Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Civciv Embriyo Beynini, İnsan Glioblastoma Hücre Davranışının In Vivo ve Ex Vivo Analizleri için Bir Model Olarak Kullanma

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65199
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute, Christiana Care, 3Department of Neurosurgery, Winthrop P. Rockefeller Cancer Institute, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Civciv embriyoları, insan glioblastoma (GBM) beyin tümörlerini ovo ve in vivo beyin dilimi ko-kültürlerinde incelemek için kullanılır. GBM hücre davranışı, ex vivo ko-kültürlerde hızlandırılmış mikroskopi ile kaydedilebilir ve her iki preparat da deneysel son noktada ayrıntılı 3D konfokal analiz ile analiz edilebilir.

Abstract

Civciv embriyosu, omurgalı gelişiminin incelenmesi için, özellikle deneysel manipülasyonlar için ideal bir model sistem olmuştur. Civciv embriyosunun kullanımı, insan glioblastoma (GBM) beyin tümörlerinin in vivo oluşumunu ve tümör hücrelerinin çevreleyen beyin dokusuna invazivliğini incelemek için genişletilmiştir. GBM tümörleri, floresan olarak etiketlenmiş hücrelerin bir süspansiyonunun ovodaki E5 orta beyin (optik tektum) ventrikülüne enjekte edilmesiyle oluşturulabilir.

GBM hücrelerine bağlı olarak, kompakt tümörler ventrikülde ve beyin duvarında rastgele oluşur ve hücre grupları beyin duvarı dokusunu istila eder. Tümörlü sabit E15 tektasının kalın doku kesitleri (350 μm), konfokal z-stack görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu ile analiz edildiğinde istilacı hücrelerin sıklıkla kan damarları boyunca göç ettiğini ortaya çıkarmak için immünoboya ile boyanabilir. Canlı E15 orta beyin ve ön beyin dilimleri (250-350 μm), floresan olarak etiketlenmiş GBM hücrelerinin, yaklaşık 1 haftalık bir süre boyunca kan damarları boyunca da meydana gelebilen hücre invazyonunu analiz etmek için ex vivo ko-kültürler sağlamak için rastgele olmayan yerlere sokulabileceği membran ekleri üzerinde kültürlenebilir. Bu ex vivo ko-kültürler, canlı hücre davranışını gözlemlemek için geniş alan veya konfokal floresan hızlandırılmış mikroskopi ile izlenebilir.

Ko-kültürlü dilimler daha sonra sabitlenebilir, immünoboyalı olabilir ve istilanın kan damarları veya aksonlar boyunca gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için konfokal mikroskopi ile analiz edilebilir. Ek olarak, ko-kültür sistemi, farklı hücre tiplerinin ve renklerinin agregalarını farklı hassas yerlere yerleştirerek ve hücre hareketlerini gözlemleyerek potansiyel hücre-hücre etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir. İlaç tedavileri ex vivo kültürlerde yapılabilirken, bu tedaviler in ovo sistemi ile uyumlu değildir. Bu iki tamamlayıcı yaklaşım, yüksek oranda manipüle edilebilir omurgalı beyin ortamında insan GBM hücre davranışının ve tümör oluşumunun ayrıntılı ve kesin analizlerine izin verir.

Introduction

Kanser hücresi davranışlarının in vitro çalışmaları, in vivo ksenogreft modellerinde tümör oluşumu ve hücre invazyonu sırasında gözlenen daha karmaşık davranış sırasında çalışan potansiyel mekanizmaları incelemek için sıklıkla kullanılır. Örneğin, glioblastoma (GBM) ile, in vitro çalışmalar, L1CAM'in yeni bir civciv embriyo ksenograft beyin tümörü modeli 1,2,3,4,5'te tümör oluşumu ve beyin invazyonu sırasında potansiyel olarak nasıl çalıştığına dair mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. İn vitro ve in vivo deneyler birbirlerini yararlı şekillerde tamamlasalar da, sonuçların nasıl ilişkilendirilebileceği konusunda önemli bir boşluk bırakırlar. Örneğin, bir çanaktaki GBM hücre hareketliliğinin mekanik analizleri oldukça yapay bir durumdur ve in vivo ksenogreft modelleri sadece tümör oluşumu ve hücre davranışının statik zaman noktası veya bitiş noktası analizlerini ortaya çıkarabilir. Kemirgenleri veya civciv embriyolarını kullanan in vivo çalışmalar, hücreler bu ksenogreft modellerinde beyin dokusunu istila ederken, hücre davranışını izlemek için kendilerini kolayca ödünç vermezler. Bununla birlikte, civciv embriyo ksenogreft modeli, yapışma proteini L1CAM'in insan T98G GBM hücrelerinin 2,5 invaziv yeteneğinde uyarıcı bir rol oynadığını göstermiştir.

Bu soruna uygun bir çözüme, ex vivo model olarak adlandırılan organotipik bir beyin dilimi kültür modeli kullanılarak hem in vivo hem de in vitro yöntemlerle köprü kurularak ulaşılabilir. Bu ex vivo modelde, canlı beyin dokusu birkaç haftaya kadar birkaç yüz mikron kalınlığında tutulabilir, bu da kanser hücrelerinin implante edilmesini, zaman içinde gerçek dokudaki davranışlarını gözlemlemeyi ve daha sonra deneyin sonunda daha ayrıntılı bir belirteç analizi yapmayı mümkün kılar.

Popüler bir organotipik dilim kültürü yöntemi, yarı saydam veya şeffaf gözenekli bir zarın üzerine birkaç yüz mikron kalınlığında bir beyin dilimini kültürlemek, dokuyu havaya maruz bırakmak, ancak besin ortamının dokuyu zarın altından sürdürmesine izin vermek olmuştur (Stoppini ve ark.6'ya bakınız). Bu yöntemin farklı varyasyonları, farklı ortamlar veya farklı membran ekleri kullanmak da dahil olmak üzere farklı çalışmalar için kullanılmıştır. Farklı membran uçları arasında 30 mm çapında, 35 mm kültür kabında gözenekli (0,4 μm) membran kesici uç 6 ve 6 delikli plakalar için hücre kültürü ekleri (0,4 μm) bulunur7. Farklı ortamlar arasında% 50 MEM / HEPES +% 25 ısı ile inaktive edilmiş at serumu +% 25 Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS)8,% 50 azaltılmış serum ortamı +% 25 at serumu +% 25 HBSS9 ve diğerleri bulunur. Floresan olarak etiketlenmiş GBM hücreleri ile birlikte yarı saydam veya şeffaf bir membran kullanılırsa, bu tür kültürler ters çevrilmiş bir geniş alan veya konfokal floresan mikroskobu 10,11,12,13,14,15 kullanılarak aşağıdan görüntülenebilir.

Kemirgenler kullanılarak birçok in vivo ortotopik beyin tümörü ksenogreft ve ex vivo organotipik beyin dilimi kültürü modeli kurulmuş olsa da, yukarıda belirtildiği gibi, civciv embriyosu (Gallus gallus) bu amaçlar için yeterince kullanılmamıştır. Bununla birlikte, civciv embriyosunun hem insan hem de sıçan glioma invazyonu 1,2,5 çalışması için in vivo ortotopik bir ksenogreft modeli olarak kullanılabileceği gösterilmiştir. Civciv embriyo beyinlerine ksenograflanmış hücreler, kemirgen modellerinde gözlemlenenlere benzer istila paternleri sergilemiş ve civciv embriyolarının GBM tümör hücresi analizi için in vivo bir model olarak kullanılmasını daha da desteklemiştir. Civciv embriyoları da ucuzdur, kemirgenlerden daha kolay korunabilir (yani, bir laboratuar inkübatöründeki yumurta kabuklarında) ve çalışması çok daha kolaydır, bu da onları kısa süreli in vivo GBM çalışmaları için çekici bir seçenek haline getirir. Yakın tarihli bir makale, dilimlerin en az 7 gün boyunca canlı olduğu normal beyin gelişimi sırasında aksonların oluşumu ve büyümesi için civciv embriyosu beyin dilimi kültürlerinin kullanımını açıklamıştır16. Bununla birlikte, bu tür civciv embriyo beyin dilimi kültürlerinin bir doku ortamında GBM hücre davranışının ex vivo analizi için kullanılması eksiktir. Bu makalede, hem insan GBM hücrelerinin hem de GBM kök hücrelerinin (GSC'ler) erken civciv embriyo beynine in vivo transplantasyonu ve GBM hücrelerinin canlı civciv embriyo beyin dilimi kültürlerine ex vivo olarak sokulması anlatılmaktadır. Ortaya çıkan tümörlerin bazı temsili örnekleri ve bu preparatlardan elde edilen hücre invazyon paternleri de verilmektedir.

Protocol

Bu çalışmayı yürütmek için Delaware Üniversitesi'nde herhangi bir izin veya onay gerekmemiştir.

1. Civciv optik tektumuna GBM hücre enjeksiyonu

  1. GSC'lerin ve GBM hücrelerinin enjeksiyon için hazırlanması
    1. GSC ortamında kültür GSC'leri (Tablo 1). Kültür, GBM ortamında GBM hücre hatları oluşturmuştur (Tablo 1).
    2. Hücreleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile plakalar üzerinde durulayın ve 10 cm'lik bir kaba 1 mL tripsin çözeltisi yerleştirin. Hücreler ayrılmaya başlayana kadar bir hücre kültürü inkübatöründe 2-3 dakika bekletin.
    3. 10 cm'lik kalıba 10 mL uygun serum içeren kültür ortamı ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
    4. Hücreleri 800 × g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca pelet haline getirin.
    5. Bir yan kol şişesine ve vakum pompasına tutturulmuş tek kullanımlık ince cam pipet kullanarak ortamı hücre peletinden aspire edin. Hücreleri uygun büyüme ortamında, mikrolitre başına 10.000 hücrelik bir konsantrasyona yeniden askıya alın ve bir mikrofüj tüpüne veya buz üzerindeki küçük vidalı tüpe yerleştirin.
    6. Hücreleri az miktarda steril% 1 Hızlı Yeşil FCF boyası ile karıştırın (5 μL boya / 100 μL hücre süspansiyonu oranı kullanın).
  2. GBM hücrelerinin ovo'da E5 optik tektuma enjeksiyonu. Ek Şekil 1'e bakınız.
    1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını nemlendirilmiş bir yumurta inkübatöründe, sivri ucu aşağı bakacak şekilde, 37.5 ° C'de ( inkübasyonun 1. günü embriyonik gün 0 [E0]) inkübe edin. Kuluçkanın 6. gününde (E5), yumurta kabuğunu% 70 etanol ile püskürterek sterilize edin.
    2. Bir yumurta mumcusu kullanarak, embriyonun üzerindeki hava boşluğunun çevresi boyunca bir kalemle iz bırakın ve ana hatlarıyla belirtilen alanı şeffaf bantla örtün.
    3. Kavisli makas kullanarak, izlenen alanın etrafını hafifçe kesin, embriyonik zarlara veya kan damarlarına kesmemeye dikkat edin ve yumurta kabuğunun üstünü atın.
    4. Hava boşluğu zarına birkaç damla salin veya hücre kültürü ortamı yerleştirin, böylece kolayca ayrılacaktır. İnce forseps kullanarak, hava boşluğu zarını embriyonun tepesine dikkatlice delin, çıkarın ve civciv embriyosunun kafasını bulun.
    5. Optik tektuma hücreler enjekte edilebilmesi için kafayı konumlandırmak üzere embriyoyu hemen çevreleyen şeffaf amniyon zarını kapmak için ince forseps kullanın. Bir elinizle, enjeksiyon işlemi sırasında kafayı yerinde tutmak için amniyonu tutmak için ince forsepsleri kullanın. Yumurta sarısı üzerindeki koryoallantoik membrandaki ekstraembriyonik kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.
      NOT: Yukarıdaki prosedür, embriyoyu yakından çevreleyen berrak amniyon zarını verimli bir şekilde yakalayabilmek için biraz pratik gerektirir, çünkü yakalanıp çekilene kadar görünmezdir. Embriyoyu hemen çevreleyen berrak amniyonunu yakalamak için ince forseps kullanarak pratik yapın.
    6. Amniyon zarını ince forsepslerle kavrayarak kafayı sabit tutun. Bir cam mikropipet ve pnömatik bir pikopompa kullanarak, optik tektuma 5 μL uygun hücre kültürü ortamında yaklaşık 50.000 hücre enjekte edin (5 μL, doldurulmuş bir mikropipetin yaklaşık 1 / 2'sidir).
      NOT: Boya ile karıştırılmış GBM hücreleri ile enjekte edilen bir E5 embriyosunun görüntüsü için Cretu ve ark.1'e bakınız.
    7. Embriyonun üzerine birkaç damla 50 mg/mL ampisilin koyun.
    8. Yumurtaların üstündeki deliği şeffaf bantla örtün ve diseksiyon için E15'e kadar nemlendiricide bırakın.

2. E15 embriyolarından beyin bölgelerinin diseksiyonu

NOT: Fiksasyon için buradaki E15 beyinlerinin diseksiyonu, canlı beyin dilimleri için adım 8.2'de tarif edilene benzer, ancak buradaki diseksiyonun aseptik koşullar altında yapılması gerekmez.

  1. Kabuğun üst kısmındaki bandı kesin ve embriyoya erişime izin verin.
  2. Embriyonun boynundaki kafasını kesin ve kafayı steril kalsiyum ve magnezyum içermeyen Tyrodes (CMF Tyrode's) çözeltisi ile 10 cm'lik bir kaba yerleştirin. Ek Şekil 2'ye bakınız.
  3. İnce forseps kullanarak, altta yatan dura mater ortaya çıkarmak için beyni kaplayan cildi soyun. Beynin sol ve sağ taraflarındaki oluşan kafatası kemiklerini çıkarın. Oluşan kafatası kemikleri henüz beynin çoğunluğunu kapsamaz.
  4. Beynin merkezini kaplayan meninksleri yırtmak için yavaşça ince sivri forseps kullanın ve beyni ortaya çıkarmak için her iki tarafa da soyun.
  5. Beyni aşağıdan almak ve yavaşça boşluğundan çıkarmak için kavisli forseps kullanın.
  6. Beyni parçalarına ayırın: ön beyin, tecta, beyincik.
  7. Üstteki pia mater'i ince forseps kullanarak tecta'dan çıkarın. Pia'nın tecta'dan kolayca ayrıldığını, ancak ön beyinden veya beyincikten ayrılmadığını unutmayın. Pia'yı ön beyinden dokunarak veya küçük bir filtre kağıdı parçası üzerinde yuvarlayarak çıkarın.
  8. Disseke edilmiş beyin bölgelerini küçük bir kaba yerleştirin.
  9. Fiksasyon için beyin bölgelerini 24 delikli bir plaka kuyusuna yerleştirin ve 0.1 M sodyum kokodilat tamponunda% 2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. 4 °C'de en az 24 saat bekletin.
  10. Fiksasyondan sonra, agar'a gömmeden önce dokuyu en az 1 saat boyunca 3x PBS'de durulayın.

3. Hasat edilen beyin bölgelerinin gömülmesi ve dilimlenmesi

  1. PBS'de% 3.5 agar ve% 8 sakkaroz çözeltisini eriyene kadar önceden ısıtın ve erime sıcaklığında tutun.
  2. Kavisli forsepsleri bir kepçe olarak kullanarak, civciv embriyo beyninin optik tektumunu veya ön beyin bölgesini yavaşça alın ve agarın dış beyin yüzeyine yapışmasını sağlamak için ekstra sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdına hafifçe lekeleyin.
  3. Steril bir transfer pipeti kullanarak, kalıbı agar çözeltisi ile doldurun.
    NOT: Küçük dikdörtgen metal titreşimli doku dilimleyici blokları gibi uygun boyutta bir nesnenin etrafında alüminyum folyo oluşturularak basit bir kalıp yapılabilir.
  4. Beyin bölgesini agar'a yerleştirin ve agar'ın tamamen katılaşmasına izin verin.
  5. Alüminyum folyoyu gömülü beynin etrafından çıkarın ve bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak yanların etrafındaki fazla agar'ı kesin.
  6. Dilimleme tepsisinin paslanmaz çelik karesine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin, agaroz bloğunu beyinle yapıştırıcının üzerine yerleştirin ve tutkalın 1 dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Tepsiyi titreşimli doku dilimleyici mandren mandren içine yerleştirin, sıkın ve tepsiyi agar bloğunun üstünü örtecek kadar PBS ile doldurun.
  7. Beyin dilimlerini titreşimli bir doku dilimleyici üzerinde çelik bir tıraş bıçağı kullanarak 350 μm kalınlığında kesin.
  8. Beyin dilimleri kesilip dilimleme tepsisine serbestçe süzülürken, dilimleri tepsiden çıkarmak ve çıkarmak için bir spatula kullanın. Bölümleri yavaşça spatuladan ve PBS ile etiketlenmiş 10 cm'lik bir Petri kabına kaydırın, böylece bölümler serbestçe yüzer.
    NOT: Beyin dilimini çevreleyen agar, beyin gömmeden önce fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdı ile yeterince lekelenmemişse ayrılabilir. Bu meydana gelirse, beyin dokusu katılaşmış agardan nazikçe çıkarılabilir ve fazla sıvının uygun şekilde lekelenmesinden sonra yeniden gömülebilir.

4. Tümör hücreleri ile immün boyama beyin dilimleri

  1. Epifloresan ile donatılmış bir stereo mikroskop kullanarak, 10 cm'lik çanaktaki bireysel dilimleri tümör hücrelerinin varlığı veya yokluğu için tek tek tarayın.
  2. İmmün boyama için yeterli miktarda fosfat tamponlu salin %0.1 Triton X-100 ve %5 normal keçi serumu (PBSTG) (bakınız Tablo 1) ile hazırlanın ve immünoboyalı dilimleri durulayın.
  3. PBS ile beyin bölümlerini boyamak için kullanılacak 24 delikli bir plakada kuyuları yarıya indirin.
  4. Beyin dilimlerinin etrafındaki agar köşelerini bir spatula veya neşter kenarı ile kesin ve yavaşça PBS içeren kuyucuklara yerleştirin.
  5. PBS'yi aspire edin ve PBSTG'de 350 μL primer antikor boyama çözeltisi ile değiştirin (örneğin, PBSTG'de 2 μg / mL UJ127).
  6. Soğuk bir odada 24 saat boyunca hafif ajitasyonla inkübe edin, böylece dilimin kuyu içinde serbestçe hareket ettiği görülür.
  7. 24 saat sonra, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve ajitasyonlu soğuk bir odada PBSTG ile 3 x 1 saat durulayın.
  8. Durulama bittiğinde, PBSTG'de 350 μL/kuyucuk sekonder antikor boyama çözeltisinde inkübe edin (örneğin, PBSTG'de biyotin-GAM'ın 1/200 seyreltilmesi). Ajitasyon ile soğuk bir odada 20 saat inkübe edin.
    NOT: Üçüncül adımdan önce geliyorsanız ve bu adımda florokrom içeren ikincil antikor ile inkübe ediliyorsa, inkübasyon sırasında ışıktan korunmak için şimdi örtün ve ardından adım 4.11'e atlayın.
  9. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve PBSTG'de 3 x 1 saatini çalkalama ile soğuk bir odada durulayın.
  10. PBSTG'yi çıkarın ve üçüncül çözeltide inkübe edin (örneğin, PBSTG'de Alexa Fluor 647 streptavidin'in 1:250 seyreltilmesi). İstenirse, karışıma 0.1 μg / mL bisbenzimid ekleyerek çekirdekleri bu adımda boyayın. Ajitasyon ile soğuk bir odada 20 saat inkübe edin.
  11. Üçüncül çözeltiyi çıkarın ve PBSTG'de 3 x 1 saat boyunca soğuk bir odada ajitasyonla durulayın.
  12. Mikroskop kızaklarına monte edilmeye hazır olana kadar PBS'de bırakın.

5. Mikroskop slaytlarına dilimlerin montajı

  1. Bağlanacak bölümler olduğu kadar mikroskop slaytı hazırlayın.
  2. Her slayt için, bir parafilm parçasının üzerine 10 mil (254 μm) kalınlığında vinil elektrik bandından oluşan 50 mm uzunluğunda bir şerit yerleştirin.
  3. 1 cm x 1 cm kare delik delme kullanarak, elektrik bandının ve parafilmin ortasından bir delik açın.
  4. Bandı parafilmden çekin ve mikroskop slaydının üzerine yerleştirin, slaytta bant etiketlemek için yer bırakın.
  5. Bir mikropipet kullanarak, elektrik bandının ortasındaki kare deliğe bir veya iki damla solmaya karşı montaj ortamı yerleştirin.
  6. İstenilen titreşimli doku dilimleyici bölümünü PBSTG'den kaldırmak için kavisli bir spatula kullanın ve temiz bir laboratuvar mendili veya filtre kağıdı parçası ile nemi iyice uzaklaştırın.
  7. Dilimin kenarına montaj elemanı damlasına dokunun ve bölümü yavaşça montaj ortamına kaydırmak için başka bir spatula kullanın.
  8. Bölümü birkaç damla daha mountant ile örtün ve bölümün ve mountantın üzerine dikkatlice 24 mm x 30 mm (#1,5 kalınlık) bir kapak kayması yerleştirin.
  9. Yerinde tutmak için kapak kaymasının kenarlarını oje ile kapatın.

6. Sabit beyin dilimlerinin konfokal mikroskopisi

  1. Uygun objektif lens ve filtre setlerini kullanarak monte edilmiş beyin dilimindeki floresan tümörleri bulmak için geniş alan floresansını kullanın.
    NOT: Bazı tümörler oldukça büyük olabilir ve 4x hedefi ile kolayca görülebilirken, tek hücreler 10x hedefi gerektirebilir.
  2. Uygun bir objektif lens, lazer(ler), iğne deliği boyutu ve dedektör ayarlarını kullanarak konfokal mikroskopiye geçin. Bu protokolü takip etmek için, rutin görüntüleme için 20x hedefi (sayısal diyafram [N.A.] = 0.75) ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için 60x yağ hedefi (N.A. = 1.40) kullanın.
  3. Optik bölümleri elde etmek için z ekseninin üst ve alt sınırlarını ve adım boyutunu (konfokal mikroskop üreticisinin talimatlarına göre özel durum için) ayarlayın. Optik bölümlerden oluşan bir z-yığını edinin.
  4. Üreticinin talimatlarına göre, tümörün 3D hacim görüntüsünü oluşturmak için konfokal mikroskop yazılımını kullanın.

7. Küresel preparat

  1. Poli(2-hidroksietil metakrilat) (poli-HEMA) plakaların oluşturulması
    1. % 95 etanol içinde 10 μg / mL poli-HEMA çözeltisi oluşturun ve 35 mm Petri kaplarını (veya hücre kültürü kaplarını) bu çözeltinin 1 mL'si ile kaplayın.
    2. Bulaşık yüzeyinin bir kaplamasını geliştirmek için bulaşıkları gece boyunca oda sıcaklığında ortaya çıkarılan bir rocker üzerinde oturtun.
      NOT: Çözücü buharlaşacak ve çanak üzerinde düzensiz görünebilecek yarı saydam bir kaplama bırakacaktır, ancak bu hücre sferoidleri yapma yeteneğini etkilemeyecektir.
    3. Kuruduktan sonra, açık bulaşıkları UV ışığı altında bir biyogüvenlik kabininde 1 saat boyunca sterilize edin. Sterilizasyondan sonra kapakları değiştirin. Kaplamalı tabaklar artık kullanıma hazırdır.
  2. Hızlandırılmış mikroskopi için floresan DiD boyama
    NOT: Bu bölüm, canlı hızlandırılmış görüntüleme için hücre hareketliliğinin görselleştirilmesini optimize eden sferoidler yapmak için kullanılacak DiD floresan boya ile tek hücrelerin boyanması içindir.
    1. Hücreleri serumsuz bir kültür ortamında askıya alın.
    2. 5 μL DiD stoğu/mL hücre süspansiyonu ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
    3. Etiketli hücre süspansiyonunu 800 × g'da 5 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    4. Süpernatantı aspire edin ve durulamak için hücreleri sıcak ortamda yeniden askıya alın.
    5. Bu santrifüjleme işlemini tekrarlayın ve adımı iki kez daha durulayın.
      NOT: İsterseniz, bu işlemden hemen sonra küre yapmak için adım 7.3.6'ya atlayın.
  3. Hücre sferoidleri yapımı
    1. % 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisini 37 ° C'ye ısıtın.
    2. GSC media17'deki kültür GSC'leri (Tablo 1) ve U-118 kültür ortamındaki U-118 malign gloima (MG) hücreleri (bakınız Tablo 1). Bir adet 35 mm'lik sferoid tabağının hazırlanması için 10 cm'lik bir tabak kullanın. GSC'lere başlangıçta ve daha sonra her 3 günde bir bFGF (10 ng / mL nihai konsantrasyon) ve TGF-α (20 ng / mL nihai konsantrasyon) büyüme faktörleri ekleyin.
      NOT: Mevcut çalışmada kullanılan hücreler yeşil GSC15-2 / K72, yeşil GSC16-4 / K72, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry2x ve kırmızı U-118 / 1879 / mCherry2x idi. Bir plaka sferoid, membran ekleri üzerindeki iki adet 6 delikli beyin dilimi plakası için yeterli olmalıdır.
    3. Plakalardaki hücreleri steril PBS ile durulayın ve 10 cm'lik bir tabak üzerine 1 mL tripsin çözeltisi yerleştirin. Hücreler ayrılmaya başlayana kadar hücre kültürü inkübatörüne 2-3 dakika bekletin.
    4. 10 cm'lik kalıba 10 mL uygun serum içeren kültür ortamı ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
    5. Hücreleri 800 × g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca pelet yapın.
    6. Ortamı hücre peletinden aspire edin ve hücreleri 10 mL ortamda yeniden askıya alın.
    7. Her 35 mm'lik poli-HEMA kaplı kabın üzerine 2 mL hücre süspansiyonu yerleştirin ve çanak başına toplam 4 mL ortam elde etmek için 2 mL daha fazla uygun ortam ekleyin. GSC'leri kullanıyorsanız büyüme faktörleri ekleyin.
    8. Agregalar 100-200 μm'lik bir boyuta ulaşana kadar hücreleri bir hücre inkübatöründe inkübe edin, bu da kaplanan hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak 1-2 gün olabilir.

8. Canlı civciv embriyo beyin diseksiyonu ve titreşimli doku dilimleyici dilimleme

  1. Diseksiyon için hazırlık
    1. Membran ekinin altında 1 mL beyin dilimi kültür ortamı (bkz. Tablo 1) bulunan 6 kuyucuklu bir polyester membran ekleme plakası hazırlayın.
    2. Çalışma alanını ve aletleri %70 etanol ile sterilize edin.
    3. Diseksiyon sırasında 6 kuyucuklu kesici uç plakasını buzun üzerine yerleştirin.
    4. 100 mL titreşimli doku dilimleyici dilimleme ortamı hazırlayın (Tablo 1) ve buzun üzerine yerleştirin.
    5. PBS'de% 4 düşük erimeli agaroz şişesini, bir sıvıya eriyene kadar (yaklaşık 50 ° C) bir su banyosuna yerleştirin.
    6. Titreşimli doku dilimleyici küvetini buzla doldurun.
  2. Aseptik E14/15 civciv embriyosu beyin diseksiyonu
    1. Bir yumurta mumlayıcısı kullanarak, E14 veya E15 embriyosunun üzerindeki hava cebinin çevresi boyunca bir kalemle iz bırakın ve ana hatlarıyla belirtilen alanı şeffaf bantla örtün.
    2. Kavisli veya ince makas kullanarak, izlenen alanın etrafını hafifçe kesin, embriyo zarına veya kan damarlarına kesmemeye dikkat edin ve üst kabuk parçasını atın.
    3. Kavisli forseps kullanarak, embriyonun üstündeki hava boşluğu zarını çıkarın ve civciv embriyosunun kafasını bulun.
    4. Embriyonun kafasını kesin ve kafayı soğuk steril CMF çözeltisi ile 10 cm'lik bir kaba yerleştirin. Ek Şekil 2'ye bakınız.
    5. Steril ince forseps kullanarak, altta yatan dura mater ortaya çıkarmak için beyni kaplayan cildi soyun. Beynin sol ve sağ taraflarındaki oluşan kafatası kemiklerini çıkarın. Oluşan kafatası kemikleri henüz beynin çoğunluğunu kapsamaz.
    6. Beynin merkezini kaplayan meninksleri yırtmak için ince sivri forsepsleri (# 5 veya # 55) yavaşça kullanın ve beyni ortaya çıkarmak için her iki tarafa da soyun.
    7. İnce kavisli forsepsler kullanarak, beyni alt önden yukarı doğru çekin ve yavaşça boşluğundan dışarı çekin.
    8. Beyni üç ana bölüme ayırın: ön beyin, orta beyin (optik tecta), beyincik. Gerekirse bir civciv gelişim atlasına danışın.
    9. Üstteki pia mater'i ince forseps kullanarak tecta'dan çıkarın.
      NOT: Pia tecta'dan kolayca ayrılır, ancak ön beyin veya beyincikten ayrılmaz. Pia ön beyinden dokunarak veya steril gazlı bez üzerinde yuvarlanarak çıkarılabilir.
    10. Disseke edilmiş beyin bölgelerini buz üzerinde küçük steril bir kaba yerleştirin.
  3. Beynin gömülmesi ve dilimlenmesi
    1. Kavisli forsepsleri bir kepçe olarak kullanarak, optik tektum veya ön beyin bölgesini yavaşça alın ve agarozun dış beyin yüzeyine yapışmasını sağlamak için ekstra sıvıyı çıkarmak için steril gazlı bez üzerinde hafifçe lekeleyin.
    2. Steril bir transfer pipeti kullanarak, kalıbı düşük erimeli agarozla doldurun. Uygun boyutta bir nesnenin etrafında alüminyum folyo oluşturarak basit bir kalıp hazırlayın. Küçük dikdörtgen metal titreşimli doku dilimleyici bloğu rutin olarak nesne olarak kullanılır. Ek Şekil 3'e bakınız.
    3. Beyin bölgesini hızlı bir şekilde agaroza yerleştirin ve buz üzerinde katılaşmasına izin verin (yaklaşık 4-5 dakika).
      NOT: Beyin, agaroz sertleşmeden önce kalıbın dibine batabilir. Bu meydana gelirse, agarın ayarlanmaya başlamasına izin vermek için 1 dakika bekleyin ve ardından beyin bölgesini agarozun içine yerleştirin. Beyin bölgesini doğrudan agarozun ortasında askıya almaya çalışın.
    4. Alüminyum folyoyu katılaşmış agarozdaki gömülü beynin etrafından çıkarın ve steril bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak yanların etrafındaki fazla agarozu kesin.
    5. Dilimleme kabının / tepsisinin paslanmaz çelik karesine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin, agaroz bloğunu beyne yerleştirin ve tutkalın 1 dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Çanağı/tepsiyi titreşimli mendil dilimleyici mandyerine yerleştirin, sıkın ve agaroz bloğunun üstünü örtmek için tepsiyi dilimleme ortamıyla doldurun.
    6. Titreşimli bir doku dilimleyici üzerindeki bölümleri, çelik bir tıraş bıçağından daha az canlı doku hasarına neden olduğu bildirilen bir safir bıçak kullanarak 250-350 μm'de kesin.
    7. Beyin dilimleri kesilip dilimleme tepsisine serbestçe yüzerken, dilimi tepsiden çıkarmak ve çıkarmak için steril bir spatula kullanın. Kesiti yavaşça spatuladan ve başka bir steril spatula kullanarak bir membran eki üzerine kaydırın.
      NOT: Normalde, istenirse her bir zar ekine iki veya üç beyin dilimi yerleştirilebilir. Beyin dilimini çevreleyen agaroz, beyin fazla sıvıyı çıkarmak için steril gazlı bezle yeterince lekelenmezse ayrılabilir. Gömmeden önce yeterli lekelemeden sonra bu hala meydana geliyorsa, dilimi çevreleyen agaroz olmadan yavaşça alın ve membran ekinin üzerine kaydırın.
    8. 6 delikli beyin dilimleri plakasını, hücre kültürü inkübatöründeki membran eklerine 37 ° C'de ve% 5 CO2'de yerleştirin.
    9. Kaplamadan sonraki gün, ortamı kesici ucun altından aspire etmek için steril bir Pasteur pipet kullanın (pipetin aşağıdaki ortama erişebilmesi için kesici uçların kenarlarında boşluklar vardır). Membran ekinin altındaki her bir oyuğa 1 mL taze dilim ortamı ekleyin. Bundan sonra her geçen gün medyayı değiştirmeye devam edin.
    10. Beyin dilimlerinin zar eklerine sıkıca yapışması ve biraz düzleşmiş gibi görünmesi için birkaç gün bekleyin. Bu, dilimlerin GBM hücrelerinin tanıtımı için canlı ve hazır olduğunun bir işaretidir.

9. Beyin dilimlerine GBM hücre girişi

  1. Sferoid yöntem
    1. Hücre sferoidleri 150-200 μm boyuta ulaştıktan sonra, bir ila birkaç sferoidi kültür kabından çıkarmak için 5 μL'ye ayarlanmış 20 μL'lik bir mikropipet kullanın. Ek Şekil 3'e bakınız.
    2. Medyayı sferoidlerle istenen beyin dilimine nazikçe atın.
      NOT: Hücre sferoidleri pipet ucunda görünür olmalıdır. Şeffaf bir pipet ucu kullanmak, uçta görünmelerini kolaylaştıracaktır. Sıvı serbest bırakıldığında sferoid beyin diliminden düşerse, ince bir ahşap aplikatör çubuğuna yapıştırılmış etanol sterilize edilmiş bir kirpik, sferoidi beyin dilimine nazikçe geri itmek için kullanılmalıdır.
    3. Sferoidlerin beyin dilimlerinde 2-5 gün boyunca kültürlenmesine izin verin.
      NOT: Buradaki sınırlama, dilimdeki kan damarlarının ve beyin hücrelerinin nihai olarak bozulması gibi görünmektedir. Bozulmuş kan damarları, laminin için boyandığında dilimde süreksiz toplar olarak görünecektir.
  2. Biyopsi punch yöntemi
    1. Beyin dilimlerinin zar eki üzerinde düzleşmiş gibi görünerek yapışmasına izin verin (kültürde 2-5 gün sürebilir).
    2. Hücre matrisini buz üzerinde çözün.
    3. Hücre kültürü biyogüvenlik kabininde, steril 1 mm çapında bir biyopsi zımbasını bir vakum aspiratör tüpüne bağlayın.
    4. Beyin diliminin merkezinde 1 mm'lik bir delik oluşturmak için biyopsi zımbasıyla beyin dilimine hafifçe dokunun.
      NOT: Biyopsi punchındaki doku, vakum tarafından punch içine aspire edilecektir.
    5. % 60-70% 'lik bir birleşik 10 cm'lik hücre kabını deneyerek ve 10 mL ortamda yeniden askıya alarak bir hücre matrisi süspansiyonu hazırlayın; daha sonra, bu süspansiyonun 1 mL'sini 100 μL matrisle karıştırın.
    6. 20 μL'lik bir mikropipet kullanarak, beyin dilimlerindeki her deliğe 1 μL hücre matrisi karışımı yerleştirin.
    7. Hücre karışımı yerleştirme işlemi bittikten sonra, gömülü hücrelere sahip beyin dilimleri tabağını inkübatöre geri yerleştirin ve matrisin katılaşmasına ve hücrelerin potansiyel olarak çevreleyen beyin dilimini istila etmesine izin verin.

10. Geniş alan floresan hızlandırılmış mikroskopi

  1. Ortamın buharlaşmasını önlemek için 6 delikli plakanın kenarına çıkarılabilir bant yerleştirin ve gaz değişimi için bir tarafta küçük bir boşluk bırakın.
  2. Plakaları, ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu üzerinde ayarlanabilir otomatik bir aşamada özelleştirilmiş bir kültür odasına yerleştirin.
    NOT: Oda, bir gaz enjeksiyon kontrolörü kullanılarak %5 CO2 ve %95 hava atmosferik koşullarında tutulmuş ve sıcaklık 37 °C'de bir sıcak hava sıcaklık kontrol cihazı ve sıcaklık kontrollü bir sahne eki ile muhafaza edilmiştir. Burada kullanılan sistemin ayrıntıları için Fotos et al.18'e bakınız.
  3. Uygun mikroskop kontrol yazılımını kullanarak, 20 saat boyunca her 10 dakikada bir ilgi alanlarının floresan görüntülerini toplayan hızlandırılmış bir edinme programı oluşturun.
    NOT: Hücrelerde yeşil floresan etiket kullanılıyorsa (örneğin, yeşil floresan proteini [GFP]), fototoksisiteyi önlemek için hücreleri görselleştirmek için gereken minimum miktarda mavi uyarma ışığı kullanın. Kırmızı (örneğin, mCherry) ve uzak kırmızı (örneğin, DiD) etiketler, daha uzun dalga boyu uyarımı nedeniyle bu potansiyel soruna sahip görünmemektedir.

11. Hızlandırılmış mikroskopi sonrası immün boyamalı beyin dilimleri

NOT: Bu immün boyama protokolü, kan damarlarını laminin ve çekirdekleri bisbenzimid ile boyamak için optimize edilmiştir. İstenilen molekül (ler) için uygun antikorları kullanın.

  1. Bir Pasteur pipet kullanarak ortamı membran ucunun altından aspire edin ve beyin dilimini örtmek için kesici ucun altındaki 0,1 M sodyum kokodilat tamponuna 1 mL %2 PFA ve kesici ucun üstüne 1 mL yerleştirin. Dilimlerin gece boyunca 4 ° C'de sabitlenmesine izin verin.
  2. Fiksatifi membran ekinin altından ve beyin diliminde kalan herhangi bir fiksatiften çıkarın (fiksatif, membran ekinden aşağıdaki kuyuya sızma eğilimindedir).
  3. Kesici ucu 35 mm'lik kuyudan dilimlerle çıkarın ve daha büyük bir plastik kaba yerleştirin.
  4. Beyin dilimleri olduğu kadar çok kuyucuğa 350 μL PBS ekleyerek 24 delikli bir plaka hazırlayın (immün boyama sırasında bir dilim / kuyu).
    1. İnce bir spatula kullanarak, beyin dilimini zar ekinden ayırmadan agarozu beyin diliminin etrafından yavaşça çıkarın. Agarozun beyin diliminin dış kenarından kolayca ayrıldığından emin olun. Değilse, agarozu beyin dilimine bağlı bırakın.
    2. Keskin bir neşter kullanarak, altta yatan zarın bulunduğu dilim kesici ucun geri kalanından kurtulana kadar beyin diliminin etrafındaki zarı kesin. Zarı kapmak için ince forseps kullanarak zarı ekli beyin dilimi ile alın ve PBS'deki 24 delikli plakanın bir kuyusuna yerleştirin.
  5. Dilimleri soğuk odada PBS ile 1 saatten fazla 3 kez durulayın, böylece dilim kuyu içinde hareket eder.
  6. Durulama yaparken, birincil antikor çözeltisini hazırlayın.
    1. Anti-laminin'i PBSTG'de 2 μg/mL'ye seyreltin (bakınız Tablo 1).
  7. PBS'yi kuyucuklardan çıkarın ve hafif ajitasyonla soğuk bir odada birincil antikor çözeltisinde gece boyunca inkübe edin.
  8. En az 20 saatlik inkübasyondan sonra, birincil antikor çözeltisini aspire edin ve PBSTG'de bölümleri 1 saat boyunca 3x durulayın.
  9. Durulama sırasında, ikincil antikor çözeltisini hazırlayın.
    1. Floresan-GAM'ı, PBSTG'de 1:200 seyreltme için gereken spesifik florokrom ile 0,1 μg/mL bisbenzimid konsantrasyonu ile seyreltin.
    2. PBSTG'yi çıkarın ve floresan sekonder antikor çözeltisinde ajitasyon ile soğuk bir odada gece boyunca inkübe edin.
    3. İkincil antikoru çıkarın ve PBSTG'de 1 saatten fazla 2x ve PBS'de 1 saatten fazla 1x'i durulayın.
    4. Mikroskop slaytlarına monte edilmeye hazır olana kadar PBS'de bırakın (bölüm 5) ve görüntüleyin.

Representative Results

Burada, optik tektuma in vivo enjeksiyonların yapılmasından (Şekil 1 ve Şekil 2), canlı beyin dilimlerinin kültürlenmesinden ve canlılıklarının değerlendirilmesinden (Şekil 3), ex vivo beyin dilimi kültürleri oluşturulmasından ve biyopsi punch yöntemi kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş hücrelerin implante edilmesinden (Şekil 4), poli-HEMA üzerinde hücrelerin kültürlenmesiyle hücre sferoidlerinin üretilmesinden elde edilen bazı temsili sonuçları gösteren çok sayıda şekil sunulmuştur (Şekil 5), hücre sferoidleri ile ex vivo beyin dilimi ko-kültürleri oluşturmak ve 4D konfokal hızlandırılmış mikroskopi kullanarak invaziv hücre davranışını kaydetmek (Şekil 6) ve sabit beyin dilimi preparatlarında kan damarlarına göre sferoidlerden invaziv hücre davranışını analiz etmek (Şekil 7 ve Şekil 8). Bu sonuçlar hiçbir şekilde kapsamlı değildir, bunun yerine civciv embriyo beynini insan GBM araştırması için bir ksenogreft modeli olarak kullanarak nelerin elde edilebileceğine dair iyi örnekler sunmaktadır.

Şekil 1, GFP'yi eksprese eden GSC'lerin enjeksiyonundan sonra optik tektumda in vivo olarak oluşan tümörlerin bazı temsili sonuçlarını göstermektedir. GSC'ler ventriküler yüzeye yapışır ve beyin duvarında invaziv tümörler oluşturur. GSC'ler açıkça kan damarlarının yakınında bulunur ve onlar boyunca göç ediyor gibi görünür. İn vivo GSC tümörlerinin sabit ve immün boyalı dilimlerinin dönen 3D hacimli render'larının filmleri Ek Video S1, Ek Video S2, Ek Video S3 ve Ek Video S4'te verilmiştir. Bu deneyde, beş özelliği tanımlamak için dört renk kullanıldı (yeşil GSC'ler, beyaz çekirdekler, beyaz kan damarları, mavi integrin alfa-6 ve kırmızı Sox2 veya kırmızı nestin).

Şekil 2, retroviral vektör transdüksiyonu nedeniyle mCherry'yi eksprese eden U-118 / L1LE hücreleri2 ile karıştırılmış GFP'yi eksprese eden GSC'lerin enjeksiyonundan sonra optik tektumda in vivo olarak oluşan tümörlerin bazı temsili sonuçlarını göstermektedir. Bu deneyler, bu tümörlerin karışık hücreli bir süspansiyondan oluştuğu için, GSC'lerin periferde veya merkezde bulunacağı, U-118 hücrelerinin ise spesifik GSC hattına bağlı olarak bir iç çekirdek veya bir dış korteks içerecek şekilde sıralamanın gerçekleştiğini ortaya koymuştur.

Şekil 3 , ex vivo beyin dilimi kültürlerinin canlılık sonuçlarını göstermektedir. Kültürde 1 hafta sonra, laminin için fiksasyon ve immün boyama, her ikisi de beyin diliminin yaşayabilirliğini göstermek için burada kullanılan birçok sağlam kan damarını ve Sox2 ekspresyonunu ortaya çıkardı. Bu, civciv embriyosu beyin dilimlerinin yaklaşık 2 hafta boyunca membran ekleri üzerinde kültürlenebileceğini ve normal görünen kan damarları ve transkripsiyon faktörü ekspresyonu ile canlı kalabileceğini gösterdi.

Şekil 4 , biyopsi punch yöntemini kullanarak dilimlerde boşluklar oluşturduktan sonra kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin (matrisle karıştırılmış) ex vivo beyin dilimlerine "tıkaçları" nın verilmesinin sonuçlarını göstermektedir. U-118 hücreleri, bazen yoğun bir şekilde ve sıklıkla kan damarları boyunca beyin dokusunu açıkça istila etti. Bununla birlikte, hücre invazyonu, tanıtılan hücrelerin çevresi etrafında tek tip değildi. Kan damarları bazen, muhtemelen yumruk yönteminin eklenen travması veya kültürdeki sürenin uzunluğu nedeniyle, bazı dilimlerde hasarlı veya eksik görünüyordu. Bu, biyopsi punch / hücre tıkacı yönteminin, GBM hücrelerini kültürlü bir ex vivo beyin dilimindeki belirli yerlere sokmak için kullanılabileceğini gösterdi, bundan sonra hücreler beyin dilimini istila etti.

Şekil 5, kültürdeki canlı sferoidleri ve hızlandırılmış deneyler için ex vivo beyin dilimlerine sokulan canlı GBM hücre sferoidlerinin geniş alan floresansının birkaç örneğini göstermektedir. Sferoidlerden beyin dilimine hücre istilası filmleri Ek Video S5 ve Ek Video S6'da verilmiştir. Bu, hücre sferoidlerinin, GBM hücrelerini veya GSC'leri ex vivo beyin diliminin belirli yerlerine sokmanın bir başka başarılı yöntemi olduğunu ve invaziv hücre davranışının, bireysel hücrelerin çözünürlüğü zayıf olsa da, geniş alan floresan mikroskobu ile izlenebileceğini göstermiştir.

Şekil 6, canlı GSC16-4 / GFP ve U-118 / L1LE / mCherry hücre invazyonunun beyin dilimlerine konfokal hızlandırılmış deneylerinin statik görüntülerini göstermektedir. Konfokal z-stack görüntüleri, çok noktalı bir hızlandırılmış deneyde 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir elde edildi. Zaman içinde konfokal z-yığınları olarak alınan sferoidlerden beyin dilimlerine hücre istilası filmleri, Ek Video S7, Ek Video S8, Ek Video S9, Ek Video S10 ve Ek Video S11'de sunulmaktadır. Bu deney, konfokal hızlandırılmış görüntülemenin, bireysel hücre invaziv davranışını izlemek için geniş alan floresansından daha üstün olduğunu ortaya koymuştur. U-118 / L1LE hücreleri, bu koşullar altında GSC'lerden belirgin şekilde daha invazivdi. Bu, statik görüntülerde bile belirgindir, GSC'ler daha merkezi olarak konumlandırılmıştır ve U-118 hücreleri daha dağınıktır.

Şekil 7 , iki farklı ayrı etiketli sferoidin (U-118 / L1LE / mCherry sferoidleri ve GSC16-4 / GFP sferoidleri) beyin dilimlerine yerleştirildiği, birkaç gün boyunca büyütüldüğü ve daha sonra sabitlendiği, laminin için immünoboya uygulandığı ve konfokal mikroskopta optik kesitleme ile görüntülendiği ex vivo beyin dilimi / sferoid preparatlarının birkaç örneğini göstermektedir. Bu, her iki hücre tipinin de beyin dilimini istila ettiğini ve kan damarları boyunca seyahat ettiğini ortaya koydu. Farklı sferoid tipleri birbirleriyle temas edecek kadar yakın olduklarında, bir hücre tipinin diğer hücre tipinin sferoidine çok az istilası olduğu görülüyordu ve sferoidler ayrı kaldı.

Şekil 8 , iki farklı etiketli hücre tipi (GSC16-4 / GFP ile karıştırılmış U-118 / L1LE / mCherry) kullanılarak kültürde üretilen "karışık hücre tipi" sferoidlerin beyin dilimlerine yerleştirildiği, birkaç gün boyunca büyütüldüğü ve daha sonra sabitlendiği, laminin için immünoboya uygulandığı ve konfokal mikroskopta optik kesitleme ile görüntülendiği ex vivo beyin dilimi / sferoid preparatlarının birkaç örneğini göstermektedir. Bu, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin sferoidlerden göç ettiğini ve sferoidlerin merkezine yakın kümelerde kalma eğiliminde olan yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinden çok daha belirgin bir şekilde dağıldığını ortaya koydu. Ek olarak, U-118 / L1LE / mCherry hücreleri de DiD ile boyandı, böylece iki ayrı etiket (mCherry ve DiD) doğrudan sabit ex vivo preparatlarda karşılaştırılabildi. DiD etiketi, beyin dilimini istila eden tek hücrelerde bile hala tespit edilebilir; ancak, bu hücre içi punkta gibiydi.

Figure 1
Şekil 1: GSC'lerin in vivo olarak E5 optik tektumuna enjeksiyonundan kaynaklanan E15'teki tümörler. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. GSC15-2 hücreleri A, C ve E panellerinde ve GSC16-4 hücreleri B, D ve F panellerinde gösterilir. (A) Ventriküle yakın bir tümör ile optik tektumun düşük büyütmeli görünümü (V). Sox2 boyaması, OT hücrelerinin çekirdeklerinin çoğunu boyayan kırmızı renkte gösterilir. (B) A'ya benzer görüntü, ancak renk karıştırma ve görüntü pozlaması nedeniyle görüntüde sarı veya beyaz görünebilen kırmızı renkte nestin için boyanmış GSC16-4 hücreleri ile. OT çekirdekleri, bisbenzimid ile karşı boyama nedeniyle beyaz görünür. (C-F) 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak z-stack'lerden üretilen hacim render'larının farklı perspektifleri. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazıları Sox2 için immün boyama nedeniyle C ve E panellerinde kırmızı görünür. D ve F panellerindeki kırmızı boyama, nestin için boyamadan kaynaklanmaktadır. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yaygın rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve GSC yüzeylerinde noktasal görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemelerinin kenarları boyunca gösterilir. C-F panellerindeki ses oluşturma dönüşlerinin videoları Ek Video S1, Ek Video S2, Ek Video S3 ve Ek Video S4'te sunulur. Ölçek çubukları = 500 μm (A,B). Kısaltmalar: GSC'ler = glioblastoma kök hücreleri; OT = optik tektum; GFP = yeşil floresan proteini; BV = kan damarı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: E15'teki tümörler, E5 optik tektumuna enjekte edilen GSC'ler ve U-118 GBM hücrelerinin bir karışımından kaynaklanır. GSC'ler GFP ekspresyonu nedeniyle yeşildir ve U-118 / L1LE hücreleri mCherry ekspresyonu nedeniyle kırmızıdır. GSC15-2, A-D panellerinde ve GSC16-4, E ve F panellerinde gösterilir. (A) Ventrikülün yakınındaki karışık hücreli bir tümörün (ok) düşük büyütmeli konfokal tek z-düzlemi. Çekirdekler bisbenzimid ile beyaza boyanır. (B) Kırmızı U-118 hücrelerinin ventrikül yüzeyine yakın OT'ye invazyonu ile A'da gösterilen tümörün daha yüksek büyütülmesi (10x objektif). (C) OT duvarının derinliklerine gömülü tümörü (ok) gösteren A'dakinden biraz farklı bir optik kesit düzlemi. (D) C'deki tümörün çoklu z-düzlemlerinin maksimum projeksiyonu (20x objektif), tümör içindeki sıralanmış hücrelerin ayrıntılarını gösterir. (E) GSC16-4 hücrelerine sahip karışık bir tümörün tek z-düzlemi görüntüsü (20x objektif), tümör içinde ayrışmanın GSC15-2 hücrelerinden zıt bir düzende gerçekleştiğini ve yeşil GSC'lerin kırmızı U-118 hücrelerini çevreleyen ince ve eşit bir korteks oluşturduğunu göstermektedir. Tümörün OT duvarına bağlanma alanı bu z-düzleminde gösterilmemiştir. GSC korteksinin süreksizliğinin olduğu tümörün U-118 / L1LE hücrelerinin şişkin olduğu alanına dikkat edin (ok). L1CAM için immün boyama mavi renkle gösterilmiştir. (F) E'dekiyle aynı görüntü, ancak yalnızca yeşil GSC'leri ve mavi L1CAM boyamayı gösteriyor. Ölçek çubukları = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). Kısaltmalar: GSC'ler = glioblastoma kök hücreleri; OT = optik tektum; GFP = yeşil floresan proteini; V = ventrikül. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Ex vivo optik tektum dilimlerinin kültürde 1 hafta sonra yaşayabilirliği. E14 optik tektum dilimleri membran ekleri üzerinde 1 hafta süreyle kültürlendi ve daha sonra sabitlenerek immünoboya tabi tutuldu. A ve B'de gösterilenler, bisbenzimid (A) ile çekirdekler için boyanmış ve laminin (B) için immün boyanmış bir beyin diliminin konfokal görüntüleridir (10x objektif), laminin boyaması nedeniyle çeşitli konfigürasyonlarda optik olarak kesitlenmiş normal, sağlam kan damarlarını açıkça gösterir. (C) Çekirdeklerin ve laminin boyamasının her ikisinin de görülebildiği A ve B panellerinde gösterilene benzer bir konfokal görüntü. (D) Nükleer ve laminin boyamasının ayrıntılarını gösteren daha yüksek büyütmeli (60x petrol hedefi) konfokal bir görüntü. (E) Kırmızı renkte Sox2 transkripsiyon faktörü ve beyaz bisbenzimid ile toplam çekirdekler için boyanmış beyin diliminin konfokal z-yığınının (20x objektif) maksimum projeksiyon görüntüsü. Çekirdeklerin çoğunluğunun in vivo olarak gösterildiği gibi Sox2 boyaması sergilediğini unutmayın (bkz. Şekil 1). Ölçek çubukları = 100 μm (A,B,C,E), 25 μm (D). Kısaltma: P = pial yüzey. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: U-118/mCherry hücreleri, biyopsi punch yöntemi ile ex vivo beyin dilimine yerleştirilir. 1 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanılarak beyin dilimlerinde boşluklar oluşturuldu ve daha sonra matrisle karıştırılmış kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücreleri bir "tıkaç" olarak implante edildi. Birkaç gün sonra, beyin dilimleri sabitlendi, laminin için immünoboya yapıldı ve konfokal mikroskop analizi için slaytlara monte edildi. Panel A ve C, ortaya çıkan "tümörün" ve beyin dilimini istila eden çevreleyen hücrelerin düşük büyütmeli, konfokal, tek z düzlemi görüntülerini (4x objektif) gösterir. (B) Panel A'daki preparattan daha yüksek bir büyütmede (20x hedef) U-118 hücrelerinin (ok) yoğun istilasını gösteren bir z-yığınının hacimsel görüntüsü. (D) Resim, C panelinde gösterilen kapsamlı olarak istilacı hücrelerin alt kısmının benzer bir hacim görüntüsünü göstermektedir. Laminin boyama yeşil renkte gösterilmiştir, ancak net bir kan damarı belirgin değildir. (E) Resim, bir hücre tıkacının bir kısmını ve beyin dilimini istila eden hücre grubunu ve mavi renkte kan damarları için laminin boyamasını göstermektedir. (F) Panel E'de gösterilen istilacı hücrelerin daha yüksek bir büyütmesi ve hücrelerin kan damarları (oklar) boyunca hizalandığı açıkça görülebilir. Tüm paneller bisbenzimid ile beyaz nükleer karşı boyama gösterir. Ölçek çubukları = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). B ve D panelleri için ölçek, hacim oluşturma eksenleri boyunca gerçekleşir. Kısaltma: OT = optik tektum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Kültürdeki canlı hücre sferoidleri ve ex vivo beyin dilimlerinde canlı GBM hücrelerinin geniş alan floresan görüntüleri. A ve B panellerinde gösterilenler, U-118 / L1LE GBM hücrelerinin (A) ve GSC'lerin (B) sferoidler (oklar) olarak büyüyen faz kontrast görüntüleridir (ters mikroskopta 10x objektif kullanılarak). Panel A'nın arka planında gösterilen, hücre kültürü kabında meydana gelebilecek poli-HEMA kaplamanın odak dışı düzensizliğidir. Panellerde gösterilen C-F, ex vivo dilimlere invazyonun canlı davranışını izlemek için hızlandırılmış bir deney sırasında U-118 / L1LE hücre sferoidlerinin ve istilacı hücrelerin (oklar) geniş alan floresan görüntüleridir (özel bir hızlandırılmış mikroskop sistemi18'de 20x'lik bir hedef kullanarak). C ve E panellerinde, hücreler uzak kırmızı floresan membran boyası DiD ile boyanır ve D ve F panellerinde hücreler kırmızı mCherry ekspresyonlarıyla görüntülenir. Ölçek çubukları = 100 μm. C ve D panellerinde gösterilen geniş alan floresan hızlandırılmış deneylerinin videoları, sırasıyla Ek Video S5 ve Ek Video S6'da bulunur. Kısaltmalar: GBM = glioblastoma; GSC'ler = GBM kök hücreleri; S = küresel. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4B hızlandırılmış çekimlerinin hacim oluşturma görüntüleri. Tüm panellerde, ayrı beyin dilimleri üzerindeki beş farklı karışık hücreli küresel engraftasyonun son nokta görüntüleri gösterilmektedir. A-E panelleri için, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımda konfokal z-stack görüntüleri elde edildi. Preparatlar, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip beyin dilimlerini içeriyordu. Konfokal görüntüler, beyin dilimleri, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan ekstra uzun çalışma mesafesi (ELWD) 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki membran ekleri üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim render'ları, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Bu konfokal hacimli render'ların zaman içindeki hızlandırılmış videoları, Ek Video S7, Ek Video S8, Ek Video S9, Ek Video S10 ve Ek Video S11'de sunulur. Kısaltmalar: GBM = glioblastoma; GSC'ler = GBM kök hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini; NA = sayısal açıklık. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Farklı hücre tiplerindeki sferoidlerden invaziv GBM hücrelerine sahip sabit beyin dilimlerinin konfokal görüntüleri. Yeşil sferoidler GSC16-4/GFP hücrelerinden, kırmızı sferoidler ise U-118/L1LE/mCherry hücrelerinden oluşuyordu. A-F panellerinde gösterilenler, laminin (mavi) için fiksasyon ve immünoboyamadan önce birkaç gün boyunca çoklu kırmızı ve yeşil sferoidlerin kültürlendiği beyin dilimlerinin farklı görünümleridir. A-C panelleri, A'nın 4x objektifle alındığı aynı OT dilimindedir ve B ve C panelleri, panel A'da gösterilen sferoidlerin ikisinden beyin dilimini istila eden hücrelerin daha yüksek büyütme hacimli render'larıdır (20x objektif). Her iki hücre tipi de kan damarları boyunca dokuyu açıkça istila etti. Panel D, iki farklı sferoidin birbirine yakın yerleştirildiği farklı bir beyin diliminin hacim render'ını (20x objektif) gösterir ve her ikisinden de hücrelerin aralarında bulunan aynı kan damarı boyunca göç ettiği görülür (ok). Panel E, yeşil hücrelerin kan damarının dış yüzeyi boyunca göç ettiğini, kırmızı hücrenin ise kan damarının içinde (ok) göç ettiğini ortaya koyan yüksek büyütmeli (60x yağ hedefi) bir hacimdir. İç kısım, kırmızı hücrenin kan damarının mavi boyanmasıyla (ok) açıkça çevrelendiği ve yeşil hücrenin açıkça kan damarının dışında olduğu tek bir z-düzlemi optik bölümünü gösterir. İç kısımdaki ölçek çubuğu = 50 μm. Panel F, birbirine yakın iki farklı renkte sferoid içeren bir ön beyin diliminin hacimsel render'ını (10x objektif) gösterir. Varsa, bir küreden diğerine çok az hücre istilası meydana geldi ve aralarında keskin bir sınır vardı. A, B, C ve E panelleri ayrıca bisbenzimid ile beyaz nükleer karşı boyama göstermektedir. Ölçek çubuğu = 500 μm (A). B-F panelleri için ölçekler, hacim oluşturma eksenleri boyuncadır. Kısaltmalar: GBM = glioblastoma; GSC'ler = GBM kök hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini; OT = optik tektum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: DiD ile etiketlenmiş karışık hücreli sferoidlerden ve sferoidlerden invaziv GBM hücrelerine sahip sabit beyin dilimlerinin konfokal görüntüleri. Paneller A-D, yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinden ve kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinden oluşan karışık hücre sferoidleri içeren beyin dilimlerinin hacim görüntülerini gösterir. Çok sayıda kırmızı U-118 hücresi sferoidlerden dağıldı ve beyin dilimini her yöne istila etti, oysa yeşil GSC'ler dağılmadı ve sferoidlerin merkezi yerlerinde kaldı. E ve F panelleri, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry sferoidleri ile bir ex vivo dilim hazırlığı gösterir, ayrıca uzak kırmızı membran boyası DiD (mavi olarak gösterilir) ile etiketlenmiştir. Fiksasyondan sonra, dilim yeşil laminin için immünoboya tabi tutuldu. DiD etiketi kırmızı hücrelerde noktasal boyama (oklar) olarak görülebiliyordu ve sferoidlerden kan damarları boyunca dağılmış hücrelerde bile görülebiliyordu. Bibenzimid ile nükleer karşı boyama bu şekilde gösterilmemiştir, böylece diğer boyama daha net görülebilir. Ölçek çubukları = 100 μm (E,F). Kısaltmalar: GBM = glioblastoma; GSC'ler = GBM kök hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ortam/çözüm Kompozisyon
GSC medya 1:1 DMEM / F12,% 1 fetal sığır serumu (FBS), 15 mM HEPES tamponu, 2 mM L-glutamin, 100 μg / mL penisilin-streptomisin (kalem / strep), A vitamini içermeyen% 2 B27 takviyesi ve 2.5 μg / mL heparin karışımı.
GBM medya DMEM (yüksek glikoz),% 10 FBS, kalem / strep ve 2 mM L-glutamin.
Fiksasyon tamponu 0,1 M sodyum kokodilat tamponunda %2 PFA
Gömme ortamı PBS'de %3.5 agar ve %8 sakkaroz
cesaret PBS'de %0,1 Triton X-100 + %5 normal keçi serumu (NGS)
U-118 MG hücre kültürü ortamı DMEM +% 10 FBS + kalem / strep + L-glutamin
Beyin Dilimi Kültür Medyası %50 MEM + %25 HBSS + %25 At Serumu + B27 + kalem/strep + L-glut + 15 mM HEPES tampon
titreşimli doku dilimleyici dilimleme ortamı Orta 199 + kalem/strep + 15 mM HEPES tampon

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan ortam ve tamponların bileşimi.

Ek Şekil 1: E5 optik tektuma enjeksiyon. (A) Hava boşluğu üzerindeki yumurta kabuğunda bir delik açıldıktan ve hava boşluğu zarı tuzlu su veya ortam ile ıslatıldıktan sonra, zar ince forsepslerle çıkarılır. (B) Hücreleri optik tektuma enjekte etmek için, amniyon sıkıştırılır ve optik tektuma erişilebilecek şekilde kafayı konumlandırmak için ince forsepslerle tutulur.  Daha sonra mikropipet optik tektuma yerleştirilir ve hücreler içine basınç enjekte edilir. (C) Hücrelerin enjeksiyonundan sonra, bir şırınga ve ince iğne kullanılarak embriyonun üzerine birkaç damla ampisilin çözeltisi eklenir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: E15 beyin bölgelerinin diseksiyonu. (A) Kafa kesildikten sonra, E15 embriyo başı steril CMF çözeltisi içeren bir kaba yerleştirilir. (B) Beynin üstündeki deri daha sonra ince forsepsler kullanılarak çıkarılır. (C ) İki kafatası kemiği daha sonra iki ön beyin (FB) yarımküresinin üstünden çıkarılır. (D) Bağ dokusu dura daha sonra ön beyin (FB), optik tektum ve beyinciği çevreleyen nazikçe çıkarılır. (E) Tüm beyin daha sonra kavisli forseps kullanılarak beyin boşluğundan yavaşça çıkarılarak kafadan çıkarılır. (F ) Çıkarılan beynin tamamının ön beyin (FB), optik tektum (OT) ve beyincik (CB) ile dorsal görünümü gösterilmiştir. (G ) İzole edilmiş beyin daha sonra ince makas kullanılarak ön beyin (FB), optik tektum (OT) yarımküreleri ve beyincik (CB) içine diseke edilir. (H ) Hassas bağ dokusu pia, daha sonra ince forsepsler kullanılarak optik tektum (OT) yarımkürelerinden kolayca çıkarılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: E15 optik tektumunun gömülmesi ve dilimlenmesi ve hücre sferoidlerinin yerleştirilmesi. (A) Bir optik tektum yarımküre, kavisli forseps kullanılarak düşük erimeli agaroza batırılır. (B) Agaroz buz üzerinde sertleştikten sonra, optik tektum içeren blok kesilir ve dilimleme kabındaki/tepsisindeki paslanmaz çelik kaideye yapıştırılır. (C) Tutkal kuruduktan sonra, dilimleme kabı/tepsisi titreşimli doku dilimleyicinin aynasına yerleştirilir ve soğuk dilimleme ortamı ile doldurulur.  Dilimler daha sonra batık doku bloğundan safir bıçakla kesilir.  Kesilmiş dilimler tabağa / tepsiye yüzer ve bir spatula kullanılarak çıkarılabilir.  (D) Kesilmiş dilimler çanaktan/tepsiden çıkarılır ve çok kuyucuklu bir plakada altta yatan dilim kültürü ortamına sahip membran eklerine doğrudan yerleştirilir. (E) Hücre sferoidleri poli-HEMA kaplı tabaklarda yetiştirildikten sonra, 20 μL mikropipetör kullanılarak bir sferoid, çanaktan minimum miktarda ortamda çıkarılır. (F) İzole edilmiş sferoid daha sonra minimal ortamdaki doğrudan beyin dilimine yerleştirilir. (G) Sferoid, ortamın akışı nedeniyle beyin diliminden düşerse, tahta bir aplikatör çubuğuna yapıştırılmış bir kirpik kullanılarak beyin dilimine geri sürülebilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: E15'te küçük bir GSC15-2 tümörünün yüksek büyütme hacimli render videosu. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. Video Şekil 1C'ye karşılık gelir ve GSC15-2 hücrelerini gösterir. Videoda, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak bir z-yığınından oluşturulan hacimli render'ın döndürülmesi gösterilmektedir. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazıları Sox2 için immün boyama nedeniyle kırmızı görünür. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yoğun rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve yeşil GSC yüzeylerinde punktat görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: E15'te küçük GSC16-4 tümörünün yüksek büyütmeli hacimli render videosu. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. Video, Şekil 1D'ye karşılık gelir ve GSC16-4 hücrelerini gösterir. Videoda, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak bir z-yığınından oluşturulan hacimli render'ın döndürülmesi gösterilmektedir. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazı GSC'ler nestin için immün boyama nedeniyle kırmızı görünür. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yoğun rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve yeşil GSC yüzeylerinde punktat görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S3: E15'te küçük GSC15-2 tümörünün yüksek büyütme hacmine sahip görüntülerinin videosu. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. Video Şekil 1E'ye karşılık gelir ve GSC15-2 hücrelerini gösterir. Videoda, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak bir z-yığınından oluşturulan hacimli render'ın döndürülmesi gösterilmektedir. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazıları Sox2 için immün boyama nedeniyle kırmızı görünür. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yoğun rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve yeşil GSC yüzeylerinde punktat görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S4: E15'te küçük GSC16-4 tümörlerinin yüksek büyütme hacimli render'larının videosu. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. Video, Şekil 1F'ye karşılık gelir ve GSC16-4 hücrelerini gösterir. Videoda, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak bir z-yığınından oluşturulan hacimli render'ın döndürülmesi gösterilmektedir. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazıları nestin için immün boyama nedeniyle kırmızı görünür. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yoğun rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve yeşil GSC yüzeylerinde punktat görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S5: Ex vivo beyin diliminde canlı GBM hücrelerinin videosu. Video, Şekil 5C'ye karşılık gelir ve ex vivo dilime invazyonun canlı davranışını izlemek için hızlandırılmış bir deney sırasında U-118 / L1LE hücre sferoidlerinin ve istilacı hücrelerin geniş alan floresan görüntülerini gösterir (özel bir hızlandırılmış mikroskop sisteminde 20x hedefi kullanarak). U-118 / L1LE hücreleri uzak kırmızı floresan membran boyası DiD ile boyandı. Görüntüler tek renkli bir kamera ile elde edildi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S6: Ex vivo beyin diliminde canlı GBM hücrelerinin videosu. Video, Şekil 5D'ye karşılık gelir ve ex vivo dilime invazyonun canlı davranışını izlemek için hızlandırılmış bir deney sırasında U-118 / L1LE hücre sferoidlerinin ve istilacı hücrelerin geniş alan floresan görüntülerini gösterir (özel bir hızlandırılmış mikroskop sisteminde 20x hedefi kullanarak). Hücreler kırmızı mCherry ekspresyonu ile görüntülendi. Görüntüler tek renkli bir kamera ile elde edildi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S7: Hacim oluşturma videosu, canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış görüntüleri. Video, Şekil 6A'ya karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. Hazırlık, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimiydi. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S8: Hacim videosu, canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış görüntülerinin görüntülerini oluşturur. Video, Şekil 6B'ye karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. Hazırlık, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimiydi. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S9: Hacim videosu, canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış görüntülerinin görüntülerini oluşturur. Video, Şekil 6C'ye karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. Hazırlık, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimiydi. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S10: Hacim videosu, canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış çekiminin görüntülerini oluşturur. Video, Şekil 6D'ye karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. Hazırlık, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimiydi. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S11: Canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış görüntülerinin hacim oluşturma videosu. Video, Şekil 6E'ye karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. preparat, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimini içeriyordu. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Hücrelerin orta beyin (optik tektum) ventrikülüne enjeksiyonu için protokoldeki kritik adımlar, yumurtadaki koryoallantoik membrandaki kan damarlarına zarar vermemeyi veya enjeksiyondan önce ve enjeksiyon sırasında embriyoyu çevrelememeyi içerir, ancak embriyoyu hemen çevreleyen amniyon zarı, hücreleri orta beyne enjekte ederken kafayı konumlandırmak için hafifçe çekilebilir ve tutulabilir. Amniyon nispeten serttir ve beynin ortasındaki büyük, yuvarlak yapı olan optik tektuma diğer eliyle hücrelerin enjeksiyonu için kafayı konumlandırmak ve bir elle sabit tutmak için ince forsepslerle çekilebilir. Genel olarak, enjekte edilen embriyoların canlılığı, bilinmeyen faktörlere bağlı olarak% 25 ila% 75 arasında değişmektedir ve pratik olarak hayatta kalan her embriyo, optik tektumda en az küçük bir tümör içerir. Canlı beyin dilimleri üretmedeki kritik adımlar, fazla sıvı dokusunun lekelenmesini içerir, böylece agaroz dilimleme sırasında beyne yapışır ve zar ekine yerleştirilene kadar doku ve dilimleri soğuk tutar. Farklı hücre tipleri sferoidleri farklı şekilde (hız ve boyut olarak) oluşturduğundan, poli-HEMA plakalarındaki kaplanmış hücre yoğunluğu ve sferoidlerin toplanmasından önceki sürenin uzunluğu her hücre tipi için optimize edilmelidir.

Buradaki çalışma, beyin dilimi canlılığının resmi bir uzunlamasına çalışmasına tabi tutulmamıştır. Yang ve ark. burada kullanılanlara benzer civciv embriyo beyin dilimi kültürleri kullanmış ve dilimlerin en az 7 gün boyunca iyi yaşayabilirliğini göstermiştir16. Önceki çalışmalar, OT dokusu suboptimal ortamda tutulduğunda, dokuda, buradaki çalışmadaki dilimlerde meydana gelmeyen birçok piknotik çekirdeğin ortaya çıktığını göstermiştir. Ek olarak, dilimler optimal olmayan koşullarda dejenere olduğunda, kan damarları parçalanır ve laminin-pozitif kürelerin sıraları olarak görünür (gösterilmemiştir). Bu nedenle, buradaki canlılık elektrofizyoloji veya aktif kaspaz-3 ekspresyonu gibi yöntemlerle kontrol edilmemiş olsa da, suboptimal kültür koşulları altında görülen hücre ölümü göstergelerinin hiçbiri burada ortaya çıkmamıştır.

OT, in vivo beyin tümörü deneyleri için odaklanmıştır, çünkü en büyük ventriküle sahip en kolay enjekte edilen bölgedir. Embriyonun yumurta sarısının üstünde erişilebilir kalacak kadar küçük olduğu son gün olan E5'te, tüm beyin bölgeleri ince bir ventrikül bölgesinden başka bir şey olmadığı için enjeksiyonlar bir ventrikül içine yapılmalıdır. Bununla birlikte, bu enjeksiyonlar, beyin parankimini istila eden hücrelere sahip gömülü tümörlerde başarılı bir şekilde sonuçlanır. Bazen, ortaya çıkan tümörler ön beyinde veya beyincikte bulunur, ancak bu yaygın değildir. E15 optik tektumunun Ex vivo dilimleri öncelikle buradaki deneyler için kullanılmıştır, böylece ex vivo ko-kültür sonuçları in vivo enjeksiyon deneyleri ile ilişkilendirilebilir. Bununla birlikte, ön beyin dilimleri de uygundur ve optik tektuma kıyasla daha geniş bir yüzey alanına ve çok ince bir ventriküle sahiptir, bu da ön beyni in vivo enjeksiyonlarla ilişkili olmayan ex vivo ko-kültürler için daha uygun hale getirebilir.

Burada, in vivo enjeksiyonların, ardından doku fiksasyonu, titreşimli doku dilimleyici kesitleme ve laminin ve diğer belirteçler için immün boyamanın, kan damarlarına yakın beyin dokusundaki GBM hücrelerinin ve GSC'lerin yüksek çözünürlüklü görüntüleriyle sonuçlandığı gösterilmiştir. Tümör hücreleri ve kan damarları arasındaki ilişkileri belirleme yeteneği, konfokal yazılımı ve üreticinin talimatlarını kullanarak konfokal optik bölümlerin z-yığınlarından 3D hacim render'ları oluşturarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. GFP, mCherry ve DiD etiketli hücrelerin geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak hızlandırılmış görüntüleme mümkündü; Bununla birlikte, yüksek oranda floresan sferoidlere yakın olan göç eden hücreler bazen sferoidden gelen "parıltı" ile gizlenmiştir. Bu istenmeyen etki, geniş alan görüntüleri toplamak için pozlama sürelerini dikkatlice ayarlayarak bir miktar en aza indirilebilir. Zaman içinde konfokal z-yığınları (4D) kullanılarak hızlandırılmış görüntüleme, sferoidlerden gelen odak dışı parıltıyı ortadan kaldırdı ve koyu bir arka plana sahip keskin bir şekilde tanımlanmış göç eden hücrelerle sonuçlandı. Bu, protokolde tanımlanmamıştır, ancak beyin dilimleri 6 delikli bir plastik plakadaki şeffaf zar ekleri üzerindeyken gerçekleştirilen geniş alan hızlandırılmış görüntülemeye benzer şekilde gerçekleştirilmiştir. Konfokal hızlandırılmış görüntüleme, bireysel hücrelerin ve davranışlarının belirgin şekilde daha net görüntüleriyle sonuçlanmasına rağmen, 20 saatlik bir süre boyunca 10 dakikalık aralıklarla 10 z-düzlemi / noktalı z-yığınlarını toplayan çok noktalı bir hızlandırılmış deney, tarama kafası galvanometrelerinin yaygın bir kullanımıdır. Bu, galvanometrelerin ömrünü önemli ölçüde azaltabileceğinden, bu yöntem akıllıca kullanılır.

Civciv embriyo sistemi, GBM hücre davranışını araştıran hem in vivo enjeksiyon hem de ex vivo ko-kültür deneyleri için çok uygun olmasına rağmen, bu model sistemin birkaç sınırlaması vardır. Herhangi bir ksenogreft sisteminde olduğu gibi, insan hücrelerinin implante edildiği ortam insan beyni değildir, ancak GBM hücre davranışı, kemirgen modellerinde ve insan hastalarında bunu taklit ediyor gibi görünmektedir. E5 üzerinde in vivo enjeksiyon deneyleri yapıldıktan sonra, tümörlerin normalde E15'e kadar 10 gün boyunca oluşmasına izin verilir. Bu açıkça tümörigenez ve hücre invazyonunun tüm yönlerini incelemek için yeterli zaman değildir. Bununla birlikte, burada beyin parankiminde katı tümörlerin oluştuğu, hücrelerin tümör içinde etkileşime girdiği ve kendilerini yeniden düzenlediği ve önemli beyin invazyonunun hem kan damarları boyunca hem de bu nispeten kısa süre içinde yaygın olarak meydana geldiği gösterilmiştir. İn vivo civciv embriyo sisteminin bir diğer sınırlaması, civciv embriyo gelişimi sırasında çalışan büyük yumurta sarısı ve ekstraembriyonik dolaşım sistemi nedeniyle ilaç veya diğer tedaviler için uygun olmamasıdır. Topikal sıvı ilaç tedavileri, embriyodan çok daha büyük yumurta sarısı kütlesine difüzyon nedeniyle beyinde oldukça değişken ve bilinmeyen bir konsantrasyona neden olacaktır. Benzer şekilde, ilaçların çok hassas ekstraembriyonik dolaşım sistemine intravenöz enjeksiyonu, kan damarlarından sızacak veya yayılacak ve ayrıca beyinde bilinmeyen konsantrasyonlara neden olacaktır. Bu, ex vivo dilim kültürü yönteminin benimsenmesinin ana nedenlerinden biridir - böylece sadece hücre davranışı hızlandırılmış mikroskopi ile gözlemlenebilir ve izlenemez, aynı zamanda bir çanak4'teki GBM hücre davranışını değiştirmede başarılı olan tedavilerin daha alakalı bir beyin dokusu ortamında test edilebilmesi için.

Civciv embriyosu ortotopik beyin tümörü model sisteminin geliştirilmesi, GBM tümör oluşumu ve invaziv hücre davranışının incelenmesi için mevcut sistemlere ve araçlara önemli bir katkı olarak görülmektedir. Döllenmiş tavuk yumurtalarının çoğu alanda kolayca bulunabilmesi muhtemeldir, kemirgenlere kıyasla ucuzdurlar, hayvan bakım maliyeti yoktur, embriyolar çok esnek ve enfeksiyona karşı dirençlidir (yani, çoğu iş bir tezgah üstünde yapılır), embriyolar oldukça manipüle edilebilir ve kabuksuz kültür19'da yetiştirilebilir ve civciv embriyoları omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmez ve bu nedenle NIH kılavuzları tarafından IACUC onayı gerektirmez (kurumsal gereksinimler) değişebilir). Bu nedenle, bu çoklu avantajlar, civciv embriyo sistemini, sorularını ve deneylerini sınırlamalarına girenlerle sınırlarsa çok çekici kılar. Civciv embriyosunu kullanan başkaları tarafından çoklu GBM hücre çalışmaları yapılmıştır, ancak bunlar neredeyse sadece embriyonun koryoallantoik zarını (CAM) 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 ve uzuv tomurcuğu 30'u kullanmıştır, beyin değil. E231'de civciv beynine medulloblastom implante eden bir rapor da var. Kuşkusuz, civciv embriyosunun ortotopik bir ksenogreft model sistemi olarak kullanılması, burada açıklandığı gibi, insan GBM tümör biyolojisi için CAM kullanan çalışmalardan çok daha anlamlı sonuçlar vermelidir.

Bu çalışmalar, insan GBM hücresi ve GSC davranışı çalışmaları için civciv embriyosu beyin tümörü model sistemini tam olarak kullanmaya başlamış olsa da, başkalarının kullanımları genişleteceği ve daha fazla potansiyel uygulama bulacağı umulmaktadır. Bu sistemin sadece GBM tümör oluşumunu ve hücre davranışını düzenleyen mekanizmaları ortaya çıkarmakla kalmayacağını, aynı zamanda spesifik ilaçların ve maddelerin spesifik hastaların hücreleri üzerinde klinik öncesi test edilmesine izin vereceğini de hayal edebiliriz. Örneğin, beyin dilimi kültürleri önceden ayarlanmışsa, tümör hücreleri, cerrahi tümör rezeksiyonlarından parçalar veya hasta kaynaklı GBM organoidleri32 doğrudan ex vivo ko-kültüre yerleştirilebilir ve çeşitli tedaviler birkaç gün içinde değerlendirilebilir. Benzer şekilde, ayrışmış hasta hücreleri, tümör oluşturma ve beyin parankimini istila etme yeteneklerini değerlendirmek için doğrudan ovo'daki E5 orta beyinlerine enjekte edilebilir. Bu nedenle, buradaki yöntemlerin ve temsili sonuçların açıklamalarının, beyin kanseri araştırmaları için oldukça az kullanılan bu sistemin kullanımını kolaylaştıracağı ve teşvik edeceği umulmaktadır.

Disclosures

Yazarların hiçbirinde çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (R03CA227312) D.S.G.'ye bir hibe ve Lisa Dean Moseley Vakfı'ndan cömert bir hibe ile finanse edildi. Canlı GBM örnekleri, Helen F. Graham Kanser Merkezi ve Araştırma Enstitüsü Doku Tedarik Merkezi aracılığıyla hasta onayı ile elde edildi. A.R.'ye finansman Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi ve Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (UL1TR003107) tarafından sağlanmıştır. N.P., A.L., Z.W. ve K.S.'ye yaz lisans araştırma bursları Delaware Üniversitesi Lisans Araştırma Programı tarafından sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch Birabira N/A
1 mm biopsy punch pen Robbins Instruments 20335
6 well insert plate (Corning Transwell) Millipore Sigma CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20C
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
24 well plate Corning Costar 3526
50 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-9
Agar Fisher BioReagents BP1423-500 for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG Jackson Immunoresearch 115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG Jackson Immunoresearch 115-545-146
Aluminum foil ReynoldsWrap N/A
Ampicillin Sigma Aldrich A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 Santa Cruz Biotechnology sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 Santa Cruz Biotechnology sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2 Santa Cruz Biotechnology sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 Santa Cruz Biotechnology sc-365823
B27 supplement without vitamin A GIBCO 17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258) Sigma-Aldrich B2883 nuclear stain
Cell culture incubator Forma standard humidified CO2 incubator
Centrifuge Beckman Coulter
Confocal microscope Nikon Instruments C2si+ With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses Nikon Instruments Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software Nikon Instruments NIS Elements Version 5.2
Curved foreceps World Precision Intruments 504478
Curved scissors Fine Science Tools
Curved spatula Fisher Scientific 14-375-20
Cyanoacrylate glue Krazy Glue KG-585 12R
D-Glucose Millipore Sigma G8270
DiD far red fluorescent dye Invitrogen V22887 Vybrant DiD
DMEM Sigma Aldrich D5671
DMEM/F12 Sigma Aldrich D8437
DMSO Sigma Aldrich D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5493-1L
egg incubator Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm) Scotch N/A
Ethanol 200 proof Decon Laboratories 2701
Fast green FCF dye Avocado Research Chemicals 16520
FBS Gemini Bio-products 900-108
filter paper Fisher Scientific
Gauze Dynarex 3353
Glass Capillaries for microinjection World Precision Instruments TW100-4
Glycerol Fisher BioReagents BP228-1 for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells) Not applicable Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Hausser scientific
Heparin Fisher Scientific BP2524-100
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887
Horse Serum (HI) Gibco 26050-088
Human FGF-2 BioVision 4037-1000
Human TGF-α BioVision 4339-1000
Inverted phase contrast microscope Nikon Instruments TMS for routine viewing of cultured cells
KCl Fisher Scientific BP366
KH2PO4 Fisher Scientific P284
Laboratory film Parafilm
Labquake Shaker LabIndustries T400-110
L-Glut:Pen:Strep Gemini Bio-products 400-110
Low-melt agarose Fisher Scientific BP1360 for embedding live brains
Matrix Corning Matrigel 354234
Medium 199 GIBCO 11150-059
MEM Corning 10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) Fisherbrand 12544A
NaCl Fisher Scientific S271
NaH2PO4 + H2O Fisher Scientific S369
NaHCO3 Fisher Scientific BP328
Normal goat serum Millipore Sigma 526-M
N-propyl gallate Sigma Aldrich P3130 for mounting media
Parafilm Parafilm
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS Sigma Aldrich P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides Fisherbrand 12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish Becton Dickinson 351008
pneumatic picopump World Precision Intruments PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA) Sigma Aldrich P-3932
razor blade- double edge PACE for cutting fixed brain slices
sapphire knife Delaware Diamond Knives for cutting live brain slices
Scalpel TruMed 1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 Electron Microscopy Sciences 11652
Specimen chamber for vibratome custom-made
Stereo Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ1500 Equipped with epifluorescence
straight foreceps World Precision Intruments 500233
straight scissors Fine Science Tools
Sucrose Mallinckrodt 7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) Nikon Instruments TE2000-E With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm Thermo Fisher Scientific 130182 for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm Becton Dickinson 353004 for cell culturing
Transfer pipette American Central Scientific Co. FFP011
Transparent tape Scotch
Triton X-100 Sigma Aldrich T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line ATCC HTB-15 Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump Cole-Parmer EW-07532-40 "Air Cadet"
Vibrating tissue slicer Vibratome 3000 for cutting live and fixed brain slices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (3), 225-236 (2005).
  2. Yang, M., et al. L1 stimulation of human glioma cell motility correlates with FAK activation. Journal of Neuro-Oncology. 105 (1), 27-44 (2011).
  3. Mohanan, V., Temburni, M. K., Kappes, J. C., Galileo, D. S. L1CAM stimulates glioma cell motility and proliferation through the fibroblast growth factor receptor. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (4), 507-520 (2013).
  4. Anderson, H. J., Galileo, D. S. Small-molecule inhibitors of FGFR, integrins and FAK selectively decrease L1CAM-stimulated glioblastoma cell motility and proliferation. Cellular Oncology. 39 (3), 229-242 (2016).
  5. Pace, K. R., Dutt, R., Galileo, D. S. Exosomal L1CAM stimulates glioblastoma cell motility, proliferation, and invasiveness. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3982 (2019).
  6. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  7. Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
  8. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  9. Aaberg-Jessen, C., et al. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (4), 546-560 (2013).
  10. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochemical and Biophysical Research Communications. 269 (2), 513-520 (2000).
  11. Ren, B., et al. Invasion and anti-invasion research of glioma cells in an improved model of organotypic brain slice culture. Tumori. 101 (4), 390-397 (2015).
  12. Fayzullin, A., et al. Time-lapse phenotyping of invasive glioma cells ex vivo reveals subtype-specific movement patterns guided by tumor core signaling. Experimental Cell Research. 349 (2), 199-213 (2016).
  13. Jensen, S. S., et al. Establishment and characterization of a tumor stem cell-based glioblastoma invasion model. PloS One. 11 (7), e0158746 (2016).
  14. Marques-Torrejon, M. A., Gangoso, E., Pollard, S. M. Modelling glioblastoma tumour-host cell interactions using adult brain organotypic slice co-culture. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031435 (2018).
  15. Tamura, R., et al. Visualization of spatiotemporal dynamics of human glioma stem cell invasion. Molecular Brain. 12 (1), 45 (2019).
  16. Yang, C., et al. Organotypic slice culture based on in ovo electroporation for chicken embryonic central nervous system. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 1813-1826 (2019).
  17. Murrell, W., et al. Expansion of multipotent stem cells from the adult human brain. PloS One. 8 (8), e71334 (2013).
  18. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  19. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  20. Shoin, K., et al. Chick embryo assay as chemosensitivity test for malignant glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
  21. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  22. Balciūniene, N., et al. Histology of human glioblastoma transplanted on chicken chorioallantoic membrane. Medicina. 45 (2), 123-131 (2009).
  23. De Magalhães, N., et al. Applications of a new In vivo tumor spheroid based shell-less chorioallantoic membrane 3-D model in bioengineering research. Journal of Biomedical Science and Engineering. 3 (1), 20-26 (2010).
  24. Szmidt, M., et al. Morphology of human glioblastoma model cultured in ovo. Journal of Veterinary Research. 56 (2), 261-266 (2012).
  25. Jaworski, S., et al. Comparison of tumor morphology and structure from U87 and U118 glioma cells cultured on chicken embryo chorioallantoic membrane. Journal of Veterinary Research. 57 (4), 593-598 (2013).
  26. Yuan, Y. J., Xu, K., Wu, W., Luo, Q., Yu, J. L. Application of the chick embryo chorioallantoic membrane in neurosurgery disease. International Journal of Medical Sciences. 11 (12), 1275-1281 (2014).
  27. Urbańska, K., et al. The effect of silver nanoparticles (AgNPs) on proliferation and apoptosis of in ovo cultured glioblastoma multiforme (GBM) cells. Nanoscale Research Letters. 10, 98 (2015).
  28. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  29. Han, J. M., Jung, H. J. Synergistic anticancer effect of a combination of berbamine and arcyriaflavin A against glioblastoma stem-like cells. Molecules. 27 (22), 7968 (2022).
  30. Ruiz-Ontañon, P., et al. Cellular plasticity confers migratory and invasive advantages to a population of glioblastoma-initiating cells that infiltrate peritumoral tissue. Stem Cells. 31 (6), 1075-1085 (2013).
  31. Cage, T. A., et al. Distinct patterns of human medulloblastoma dissemination in the developing chick embryo nervous system. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (4), 371-380 (2012).
  32. Darrigues, E., et al. Biobanked glioblastoma patient-derived organoids as a precision medicine model to study inhibition of invasion. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10720 (2021).

Tags

Nörobilim Sayı 195
Civciv Embriyo Beynini, İnsan Glioblastoma Hücre Davranışının <em>In</em> Vivo ve <em>Ex Vivo</em> Analizleri için Bir Model Olarak Kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pastorino, N. G., Tomatsu, S., Lin,… More

Pastorino, N. G., Tomatsu, S., Lin, A., Doerr, J., Waterman, Z., Sershen, K., Ray, P., Rodriguez, A., Galileo, D. S. Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior. J. Vis. Exp. (195), e65199, doi:10.3791/65199 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter