뇌 절편에 직접 배치됩니다. (G) 스페로이드가 매체의 흐름으로 인해 뇌 절편에서 떨어지면 나무 어플리케이터 스틱에 붙인 속눈썹을 사용하여 뇌 절편으로 다시 밀어 넣을 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S1: E15에서 작은 GSC15-2 종양의 고배율 볼륨 렌더링 비디오. GSC는 GFP 발현으로 인해 녹색입니다. 비디오는 그림 1C 에 해당하며 GSC15-2 셀을 보여줍니다. 이 비디오는 60x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 z-스택에서 생성된 볼륨 렌더의 회전을 보여줍니다. 세포핵은 비스벤지미드 염색으로 인해 흰색으로 나타나고 일부는 Sox2에 대한 면역염색으로 인해 빨간색으로 나타납니다. 컨포칼 현미경 소프트웨어의 볼륨 렌더링을 위한 "알파 블렌딩"으로 인해 최대 강도 투영을 사용할 때처럼 색상이 혼합되지 않으며 가장 강렬한 색상이 우세하고 덜 강렬한 색상을 가립니다. 혈관은 라미닌에 대한 면역 염색으로 인해 흰색으로 염색됩니다. GSC 마커 인테그린 알파-6 염색은 파란색으로 표시되고, 녹색 GSC 표면 상에 점상으로 나타난다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S2: E15에서 작은 GSC16-4 종양의 고배율 볼륨 렌더링 비디오. GSC는 GFP 발현으로 인해 녹색입니다. 비디오는 그림 1D 에 해당하며 GSC16-4 셀을 보여줍니다. 이 비디오는 60x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 z-스택에서 생성된 볼륨 렌더의 회전을 보여줍니다. 세포핵은 비스벤지미드 염색으로 인해 흰색으로 나타나고 일부 GSC는 네스틴에 대한 면역염색으로 인해 빨간색으로 나타납니다. 컨포칼 현미경 소프트웨어의 볼륨 렌더링을 위한 "알파 블렌딩"으로 인해 최대 강도 투영을 사용할 때처럼 색상이 혼합되지 않으며 가장 강렬한 색상이 우세하고 덜 강렬한 색상을 가립니다. 혈관은 라미닌에 대한 면역 염색으로 인해 흰색으로 염색됩니다. GSC 마커 인테그린 알파-6 염색은 파란색으로 표시되고, 녹색 GSC 표면 상에 점상으로 나타난다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S3: E15에서 작은 GSC15-2 종양의 고배율 볼륨 렌더링 비디오. GSC는 GFP 발현으로 인해 녹색입니다. 비디오는 그림 1E 에 해당하며 GSC15-2 셀을 보여줍니다. 이 비디오는 60x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 z-스택에서 생성된 볼륨 렌더의 회전을 보여줍니다. 세포핵은 비스벤지미드 염색으로 인해 흰색으로 나타나고 일부는 Sox2에 대한 면역염색으로 인해 빨간색으로 나타납니다. 컨포칼 현미경 소프트웨어의 볼륨 렌더링을 위한 "알파 블렌딩"으로 인해 최대 강도 투영을 사용할 때처럼 색상이 혼합되지 않으며 가장 강렬한 색상이 우세하고 덜 강렬한 색상을 가립니다. 혈관은 라미닌에 대한 면역 염색으로 인해 흰색으로 염색됩니다. GSC 마커 인테그린 알파-6 염색은 파란색으로 표시되고, 녹색 GSC 표면 상에 점상으로 나타난다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S4: E15에서 작은 GSC16-4 종양의 고배율 볼륨 렌더링 비디오. GSC는 GFP 발현으로 인해 녹색입니다. 비디오는 그림 1F 에 해당하며 GSC16-4 셀을 보여줍니다. 이 비디오는 60x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 z-스택에서 생성된 볼륨 렌더의 회전을 보여줍니다. 세포핵은 비스벤지미드 염색으로 인해 흰색으로 나타나고 일부는 네스틴에 대한 면역염색으로 인해 빨간색으로 나타납니다. 컨포칼 현미경 소프트웨어의 볼륨 렌더링을 위한 "알파 블렌딩"으로 인해 최대 강도 투영을 사용할 때처럼 색상이 혼합되지 않으며 가장 강렬한 색상이 우세하고 덜 강렬한 색상을 가립니다. 혈관은 라미닌에 대한 면역 염색으로 인해 흰색으로 염색됩니다. GSC 마커 인테그린 알파-6 염색은 파란색으로 표시되고, 녹색 GSC 표면 상에 점상으로 나타난다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S5: 생체 외 뇌 조각에서 살아있는 GBM 세포의 비디오. 비디오는 그림 5C 에 해당하며 생체 외 슬라이스로의 침입의 실시간 거동을 모니터링하기 위한 타임랩스 실험 중 U-118/L1LE 세포 스페로이드 및 침입 세포의 광시야 형광 이미지를 보여줍니다(맞춤형 타임랩스 현미경 시스템에서 20x 대물렌즈 사용). U-118/L1LE 세포는 원적외선 형광막 염료 DiD로 염색되었습니다. 이미지는 흑백 카메라로 획득했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S6: 생체 외 뇌 조각에서 살아있는 GBM 세포의 비디오. 비디오는 그림 5D 에 해당하며 생체 외 슬라이스로의 침입의 실시간 거동을 모니터링하기 위한 타임랩스 실험 중 U-118/L1LE 세포 스페로이드 및 침입 세포의 광시야 형광 이미지를 보여줍니다(맞춤형 타임랩스 현미경 시스템에서 20x 대물렌즈 사용). 세포는 적색 mCherry 발현을 통해 이미지화되었습니다. 이미지는 흑백 카메라로 획득했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S7: 라이브 GSC 및 GBM 셀의 컨포칼 4D 타임랩스 볼륨 렌더링 이미지 비디오. 비디오는 도 6A에 대응한다. 컨포칼 z-스택 이미지는 20시간 동안 10분마다 10μm 단계로 획득되었습니다. 준비는 적색 U-118/L1LE/mCherry 세포와 녹색 GSC16-4/GFP 세포의 혼합 세포 스페로이드를 이식한 뇌 절편으로 구성되었습니다. 필요한 추가 작동 거리를 제공하는 ELWD 20x 대물 렌즈(0.45NA)를 사용하여 6웰 플라스틱 세포 배양 접시의 멤브레인 삽입물에서 뇌 절편을 배양하는 동안 공초점 이미지를 촬영했습니다. 볼륨 렌더링은 컨포칼 현미경 소프트웨어 "Alpha Blending"을 사용하여 생성되었으며, 이는 명백한 3D 효과를 제공합니다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 비디오 플레이어가 정상적인 느린 속도로 진행되도록 하는 대신 비디오 플레이어의 비디오 진행률 슬라이더를 앞뒤로 수동으로 드래그하여 셀 움직임을 관찰하는 것이 비디오를 가장 잘 관찰할 수 있습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S8: 라이브 GSC 및 GBM 셀의 컨포칼 4D 타임랩스 볼륨 렌더링 이미지 비디오. 비디오는 도 6B에 대응한다. 컨포칼 z-스택 이미지는 20시간 동안 10분마다 10μm 단계로 획득되었습니다. 준비는 적색 U-118/L1LE/mCherry 세포와 녹색 GSC16-4/GFP 세포의 혼합 세포 스페로이드를 이식한 뇌 절편으로 구성되었습니다. 필요한 추가 작동 거리를 제공하는 ELWD 20x 대물 렌즈(0.45NA)를 사용하여 6웰 플라스틱 세포 배양 접시의 멤브레인 삽입물에서 뇌 절편을 배양하는 동안 공초점 이미지를 촬영했습니다. 볼륨 렌더링은 컨포칼 현미경 소프트웨어 "Alpha Blending"을 사용하여 생성되었으며, 이는 명백한 3D 효과를 제공합니다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 비디오 플레이어가 정상적인 느린 속도로 진행되도록 하는 대신 비디오 플레이어의 비디오 진행률 슬라이더를 앞뒤로 수동으로 드래그하여 셀 움직임을 관찰하는 것이 비디오를 가장 잘 관찰할 수 있습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S9: 라이브 GSC 및 GBM 셀의 컨포칼 4D 타임랩스 볼륨 렌더링 이미지 비디오. 비디오는 도 6C에 대응한다. 컨포칼 z-스택 이미지는 20시간 동안 10분마다 10μm 단계로 획득되었습니다. 준비는 적색 U-118/L1LE/mCherry 세포와 녹색 GSC16-4/GFP 세포의 혼합 세포 스페로이드를 이식한 뇌 절편으로 구성되었습니다. 필요한 추가 작동 거리를 제공하는 ELWD 20x 대물 렌즈(0.45NA)를 사용하여 6웰 플라스틱 세포 배양 접시의 멤브레인 삽입물에서 뇌 절편을 배양하는 동안 공초점 이미지를 촬영했습니다. 볼륨 렌더링은 컨포칼 현미경 소프트웨어 "Alpha Blending"을 사용하여 생성되었으며, 이는 명백한 3D 효과를 제공합니다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 비디오 플레이어가 정상적인 느린 속도로 진행되도록 하는 대신 비디오 플레이어의 비디오 진행률 슬라이더를 앞뒤로 수동으로 드래그하여 셀 움직임을 관찰하는 것이 비디오를 가장 잘 관찰할 수 있습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S10: 라이브 GSC 및 GBM 셀의 컨포칼 4D 타임랩스 볼륨 렌더링 이미지 비디오. 비디오는 도 6D에 대응한다. 컨포칼 z-스택 이미지는 20시간 동안 10분마다 10μm 단계로 획득되었습니다. 준비는 적색 U-118/L1LE/mCherry 세포와 녹색 GSC16-4/GFP 세포의 혼합 세포 스페로이드를 이식한 뇌 절편으로 구성되었습니다. 필요한 추가 작동 거리를 제공하는 ELWD 20x 대물 렌즈(0.45NA)를 사용하여 6웰 플라스틱 세포 배양 접시의 멤브레인 삽입물에서 뇌 절편을 배양하는 동안 공초점 이미지를 촬영했습니다. 볼륨 렌더링은 컨포칼 현미경 소프트웨어 "Alpha Blending"을 사용하여 생성되었으며, 이는 명백한 3D 효과를 제공합니다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 비디오 플레이어가 정상적인 느린 속도로 진행되도록 하는 대신 비디오 플레이어의 비디오 진행률 슬라이더를 앞뒤로 수동으로 드래그하여 셀 움직임을 관찰하는 것이 비디오를 가장 잘 관찰할 수 있습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S11: 라이브 GSC 및 GBM 셀의 컨포칼 4D 타임랩스 볼륨 렌더링 이미지 비디오. 비디오는 도 6E에 대응한다. 컨포칼 z-스택 이미지는 20시간 동안 10분마다 10μm 단계로 획득되었습니다. 준비에는 빨간색 U-118/L1LE/mCherry 세포와 녹색 GSC16-4/GFP 세포의 혼합 세포 스페로이드가 이식된 뇌 절편이 포함되었습니다. 필요한 추가 작동 거리를 제공하는 ELWD 20x 대물 렌즈(0.45NA)를 사용하여 6웰 플라스틱 세포 배양 접시의 멤브레인 삽입물에서 뇌 절편을 배양하는 동안 공초점 이미지를 촬영했습니다. 볼륨 렌더링은 컨포칼 현미경 소프트웨어 "Alpha Blending"을 사용하여 생성되었으며, 이는 명백한 3D 효과를 제공합니다. 미크론 스케일은 볼륨 렌더의 가장자리를 따라 표시됩니다. 비디오 플레이어가 정상적인 느린 속도로 진행되도록 하는 대신 비디오 플레이어의 비디오 진행률 슬라이더를 앞뒤로 수동으로 드래그하여 셀 움직임을 관찰하는 것이 비디오를 가장 잘 관찰할 수 있습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
중뇌(시신경) 심실에 세포를 주입하기 위한 프로토콜의 중요한 단계에는 난자의 융모막 막에 있는 혈관을 손상시키지 않거나 주사 전과 주사 중에 배아를 둘러싸고 있는 혈관을 손상시키지 않는 것이 포함되지만, 배아를 바로 둘러싸고 있는 양막은 세포를 중뇌에 주입할 때 머리를 위치시키기 위해 부드럽게 당겨지고 유지될 수 있습니다. 양막은 비교적 단단하며 미세한 집게로 잡아당겨 머리를 배치하고 한 손으로 안정적으로 잡을 수 있으며, 다른 손으로 뇌 중앙에 있는 크고 둥근 구조인 시신경에 세포를 주입할 수 있습니다. 일반적으로 주입된 배아의 생존율은 알려지지 않은 요인에 따라 25%에서 75% 사이이며, 실제로 살아남은 모든 배아는 시신경에 적어도 작은 종양을 포함합니다. 생존 가능한 뇌 절편을 생성하는 중요한 단계에는 슬라이싱 중에 아가로스가 뇌에 달라붙도록 과잉 액체의 조직을 블로팅하고 멤브레인 삽입물에 놓일 때까지 조직과 슬라이스를 차갑게 유지하는 것이 포함됩니다. 서로 다른 세포 유형이 스페로이드를 다르게 형성하기 때문에(속도와 크기) poly-HEMA 플레이트에 도금된 세포 밀도와 스페로이드를 수확하기 전의 시간은 각 세포 유형에 맞게 최적화되어야 합니다.
여기에서의 연구는 뇌 절편 생존 가능성에 대한 공식적인 종단 연구의 대상이 아닙니다. Yang et al.은 여기에 사용된 것과 유사한 병아리 배아 뇌 절편 배양물을 사용하였고, 적어도 7일 동안 절편의 양호한 생존율을 보였다16. 이전 연구에서는 OT 조직이 최적이 아닌 배지에 보관되었을 때 많은 pyknotic 핵이 조직에 나타 났으며, 이는 여기 작업의 조각에서는 발생하지 않았습니다. 또한, 슬라이스가 최적이 아닌 조건에서 퇴화되면 혈관이 단편화되어 라미닌 양성 구체의 열로 나타납니다(표시되지 않음). 따라서, 여기서의 생존력은 전기생리학 또는 활성 카스파제-3 발현과 같은 방법에 의해 확인되지 않았지만, 최적이 아닌 배양 조건에서 관찰된 세포 사멸의 지표는 여기에 나타나지 않았다.
OT는 가장 큰 심실을 가진 가장 쉽게 주입되는 영역이기 때문에 생체 내 뇌종양 실험에 중점을 두었습니다. 배아가 노른자 위에 접근 할 수있을만큼 작은 가장 최근의 날인 E5에서는 모든 뇌 영역이 얇은 심실 영역에 지나지 않기 때문에 주사를 심실로 만들어야합니다. 그럼에도 불구하고 이러한 주사는 뇌 실질을 침범하는 세포가 있는 내장 종양을 성공적으로 초래합니다. 때로는 종양이 전뇌 또는 소뇌에서 발견되지만 흔하지는 않습니다. E15 시신경의 생체 외 절편은 주로 여기에서 실험에 사용되어 생체 외 공동 배양 결과가 생체 내 주입 실험 과 상관 관계가 있을 수 있습니다. 그러나 전뇌 절편도 적합하고 시신경에 비해 표면적이 더 크고 심실이 매우 얇기 때문에 전뇌가 생체 내 주사와 상관관계가 없는 생체 외 공동 배양에 더 적합할 수 있습니다.
여기에서 생체 내 주사, 조직 고정, 진동 조직 슬라이서 절편, 라미닌 및 기타 마커에 대한 면역염색이 혈관에 가까운 뇌 조직에서 GBM 세포 및 GSC의 고해상도 이미지를 생성한다는 것이 입증되었습니다. 종양 세포와 혈관 사이의 상호 관계를 결정하는 기능은 컨포칼 소프트웨어 및 제조업체의 지침을 사용하여 컨포칼 광학 섹션의 z 스택에서 3D 볼륨 렌더를 생성함으로써 크게 촉진되었습니다. GFP, mCherry 및 DiD 표지 세포의 광시야 형광 현미경을 사용한 타임랩스 이미징이 가능했습니다. 그러나 형광이 높은 스페로이드에 근접한 이동 세포는 때때로 스페로이드의 "빛"에 의해 가려졌습니다. 이러한 바람직하지 않은 효과는 광시야 이미지를 수집하기 위한 노출 시간을 신중하게 조정하여 다소 최소화할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 컨포칼 z-스택(4D)을 사용한 타임랩스 이미징은 스페로이드에서 초점이 맞지 않는 빛을 제거하고 어두운 배경으로 이동하는 세포를 선명하게 정의했습니다. 이것은 프로토콜에 설명되지 않았지만 뇌 절편이 6웰 플라스틱 플레이트의 투명 막 삽입물에 있는 동안 수행된 광시야 타임랩스 이미징과 유사하게 수행되었습니다. 컨포칼 타임랩스 이미징을 통해 개별 세포와 그 행동의 이미지가 훨씬 더 선명해지지만, 20시간 동안 10분 간격으로 10개의 z-평면/포인트의 z-스택을 수집하는 다지점 타임랩스 실험은 스캔 헤드 검류계를 광범위하게 사용합니다. 이것은 검류계의 수명을 크게 단축시킬 수 있으므로 이 방법은 현명하게 사용됩니다.
병아리 배아 시스템은 GBM 세포 행동을 조사하는 생체 내 주사 및 생체 외 공동 배양 실험 모두에 매우 적합하지만 이 모델 시스템에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 다른 이종이식 시스템과 마찬가지로 인간 세포가 이식되는 환경은 인간의 뇌가 아니지만 GBM 세포 행동은 설치류 모델과 인간 환자에서 이를 모방하는 것으로 보입니다. E5에 대한 생체 내 주사 실험을 수행 한 후, 종양은 일반적으로 E15까지 10 일 동안 형성되도록 허용된다. 이것은 분명히 종양 형성과 세포 침습의 모든 측면을 연구하기에 충분한 시간이 아닙니다. 그러나 여기에서 뇌 실질에서 고형 종양이 형성되고 세포가 종양 내에서 상호 작용하고 재배열되며 상당한 뇌 침범이 혈관을 따라 그리고 이 비교적 짧은 기간 내에 확산적으로 발생한다는 것이 입증되었습니다. 생체 내 병아리 배아 시스템에 대한 또 다른 한계는 병아리 배아 발달 동안 작동하는 큰 난황 및 배아 외 순환계 때문에 약물 또는 기타 치료에 적합하지 않다는 것입니다. 국소 액체 약물 치료는 배아에서 훨씬 더 큰 난황 덩어리로 확산되기 때문에 뇌에서 매우 다양하고 알려지지 않은 농도를 초래할 것입니다. 유사하게, 매우 섬세한 배아 외 순환계에 약물을 정맥 주사하면 혈관에서 누출되거나 확산되어 뇌에서 알 수 없는 농도가 발생합니다. 이것이 생체 외 절편 배양 방법을 채택한 주된 이유 중 하나로, 타임랩스 현미경을 통해 세포 행동을 관찰하고 추적할 수 있을 뿐만 아니라 접시에서 GBM 세포 행동을 변경하는 데 성공한 치료법을 보다 관련성이 높은 뇌 조직 환경에서 테스트할 수 있습니다.4
병아리 배아 동소 뇌종양 모델 시스템의 개발은 GBM 종양 형성 및 침습성 세포 행동 연구에 사용할 수 있는 시스템 및 도구에 중요한 추가 사항으로 간주됩니다. 수정된 닭고기 달걀은 대부분의 지역에서 쉽게 구할 수 있고, 설치류에 비해 가격이 저렴하며, 동물 관리 비용이 없고, 배아는 매우 탄력 있고 감염에 대한 저항성이 있으며(즉, 대부분의 작업은 벤치 탑에서 수행됨), 배아는 조작이 매우 가능하며 껍질이 없는 배양에서 자랄 수 있으며19, 병아리 배아는 척추동물로 간주되지 않으므로 NIH 지침(기관 요구 사항)에 의한 IACUC 승인이 필요하지 않습니다 다를 수 있음). 따라서 이러한 여러 장점으로 인해 병아리 배아 시스템은 질문과 실험을 한계에 속하는 것으로 제한하는 경우 매우 매력적입니다. 병아리 배아를 사용하여 다른 사람들에 의해 여러 GBM 세포 연구가 수행되었지만 이들은 거의 독점적으로 배아 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 및 사지 새싹 30의 융모막 막(CAM)을 활용했습니다, 그리고 뇌가 아닙니다. E231에서 병아리 뇌에 수모세포종을 이식했다는 보고도 있었습니다. 의심할 여지 없이, 여기에 설명된 바와 같이 병아리 배아를 동소 이종이식 모델 시스템으로 사용하는 것은 CAM을 사용한 연구보다 인간 GBM 종양 생물학에 훨씬 더 의미 있는 결과를 산출해야 합니다.
이러한 연구는 인간 GBM 세포 및 GSC 행동 연구를 위해 병아리 배아 뇌종양 모델 시스템을 완전히 활용하기 시작했지만 다른 연구에서도 사용을 확장하고 더 많은 잠재적 응용 분야를 찾을 수 있기를 바랍니다. 이 시스템은 GBM 종양 형성 및 세포 행동을 조절하는 메커니즘을 밝힐 뿐만 아니라 특정 환자의 세포에서 특정 약물 및 물질에 대한 전임상 테스트를 허용할 것이라고 상상할 수 있습니다. 예를 들어, 뇌 절편 배양이 미리 설정된 경우, 종양 세포, 외과적 종양 절제술 조각 또는 환자 유래 GBM 오가노이드(32 )를 생체 외 공동 배양에 직접 배치할 수 있으며, 다양한 치료법을 며칠 만에 평가할 수 있습니다. 유사하게, 해리된 환자 세포는 종양을 형성하고 뇌 실질을 침범하는 능력을 평가하기 위해 ovo의 E5 중뇌에 직접 주입될 수 있습니다. 따라서 여기에 있는 방법과 대표적인 결과에 대한 설명이 뇌암 연구에 활용도가 낮은 이 시스템의 사용을 촉진하고 장려할 수 있기를 바랍니다.
Disclosures
저자 중 누구도 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 암 연구소 (National Cancer Institute) (R03CA227312)의 DSG 보조금과 Lisa Dean Moseley Foundation의 관대 한 보조금으로 부분적으로 자금을 지원받았습니다. 살아있는 GBM 표본은 Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute의 조직 조달 센터를 통해 환자의 동의하에 획득되었습니다. AR에 대한 자금은 국립 연구 자원 센터 (National Center for Research Resources)와 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 국립 중개 과학 발전 센터 (National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health)에서 제공했습니다. N.P., A.L., Z.W. 및 KS에 대한 여름 학부 연구 펠로우십은 델라웨어 대학교 학부 연구 프로그램에서 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cm x 1 cm square hole paper punch | Birabira | N/A | |
| 1 mm biopsy punch pen | Robbins Instruments | 20335 | |
| 6 well insert plate (Corning Transwell) | Millipore Sigma | CLS3450 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| 24 well plate | Corning Costar | 3526 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-9 | |
| Agar | Fisher BioReagents | BP1423-500 | for embedding fixed brains |
| Alexafluor 488-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-605-146 | |
| Alexafluor 647-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-146 | |
| Aluminum foil | ReynoldsWrap | N/A | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A-9518 | |
| anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19622 | |
| anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53386 | |
| anti-laminin monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| anti-nestin monoclonal antibody 10c2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
| anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| B27 supplement without vitamin A | GIBCO | 17504-044 | |
| bisbenzimide (Hoechst 33258) | Sigma-Aldrich | B2883 | nuclear stain |
| Cell culture incubator | Forma | standard humidified CO2 incubator | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Confocal microscope | Nikon Instruments | C2si+ | With custom-made cell incubator chamber |
| Confocal microscope objective lenses | Nikon Instruments | Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging | |
| Confocal microscope software | Nikon Instruments | NIS Elements | Version 5.2 |
| Curved foreceps | World Precision Intruments | 504478 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | ||
| Curved spatula | Fisher Scientific | 14-375-20 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | KG-585 12R | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270 | |
| DiD far red fluorescent dye | Invitrogen | V22887 | Vybrant DiD |
| DMEM | Sigma Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Sigma Aldrich | D8437 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
| egg incubator | Humidaire | ||
| electrical tape (10 mil thick/254 µm) | Scotch | N/A | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fast green FCF dye | Avocado Research Chemicals | 16520 | |
| FBS | Gemini Bio-products | 900-108 | |
| filter paper | Fisher Scientific | ||
| Gauze | Dynarex | 3353 | |
| Glass Capillaries for microinjection | World Precision Instruments | TW100-4 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP228-1 | for mounting media |
| GSCs (human glioblastoma stem cells) | Not applicable | Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector. Cells used were between passage 10 and 30. | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
| Hemacytometer | Hausser scientific | ||
| Heparin | Fisher Scientific | BP2524-100 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| Horse Serum (HI) | Gibco | 26050-088 | |
| Human FGF-2 | BioVision | 4037-1000 | |
| Human TGF-α | BioVision | 4339-1000 | |
| Inverted phase contrast microscope | Nikon Instruments | TMS | for routine viewing of cultured cells |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
| Laboratory film | Parafilm | ||
| Labquake Shaker | LabIndustries | T400-110 | |
| L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-products | 400-110 | |
| Low-melt agarose | Fisher Scientific | BP1360 | for embedding live brains |
| Matrix | Corning Matrigel | 354234 | |
| Medium 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| Metal vibratome block | |||
| Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) | Fisherbrand | ||
| Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) | Gilson | ||
| Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) | Fisherbrand | 12544A | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| NaH2PO4 + H2O | Fisher Scientific | S369 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
| Normal goat serum | Millipore Sigma | 526-M | |
| N-propyl gallate | Sigma Aldrich | P3130 | for mounting media |
| Parafilm | Parafilm | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
| Pencil | |||
| Plain Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Plastic 35 mm Petri dish | Becton Dickinson | 351008 | |
| pneumatic picopump | World Precision Intruments | PV830 | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | P-3932 | |
| razor blade- double edge | PACE | for cutting fixed brain slices | |
| sapphire knife | Delaware Diamond Knives | for cutting live brain slices | |
| Scalpel | TruMed | 1001 | |
| Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Specimen chamber for vibratome | custom-made | ||
| Stereo Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | Equipped with epifluorescence |
| straight foreceps | World Precision Intruments | 500233 | |
| straight scissors | Fine Science Tools | ||
| Sucrose | Mallinckrodt | 7723 | |
| Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) | Nikon Instruments | TE2000-E | With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006) |
| Tissue culture dish polystyrene 100 mm | Thermo Fisher Scientific | 130182 | for cell culturing |
| Tissue culture dish polystyrene 60 mm | Becton Dickinson | 353004 | for cell culturing |
| Transfer pipette | American Central Scientific Co. | FFP011 | |
| Transparent tape | Scotch | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T-8787 | |
| Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| U-118 MG human GBM cell line | ATCC | HTB-15 | Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry. Passage numbers are unknown. |
| Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-07532-40 | "Air Cadet" |
| Vibrating tissue slicer | Vibratome | 3000 | for cutting live and fixed brain slices |
References
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