मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल व्यवहार के विवो और एक्स विवो विश्लेषण के लिए एक मॉडल के रूप में चूजा भ्रूण मस्तिष्क का उपयोग करना

Summary

चूजा भ्रूण का उपयोग ओवो में मानव ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) मस्तिष्क ट्यूमर और पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस सह-संस्कृतियों में अध्ययन के लिए किया जाता है। जीबीएम सेल व्यवहार को एक्स विवो सह-संस्कृतियों में टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज किया जा सकता है, और दोनों तैयारियों का विश्लेषण प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर विस्तृत 3 डी कॉन्फोकल विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है।

Abstract

चूजा भ्रूण कशेरुक विकास के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली रही है, विशेष रूप से प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए। चूजे के भ्रूण का उपयोग विवो में मानव ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) मस्तिष्क ट्यूमर के गठन और आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों में ट्यूमर कोशिकाओं की आक्रामकता का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया गया है। जीबीएम ट्यूमर ओवो में ई 5 मिडब्रेन (ऑप्टिक टेक्टम) वेंट्रिकल में फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं के निलंबन के इंजेक्शन से बन सकता है।

जीबीएम कोशिकाओं के आधार पर, कॉम्पैक्ट ट्यूमर यादृच्छिक रूप से वेंट्रिकल में और मस्तिष्क की दीवार के भीतर बनते हैं, और कोशिकाओं के समूह मस्तिष्क की दीवार के ऊतकों पर आक्रमण करते हैं। ट्यूमर के साथ निश्चित ई 15 टेक्टा के मोटे ऊतक खंड (350 μm) को यह प्रकट करने के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया जा सकता है कि हमलावर कोशिकाएं अक्सर रक्त वाहिकाओं के साथ पलायन करती हैं जब कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों के 3 डी पुनर्निर्माण द्वारा विश्लेषण किया जाता है। लाइव ई 15 मिडब्रेन और फोरब्रेन स्लाइस (250-350 μm) को झिल्ली डालने पर सुसंस्कृत किया जा सकता है, जहां फ्लोरोसेंटली लेबल वाले जीबीएम कोशिकाओं को गैर-यादृच्छिक स्थानों में पेश किया जा सकता है ताकि सेल आक्रमण का विश्लेषण करने के लिए पूर्व विवो सह-संस्कृतियों को प्रदान किया जा सके, जो लगभग 1 सप्ताह की अवधि में रक्त वाहिकाओं के साथ भी हो सकता है। लाइव सेल व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए इन पूर्व विवो सह-संस्कृतियों की निगरानी वाइडफील्ड या कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी द्वारा की जा सकती है।

सह-सुसंस्कृत स्लाइस को तब कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा तय, इम्यूनोस्टेन्ड और विश्लेषण किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि आक्रमण रक्त वाहिकाओं या अक्षतंतु के साथ हुआ है या नहीं। इसके अतिरिक्त, सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग विभिन्न सटीक स्थानों में विभिन्न सेल प्रकारों और रंगों के समुच्चय रखकर और सेल आंदोलनों का अवलोकन करके संभावित सेल-सेल इंटरैक्शन की जांच के लिए किया जा सकता है। दवा उपचार पूर्व विवो संस्कृतियों पर किया जा सकता है, जबकि ये उपचार इन ओवो सिस्टम के साथ संगत नहीं हैं। ये दो पूरक दृष्टिकोण मानव जीबीएम सेल व्यवहार और अत्यधिक मैनिपुलेबल कशेरुक मस्तिष्क वातावरण में ट्यूमर गठन के विस्तृत और सटीक विश्लेषण की अनुमति देते हैं।

Introduction

कैंसर सेल व्यवहार के इन विट्रो अध्ययन का उपयोग अक्सर संभावित तंत्रों को विच्छेदित करने के लिए किया जाता है जो विवो जेनोग्राफ्ट मॉडल में ट्यूमर गठन और सेल आक्रमण के दौरान देखे जाने वाले अधिक जटिल व्यवहार के दौरान काम करते हैं। उदाहरण के लिए, ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) के साथ, इन विट्रो अध्ययनों ने तंत्र को उजागर किया है कि एल 1 सीएएम संभावित रूप से एक नए चूजे भ्रूण जेनोग्राफ्ट ब्रेन ट्यूमर मॉडल 1,2,3,4,5 में ट्यूमर गठन और मस्तिष्क आक्रमण के दौरान कैसे संचालित होता है। यद्यपि इन विट्रो और विवो प्रयोगों में उपयोगी तरीकों से एक-दूसरे के पूरक हैं, वे परिणामों को सहसंबद्ध करने में पर्याप्त अंतर छोड़ते हैं। उदाहरण के लिए, एक डिश पर जीबीएम सेल गतिशीलता का यंत्रवत विश्लेषण एक अत्यधिक कृत्रिम स्थिति है, और विवो जेनोग्राफ्ट मॉडल में केवल ट्यूमर गठन और सेल व्यवहार के स्थिर समय बिंदु या समापन बिंदु विश्लेषण प्रकट हो सकते हैं। विवो अध्ययनों में, या तो कृन्तकों या चूजे के भ्रूण का उपयोग करके आसानी से सेल व्यवहार की निगरानी के लिए खुद को उधार नहीं देते हैं, जबकि कोशिकाएं इन जेनोग्राफ्ट मॉडल में मस्तिष्क के ऊतकों पर आक्रमण करती हैं। फिर भी, चूजा भ्रूण जेनोग्राफ्ट मॉडल ने प्रदर्शित किया है कि आसंजन प्रोटीन एल 1 सीएएम मानव टी 9 8 जी जीबीएम कोशिकाओं ^2,5 की आक्रामक क्षमता में उत्तेजक भूमिका निभाता है।

इस समस्या का एक उपयुक्त समाधान एक ऑर्गेनोटाइपिक ब्रेन स्लाइस कल्चर मॉडल का उपयोग करके विवो और इन विट्रो दोनों तरीकों में ब्रिजिंग करके पहुंचा जा सकता है, जिसे एक्स विवो मॉडल के रूप में जाना जाता है। इस पूर्व विवो मॉडल में, जीवित मस्तिष्क ऊतक को कुछ हफ्तों तक कई सौ माइक्रोन की मोटाई पर बनाए रखा जा सकता है, जिससे कैंसर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना, समय के साथ वास्तविक ऊतक में उनके व्यवहार का निरीक्षण करना और फिर प्रयोग के समापन बिंदु पर अधिक विस्तृत मार्कर विश्लेषण करना संभव हो जाता है।

एक लोकप्रिय ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस कल्चर विधि एक पारभासी या पारदर्शी छिद्रपूर्ण झिल्ली के शीर्ष पर कई सौ माइक्रोन-मोटी मस्तिष्क स्लाइस को कल्चर करने के लिए है, जिससे ऊतक हवा के संपर्क में आ जाता है, फिर भी पोषक तत्व मीडिया को झिल्ली के नीचे से ऊतक को बनाए रखने की अनुमति मिलती है (स्टॉपिनी एट अल ⁶ देखें)। इस विधि के विभिन्न रूपों का उपयोग विभिन्न अध्ययनों के लिए किया गया है, जिसमें विभिन्न मीडिया या विभिन्न झिल्ली आवेषण का उपयोग करना शामिल है। विभिन्न झिल्ली आवेषण में 30 मिमी व्यास, छिद्रपूर्ण (0.4 μm) झिल्ली 35 मिमी कल्चर डिश 6 में सम्मिलित होती है, और^6-वेल प्लेटों 7 के लिए सेल कल्चर इंसर्ट (0.4 μm)^{शामिल होती है}। विभिन्न मीडिया में 50% एमईएम / एचईपीईएस + 25% गर्मी-निष्क्रिय घोड़े सीरम + 25% हैंक्स संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) ⁸, 50% कम सीरम मीडिया + 25% घोड़े सीरम + 25% एचबीएसएस⁹, साथ ही अन्य शामिल हैं। यदि फ्लोरोसेंटली लेबल जीबीएम कोशिकाओं के साथ एक पारभासी या पारदर्शी झिल्ली का उपयोग किया जाता है, तो ऐसी संस्कृतियों को उल्टे वाइडफील्ड या कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप^{10,11,12,13,14,15} का उपयोग करके नीचे से चित्रित किया जा सकता है।

जबकि विवो ऑर्थोटोपिक ब्रेन ट्यूमर जेनोग्राफ्ट और एक्स विवो ऑर्गेनोटाइपिक ब्रेन स्लाइस कल्चर मॉडल में कई कृन्तकों का उपयोग करके स्थापित किए गए हैं, जैसा कि ऊपर उद्धृत किया गया है, चूजा भ्रूण (गैलस गैलस) को इन उद्देश्यों के लिए कम उपयोग किया गया है। हालांकि, चूजे के भ्रूण को मानव और चूहे के ग्लियोमा आक्रमण ^1,2,5 दोनों के अध्ययन के लिए विवो ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट मॉडल के रूप में उपयोग करने में सक्षम दिखाया गया है। चूजे के भ्रूण के दिमाग में जेनोग्राफ्ड कोशिकाओं ने कृंतक मॉडल में देखे गए आक्रमण पैटर्न का प्रदर्शन किया है, जो जीबीएम ट्यूमर सेल विश्लेषण के लिए विवो मॉडल के रूप में चूजे के भ्रूण के उपयोग का समर्थन करता है। चूजा भ्रूण भी सस्ती हैं, कृन्तकों की तुलना में अधिक आसानी से बनाए रखा जा सकता है (यानी, एक प्रयोगशाला इनक्यूबेटर में उनके अंडे के छिलके में), और उनके साथ काम करना बहुत आसान है, जिससे उन्हें विवो जीबीएम अध्ययनों में अल्पकालिक के लिए एक आकर्षक विकल्प बना दिया जाता है। एक हालिया लेख ने सामान्य मस्तिष्क विकास के दौरान अक्षतंतु के गठन और विकास के लिए चूजे के भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग का वर्णन किया है जहां स्लाइस कम से कम^{7 दिनों के} लिए व्यवहार्य थे। हालांकि, ऊतक वातावरण में जीबीएम सेल व्यवहार के पूर्व विवो विश्लेषण के लिए ऐसे चिक भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग की कमी है। इस लेख में, विवो में प्रारंभिक चूजा भ्रूण मस्तिष्क में मानव जीबीएम कोशिकाओं और जीबीएम स्टेम कोशिकाओं (जीएससी) के प्रत्यारोपण के साथ-साथ जीवित चूजा भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों पर जीबीएम कोशिकाओं की शुरूआत दोनों का वर्णन किया गया है। इन तैयारियों से प्राप्त परिणामी ट्यूमर और सेल आक्रमण पैटर्न के कुछ प्रतिनिधि उदाहरण भी प्रदान किए गए हैं।

Protocol

इस काम को करने के लिए डेलावेयर विश्वविद्यालय में कोई मंजूरी या अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी।

1. चिक ऑप्टिक टेक्टम में जीबीएम सेल इंजेक्शन।

1. इंजेक्शन के लिए जीएससी और जीबीएम कोशिकाओं की तैयारी
   1. जीएससी मीडिया में संस्कृति जीएससी (तालिका 1)। संस्कृति ने जीबीएम मीडिया में जीबीएम सेल लाइनों की स्थापना की (तालिका 1)।
   2. बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) के साथ प्लेटों पर कोशिकाओं को कुल्ला करें और 10 सेमी डिश में 1 एमएल ट्रिप्सिन घोल रखें। 2-3 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में छोड़ दें जब तक कि कोशिकाएं अलग न होने लगें।
   3. 10 सेमी डिश में 10 एमएल उपयुक्त सीरम युक्त कल्चर मीडिया जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें और ऊपर और नीचे पाइप करके कोशिकाओं को अलग करें। सेल सस्पेंशन को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
   4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें।
   5. साइड आर्म फ्लास्क और वैक्यूम पंप से जुड़े एक डिस्पोजेबल फाइन ग्लास पिपेट का उपयोग करके सेल पेलेट से मीडिया को एस्पिरेट करें। प्रति माइक्रोलीटर 10,000 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए उपयुक्त विकास मीडिया में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और बर्फ पर एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब या छोटे स्क्रू-टॉप ट्यूब में रखें।
   6. कोशिकाओं को बाँझ 1% फास्ट ग्रीन एफसीएफ डाई की थोड़ी मात्रा के साथ मिलाएं (डाई के 5 μL के अनुपात का उपयोग करें / सेल निलंबन के 100 μL का उपयोग करें)।
2. ओवो में ई 5 ऑप्टिक टेक्टम में जीबीएम कोशिकाओं का इंजेक्शन। अनुपूरक चित्र 1 देखें।
   1. निषेचित चिकन अंडे को एक ह्यूमिडिफायर अंडे इनक्यूबेटर में 37.5 डिग्री सेल्सियस पर नीचे की ओर इंगित करते हुए इनक्यूबेट करें ( इनक्यूबेशन का पहला दिन भ्रूण दिवस 0 [E0] है)। इनक्यूबेशन (E5) के 6 वें दिन, 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव करके अंडे के छिलके को निष्फल करें।
   2. एक अंडा मोमबत्ती का उपयोग करके, एक पेंसिल के साथ भ्रूण के ऊपर वायु स्थान की परिधि के साथ ट्रेस करें और पारदर्शी टेप के साथ उल्लिखित क्षेत्र को कवर करें।
   3. घुमावदार कैंची का उपयोग करके, ट्रेस किए गए क्षेत्र के चारों ओर धीरे से काटें, सावधान रहें कि भ्रूण झिल्ली या रक्त वाहिकाओं में न काटें, और अंडे के शीर्ष को छोड़ दें।
   4. इसे गीला करने के लिए वायु अंतरिक्ष झिल्ली पर खारा या सेल कल्चर मीडिया की कुछ बूंदें रखें ताकि यह आसानी से अलग हो जाए। महीन बल का उपयोग करके, भ्रूण के शीर्ष पर वायु अंतरिक्ष झिल्ली को सावधानीपूर्वक छेदें, इसे हटा दें, और चूजे के भ्रूण के सिर का पता लगाएं।
   5. पारदर्शी एमनियन झिल्ली को पकड़ने के लिए बारीक बल का उपयोग करें जो तुरंत सिर को रखने के लिए भ्रूण को घेरता है ताकि ऑप्टिक टेक्टम को कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया जा सके। एक हाथ से, इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सिर को जगह में रखने के लिए एमनियन को पकड़ने के लिए बारीक बल का उपयोग करें। जर्दी पर कोरियोलांटोइक झिल्ली में एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक रक्त वाहिकाओं को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
      नोट: उपरोक्त प्रक्रिया भ्रूण को घेरने वाली स्पष्ट एमनियन झिल्ली को कुशलतापूर्वक पकड़ने में सक्षम होने के लिए कुछ अभ्यास करती है, क्योंकि यह तब तक अदृश्य होता है जब तक कि इसे पकड़ा और खींचा नहीं जाता है। भ्रूण को तुरंत घेरने वाले स्पष्ट एमनियन को पकड़ने के लिए बारीक बल का उपयोग करने का अभ्यास करें।
   6. एमनियन झिल्ली को बारीक बल से जकड़कर सिर को स्थिर रखें। एक ग्लास माइक्रोपिपेट और एक वायवीय पिकोपंप का उपयोग करके, ऑप्टिक टेक्टम में उपयुक्त सेल कल्चर मीडिया के 5 μL में लगभग 50,000 कोशिकाओं को इंजेक्ट करें (5 μL एक भरे हुए माइक्रोपिपेट का लगभग 1/2 है)।
      नोट: ई 5 भ्रूण की एक छवि के लिए क्रेटू एट ^अल.1 देखें जिसे डाई के साथ मिश्रित जीबीएम कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया है।
   7. भ्रूण के शीर्ष पर 50 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन की कुछ बूंदें रखें।
   8. स्पष्ट टेप के साथ अंडे के शीर्ष में छेद को कवर करें और विच्छेदन के लिए ई 15 तक ह्यूमिडिफायर में छोड़ दें।

2. ई 15 भ्रूण से मस्तिष्क क्षेत्रों का विच्छेदन

नोट: निर्धारण के लिए यहां ई 15 दिमाग का विच्छेदन जीवित मस्तिष्क स्लाइस के लिए चरण 8.2 में वर्णित के समान है, लेकिन यहां विच्छेदन सड़न रोकनेवाला स्थितियों के तहत नहीं किया जाना है।

1. शेल के शीर्ष के चारों ओर टेप को काट दें, जिससे भ्रूण तक पहुंच हो सके।
2. गर्दन पर भ्रूण को अलग करें और बाँझ कैल्शियम- और मैग्नीशियम मुक्त टायरोड्स (सीएमएफ टाइरोड) समाधान के साथ 10 सेमी डिश में सिर रखें। अनुपूरक चित्र 2 देखें।
3. बारीक बल का उपयोग करके, अंतर्निहित ड्यूरा मैटर को प्रकट करने के लिए मस्तिष्क को कवर करने वाली त्वचा को छील दें। मस्तिष्क के बाईं और दाईं ओर बनने वाली खोपड़ी की हड्डियों को हटा दें। खोपड़ी की हड्डियों का निर्माण अभी तक मस्तिष्क के बहुमत को कवर नहीं करता है।
4. धीरे-धीरे मस्तिष्क के केंद्र में स्थित मेनिंगेस को फाड़ने के लिए बारीक नुकीले बल का उपयोग करें और मस्तिष्क को उजागर करने के लिए इसे प्रत्येक तरफ छील दें।
5. मस्तिष्क को नीचे से खींचने के लिए घुमावदार बल का उपयोग करें और धीरे से इसे अपनी गुहा से बाहर खींचें।
6. मस्तिष्क को उसके भागों में विच्छेदित करें: फोरब्रेन, टेक्टा, सेरिबैलम।
7. बारीक बल का उपयोग करके टेक्टा से ऊपर की पिया मैटर को हटा दें। ध्यान दें कि पिया टेक्टा से आसानी से अलग हो जाता है, लेकिन फोरब्रेन या सेरिबैलम से नहीं। पिया को फोरब्रेन से छूकर या फिल्टर पेपर के एक छोटे से टुकड़े पर रोल करके निकालें।
8. विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों को एक छोटे से पकवान में रखें।
9. 24-वेल प्लेट में निर्धारण के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों को अच्छी तरह से रखें और 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर में 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में ठीक करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए छोड़ दें।
10. निर्धारण के बाद, आगर में एम्बेड करने से पहले कम से कम 1 घंटे में 3x पीबीएस में ऊतक को कुल्ला करें।

3. कटे हुए मस्तिष्क क्षेत्रों को एम्बेड करना और स्लाइस करना।

1. पीबीएस में 3.5% एगर और 8% सुक्रोज के घोल को पिघलने तक गर्म करें और इसे पिघलने के तापमान पर रखें।
2. एक स्कूप के रूप में घुमावदार बल का उपयोग करते हुए, धीरे से चूजे के भ्रूण के मस्तिष्क के ऑप्टिक टेक्टम या फोरब्रेन क्षेत्र को उठाएं, और बाहरी मस्तिष्क की सतह पर आगर के आसंजन को सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फिल्टर पेपर पर थोड़ा धब्बा लगाएं।
3. एक बाँझ स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, मोल्ड को आगर समाधान से भरें।
   नोट: एक साधारण मोल्ड एक उचित आकार की वस्तु के चारों ओर एल्यूमीनियम पन्नी बनाकर बनाया जा सकता है, जैसे कि छोटे आयताकार धातु कंपन ऊतक स्लाइसर ब्लॉक।
4. आगर में मस्तिष्क क्षेत्र रखें, और एगर को पूरी तरह से जमने दें।
5. एम्बेडेड मस्तिष्क के चारों ओर से एल्यूमीनियम पन्नी को हटा दें और रेजर ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करके किनारों के चारों ओर अतिरिक्त एगर को ट्रिम करें।
6. स्लाइसिंग ट्रे के स्टेनलेस-स्टील स्क्वायर पर साइनोएक्रिलेट गोंद की एक बूंद रखें, मस्तिष्क के साथ एगारोस ब्लॉक को गोंद पर रखें, और 1 मिनट के लिए गोंद बंधन दें। ट्रे को कंपन ऊतक स्लाइसर चक में रखें, कस ें, और आगर ब्लॉक के शीर्ष को कवर करने के लिए ट्रे को पर्याप्त पीबीएस से भरें।
7. स्टील रेजर ब्लेड का उपयोग करके 350 μm मोटाई पर एक कंपन ऊतक स्लाइसर पर मस्तिष्क स्लाइस काटें।
8. जैसा कि मस्तिष्क के स्लाइस काटे जाते हैं और स्लाइसिंग ट्रे में स्वतंत्र रूप से तैरते हैं, ट्रे से स्लाइस को निकालने और हटाने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें। धीरे से स्पैटुला से अनुभाग को स्लाइड करें और पीबीएस के साथ 10 सेमी पेट्री डिश लेबल करें ताकि अनुभाग स्वतंत्र रूप से तैरें।
   नोट: मस्तिष्क स्लाइस के आसपास का एगर अलग हो सकता है यदि मस्तिष्क एम्बेड करने से पहले अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फिल्टर पेपर के साथ पर्याप्त रूप से धब्बा नहीं है। यदि ऐसा होता है, तो मस्तिष्क के ऊतकों को धीरे-धीरे ठोस आगर से हटाया जा सकता है और अतिरिक्त तरल के उचित सोख्ता के बाद फिर से एम्बेडेड किया जा सकता है।

4. ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इम्यूनोस्टेनिंग मस्तिष्क स्लाइस

1. एपिफ्लोरेसेंस से लैस स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए एक-एक करके 10 सेमी डिश में व्यक्तिगत स्लाइस स्क्रीन करें।
2. इम्यूनोस्टेनिंग के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 और 5% सामान्य बकरी सीरम (पीबीएसटीजी) (तालिका 1 देखें) के साथ फॉस्फेट-बफर्ड खारा की पर्याप्त मात्रा तैयार करें और स्लाइस को इम्यूनोस्टेन्ड होने के लिए कुल्ला करें।
3. 24-वेल प्लेट में आधे कुएं भरें जिनका उपयोग पीबीएस के साथ मस्तिष्क वर्गों को धुंधला करने के लिए किया जाएगा।
4. एक स्पैटुला या स्केलपेल के किनारे के साथ मस्तिष्क स्लाइस के चारों ओर आगर के कोनों को ट्रिम करें, और धीरे से उन्हें पीबीएस युक्त कुओं में रखें।
5. पीबीएस को एस्पिरेट करें और पीबीएसटीजी में प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला समाधान के 350 μL के साथ बदलें (उदाहरण के लिए, PBSTG में 2 μg / mL UJ127)।
6. कोमल आंदोलन के साथ एक ठंडे कमरे में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें ताकि टुकड़ा कुएं के भीतर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो जाए।
7. 24 घंटे के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और आंदोलन के साथ ठंडे कमरे में पीबीएसटीजी के साथ 3 x 1 घंटे कुल्ला करें।
8. कुल्ला समाप्त होने पर, पीबीएसटीजी में द्वितीयक एंटीबॉडी धुंधला समाधान के 350 μL / कुएं में इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, PBSTG में बायोटिन-जीएएम का 1/200 कमजोर पड़ना)। आंदोलन के साथ ठंडे कमरे में 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
   नोट: यदि इस चरण में तृतीयक चरण को छोड़ दिया जाए और फ्लोरोक्रोम युक्त द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इंजेक्शन लगाया जाए, तो अब इनक्यूबेशन दौरान प्रकाश से बचाने के लिए कवर करें और फिर चरण 4.11 पर जाएं।
9. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें और आंदोलन के साथ ठंडे कमरे में पीबीएसटीजी में 3 x 1 घंटे कुल्ला करें।
10. PBSTG को निकालें और तृतीयक समाधान में इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, PBSTG में Alexa Fluor 647 स्ट्रेप्टाविडिन का 1:250 कमजोर पड़ना)। यदि वांछित हो, तो मिश्रण में 0.1 μg / mL bisbenzimide जोड़कर इस चरण पर नाभिक को दाग दें। आंदोलन के साथ ठंडे कमरे में 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
11. तृतीयक घोल निकालें और आंदोलन के साथ ठंडे कमरे में पीबीएसटीजी में 3 x 1 घंटे कुल्ला करें।
12. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट करने के लिए तैयार होने तक पीबीएस में छोड़ दें।

5. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्लाइस माउंटिंग

1. माउंट करने के लिए जितने भी सेक्शन हैं, उतने माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें।
2. प्रत्येक स्लाइड के लिए, पैराफिल्म के एक टुकड़े पर 10 मील (254 μm) मोटी विनाइल विद्युत टेप की 50 मिमी लंबाई की पट्टी रखें।
3. 1 सेमी x 1 सेमी स्क्वायर होल पंच का उपयोग करके, विद्युत टेप और पैराफिल्म के केंद्र के माध्यम से एक छेद को छिद्रित करें।
4. पैराफिल्म से टेप खींचें और इसे माइक्रोस्कोप स्लाइड के शीर्ष पर रखें, स्लाइड पर टेप लेबलिंग के लिए जगह छोड़ दें।
5. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, विद्युत टेप के केंद्र में चौकोर छेद में एंटी-फीके माउंटिंग मीडिया की एक या दो बूंदें रखें।
6. पीबीएसटीजी से वांछित कंपन ऊतक स्लाइसर अनुभाग को उठाने के लिए एक घुमावदार स्पैटुला का उपयोग करें और एक साफ प्रयोगशाला पोंछे या फिल्टर पेपर के टुकड़े के साथ नमी को अच्छी तरह से दूर करें।
7. स्लाइस के किनारे को माउंटेंट की बूंद तक स्पर्श करें और अनुभाग को धीरे से माउंटिंग मीडिया में स्लाइड करने के लिए एक और स्पैटुला का उपयोग करें।
8. माउंटेंट की कुछ और बूंदों के साथ अनुभाग को कवर करें और ध्यान से अनुभाग और माउंटेंट के शीर्ष पर 24 मिमी x 30 मिमी (# 1.5 मोटाई) कवरस्लिप रखें।
9. कवरस्लिप के किनारों को नेल पॉलिश से सील करें ताकि इसे जगह पर रखा जा सके।

6. निश्चित मस्तिष्क स्लाइस की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी।

1. उचित उद्देश्य लेंस और फ़िल्टर सेट (एस) का उपयोग करके माउंटेड मस्तिष्क स्लाइस में फ्लोरोसेंट ट्यूमर खोजने के लिए वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस का उपयोग करें।
   नोट: कुछ ट्यूमर काफी बड़े हो सकते हैं और 4x उद्देश्य के साथ आसानी से दिखाई दे सकते हैं, जबकि एकल कोशिकाओं को 10x उद्देश्य की आवश्यकता हो सकती है।
2. एक उपयुक्त उद्देश्य लेंस, लेजर (एस), पिनहोल आकार और डिटेक्टर सेटिंग्स का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर स्विच करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, नियमित इमेजिंग के लिए 20x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर [N.A.] = 0.75) और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए 60x तेल उद्देश्य (N.A. = 1.40) का उपयोग करें।
3. ऑप्टिकल वर्गों को प्राप्त करने के लिए जेड-अक्ष और चरण आकार (कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप निर्माता के निर्देशों के अनुसार विशिष्ट स्थिति के लिए) की ऊपरी और निचली सीमाएं निर्धारित करें। ऑप्टिकल वर्गों का एक जेड-स्टैक प्राप्त करें।
4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, ट्यूमर का 3 डी वॉल्यूम रेंडर बनाने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

7. स्फेरॉइड तैयारी

1. पॉली (2-हाइड्रॉक्सीथाइल मेथैक्रिलेट) (पॉली-हेमा) प्लेटें बनाना
   1. 95% इथेनॉल में 10 μg / mL पॉली-हेमा का एक समाधान बनाएं, और इस समाधान के 1 एमएल के साथ 35 मिमी पेट्री व्यंजन (या सेल कल्चर व्यंजन) कोट करें।
   2. व्यंजन की सतह की एक कोटिंग विकसित करने के लिए व्यंजन को कमरे के तापमान पर रात भर खुले रॉकर पर बैठने दें।
      नोट: विलायक वाष्पित हो जाएगा और पकवान पर एक पारभासी कोटिंग छोड़ देगा, जो असमान दिखाई दे सकता है, लेकिन यह सेल स्फेरॉइड बनाने की क्षमता को प्रभावित नहीं करेगा।
   3. सूखने के बाद, 1 घंटे के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में यूवी प्रकाश के तहत खुले व्यंजनों को निष्फल करें। नसबंदी के बाद ढक्कन बदलें। लेपित व्यंजन अब उपयोग के लिए तैयार हैं।
2. टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के लिए फ्लोरोसेंट डीआईडी धुंधला होना
   नोट: यह खंड स्फेरॉइड बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले डीआईडी फ्लोरोसेंट डाई के साथ एकल कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए है, जो लाइव टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए सेल गतिशीलता के विज़ुअलाइज़ेशन को अनुकूलित करता है।
   1. सीरम-मुक्त संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को निलंबित करें।
   2. सेल सस्पेंशन के 5 μL DiD स्टॉक / mL जोड़ें और धीरे से पाइपिंग द्वारा मिलाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
   3. लेबल सेल सस्पेंशन को 5 मिनट के लिए 5 डिग्री सेल्सियस पर 800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
   4. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और कुल्ला करने के लिए गर्म मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
   5. इस सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं और चरण को दो बार और धो लें।
      नोट: यदि वांछित हो, तो इस प्रक्रिया के तुरंत बाद स्फेरॉइड बनाने के लिए चरण 7.3.6 पर जाएं।
3. सेल स्फेरॉइड बनाना
   1. एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) घोल को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
   2. यू-118 कल्चर माध्यम में जीएससी मीडिया¹⁷ (तालिका 1) और यू -118 घातक ग्लोइमा (एमजी) कोशिकाओं में कल्चर जीएससी (तालिका 1 देखें)। स्फेरॉइड की एक 35 मिमी प्लेट की तैयारी के लिए एक कंफ्लुएंट 10 सेमी डिश का उपयोग करें। बीएफजीएफ (10 एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता) और टीजीएफ-α (20 एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता) वृद्धि कारकों को जीएससी में शुरू में और फिर हर 3 दिनों में जोड़ें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं हरे रंग की जीएससी 15-2/के 72, हरी जीएससी 16-4/के 72, लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी 2 एक्स और लाल यू -118/1879 / झिल्ली डालने पर मस्तिष्क स्लाइस की दो 6-वेल प्लेटों के लिए स्फेरॉइड की एक प्लेट पर्याप्त होनी चाहिए।
   3. बाँझ पीबीएस के साथ प्लेटों पर कोशिकाओं को कुल्ला करें और 10 सेमी डिश पर 1 एमएल ट्रिप्सिन घोल रखें। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 2-3 मिनट के लिए रखें जब तक कि कोशिकाएं अलग न होने लगें।
   4. 10 सेमी डिश में 10 एमएल उपयुक्त सीरम युक्त कल्चर मीडिया जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें और ऊपर और नीचे पाइप करके कोशिकाओं को अलग करें। सेल सस्पेंशन को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
   5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें।
   6. सेल गोली से मीडिया को एस्पिरेट करें और 10 एमएल मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
   7. प्रत्येक 35 मिमी पॉली-हेमा-लेपित डिश पर 2 एमएल सेल सस्पेंशन रखें और प्रति डिश कुल मीडिया के 4 एमएल प्राप्त करने के लिए 2 एमएल अधिक उपयुक्त मीडिया जोड़ें। जीएससी का उपयोग करते समय, विकास कारक जोड़ें।
   8. सेल इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि समुच्चय 100-200 μm के आकार तक न पहुंच जाए, जो चढ़ाई गई कोशिकाओं के घनत्व के आधार पर 1-2 दिन हो सकता है।

8. जीवित चूजा भ्रूण मस्तिष्क विच्छेदन और कंपन ऊतक स्लाइसर स्लाइसिंग

1. विच्छेदन के लिए तैयारी।
   1. झिल्ली डालने के नीचे 1 एमएल ब्रेन स्लाइस कल्चर मीडिया ( तालिका 1 देखें) के साथ एक 6-अच्छी तरह से पॉलिएस्टर झिल्ली डालने वाली प्लेट तैयार करें।
   2. 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र और उपकरणों को निष्फल करें।
   3. विच्छेदन होने के दौरान बर्फ पर 6-अच्छी तरह से डालने वाली प्लेट रखें।
   4. 100 एमएल कंपन ऊतक स्लाइसर स्लाइसिंग मीडिया (तालिका 1) तैयार करें और बर्फ पर रखें।
   5. पीबीएस में 4% कम पिघले हुए अगारोस की एक शीशी को पानी के स्नान में रखें जब तक कि यह तरल (लगभग 50 डिग्री सेल्सियस) में पिघल न जाए।
   6. कंपन ऊतक स्लाइसर टब को बर्फ से भरें।
2. सड़न रोकनेवाला ई 14/15 चूजा भ्रूण मस्तिष्क विच्छेदन।
   1. अंडे की मोमबत्ती का उपयोग करके, एक पेंसिल के साथ ई 14 या ई 15 भ्रूण के ऊपर हवा की जेब की परिधि के साथ ट्रेस करें और पारदर्शी टेप के साथ उल्लिखित क्षेत्र को कवर करें।
   2. घुमावदार या महीन कैंची का उपयोग करके, ट्रेस किए गए क्षेत्र के चारों ओर धीरे से काटें, सावधान रहें कि भ्रूण झिल्ली या रक्त वाहिकाओं में न काटें, और खोल के शीर्ष टुकड़े को फेंक दें।
   3. घुमावदार बल का उपयोग करके, भ्रूण के शीर्ष पर वायु स्थान झिल्ली को हटा दें और चूजे के भ्रूण के सिर का पता लगाएं।
   4. भ्रूण को अलग करें और सिर को ठंडे बाँझ सीएमएफ समाधान के साथ 10 सेमी डिश में रखें। अनुपूरक चित्र 2 देखें।
   5. बाँझ महीन बल का उपयोग करके, अंतर्निहित ड्यूरा मैटर को प्रकट करने के लिए मस्तिष्क को कवर करने वाली त्वचा को छील दें। मस्तिष्क के बाईं और दाईं ओर बनने वाली खोपड़ी की हड्डियों को हटा दें। खोपड़ी की हड्डियों का निर्माण अभी तक मस्तिष्क के बहुमत को कवर नहीं करता है।
   6. मस्तिष्क के केंद्र में स्थित मेनिंगेस को फाड़ने के लिए धीरे से बारीक नुकीले बल (# 5 या # 55) का उपयोग करें और मस्तिष्क को उजागर करने के लिए इसे प्रत्येक तरफ छील दें।
   7. महीन घुमावदार बल का उपयोग करके, मस्तिष्क को नीचे के सामने से ऊपर खींचें और धीरे से इसे अपनी गुहा से बाहर निकालें।
   8. मस्तिष्क को इसके तीन मुख्य भागों में विभाजित करें: फोरब्रेन, मिडब्रेन (ऑप्टिक टेक्टा), सेरिबैलम। यदि आवश्यक हो, तो चूजे के विकास के एटलस से परामर्श करें।
   9. बारीक बल का उपयोग करके टेक्टा से ऊपर की पिया मैटर को हटा दें।
      नोट: पिया टेक्टा से आसानी से अलग हो जाता है, लेकिन फोरब्रेन या सेरिबैलम से नहीं। पिया को इसे छूने या बाँझ धुंध पर घुमाने से अग्रमस्तिष्क से हटाया जा सकता है।
   10. विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों को बर्फ पर एक छोटे बाँझ पकवान में रखें।
3. मस्तिष्क को एम्बेड करना और काटना
   1. एक स्कूप के रूप में घुमावदार बल का उपयोग करते हुए, धीरे से ऑप्टिक टेक्टम या फोरब्रेन क्षेत्र को उठाएं और बाहरी मस्तिष्क की सतह पर अगारोस के आसंजन को सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए बाँझ धुंध पर थोड़ा धब्बा लगाएं।
   2. एक बाँझ स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, मोल्ड को कम-पिघले हुए अगारोस से भरें। उचित आकार की वस्तु के चारों ओर एल्यूमीनियम पन्नी बनाकर एक साधारण मोल्ड तैयार करें। छोटे आयताकार धातु कंपन ऊतक स्लाइसर ब्लॉक को नियमित रूप से वस्तु के रूप में उपयोग किया जाता है। अनुपूरक चित्र 3 देखें।
   3. जल्दी से मस्तिष्क क्षेत्र को अगारोस में रखें और इसे बर्फ पर जमने दें (लगभग 4-5 मिनट)।
      नोट: अगारोस के कठोर होने से पहले मस्तिष्क मोल्ड के तल तक डूब सकता है। यदि ऐसा होता है, तो एगर को सेट करना शुरू करने के लिए 1 मिनट प्रतीक्षा करें, और फिर मस्तिष्क क्षेत्र को अगारोस में रखें। अगारोस के बीच में सीधे मस्तिष्क क्षेत्र को निलंबित करने की कोशिश करें।
   4. ठोस अगारोस में एम्बेडेड मस्तिष्क के चारों ओर से एल्यूमीनियम पन्नी को हटा दें और बाँझ रेजर ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करके किनारों के चारों ओर अतिरिक्त एग्रोस को ट्रिम करें।
   5. ट्रे के स्टेनलेस-स्टील वर्ग पर साइनोएक्रिलेट गोंद की एक बूंद रखें, मस्तिष्क के साथ अगारोस ब्लॉक रखें, और 1 मिनट के लिए गोंद बंधन दें। ट्रे को कंपन ऊतक स्लाइसर चक में रखें, कसलें, और ट्रे को अगारोस ब्लॉक के शीर्ष को कवर करने के लिए स्लाइसिंग मीडिया से भरें।
   6. नीलम चाकू का उपयोग करके 250-350 μm पर एक कंपन ऊतक स्लाइसर पर वर्गों को काटें, जिसके परिणामस्वरूप स्टील रेजर ब्लेड की तुलना में कम जीवित ऊतक क्षति होने की सूचना मिली है।
   7. चूंकि मस्तिष्क के स्लाइस काटे जाते हैं और स्लाइसिंग ट्रे में स्वतंत्र रूप से तैरते हैं, ट्रे से स्लाइस को निकालने और हटाने के लिए बाँझ स्पैटुला का उपयोग करें। धीरे से स्पैटुला के अनुभाग को स्लाइड करें और एक अन्य बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके एक झिल्ली पर डालें।
      नोट: आम तौर पर, यदि वांछित हो, तो प्रत्येक झिल्ली डालने पर दो या तीन मस्तिष्क स्लाइस रखे जा सकते हैं। मस्तिष्क के टुकड़े के आसपास का अगारोस अलग हो सकता है यदि मस्तिष्क अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए बाँझ धुंध के साथ पर्याप्त रूप से धब्बा नहीं है। यदि एम्बेड करने से पहले पर्याप्त सोख्ता के बाद भी ऐसा होता है, तो धीरे से आस-पास के अगारोस के बिना स्लाइस उठाएं और इसे झिल्ली डालने पर स्लाइड करें।
   8. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में झिल्ली के आवेषण पर मस्तिष्क स्लाइस की 6-वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂ पर रखें।
   9. चढ़ाना के अगले दिन, इंसर्ट के नीचे से मीडिया को एस्पिरेट करने के लिए एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करें (एक पिपेट को नीचे मीडिया तक पहुंच प्राप्त करने की अनुमति देने के लिए इंसर्ट के किनारों में अंतराल हैं)। झिल्ली डालने के नीचे प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर ताजा स्लाइस मीडिया जोड़ें। इसके बाद हर दूसरे दिन मीडिया बदलना जारी रखें।
   10. कुछ दिनों तक प्रतीक्षा करें कि मस्तिष्क के स्लाइस झिल्ली के सम्मिलित होने से मजबूती से जुड़ जाएं और कुछ हद तक समतल हो जाएं। यह एक संकेत है कि स्लाइस व्यवहार्य हैं और जीबीएम कोशिकाओं की शुरूआत के लिए तैयार हैं।

9. मस्तिष्क स्लाइस पर जीबीएम सेल का परिचय।

1. स्फेरॉइड विधि
   1. सेल स्फेरॉइड आकार में 150-200 μm तक पहुंचने के बाद, अपने कल्चर डिश से एक से कई स्फेरॉइड को हटाने के लिए 5 μL पर 20 μL माइक्रोपिपेट सेट का उपयोग करें। अनुपूरक चित्र 3 देखें।
   2. धीरे से वांछित मस्तिष्क स्लाइस पर स्फेरॉइड के साथ मीडिया को निष्कासित करें।
      नोट: सेल स्फेरॉइड पिपेट टिप में दिखाई देना चाहिए। एक स्पष्ट पिपेट टिप का उपयोग करने से उन्हें टिप में देखना आसान हो जाएगा। यदि तरल निकलने पर स्फेरॉइड मस्तिष्क के टुकड़े से गिर जाता है, तो एक पतली लकड़ी के एप्लिकेटर स्टिक से चिपके हुए इथेनॉल-स्टरलाइज्ड आईलैश का उपयोग धीरे-धीरे स्फेरॉइड को मस्तिष्क स्लाइस पर वापस धकेलने के लिए किया जाना चाहिए।
   3. स्फेरॉइड को 2-5 दिनों के लिए मस्तिष्क स्लाइस पर कल्चर करने की अनुमति दें।
      नोट: यहां सीमा स्लाइस में रक्त वाहिकाओं और मस्तिष्क कोशिकाओं का अंतिम क्षरण प्रतीत होता है। लैमिनिन के लिए दाग होने पर अवक्रमित रक्त वाहिकाएं स्लाइस में असंतुलित गेंदों के रूप में दिखाई देंगी।
2. बायोप्सी पंच विधि
   1. मस्तिष्क के स्लाइस को झिल्ली डालने पर समतल होने के लिए दिखाई देकर संलग्न करने की अनुमति दें (संस्कृति में 2-5 दिन लग सकते हैं)।
   2. बर्फ पर सेल मैट्रिक्स को पिघलाएं।
   3. सेल कल्चर बायोसेफ्टी कैबिनेट में, एक बाँझ 1 मिमी व्यास बायोप्सी पंच को वैक्यूम एस्पिरेटर ट्यूब से कनेक्ट करें।
   4. मस्तिष्क स्लाइस के केंद्र में 1 मिमी छेद बनाने के लिए बायोप्सी पंच के साथ मस्तिष्क के टुकड़े को धीरे से स्पर्श करें।
      नोट: बायोप्सी पंच में ऊतक को वैक्यूम द्वारा पंच में एस्पिरेटेड किया जाएगा।
   5. कोशिकाओं के 60% -70% कंफ्लुएंट 10 सेमी डिश को ट्रिप्सिनाइज्ड करके और 10 एमएल मीडिया में पुन: निलंबित करके सेल मैट्रिक्स निलंबन तैयार करें; फिर, उस निलंबन के 1 एमएल को मैट्रिक्स के 100 μL के साथ मिलाएं।
   6. 20 μL माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, मस्तिष्क स्लाइस में प्रत्येक छेद में सेल मैट्रिक्स मिश्रण के 1 μL रखें।
   7. सेल मिश्रण प्लेसमेंट समाप्त होने के बाद, एम्बेडेड कोशिकाओं के साथ मस्तिष्क स्लाइस के पकवान को इनक्यूबेटर में वापस रखें, और मैट्रिक्स को ठोस होने दें और कोशिकाओं को संभावित रूप से आसपास के मस्तिष्क स्लाइस पर आक्रमण करने की अनुमति दें।

10. वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी।

1. मीडिया के वाष्पीकरण को रोकने के लिए 6-वेल प्लेट के किनारे के चारों ओर हटाने योग्य टेप रखें, जिससे गैस विनिमय के लिए एक तरफ एक छोटा सा अंतर छोड़ दिया जाए।
2. प्लेटों को एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर एक समायोज्य स्वचालित चरण पर एक अनुकूलित संस्कृति कक्ष में रखें।
   नोट: चैंबर को गैस इंजेक्शन नियंत्रक का उपयोग करके 5% सीओ₂ और 95% हवा की वायुमंडलीय स्थितियों में रखा गया था, और गर्म हवा के तापमान नियंत्रक और तापमान-नियंत्रित चरण डालने के साथ तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली के विवरण के लिए Fotos et ^al.18 देखें।
3. उपयुक्त माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, एक टाइम-लैप्स अधिग्रहण अनुसूची बनाएं जो 20 घंटे के लिए हर 10 मिनट में एक बार रुचि के क्षेत्रों की फ्लोरोसेंट छवियों को एकत्र करता है।
   नोट: यदि कोशिकाओं में एक हरे फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग किया जाता है (जैसे, हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन [जीएफपी]), तो फोटोटॉक्सिसिटी को रोकने के लिए कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए आवश्यक नीली उत्तेजना प्रकाश की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करें। लाल (जैसे, एमचेरी) और दूर लाल (जैसे, डीआईडी) लेबल में लंबी तरंग दैर्ध्य उत्तेजना के कारण यह संभावित समस्या नहीं होती है।

11. टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के बाद इम्यूनोस्टेनिंग ब्रेन स्लाइस

नोट: यह इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल लैमिनिन के साथ रक्त वाहिकाओं और बिस्बेंज़िमाइड के साथ नाभिक को धुंधला करने के लिए अनुकूलित है। रुचि के वांछित अणु (ओं) के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग करें।

1. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके झिल्ली के नीचे से मीडिया को एस्पिरेट करें, और इंसर्ट के नीचे 0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर में 2% पीएफए के 1 एमएल और मस्तिष्क स्लाइस को कवर करने के लिए इंसर्ट के ऊपर 1 एमएल रखें। स्लाइस को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठीक होने दें।
2. झिल्ली डालने के नीचे से फिक्सेटिव को हटा दें और मस्तिष्क के टुकड़े पर शेष किसी भी फिक्सेटिव को हटा दें (फिक्सेटिव नीचे कुएं में झिल्ली डालने के माध्यम से रिसाव करता है)।
3. 35 मिमी कुएं से स्लाइस के साथ डालें और उन्हें एक बड़े प्लास्टिक डिश में रखें।
4. मस्तिष्क स्लाइस (इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान एक टुकड़ा / अच्छी तरह से) के कई कुओं में पीबीएस के 350 μL जोड़कर 24-अच्छी प्लेट तैयार करें।
   1. एक पतली स्पैटुला का उपयोग करके, झिल्ली डालने से मस्तिष्क के टुकड़े को अलग किए बिना धीरे से मस्तिष्क स्लाइस के चारों ओर से एगारोस को हटा दें। सुनिश्चित करें कि अगारोस मस्तिष्क स्लाइस के बाहरी किनारे से आसानी से अलग हो जाता है। यदि नहीं, तो मस्तिष्क के टुकड़े से जुड़े अगारोस को छोड़ दें।
   2. एक तेज स्केलपेल का उपयोग करके, मस्तिष्क स्लाइस के चारों ओर झिल्ली के माध्यम से काट लें जब तक कि अंतर्निहित झिल्ली के साथ स्लाइस बाकी इंसर्ट से मुक्त न हो जाए। झिल्ली को पकड़ने के लिए बारीक बल का उपयोग करके, संलग्न मस्तिष्क स्लाइस के साथ झिल्ली को उठाएं, और इसे पीबीएस में 24-वेल प्लेट के कुएं में रखें।
5. ठंडे कमरे में पीबीएस के साथ स्लाइस 3x को लगातार कोमल आंदोलन या रॉकिंग के साथ 1 घंटे से अधिक कुल्ला करें, ताकि स्लाइस अच्छी तरह से अंदर चले जाएं।
6. कुल्ला करते समय, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
   1. पीबीएसटीजी में एंटी-लैमिनिन को 2 μg / mL तक पतला करें ( तालिका 1 देखें)।
7. पीबीएस को कुओं से निकालें और कोमल आंदोलन के साथ ठंडे कमरे में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में रात भर इनक्यूबेट करें।
8. कम से कम 20 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को एस्पिरेट करें और पीबीएसटीजी में 1 घंटे के लिए सेक्शन 3 x को कुल्ला करें।
9. कुल्ला करते समय, द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
   1. विशिष्ट फ्लोरोक्रोम के साथ पतला फ्लोरोसेंट-जीएएम को पीबीएसटीजी में 1:200 कमजोर पड़ने के साथ-साथ बिस्बेंजाइमाइड की 0.1 μg / mL एकाग्रता की आवश्यकता होती है।
   2. पीबीएसटीजी को हटा दें और फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी समाधान में आंदोलन के साथ ठंडे कमरे में रात भर इनक्यूबेट करें।
   3. द्वितीयक एंटीबॉडी को निकालें और पीबीएसटीजी में 1 घंटे से अधिक 2x और पीबीएस में 1 x से अधिक कुल्ला करें।
   4. माइक्रोस्कोप स्लाइड (अनुभाग 5) पर माउंट करने और देखने के लिए तैयार होने तक पीबीएस में छोड़ दें।

Representative Results

यहां प्रस्तुत कुछ प्रतिनिधि परिणामों को दिखाने के लिए कई आंकड़े दिए गए हैं जो ऑप्टिक टेक्टम (चित्रा 1 और चित्रा 2) में विवो इंजेक्शन में प्रदर्शन करने से प्राप्त किए गए थे, जीवित मस्तिष्क स्लाइस की खेती और उनकी व्यवहार्यता का आकलन (चित्रा 3), पूर्व विवो ब्रेन स्लाइस कल्चर बनाने और बायोप्सी पंच विधि (चित्रा 4) का उपयोग करके फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने, पॉली-हेमा पर कोशिकाओं को संवर्धन करके सेल स्फेरॉइड उत्पन्न करने (चित्रा 5), सेल स्फेरॉइड के साथ पूर्व विवो ब्रेन स्लाइस सह-संस्कृतियों का निर्माण करना और 4 डी कॉन्फोकल टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6) का उपयोग करके आक्रामक सेल व्यवहार को रिकॉर्ड करना, और निश्चित मस्तिष्क स्लाइस तैयारी में रक्त वाहिकाओं के सापेक्ष स्फेरॉइड से आक्रामक सेल व्यवहार का विश्लेषण करना (चित्रा 7 और चित्रा 8)। ये परिणाम किसी भी तरह से संपूर्ण नहीं हैं, बल्कि मानव जीबीएम अनुसंधान के लिए एक जेनोग्राफ्ट मॉडल के रूप में चूजे के भ्रूण मस्तिष्क का उपयोग करके क्या प्राप्त किया जा सकता है, इसके अच्छे उदाहरण प्रदान करते हैं।

चित्रा 1 जीएफपी को व्यक्त करने वाले जीएससी के इंजेक्शन के बाद विवो में ऑप्टिक टेक्टम में बनने वाले ट्यूमर के कुछ प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। जीएससी वेंट्रिकुलर सतह से जुड़ते हैं और मस्तिष्क की दीवार में आक्रामक ट्यूमर बनाते हैं। जीएससी स्पष्ट रूप से रक्त वाहिकाओं के पास रहते हैं और उनके साथ पलायन करते प्रतीत होते हैं। विवो जीएससी ट्यूमर में फिक्स्ड और इम्यूनोस्टेन्ड स्लाइस के घूर्णन 3 डी वॉल्यूम रेंडर की फिल्में पूरक वीडियो एस 1, पूरक वीडियो एस 2, पूरक वीडियो एस 3 और पूरक वीडियो एस 4 में दी गई हैं। इस प्रयोग में, पांच विशेषताओं (हरे जीएससी, सफेद नाभिक, सफेद रक्त वाहिकाओं, नीले इंटीग्रिन अल्फा -6, और या तो लाल सॉक्स 2 या लाल नेस्टिन) की पहचान करने के लिए चार रंगों का उपयोग किया गया था।

चित्रा 2 रेट्रोवायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन के कारण एमचेरी^{व्यक्त करने} वाले जीएफपी को यू -118 / एल 1 एल ई कोशिकाओं के साथ मिश्रित करने वाले जीएससी के इंजेक्शन के बाद विवो में ऑप्टिक टेक्टम में बनने वाले ट्यूमर के कुछ प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है। इन प्रयोगों से पता चला कि चूंकि ये ट्यूमर एक मिश्रित-सेल निलंबन से बने थे, इसलिए छंटाई इस तरह हुई कि जीएससी या तो परिधि या केंद्र में रहते थे, जबकि यू -118 कोशिकाओं में विशिष्ट जीएससी लाइन के आधार पर या तो एक आंतरिक कोर या बाहरी कॉर्टेक्स शामिल था।

चित्रा 3 पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों के व्यवहार्यता परिणाम दिखाता है। संस्कृति में 1 सप्ताह के बाद, लैमिनिन के लिए निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग ने कई बरकरार रक्त वाहिकाओं और सॉक्स 2 की अभिव्यक्ति का खुलासा किया, जिनमें से दोनों का उपयोग मस्तिष्क स्लाइस की व्यवहार्यता प्रदर्शित करने के लिए यहां किया गया था। इससे पता चला कि चूजे के भ्रूण के मस्तिष्क के स्लाइस को लगभग 2 सप्ताह के लिए झिल्ली डालने पर सुसंस्कृत किया जा सकता है और सामान्य दिखने वाली रक्त वाहिकाओं और प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के साथ व्यवहार्य बना रह सकता है।

चित्रा 4 बायोप्सी पंच विधि का उपयोग करके स्लाइस में गुहाओं को बनाने के बाद पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं (मैट्रिक्स के साथ मिश्रित) के "प्लग" को पेश करने के परिणामों को दर्शाता है। यू -118 कोशिकाओं ने स्पष्ट रूप से मस्तिष्क के ऊतकों पर आक्रमण किया, कभी-कभी बड़े पैमाने पर, और अक्सर रक्त वाहिकाओं के साथ। हालांकि, सेल आक्रमण पेश की गई कोशिकाओं की परिधि के आसपास समान नहीं था। रक्त वाहिकाएं कभी-कभी कुछ स्लाइस में क्षतिग्रस्त या अनुपस्थित दिखाई देती हैं, संभवतः पंच विधि के अतिरिक्त आघात या संस्कृति में समय की लंबाई के कारण। इससे पता चला कि बायोप्सी पंच / सेल प्लग विधि का उपयोग जीबीएम कोशिकाओं को एक सुसंस्कृत पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में विशिष्ट स्थानों में पेश करने के लिए किया जा सकता है, जिसके बाद कोशिकाएं मस्तिष्क स्लाइस पर आक्रमण करती हैं।

चित्रा 5 संस्कृति में लाइव स्फेरॉइड दिखाता है और समय-चूक प्रयोगों के लिए पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस पर पेश किए गए लाइव जीबीएम सेल स्फेरॉइड के वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस के कई उदाहरण हैं। मस्तिष्क स्लाइस में स्फेरॉइड से सेल आक्रमण की फिल्में पूरक वीडियो एस 5 और पूरक वीडियो एस 6 में दी गई हैं। इससे पता चला कि सेल स्फेरॉइड एक पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस के विशिष्ट स्थानों पर जीबीएम कोशिकाओं या जीएससी को पेश करने का एक और सफल तरीका है, और इनवेसिव सेल व्यवहार को वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मॉनिटर किया जा सकता है, हालांकि व्यक्तिगत कोशिकाओं का रिज़ॉल्यूशन खराब हो सकता है।

चित्र 6 मस्तिष्क स्लाइस में लाइव जीएससी 16-4/जीएफपी और यू-118/एल1एलई/एमचेरी सेल आक्रमण के कॉन्फोकल टाइम-लैप्स प्रयोगों की स्थैतिक छवियां दिखाई देती हैं। कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों को बहु-बिंदु समय-चूक प्रयोग में 20 घंटे की अवधि में हर 10 मिनट में प्राप्त किया गया था। समय के साथ कॉन्फोकल जेड-स्टैक्स के रूप में लिए गए मस्तिष्क स्लाइस में स्फेरॉइड से सेल आक्रमण की फिल्में पूरक वीडियो एस 7, पूरक वीडियो एस 8, पूरक वीडियो एस 9, पूरक वीडियो एस 10 और पूरक वीडियो एस 11 में प्रस्तुत की जाती हैं। इस प्रयोग से पता चला कि व्यक्तिगत सेल इनवेसिव व्यवहार को ट्रैक करने के लिए कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस से बेहतर थी। यू -118 / एल 1 एल ई कोशिकाएं इन स्थितियों के तहत जीएससी की तुलना में अधिक आक्रामक थीं। यह स्थैतिक छवियों में भी स्पष्ट है, जीएससी अधिक केंद्रीय रूप से स्थित हैं और यू -118 कोशिकाएं अधिक फैली हुई हैं।

चित्र 7 पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस / स्फेरॉइड तैयारी के कई उदाहरण दिखाता है, जहां दो अलग-अलग लेबल वाले स्फेरॉइड (यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी स्फेरॉइड और जीएससी 16-4 / जीएफपी स्फेरॉइड) को मस्तिष्क स्लाइस पर रखा गया था, कई दिनों तक उगाया गया था, और बाद में लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर ऑप्टिकल सेक्शनिंग द्वारा चित्रित किया गया था। इससे पता चला कि दोनों सेल प्रकारों ने मस्तिष्क के टुकड़े पर आक्रमण किया और रक्त वाहिकाओं के साथ यात्रा की। जब विभिन्न प्रकार के स्फेरॉइड एक-दूसरे से संपर्क करने के लिए पर्याप्त करीब थे, तो एक सेल प्रकार का दूसरे सेल प्रकार के स्फेरॉइड में बहुत कम आक्रमण हुआ, और स्फेरॉइड अलग रहे।

चित्र 8 पूर्व विवो ब्रेन स्लाइस/स्फेरॉइड तैयारी के कई उदाहरण ों को दर्शाता है, जहां दो अलग-अलग लेबल वाले सेल प्रकारों (यू-118/एल1एलई/एमचेरी के साथ जीएससी16-4/जीएफपी के साथ मिश्रित) का उपयोग करके कल्चर में उत्पन्न "मिश्रित-सेल प्रकार" स्फेरॉइड को मस्तिष्क स्लाइस पर रखा गया था, जो कई दिनों तक उगाया गया था, और बाद में लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर ऑप्टिकल सेक्शनिंग द्वारा चित्रित किया गया था। इससे पता चला कि लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाएं स्फेरॉइड से बाहर निकल गईं और हरे जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं की तुलना में अधिक स्पष्ट रूप से फैल गईं, जो स्फेरॉइड के केंद्र के पास झुरमुट में रहती थीं। इसके अतिरिक्त, यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं को भी डीआईडी के साथ दाग दिया गया था ताकि दो अलग-अलग लेबल (एमचेरी और डीआईडी) की तुलना सीधे निश्चित एक्स विवो तैयारी में की जा सके। डीआईडी लेबल का अभी भी पता लगाया जा सकता है, यहां तक कि एकल कोशिकाओं में भी जिन्होंने मस्तिष्क के टुकड़े पर आक्रमण किया था; हालांकि, यह इंट्रासेल्युलर पंक्टा के रूप में था।

चित्र 1: विवो में ई 5 ऑप्टिक टेक्टम में जीएससी के इंजेक्शन के परिणामस्वरूप ई 15 पर ट्यूमर। जीएफपी अभिव्यक्ति के कारण जीएससी हरे रंग के होते हैं। जीएससी 15-2 कोशिकाओं को पैनल ए, सी और ई में दिखाया गया है, और जीएससी 16-4 कोशिकाओं को पैनल बी, डी और एफ में दिखाया गया है। (ए) वेंट्रिकल (वी) के पास एक ट्यूमर के साथ ऑप्टिक टेक्टम का कम-आवर्धन दृश्य। सॉक्स 2 धुंधला लाल रंग में दिखाया गया है, जो ओटी कोशिकाओं के अधिकांश नाभिक पर दाग लगाता है। (बी) ए के समान छवि लेकिन जीएससी 16-4 कोशिकाओं के साथ जो लाल रंग में नेस्टिन के लिए दागदार हैं, जो रंग मिश्रण और छवि जोखिम के कारण छवि में पीले या सफेद दिखाई दे सकते हैं। बिस्बेंज़िमाइड के साथ काउंटरस्टेनिंग के कारण ओटी नाभिक सफेद दिखाई देते हैं। (C-F) 60x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके जेड-स्टैक्स से उत्पन्न वॉल्यूम रेंडर के विभिन्न दृष्टिकोण। सेल नाभिक बिस्बेंज़िमाइड धुंधला होने के कारण सफेद दिखाई देते हैं, और कुछ सॉक्स 2 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण पैनल सी और ई में लाल दिखाई देते हैं। पैनल डी और एफ में लाल धुंधलापन नेस्टिन के लिए धुंधला होने से है। ध्यान दें कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में वॉल्यूम रेंडर के लिए "अल्फा ब्लेंडिंग" के कारण, रंग मिश्रण नहीं करते हैं क्योंकि वे अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करेंगे, और सबसे प्रचलित रंग कम तीव्र रंग को प्रबल और अस्पष्ट करता है। लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण रक्त वाहिकाओं को सफेद रंग दिया जाता है। जीएससी मार्कर इंटीग्रिन अल्फा -6 धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है, और जीएससी सतहों पर धुंधला दिखाई देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। पैनल सी-एफ में वॉल्यूम रेंडर के रोटेशन के वीडियो पूरक वीडियो एस 1, पूरक वीडियो एस 2, पूरक वीडियो एस 3 और पूरक वीडियो एस 4 में प्रस्तुत किए जाते हैं। स्केल बार = 500 μm (A,B)। संक्षेप: जीएससी = ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल; ओटी = ऑप्टिक टेक्टम; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; बीवी = रक्त वाहिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2: ई 15 पर ट्यूमर जीएससी और यू -118 जीबीएम कोशिकाओं के मिश्रण के परिणामस्वरूप ई 5 ऑप्टिक टेक्टम में इंजेक्ट किया गया। जीएफपी अभिव्यक्ति के कारण जीएससी हरे रंग के होते हैं और एमचेरी अभिव्यक्ति के कारण यू -118 / एल 1 एल ई कोशिकाएं लाल होती हैं। जीएससी 15-2 पैनल ए-डी में दिखाए गए हैं, और जीएससी 16-4 पैनल ई और एफ में दिखाए गए हैं। (ए) वेंट्रिकल के पास एक मिश्रित सेल ट्यूमर (तीर) का कम-आवर्धन कॉन्फोकल एकल जेड-प्लेन। नाभिक को बिस्बेंज़िमाइड के साथ सफेद रंग दिया जाता है। (बी) वेंट्रिकुलर सतह के पास ओटी में लाल यू -118 कोशिकाओं के आक्रमण के साथ ए में दिखाए गए ट्यूमर का उच्च आवर्धन (10 x उद्देश्य)। (सी) ऑप्टिकल सेक्शन का एक थोड़ा अलग विमान जो ओटी दीवार में गहराई से एम्बेडेड ट्यूमर (तीर) को दर्शाता है। (डी) सी में ट्यूमर के कई जेड-प्लेन का अधिकतम प्रक्षेपण (20x उद्देश्य) ट्यूमर के भीतर क्रमबद्ध कोशिकाओं का विवरण दर्शाता है। (ई) जीएससी 16-4 कोशिकाओं के साथ मिश्रित ट्यूमर की एकल जेड-प्लेन छवि (20x उद्देश्य), यह दर्शाता है कि ट्यूमर के भीतर छंटाई जीएससी 15-2 कोशिकाओं से विपरीत पैटर्न में हुई, जिसमें हरे जीएससी लाल यू -118 कोशिकाओं के चारों ओर एक पतली और यहां तक कि कॉर्टेक्स बनाते हैं। ओटी दीवार से ट्यूमर के लगाव का क्षेत्र इस जेड-प्लेन में नहीं दिखाया गया है। ट्यूमर के उस क्षेत्र पर ध्यान दें जहां यू -118 / एल 1 एल कोशिकाओं के साथ जीएससी कॉर्टेक्स का अलगाव है (तीर)। एल 1 सीएएम के लिए इम्यूनोस्टेनिंग नीले रंग में दिखाया गया है। (एफ) ई के समान छवि, लेकिन केवल हरे जीएससी और नीले एल 1 सीएएम धुंधला दिखा रहा है। स्केल बार = 500 μm (A, C), 100 μm (B, D, E, F)। संक्षेप: जीएससी = ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल; ओटी = ऑप्टिक टेक्टम; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; वी = वेंट्रिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3: संस्कृति में 1 सप्ताह के बाद पूर्व विवो ऑप्टिक टेक्टम स्लाइस की व्यवहार्यता। ई 14 ऑप्टिक टेक्टम स्लाइस को 1 सप्ताह के लिए झिल्ली डालने पर सुसंस्कृत किया गया था और फिर तय और इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था। ए और बी में दिखाए गए मस्तिष्क के टुकड़े की कॉन्फोकल छवियां (10x उद्देश्य) हैं जो नाभिक के लिए बिस्बेंज़ामाइड (ए) और लैमिनिन (बी) के लिए इम्यूनोस्टेन्ड हैं, जो स्पष्ट रूप से सामान्य, बरकरार रक्त वाहिकाओं को लैमिनिन धुंधला होने के आधार पर विभिन्न विन्यासों में ऑप्टिकल रूप से विभाजित दिखाती हैं। (सी) पैनल ए और बी में दिखाए गए के समान एक कॉन्फोकल छवि जहां नाभिक और लैमिनिन धुंधला दोनों दिखाई देते हैं। (डी) एक उच्च-आवर्धन (60 x तेल उद्देश्य) कॉन्फोकल छवि जो परमाणु और लैमिनिन धुंधला होने का विवरण दिखाती है। (ई) लाल रंग में सॉक्स 2 प्रतिलेखन कारक के लिए सना हुआ मस्तिष्क स्लाइस के कॉन्फोकल जेड-स्टैक (20x उद्देश्य) की अधिकतम प्रक्षेपण छवि और सफेद में बिस्बेंज़िमाइड के साथ कुल नाभिक। ध्यान दें कि अधिकांश नाभिक सॉक्स 2 धुंधलापन प्रदर्शित करते हैं, जैसा कि विवो में दिखाया गया है (चित्र 1 देखें)। स्केल बार = 100 μm (A, B, C, E), 25 μm (D)। संक्षिप्त नाम: पी = पियाल सतह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 4: यू -118 / एमचेरी कोशिकाओं को बायोप्सी पंच विधि के माध्यम से एक पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में रखा गया। 1 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके मस्तिष्क स्लाइस में गुहाओं का निर्माण किया गया था, और फिर मैट्रिक्स के साथ मिश्रित लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं को "प्लग" के रूप में प्रत्यारोपित किया गया था। कई दिनों के बाद, मस्तिष्क के स्लाइस तय किए गए, लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया गया, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप विश्लेषण के लिए स्लाइड पर रखा गया। पैनल ए और सी परिणामी "ट्यूमर" और आसपास की कोशिकाओं के कम-आवर्धन, कॉन्फोकल, एकल जेड-प्लेन छवियों (4x उद्देश्य) को दिखाते हैं जो मस्तिष्क के टुकड़े पर आक्रमण करते हैं। (बी) पैनल ए में तैयारी से जेड-स्टैक का एक वॉल्यूम रेंडर उच्च आवर्धन (20 x उद्देश्य) पर है, जो यू -118 कोशिकाओं (तीर) के व्यापक आक्रमण को दर्शाता है। (डी) छवि पैनल सी में दिखाए गए बड़े पैमाने पर हमलावर कोशिकाओं के निचले हिस्से का एक समान वॉल्यूम रेंडर दिखाती है। लैमिनिन धुंधला पन हरे रंग में दिखाया गया है, लेकिन कोई स्पष्ट रक्त वाहिकाएं स्पष्ट नहीं हैं। (ई) छवि एक सेल प्लग और कोशिकाओं के समूह के हिस्से को दिखाती है जिन्होंने मस्तिष्क के टुकड़े पर आक्रमण किया है, साथ ही नीले रंग में रक्त वाहिकाओं के लिए लैमिनिन धुंधला है। (एफ) पैनल ई में दिखाए गए हमलावर कोशिकाओं का एक उच्च आवर्धन, और कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से रक्त वाहिकाओं (तीर) के साथ संरेखित देखा जा सकता है। सभी पैनल बिस्बेंज़िमाइड के साथ सफेद परमाणु काउंटरस्टेनिंग दिखाते हैं। स्केल बार = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F)। पैनल बी और डी के लिए स्केल वॉल्यूम रेंडर अक्षों के साथ है। संक्षिप्त नाम: ओटी = ऑप्टिक टेक्टम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 5: संस्कृति में लाइव सेल स्फेरॉइड और पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में जीवित जीबीएम कोशिकाओं की वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस छवियां। पैनल ए और बी में दिखाए गए यू -118 / एल 1 एल जीबीएम कोशिकाओं (ए) और जीएससी (बी) के चरण कंट्रास्ट चित्र (उल्टे माइक्रोस्कोप पर 10 x उद्देश्य का उपयोग करके) स्फेरॉइड (तीर) के रूप में बढ़ रहे हैं। पैनल ए की पृष्ठभूमि में दिखाया गया पॉली-हेमा कोटिंग की आउट-ऑफ-फोकस असमानता है जो सेल कल्चर डिश पर हो सकती है। पैनल ों में दिखाए गए सी-एफ यू -118 / एल 1 एल सेल स्फेरॉइड और हमलावर कोशिकाओं (तीर) की वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस छवियां हैं, जो एक्स विवो स्लाइस में आक्रमण के लाइव व्यवहार की निगरानी के लिए एक टाइम-लैप्स प्रयोग के दौरान हैं (कस्टम टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोप सिस्टम¹⁸ पर 20एक्स उद्देश्य का उपयोग करके)। पैनल सी और ई में, कोशिकाओं को दूर-लाल फ्लोरोसेंट झिल्ली डाई डीआईडी से दाग दिया जाता है, और पैनल डी और एफ में, कोशिकाओं को उनके लाल एमचेरी अभिव्यक्ति के माध्यम से चित्रित किया जाता है। स्केल सलाखों = 100 μm. पैनल सी और डी में दिखाए गए वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस टाइम-लैप्स प्रयोगों के वीडियो क्रमशः पूरक वीडियो एस 5 और पूरक वीडियो एस 6 में स्थित हैं। संक्षेप: जीबीएम = ग्लियोब्लास्टोमा; जीएससी = जीबीएम स्टेम सेल; एस = स्फेरॉइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 6: वॉल्यूम लाइव जीएससी और जीबीएम कोशिकाओं के कॉन्फोकल 4 डी टाइम-लैप्स की छवियों को प्रस्तुत करता है। सभी पैनलों में दिखाए गए अलग-अलग मस्तिष्क स्लाइस पर पांच अलग-अलग मिश्रित सेल स्फेरॉइड एन्ग्राफमेंट की समापन बिंदु छवियां हैं। पैनल ए-ई के लिए, कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों को 20 घंटे की अवधि में हर 10 मिनट में 10 μm चरणों पर प्राप्त किया गया था। तैयारी में लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं और हरे जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं के प्रत्यारोपित मिश्रित सेल स्फेरॉइड के साथ मस्तिष्क स्लाइस शामिल थे। कॉन्फोकल छवियों को लिया गया था, जबकि मस्तिष्क के स्लाइस को एक अतिरिक्त-लंबी कामकाजी दूरी (ईएलडब्ल्यूडी) 20 एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस (0.45 एनए) का उपयोग करके 6-वेल प्लास्टिक सेल कल्चर डिश में झिल्ली डालने पर संवर्धित किया गया था, जो आवश्यक अतिरिक्त कामकाजी दूरी प्रदान करता था। वॉल्यूम रेंडर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर "अल्फा ब्लेंडिंग" का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे, जो एक स्पष्ट 3 डी प्रभाव देता है। समय के साथ इन कॉन्फोकल वॉल्यूम रेंडर के टाइम-लैप्स वीडियो पूरक वीडियो एस 7, पूरक वीडियो एस 8, पूरक वीडियो एस 9, पूरक वीडियो एस 10 और पूरक वीडियो एस 11 में प्रस्तुत किए जाते हैं। संक्षेप: जीबीएम = ग्लियोब्लास्टोमा; जीएससी = जीबीएम स्टेम सेल; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एनए = संख्यात्मक एपर्चर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 7: विभिन्न सेल प्रकारों के स्फेरॉइड से आक्रामक जीबीएम कोशिकाओं के साथ निश्चित मस्तिष्क स्लाइस की कॉन्फोकल छवियां। ग्रीन स्फेरॉइड जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं से बने थे और लाल स्फेरॉइड यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं से बने थे। पैनलों ए-एफ में दिखाए गए मस्तिष्क स्लाइस के अलग-अलग दृश्य हैं, जिन पर लैमिनिन (नीले) के लिए निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग से पहले कई दिनों तक कई लाल और हरे रंग के स्फेरॉइड सुसंस्कृत किए गए थे। पैनल ए-सी उसी ओटी स्लाइस के हैं जहां ए को 4 x उद्देश्य के साथ लिया गया था, और पैनल बी और सी कोशिकाओं के उच्च आवर्धन वॉल्यूम रेंडर (20x उद्देश्य) हैं जो पैनल ए में दिखाए गए दो स्फेरॉइड से मस्तिष्क स्लाइस पर आक्रमण करते हैं। दोनों सेल प्रकार ों ने स्पष्ट रूप से रक्त वाहिकाओं के साथ ऊतक पर आक्रमण किया। पैनल डी एक अलग मस्तिष्क स्लाइस का एक वॉल्यूम रेंडर (20x उद्देश्य) दिखाता है जहां दो अलग-अलग स्फेरॉइड एक साथ स्थित थे, और दोनों की कोशिकाओं को एक ही रक्त वाहिका के साथ पलायन करते हुए देखा जाता है जो उनके बीच स्थित है (तीर)। पैनल ई एक उच्च-आवर्धन (60x तेल उद्देश्य) वॉल्यूम रेंडर है जो बताता है कि हरी कोशिकाएं रक्त वाहिका की बाहरी सतह के साथ पलायन कर रही हैं, जबकि लाल कोशिका रक्त वाहिका (तीर) के अंदर पलायन कर रही है। इनसेट एक एकल जेड-प्लेन ऑप्टिकल सेक्शन दिखाता है, जहां लाल कोशिका स्पष्ट रूप से रक्त वाहिका (तीर) के नीले धुंधलापन से घिरी होती है, और हरी कोशिका स्पष्ट रूप से रक्त वाहिका के बाहर होती है। इनसेट में स्केल बार = 50 μm। पैनल एफ एक फोरब्रेन स्लाइस का वॉल्यूम रेंडर (10x उद्देश्य) दिखाता है जिसमें दो अलग-अलग रंग के स्फेरॉइड होते हैं। बहुत कम, यदि कोई हो, सेल आक्रमण एक स्फेरॉइड से दूसरे में हुआ, और उनके बीच एक तेज सीमा मौजूद थी। पैनल ए, बी, सी और ई भी बिस्बेंज़िमाइड के साथ सफेद परमाणु काउंटरस्टेनिंग दिखाते हैं। स्केल बार = 500 μm (A)। पैनल बी-एफ के लिए स्केल वॉल्यूम रेंडर अक्षों के साथ हैं। संक्षेप: जीबीएम = ग्लियोब्लास्टोमा; जीएससी = जीबीएम स्टेम सेल; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; ओटी = ऑप्टिक टेक्टम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 8: मिश्रित सेल स्फेरॉइड और डीआईडी के साथ लेबल किए गए स्फेरॉइड से आक्रामक जीबीएम कोशिकाओं के साथ निश्चित मस्तिष्क स्लाइस की कॉन्फोकल छवियां। पैनल ए-डी मस्तिष्क स्लाइस के वॉल्यूम रेंडर्स दिखाते हैं जिसमें हरे जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं और लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं से बने मिश्रित सेल स्फेरॉइड होते हैं। कई लाल यू -118 कोशिकाएं स्फेरॉइड से फैल गईं और सभी दिशाओं में मस्तिष्क के टुकड़े पर आक्रमण किया, जबकि हरे जीएससी फैल नहीं गए और स्फेरॉइड के केंद्रीय स्थानों पर बने रहे। पैनल ई और एफ लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी स्फेरॉइड के साथ एक पूर्व विवो स्लाइस तैयारी दिखाते हैं जिसे दूर-लाल झिल्ली डाई डीआईडी (नीले रंग के रूप में दिखाया गया है) के साथ भी लेबल किया जाता है। निर्धारण के बाद, स्लाइस हरे रंग में लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेन्ड था। डीआईडी लेबल लाल कोशिकाओं में पंक्टेट स्टेनिंग (तीर) के रूप में दिखाई दे रहा था और उन कोशिकाओं में भी दिखाई दे रहा था जो रक्त वाहिकाओं के साथ स्फेरॉइड से फैल गए थे। बिस्बेंज़िमाइड के साथ परमाणु काउंटरस्टेनिंग को इस आंकड़े में नहीं दिखाया गया है ताकि अन्य धुंधलापन अधिक स्पष्ट रूप से दिखाई दे। स्केल सलाखों = 100 μm (E, F)। संक्षेप: जीबीएम = ग्लियोब्लास्टोमा; जीएससी = जीबीएम स्टेम सेल; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

माध्यम/समाधान	संयोजन
जीएससी मीडिया	1: 1 डीएमईएम / एफ 12 का मिश्रण, 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 15 एमएम एचईपीईएस बफर, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 100 μg / mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप), विटामिन ए के बिना 2% बी 27 पूरक, और 2.5 μg / mL हेपरिन।
GBM मीडिया	डीएमईएम (उच्च ग्लूकोज), 10% एफबीएस, पेन / स्ट्रेप, और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन।
फिक्सेशन बफर	0.1 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर में 2% पीएफए
एम्बेड िंग माध्यम	पीबीएस में 3.5% एगर और 8% सुक्रोज
PBSTG	पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 + 5% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस)
यू -118 एमजी सेल कल्चर माध्यम	डीएमईएम + 10% एफबीएस + पेन / स्ट्रेप + एल-ग्लूटामाइन
ब्रेन स्लाइस कल्चर मीडिया	50% एमईएम + 25% एचबीएसएस + 25% हॉर्स सीरम + बी 27 + पेन / स्ट्रेप + एल-ग्लूट + 15 एमएम एचईपीईएस बफर
कंपन ऊतक स्लाइसर स्लाइसिंग मीडिया	मध्यम 199 + पेन / स्ट्रेप + 15 एमएम एचईपीईएस बफर

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मीडिया और बफर की संरचना।

पूरक चित्र 1: ई 5 ऑप्टिक टेक्टम में इंजेक्शन। (ए) हवा के स्थान पर अंडे के छिलके में एक छेद काटने के बाद, और वायु अंतरिक्ष झिल्ली को नमकीन या मीडिया से गीला करने के बाद, झिल्ली को महीन बल के साथ हटा दिया जाता है। (बी) ऑप्टिक टेक्टम में कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के लिए, एमनियन को पिन किया जाता है और सिर को रखने के लिए महीन बल के साथ रखा जाता है ताकि ऑप्टिक टेक्टम सुलभ हो।  फिर माइक्रोपिपेट को ऑप्टिक टेक्टम में डाला जाता है और कोशिकाओं को इसमें दबाव इंजेक्ट किया जाता है। (सी) कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद, सिरिंज और महीन सुई का उपयोग करके भ्रूण के शीर्ष पर एम्पीसिलिन समाधान की कुछ बूंदें जोड़ी जाती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2: ई 15 मस्तिष्क क्षेत्रों का विच्छेदन। (ए) डिकैपिटेशन के बाद, ई 15 भ्रूण के सिर को बाँझ सीएमएफ समाधान के साथ एक डिश में रखा जाता है। (बी) मस्तिष्क के ऊपर की त्वचा को फिर महीन बल का उपयोग करके हटा दिया जाता है। (सी ) खोपड़ी की दो हड्डियों को फिर दो अग्रमस्तिष्क (एफबी) गोलार्धों से हटा दिया जाता है। (डी) संयोजी ऊतक ड्यूरा को तब फोरब्रेन (एफबी), ऑप्टिक टेक्टम और सेरिबैलम के आसपास से धीरे-धीरे हटा दिया जाता है। (ई) पूरे मस्तिष्क को फिर सिर से हटा दिया जाता है, धीरे से घुमावदार बल का उपयोग करके मस्तिष्क गुहा से नीचे से बाहर निकाला जाता है। (एफ) दिखाया गया है कि फोरब्रेन (एफबी), ऑप्टिक टेक्टम (ओटी), और सेरिबैलम (सीबी) के साथ पूरे हटाए गए मस्तिष्क का पृष्ठीय दृश्य है। (जी ) पृथक मस्तिष्क को तब ठीक कैंची का उपयोग करके फोरब्रेन (एफबी), ऑप्टिक टेक्टम (ओटी) गोलार्धों और सेरिबैलम (सीबी) में विच्छेदित किया जाता है। (एच ) नाजुक संयोजी ऊतक पिया को तब ऑप्टिक टेक्टम (ओटी) गोलार्धों से ठीक बल का उपयोग करके आसानी से हटा दिया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3: ई 15 ऑप्टिक टेक्टम को एम्बेड करना और स्लाइस करना और सेल स्फेरॉइड का प्लेसमेंट। (ए) एक ऑप्टिक टेक्टम गोलार्ध घुमावदार बल का उपयोग करके कम पिघले हुए अगारोस में डूबा हुआ है। (बी) बर्फ पर अगारोस के सख्त होने के बाद, ऑप्टिक टेक्टम वाले ब्लॉक को ट्रिम किया जाता है और स्लाइसिंग डिश / ट्रे में स्टेनलेस-स्टील पेडस्टल से चिपका दिया जाता है। (सी) गोंद सूखने के बाद, स्लाइसिंग डिश / ट्रे को कंपन ऊतक स्लाइसर के चक में रखा जाता है और ठंडे स्लाइसिंग मीडिया से भर दिया जाता है।  फिर जलमग्न ऊतक ब्लॉक से नीलम चाकू के साथ स्लाइस काटे जाते हैं।  कटे हुए स्लाइस डिश / ट्रे में तैरेंगे और स्पैटुला का उपयोग करके हटाया जा सकता है।  ट्रे से कटे हुए स्लाइस को हटा दिया जाता है और एक मल्टी-वेल प्लेट में अंतर्निहित स्लाइस कल्चर मीडिया के साथ सीधे झिल्ली डालने पर रखा जाता है। (ई) पॉली-हेमा लेपित व्यंजनों पर सेल स्फेरॉइड उगाए जाने के बाद, 20 μL माइक्रोपिपेटर का उपयोग करके न्यूनतम मात्रा में मीडिया में पकवान से एक स्फेरॉइड हटा दिया जाता है। (एफ) पृथक स्फेरॉइड को फिर न्यूनतम मीडिया में सीधे मस्तिष्क स्लाइस पर रखा जाता है। (जी) यदि मीडिया के प्रवाह के कारण स्फेरॉइड मस्तिष्क के टुकड़े से गिर जाता है, तो इसे लकड़ी के एप्लिकेटर स्टिक से चिपके हुए आईलैश का उपयोग करके मस्तिष्क के टुकड़े पर वापस धकेला जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो एस 1: ई 15 पर एक छोटे जीएससी 15-2 ट्यूमर के उच्च-आवर्धन मात्रा रेंडर का वीडियो। जीएफपी अभिव्यक्ति के कारण जीएससी हरे रंग के होते हैं। वीडियो चित्रा 1 सी से मेल खाती है और जीएससी 15-2 कोशिकाओं को दिखाती है। वीडियो में 60x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके जेड-स्टैक से उत्पन्न वॉल्यूम रेंडर का रोटेशन दिखाया गया है। सेल नाभिक बिस्बेंज़िमाइड धुंधला होने के कारण सफेद दिखाई देते हैं, और कुछ सॉक्स 2 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण लाल दिखाई देते हैं। ध्यान दें कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में वॉल्यूम रेंडर के लिए "अल्फा ब्लेंडिंग" के कारण, रंग मिश्रण नहीं करते हैं क्योंकि वे अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करेंगे, और सबसे तीव्र रंग कम तीव्र रंग को प्रबल और अस्पष्ट करता है। लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण रक्त वाहिकाओं को सफेद रंग दिया जाता है। जीएससी मार्कर इंटीग्रिन अल्फा -6 धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है और हरे रंग की जीएससी सतहों पर दिखाई देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 2: ई 15 पर छोटे जीएससी 16-4 ट्यूमर के उच्च-आवर्धन मात्रा रेंडर का वीडियो। जीएफपी अभिव्यक्ति के कारण जीएससी हरे रंग के होते हैं। वीडियो चित्रा 1 डी से मेल खाती है और जीएससी 16-4 कोशिकाओं को दिखाती है। वीडियो में 60x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके जेड-स्टैक से उत्पन्न वॉल्यूम रेंडर का रोटेशन दिखाया गया है। सेल नाभिक बिस्बेंज़िमाइड धुंधला होने के कारण सफेद दिखाई देते हैं, और कुछ जीएससी नेस्टीन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण लाल दिखाई देते हैं। ध्यान दें कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में वॉल्यूम रेंडर के लिए "अल्फा ब्लेंडिंग" के कारण, रंग मिश्रण नहीं करते हैं क्योंकि वे अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करेंगे, और सबसे तीव्र रंग कम तीव्र रंग को प्रबल और अस्पष्ट करता है। लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण रक्त वाहिकाओं को सफेद रंग दिया जाता है। जीएससी मार्कर इंटीग्रिन अल्फा -6 धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है और हरे रंग की जीएससी सतहों पर दिखाई देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 3: ई 15 पर छोटे जीएससी 15-2 ट्यूमर के उच्च-आवर्धन मात्रा रेंडर का वीडियो। जीएफपी अभिव्यक्ति के कारण जीएससी हरे रंग के होते हैं। वीडियो चित्रा 1 ई से मेल खाती है और जीएससी 15-2 कोशिकाओं को दिखाती है। वीडियो में 60x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके जेड-स्टैक से उत्पन्न वॉल्यूम रेंडर का रोटेशन दिखाया गया है। सेल नाभिक बिस्बेंज़िमाइड धुंधला होने के कारण सफेद दिखाई देते हैं, और कुछ सॉक्स 2 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण लाल दिखाई देते हैं। ध्यान दें कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में वॉल्यूम रेंडर के लिए "अल्फा ब्लेंडिंग" के कारण, रंग मिश्रण नहीं करते हैं क्योंकि वे अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करेंगे, और सबसे तीव्र रंग कम तीव्र रंग को प्रबल और अस्पष्ट करता है। लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण रक्त वाहिकाओं को सफेद रंग दिया जाता है। जीएससी मार्कर इंटीग्रिन अल्फा -6 धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है और हरे रंग की जीएससी सतहों पर दिखाई देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 4: ई 15 पर छोटे जीएससी 16-4 ट्यूमर के उच्च-आवर्धन मात्रा रेंडर का वीडियो। जीएफपी अभिव्यक्ति के कारण जीएससी हरे रंग के होते हैं। वीडियो चित्रा 1 एफ से मेल खाती है और जीएससी 16-4 कोशिकाओं को दिखाती है। वीडियो में 60x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके जेड-स्टैक से उत्पन्न वॉल्यूम रेंडर का रोटेशन दिखाया गया है। सेल नाभिक बिस्बेंज़िमाइड धुंधला होने के कारण सफेद दिखाई देते हैं, और कुछ नेस्टीन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण लाल दिखाई देते हैं। ध्यान दें कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में वॉल्यूम रेंडर के लिए "अल्फा ब्लेंडिंग" के कारण, रंग मिश्रण नहीं करते हैं क्योंकि वे अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करेंगे, और सबसे तीव्र रंग कम तीव्र रंग को प्रबल और अस्पष्ट करता है। लैमिनिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के कारण रक्त वाहिकाओं को सफेद रंग दिया जाता है। जीएससी मार्कर इंटीग्रिन अल्फा -6 धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है और हरे रंग की जीएससी सतहों पर दिखाई देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 5: पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में लाइव जीबीएम कोशिकाओं का वीडियो। वीडियो चित्रा 5 सी से मेल खाता है और एक्स विवो स्लाइस में आक्रमण के लाइव व्यवहार की निगरानी के लिए टाइम-लैप्स प्रयोग के दौरान यू -118 / एल 1 एलई सेल स्फेरॉइड और हमलावर कोशिकाओं की वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस छवियों को दिखाता है (कस्टम टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोप सिस्टम पर 20एक्स उद्देश्य का उपयोग करके)। यू -118 / एल 1 एल ई कोशिकाओं को दूर-लाल फ्लोरोसेंट झिल्ली डाई डीआईडी से दाग दिया गया था। छवियों को एक मोनोक्रोम कैमरे के साथ प्राप्त किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 6: एक्स विवो मस्तिष्क स्लाइस में लाइव जीबीएम कोशिकाओं का वीडियो। वीडियो चित्रा 5 डी से मेल खाता है और एक्स विवो स्लाइस में आक्रमण के लाइव व्यवहार की निगरानी के लिए टाइम-लैप्स प्रयोग के दौरान यू -118 / एल 1 एलई सेल स्फेरॉइड और हमलावर कोशिकाओं की वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस छवियों को दिखाता है (कस्टम टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोप सिस्टम पर 20एक्स उद्देश्य का उपयोग करके)। कोशिकाओं को उनके लाल एमचेरी अभिव्यक्ति के माध्यम से चित्रित किया गया था। छवियों को एक मोनोक्रोम कैमरे के साथ प्राप्त किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 7: वॉल्यूम का वीडियो लाइव जीएससी और जीबीएम कोशिकाओं के कॉन्फोकल 4 डी टाइम-लैप्स की छवियों को प्रस्तुत करता है। वीडियो चित्रा 6 ए से मेल खाती है। कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों को 20 घंटे की अवधि में हर 10 मिनट में 10 μm चरणों पर प्राप्त किया गया था। तैयारी लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं और हरे जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं के प्रत्यारोपित मिश्रित सेल स्फेरॉइड के साथ एक मस्तिष्क स्लाइस की थी। कॉन्फोकल छवियों को लिया गया था, जबकि मस्तिष्क स्लाइस को ईएलडब्ल्यूडी 20एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस (0.45 एनए) का उपयोग करके 6-वेल प्लास्टिक सेल कल्चर डिश में झिल्ली डालने पर संवर्धित किया गया था, जिसने आवश्यक अतिरिक्त कामकाजी दूरी प्रदान की थी। वॉल्यूम रेंडर को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर "अल्फा ब्लेंडिंग" का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जो एक स्पष्ट 3 डी प्रभाव देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। वीडियो प्लेयर को अपनी सामान्य धीमी गति से आगे बढ़ने की अनुमति देने के बजाय सेल आंदोलन का निरीक्षण करने के लिए वीडियो प्लेयर में वीडियो प्रगति स्लाइडर को मैन्युअल रूप से आगे और पीछे खींचकर वीडियो को सबसे अच्छा देखा जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 8: वॉल्यूम का वीडियो लाइव जीएससी और जीबीएम कोशिकाओं के कॉन्फोकल 4 डी टाइम-लैप्स की छवियों को प्रस्तुत करता है। वीडियो चित्रा 6 बी से मेल खाती है। कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों को 20 घंटे की अवधि में हर 10 मिनट में 10 μm चरणों पर प्राप्त किया गया था। तैयारी लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं और हरे जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं के प्रत्यारोपित मिश्रित सेल स्फेरॉइड के साथ एक मस्तिष्क स्लाइस की थी। कॉन्फोकल छवियों को लिया गया था, जबकि मस्तिष्क स्लाइस को ईएलडब्ल्यूडी 20एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस (0.45 एनए) का उपयोग करके 6-वेल प्लास्टिक सेल कल्चर डिश में झिल्ली डालने पर संवर्धित किया गया था, जिसने आवश्यक अतिरिक्त कामकाजी दूरी प्रदान की थी। वॉल्यूम रेंडर को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर "अल्फा ब्लेंडिंग" का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जो एक स्पष्ट 3 डी प्रभाव देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। वीडियो प्लेयर को अपनी सामान्य धीमी गति से आगे बढ़ने की अनुमति देने के बजाय सेल आंदोलन का निरीक्षण करने के लिए वीडियो प्लेयर में वीडियो प्रगति स्लाइडर को मैन्युअल रूप से आगे और पीछे खींचकर वीडियो को सबसे अच्छा देखा जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 9: वॉल्यूम का वीडियो लाइव जीएससी और जीबीएम कोशिकाओं के कॉन्फोकल 4 डी टाइम-लैप्स की छवियों को प्रस्तुत करता है। वीडियो चित्रा 6 सी से मेल खाती है। कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों को 20 घंटे की अवधि में हर 10 मिनट में 10 μm चरणों पर प्राप्त किया गया था। तैयारी लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं और हरे जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं के प्रत्यारोपित मिश्रित सेल स्फेरॉइड के साथ एक मस्तिष्क स्लाइस की थी। कॉन्फोकल छवियों को लिया गया था, जबकि मस्तिष्क स्लाइस को ईएलडब्ल्यूडी 20एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस (0.45 एनए) का उपयोग करके 6-वेल प्लास्टिक सेल कल्चर डिश में झिल्ली डालने पर संवर्धित किया गया था, जिसने आवश्यक अतिरिक्त कामकाजी दूरी प्रदान की थी। वॉल्यूम रेंडर को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर "अल्फा ब्लेंडिंग" का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जो एक स्पष्ट 3 डी प्रभाव देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। वीडियो प्लेयर को अपनी सामान्य धीमी गति से आगे बढ़ने की अनुमति देने के बजाय सेल आंदोलन का निरीक्षण करने के लिए वीडियो प्लेयर में वीडियो प्रगति स्लाइडर को मैन्युअल रूप से आगे और पीछे खींचकर वीडियो को सबसे अच्छा देखा जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 10: वॉल्यूम का वीडियो लाइव जीएससी और जीबीएम कोशिकाओं के कॉन्फोकल 4 डी टाइम-लैप्स की छवियों को प्रस्तुत करता है। वीडियो चित्रा 6 डी से मेल खाती है। कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों को 20 घंटे की अवधि में हर 10 मिनट में 10 μm चरणों पर प्राप्त किया गया था। तैयारी लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं और हरे जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं के प्रत्यारोपित मिश्रित सेल स्फेरॉइड के साथ एक मस्तिष्क स्लाइस की थी। कॉन्फोकल छवियों को लिया गया था, जबकि मस्तिष्क स्लाइस को ईएलडब्ल्यूडी 20एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस (0.45 एनए) का उपयोग करके 6-वेल प्लास्टिक सेल कल्चर डिश में झिल्ली डालने पर संवर्धित किया गया था, जिसने आवश्यक अतिरिक्त कामकाजी दूरी प्रदान की थी। वॉल्यूम रेंडर को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर "अल्फा ब्लेंडिंग" का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जो एक स्पष्ट 3 डी प्रभाव देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। वीडियो प्लेयर को अपनी सामान्य धीमी गति से आगे बढ़ने की अनुमति देने के बजाय सेल आंदोलन का निरीक्षण करने के लिए वीडियो प्लेयर में वीडियो प्रगति स्लाइडर को मैन्युअल रूप से आगे और पीछे खींचकर वीडियो को सबसे अच्छा देखा जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 11: वॉल्यूम का वीडियो लाइव जीएससी और जीबीएम कोशिकाओं के कॉन्फोकल 4 डी टाइम-लैप्स की छवियों को प्रस्तुत करता है। वीडियो चित्रा 6 ई से मेल खाती है। कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों को 20 घंटे की अवधि में हर 10 मिनट में 10 μm चरणों पर प्राप्त किया गया था। तैयारी में लाल यू -118 / एल 1 एल ई / एमचेरी कोशिकाओं और हरे जीएससी 16-4 / जीएफपी कोशिकाओं के प्रत्यारोपित मिश्रित सेल स्फेरॉइड के साथ एक मस्तिष्क टुकड़ा शामिल था। कॉन्फोकल छवियों को लिया गया था, जबकि मस्तिष्क स्लाइस को ईएलडब्ल्यूडी 20एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस (0.45 एनए) का उपयोग करके 6-वेल प्लास्टिक सेल कल्चर डिश में झिल्ली डालने पर संवर्धित किया गया था, जिसने आवश्यक अतिरिक्त कामकाजी दूरी प्रदान की थी। वॉल्यूम रेंडर को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर "अल्फा ब्लेंडिंग" का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जो एक स्पष्ट 3 डी प्रभाव देता है। वॉल्यूम रेंडर के किनारों के साथ माइक्रोन स्केल दिखाए गए हैं। वीडियो प्लेयर को अपनी सामान्य धीमी गति से आगे बढ़ने की अनुमति देने के बजाय सेल आंदोलन का निरीक्षण करने के लिए वीडियो प्लेयर में वीडियो प्रगति स्लाइडर को मैन्युअल रूप से आगे और पीछे खींचकर वीडियो को सबसे अच्छा देखा जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

मिडब्रेन (ऑप्टिक टेक्टम) वेंट्रिकल में कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में अंडे में कोरियोलांटोइक झिल्ली में रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं पहुंचाना या इंजेक्शन से पहले और दौरान भ्रूण के आसपास शामिल नहीं है, हालांकि भ्रूण के तुरंत आसपास की एमनियन झिल्ली को धीरे से खींचा जा सकता है और कोशिकाओं को मिडब्रेन में इंजेक्ट करते समय सिर को स्थिति में रखा जा सकता है। एमनियन अपेक्षाकृत कठिन है और इसे सिर को रखने और इसे एक हाथ से स्थिर रखने के लिए ठीक बल के साथ खींचा जा सकता है, दूसरे हाथ से कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए ऑप्टिक टेक्टम में, जो मस्तिष्क के बीच में बड़ी, गोल संरचना है। आम तौर पर, अज्ञात कारकों के आधार पर इंजेक्शन वाले भ्रूण की व्यवहार्यता 25% से 75% तक होती है, और व्यावहारिक रूप से हर भ्रूण जो जीवित रहता है उसमें ऑप्टिक टेक्टम में कम से कम एक छोटा ट्यूमर होता है। व्यवहार्य मस्तिष्क स्लाइस उत्पन्न करने में महत्वपूर्ण कदमों में अतिरिक्त तरल के ऊतक को सोखना शामिल है ताकि अगारोस स्लाइस िंग के दौरान मस्तिष्क का पालन करे और झिल्ली डालने पर रखे जाने तक ऊतक और स्लाइस को ठंडा रखे। चूंकि विभिन्न सेल प्रकार अलग-अलग (गति और आकार में) स्फेरॉइड बनाते हैं, पॉली-हेमा प्लेटों पर प्लेटेड सेल घनत्व और स्फेरॉइड की कटाई से पहले समय की लंबाई को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

यहां काम मस्तिष्क स्लाइस व्यवहार्यता के औपचारिक अनुदैर्ध्य अध्ययन के अधीन नहीं है। यांग एट अल ने यहां उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान चिक भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग किया और कम से कम^{7 दिनों के} लिए स्लाइस की अच्छी व्यवहार्यता दिखाई। पिछले काम से पता चला है कि जब ओटी ऊतक को उप-मानक मीडिया में रखा गया था, तो ऊतक में कई पाइनॉटिक नाभिक दिखाई दिए, जो यहां काम में स्लाइस में नहीं हुए थे। इसके अतिरिक्त, जब स्लाइस उप-मानक परिस्थितियों में खराब हो जाते हैं, तो रक्त वाहिकाएं टुकड़े हो जाती हैं और लैमिनिन-पॉजिटिव गोले की पंक्तियों के रूप में दिखाई देती हैं (दिखाया नहीं गया है)। इस प्रकार, हालांकि यहां व्यवहार्यता को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या सक्रिय कैसपेज़ -3 अभिव्यक्ति जैसे तरीकों से जांचनहीं की गई है, कोशिका मृत्यु के संकेतकों में से कोई भी जो उप-संस्कृति स्थितियों के तहत देखा गया था, यहां दिखाई नहीं दिया।

विवो ब्रेन ट्यूमर प्रयोगों में ओटी पर ध्यान केंद्रित किया गया है क्योंकि यह सबसे बड़े वेंट्रिकल के साथ सबसे आसानी से इंजेक्शन वाला क्षेत्र है। ई 5 में, जो नवीनतम दिन है कि भ्रूण जर्दी के शीर्ष पर सुलभ रहने के लिए काफी छोटा है, इंजेक्शन को वेंट्रिकल में बनाया जाना चाहिए, क्योंकि सभी मस्तिष्क क्षेत्र एक पतले वेंट्रिकुलर क्षेत्र से ज्यादा कुछ नहीं हैं। फिर भी, इन इंजेक्शनों के परिणामस्वरूप कोशिकाओं के साथ एम्बेडेड ट्यूमर सफलतापूर्वक होते हैं जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा पर आक्रमण करते हैं। कभी-कभी, परिणामी ट्यूमर फोरब्रेन या सेरिबैलम में पाए जाते हैं, लेकिन यह आम नहीं है। ई 15 ऑप्टिक टेक्टम के एक्स विवो स्लाइस का उपयोग मुख्य रूप से यहां प्रयोगों के लिए किया गया है, ताकि पूर्व विवो सह-संस्कृति परिणामों को विवो इंजेक्शन प्रयोगों के साथ सहसंबद्ध किया जा सके। हालांकि, फोरब्रेन स्लाइस भी उपयुक्त हैं और ऑप्टिक टेक्टम की तुलना में एक बड़ा सतह क्षेत्र और एक बहुत पतला वेंट्रिकल है, जो फोरब्रेन को पूर्व विवो सह-संस्कृतियों के लिए अधिक उपयुक्त बना सकता है जो विवो इंजेक्शन में सहसंबद्ध नहीं हो रहे हैं।

यहां यह प्रदर्शित किया गया है कि विवो इंजेक्शन में, ऊतक निर्धारण, कंपन ऊतक स्लाइसर सेक्शनिंग, और लैमिनिन और अन्य मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के परिणामस्वरूप, रक्त वाहिकाओं के करीब मस्तिष्क के ऊतकों में जीबीएम कोशिकाओं और जीएससी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां हुईं। ट्यूमर कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं के बीच अंतर्संबंधों को निर्धारित करने की क्षमता को कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर और निर्माता के निर्देशों का उपयोग करके कॉन्फोकल ऑप्टिकल वर्गों के जेड-स्टैक्स से 3 डी वॉल्यूम रेंडर बनाकर बहुत सुविधाजनक बनाया गया था। जीएफपी, एमचेरी और डीआईडी लेबल कोशिकाओं के वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग संभव थी; हालांकि, माइग्रेटिंग कोशिकाएं जो अत्यधिक फ्लोरोसेंट स्फेरॉइड के करीब थीं, कभी-कभी स्फेरॉइड से "चमक" से अस्पष्ट थीं। वाइडफील्ड छवियों को इकट्ठा करने के लिए एक्सपोजर समय को सावधानीपूर्वक समायोजित करके इस अवांछित प्रभाव को कुछ हद तक कम किया जा सकता है। समय के साथ कॉन्फोकल जेड-स्टैक्स (4 डी) का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग ने स्फेरॉइड से आउट-ऑफ-फोकस चमक को समाप्त कर दिया और इसके परिणामस्वरूप अंधेरे पृष्ठभूमि के साथ तेजी से परिभाषित माइग्रेटिंग कोशिकाएं हुईं। यह प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया गया था, लेकिन वाइडफील्ड टाइम-लैप्स इमेजिंग के समान किया गया था, जो तब किया गया था जब मस्तिष्क के स्लाइस 6-वेल प्लास्टिक प्लेट में पारदर्शी झिल्ली सम्मिलित पर थे। यद्यपि कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग के परिणामस्वरूप व्यक्तिगत कोशिकाओं और उनके व्यवहार की स्पष्ट रूप से स्पष्ट छवियां होती हैं, लेकिन 20 घंटे की अवधि में 10 मिनट के अंतराल पर 10 जेड-प्लेन / पॉइंट के जेड-स्टैक एकत्र करने वाला एक बहु-बिंदु टाइम-लैप्स प्रयोग, स्कैन हेड गैल्वेनोमीटर का व्यापक उपयोग है। चूंकि यह गैल्वेनोमीटर के जीवनकाल को काफी कम कर सकता है, इसलिए इस विधि का उपयोग विवेकपूर्ण रूप से किया जाता है।

यद्यपि चूजा भ्रूण प्रणाली विवो इंजेक्शन और पूर्व विवो सह-संस्कृति प्रयोगों दोनों के लिए बहुत उपयुक्त है जो जीबीएम सेल व्यवहार की जांच करते हैं, इस मॉडल प्रणाली की कई सीमाएं हैं। किसी भी जेनोग्राफ्ट सिस्टम के साथ, जिस वातावरण में मानव कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया जाता है वह मानव मस्तिष्क नहीं है, लेकिन जीबीएम सेल व्यवहार कृंतक मॉडल और मानव रोगियों में इसकी नकल करता प्रतीत होता है। ई 5 पर विवो इंजेक्शन प्रयोगों में प्रदर्शन करने के बाद, ट्यूमर को आम तौर पर ई 15 तक 10 दिनों के लिए बनने की अनुमति दी जाती है। यह स्पष्ट रूप से ट्यूमरजेनिसिस और सेल आक्रमण के सभी पहलुओं का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त समय नहीं है। हालांकि, यहां यह प्रदर्शित किया गया है कि मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ठोस ट्यूमर बनते हैं, कोशिकाएं ट्यूमर के भीतर खुद को बातचीत और पुनर्व्यवस्थित करती हैं, और महत्वपूर्ण मस्तिष्क आक्रमण रक्त वाहिकाओं के साथ और इस अपेक्षाकृत कम समय अवधि के भीतर फैलता है। विवो चिक भ्रूण प्रणाली में एक और सीमा यह है कि यह बड़ी जर्दी और एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक संचार प्रणाली के कारण दवा या अन्य उपचारों के लिए उपयुक्त नहीं है जो चूजे के भ्रूण के विकास के दौरान संचालित होता है। सामयिक तरल दवा उपचार के परिणामस्वरूप भ्रूण से बहुत बड़े जर्दी द्रव्यमान में प्रसार के कारण मस्तिष्क में अत्यधिक परिवर्तनशील और अज्ञात एकाग्रता होगी। इसी तरह, बहुत नाजुक एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक संचार प्रणाली में दवाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन रक्त वाहिकाओं से लीक या फैल जाएंगे और इसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क में अज्ञात सांद्रता भी होगी। यह मुख्य कारणों में से एक है कि एक्स विवो स्लाइस कल्चर विधि को अपनाया गया था- ताकि न केवल सेल व्यवहार को टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा और ट्रैक किया जा सके, बल्कि यह भी कि डिश⁴ में जीबीएम सेल व्यवहार को बदलने में सफल रहे उपचारों को अधिक प्रासंगिक मस्तिष्क ऊतक वातावरण में परीक्षण किया जा सके।

चूजा भ्रूण ऑर्थोटोपिक ब्रेन ट्यूमर मॉडल सिस्टम के विकास को जीबीएम ट्यूमर गठन और आक्रामक सेल व्यवहार के अध्ययन के लिए उपलब्ध प्रणालियों और उपकरणों के लिए एक महत्वपूर्ण अतिरिक्त के रूप में देखा जाता है। अधिकांश क्षेत्रों में निषेचित चिकन अंडे आसानी से उपलब्ध होने की संभावना है, वे कृन्तकों की तुलना में सस्ती हैं, कोई पशु देखभाल लागत नहीं है, भ्रूण बहुत लचीला और संक्रमण के लिए प्रतिरोधी हैं (यानी, अधिकांश काम बेंच टॉप पर किया जाता है), भ्रूण अत्यधिक मैनिपुलेबल होते हैं और शेल-लेस कल्चर¹⁹ में उगाए जा सकते हैं, और चूजे के भ्रूण को कशेरुक जानवर नहीं माना जाता है और इसलिए एनआईएच दिशानिर्देशों (संस्थागत आवश्यकताओं) द्वारा आईएसीयूसी अनुमोदन की आवश्यकता नहीं होती है। भिन्न हो सकते हैं)। इस प्रकार, ये कई फायदे चूजा भ्रूण प्रणाली को बहुत आकर्षक बनाते हैं यदि कोई अपने प्रश्नों और प्रयोगों को उन लोगों तक सीमित करता है जो इसकी सीमाओं के भीतर आते हैं। चूजे के भ्रूण का उपयोग करके दूसरों द्वारा कई जीबीएम सेल अध्ययन किए गए हैं, लेकिन ये लगभग विशेष रूप से भ्रूण 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 और अंग कली ³⁰ के कोरियोलांटोइक झिल्ली (सीएएम) का उपयोग करते हैं।और मस्तिष्क नहीं। ई 2³¹ पर चूजे के मस्तिष्क में मेडुलोब्लास्टोमा प्रत्यारोपित करने की भी रिपोर्ट आई है। निस्संदेह, एक ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट मॉडल सिस्टम के रूप में चूजे के भ्रूण का उपयोग, जैसा कि यहां वर्णित है, ऐसे परिणाम प्राप्त करना चाहिए जो सीएएम का उपयोग करने वाले अध्ययनों की तुलना में मानव जीबीएम ट्यूमर जीव विज्ञान के लिए अधिक सार्थक हैं।

यद्यपि इन अध्ययनों ने केवल मानव जीबीएम सेल और जीएससी व्यवहार के अध्ययन के लिए चूजा भ्रूण मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल प्रणाली का पूरी तरह से उपयोग करना शुरू कर दिया है, यह आशा की जाती है कि अन्य उपयोग का विस्तार करेंगे और आगे संभावित अनुप्रयोग पाएंगे। कोई कल्पना कर सकता है कि न केवल यह प्रणाली जीबीएम ट्यूमर गठन और सेल व्यवहार को विनियमित करने वाले तंत्र को उजागर करेगी, बल्कि विशिष्ट रोगियों की कोशिकाओं पर विशिष्ट दवाओं और पदार्थों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण की भी अनुमति देगी। उदाहरण के लिए, यदि मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों को पहले से स्थापित किया गया था, तो ट्यूमर कोशिकाओं, सर्जिकल ट्यूमर रिसेक्शन के टुकड़े, या रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम ऑर्गेनोइड्स³² को सीधे पूर्व विवो सह-संस्कृति में रखा जा सकता है, और कुछ ही दिनों में विभिन्न उपचारों का आकलन किया जा सकता है। इसी तरह, अलग रोगी कोशिकाओं को ट्यूमर बनाने और मस्तिष्क पैरेन्काइमा पर आक्रमण करने की उनकी क्षमता का आकलन करने के लिए ओवो में ई 5 मिडब्रेन में सीधे इंजेक्ट किया जा सकता है। इस प्रकार, यह आशा की जाती है कि यहां विधियों और प्रतिनिधि परिणामों का विवरण मस्तिष्क कैंसर अनुसंधान के लिए इस अत्यधिक अप्रयुक्त प्रणाली के बढ़ते उपयोग को सुविधाजनक और प्रोत्साहित करेगा।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cm x 1 cm square hole paper punch	Birabira	N/A
1 mm biopsy punch pen	Robbins Instruments	20335
6 well insert plate (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9" Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20C
15 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-12
24 well plate	Corning Costar	3526
50 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	for embedding fixed brains
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-146
Aluminum foil	ReynoldsWrap	N/A
Ampicillin	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127	Santa Cruz Biotechnology	sc-53386
anti-laminin monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	3H11
anti-nestin monoclonal antibody 10c2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 supplement without vitamin A	GIBCO	17504-044
bisbenzimide (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	nuclear stain
Cell culture incubator	Forma		standard humidified CO2 incubator
Centrifuge	Beckman Coulter
Confocal microscope	Nikon Instruments	C2si+	With custom-made cell incubator chamber
Confocal microscope objective lenses	Nikon Instruments		Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging
Confocal microscope software	Nikon Instruments	NIS Elements	Version 5.2
Curved foreceps	World Precision Intruments	504478
Curved scissors	Fine Science Tools
Curved spatula	Fisher Scientific	14-375-20
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270
DiD far red fluorescent dye	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
egg incubator	Humidaire
electrical tape (10 mil thick/254 µm)	Scotch	N/A
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fast green FCF dye	Avocado Research Chemicals	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
filter paper	Fisher Scientific
Gauze	Dynarex	3353
Glass Capillaries for microinjection	World Precision Instruments	TW100-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP228-1	for mounting media
GSCs (human glioblastoma stem cells)	Not applicable		Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector.  Cells used were between passage 10 and 30.
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometer	Hausser scientific
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
HEPES buffer	Sigma Aldrich	H0887
Horse Serum (HI)	Gibco	26050-088
Human FGF-2	BioVision	4037-1000
Human TGF-α	BioVision	4339-1000
Inverted phase contrast microscope	Nikon Instruments	TMS	for routine viewing of cultured cells
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Laboratory film	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pen:Strep	Gemini Bio-products	400-110
Low-melt agarose	Fisher Scientific	BP1360	for embedding live brains
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metal vibratome block
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL)	Fisherbrand
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL)	Gilson
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH2PO4 + H2O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
Normal goat serum	Millipore Sigma	526-M
N-propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130	for mounting media
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pencil
Plain Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3
Plastic 35 mm Petri dish	Becton Dickinson	351008
pneumatic picopump	World Precision Intruments	PV830
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)  (poly-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
razor blade- double edge	PACE		for cutting fixed brain slices
sapphire knife	Delaware Diamond Knives		for cutting live brain slices
Scalpel	TruMed	1001
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11652
Specimen chamber for vibratome	custom-made
Stereo Dissecting Microscope	Nikon Instruments	SMZ1500	Equipped with epifluorescence
straight foreceps	World Precision Intruments	500233
straight scissors	Fine Science Tools
Sucrose	Mallinckrodt	7723
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence)	Nikon Instruments	TE2000-E	With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006)
Tissue culture dish polystyrene 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	for cell culturing
Tissue culture dish polystyrene 60 mm	Becton Dickinson	353004	for cell culturing
Transfer pipette	American Central Scientific Co.	FFP011
Transparent tape	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG human GBM cell line	ATCC	HTB-15	Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry.  Passage numbers are unknown.
Vacuum pump	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Vibrating tissue slicer	Vibratome	3000	for cutting live and fixed brain slices