चूजा भ्रूण का उपयोग ओवो में मानव ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) मस्तिष्क ट्यूमर और पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस सह-संस्कृतियों में अध्ययन के लिए किया जाता है। जीबीएम सेल व्यवहार को एक्स विवो सह-संस्कृतियों में टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज किया जा सकता है, और दोनों तैयारियों का विश्लेषण प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर विस्तृत 3 डी कॉन्फोकल विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है।
चूजा भ्रूण कशेरुक विकास के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली रही है, विशेष रूप से प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए। चूजे के भ्रूण का उपयोग विवो में मानव ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) मस्तिष्क ट्यूमर के गठन और आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों में ट्यूमर कोशिकाओं की आक्रामकता का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया गया है। जीबीएम ट्यूमर ओवो में ई 5 मिडब्रेन (ऑप्टिक टेक्टम) वेंट्रिकल में फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं के निलंबन के इंजेक्शन से बन सकता है।
जीबीएम कोशिकाओं के आधार पर, कॉम्पैक्ट ट्यूमर यादृच्छिक रूप से वेंट्रिकल में और मस्तिष्क की दीवार के भीतर बनते हैं, और कोशिकाओं के समूह मस्तिष्क की दीवार के ऊतकों पर आक्रमण करते हैं। ट्यूमर के साथ निश्चित ई 15 टेक्टा के मोटे ऊतक खंड (350 μm) को यह प्रकट करने के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया जा सकता है कि हमलावर कोशिकाएं अक्सर रक्त वाहिकाओं के साथ पलायन करती हैं जब कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों के 3 डी पुनर्निर्माण द्वारा विश्लेषण किया जाता है। लाइव ई 15 मिडब्रेन और फोरब्रेन स्लाइस (250-350 μm) को झिल्ली डालने पर सुसंस्कृत किया जा सकता है, जहां फ्लोरोसेंटली लेबल वाले जीबीएम कोशिकाओं को गैर-यादृच्छिक स्थानों में पेश किया जा सकता है ताकि सेल आक्रमण का विश्लेषण करने के लिए पूर्व विवो सह-संस्कृतियों को प्रदान किया जा सके, जो लगभग 1 सप्ताह की अवधि में रक्त वाहिकाओं के साथ भी हो सकता है। लाइव सेल व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए इन पूर्व विवो सह-संस्कृतियों की निगरानी वाइडफील्ड या कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी द्वारा की जा सकती है।
सह-सुसंस्कृत स्लाइस को तब कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा तय, इम्यूनोस्टेन्ड और विश्लेषण किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि आक्रमण रक्त वाहिकाओं या अक्षतंतु के साथ हुआ है या नहीं। इसके अतिरिक्त, सह-संस्कृति प्रणाली का उपयोग विभिन्न सटीक स्थानों में विभिन्न सेल प्रकारों और रंगों के समुच्चय रखकर और सेल आंदोलनों का अवलोकन करके संभावित सेल-सेल इंटरैक्शन की जांच के लिए किया जा सकता है। दवा उपचार पूर्व विवो संस्कृतियों पर किया जा सकता है, जबकि ये उपचार इन ओवो सिस्टम के साथ संगत नहीं हैं। ये दो पूरक दृष्टिकोण मानव जीबीएम सेल व्यवहार और अत्यधिक मैनिपुलेबल कशेरुक मस्तिष्क वातावरण में ट्यूमर गठन के विस्तृत और सटीक विश्लेषण की अनुमति देते हैं।
कैंसर सेल व्यवहार के इन विट्रो अध्ययन का उपयोग अक्सर संभावित तंत्रों को विच्छेदित करने के लिए किया जाता है जो विवो जेनोग्राफ्ट मॉडल में ट्यूमर गठन और सेल आक्रमण के दौरान देखे जाने वाले अधिक जटिल व्यवहार के दौरान काम करते हैं। उदाहरण के लिए, ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) के साथ, इन विट्रो अध्ययनों ने तंत्र को उजागर किया है कि एल 1 सीएएम संभावित रूप से एक नए चूजे भ्रूण जेनोग्राफ्ट ब्रेन ट्यूमर मॉडल 1,2,3,4,5 में ट्यूमर गठन और मस्तिष्क आक्रमण के दौरान कैसे संचालित होता है। यद्यपि इन विट्रो और विवो प्रयोगों में उपयोगी तरीकों से एक-दूसरे के पूरक हैं, वे परिणामों को सहसंबद्ध करने में पर्याप्त अंतर छोड़ते हैं। उदाहरण के लिए, एक डिश पर जीबीएम सेल गतिशीलता का यंत्रवत विश्लेषण एक अत्यधिक कृत्रिम स्थिति है, और विवो जेनोग्राफ्ट मॉडल में केवल ट्यूमर गठन और सेल व्यवहार के स्थिर समय बिंदु या समापन बिंदु विश्लेषण प्रकट हो सकते हैं। विवो अध्ययनों में, या तो कृन्तकों या चूजे के भ्रूण का उपयोग करके आसानी से सेल व्यवहार की निगरानी के लिए खुद को उधार नहीं देते हैं, जबकि कोशिकाएं इन जेनोग्राफ्ट मॉडल में मस्तिष्क के ऊतकों पर आक्रमण करती हैं। फिर भी, चूजा भ्रूण जेनोग्राफ्ट मॉडल ने प्रदर्शित किया है कि आसंजन प्रोटीन एल 1 सीएएम मानव टी 9 8 जी जीबीएम कोशिकाओं 2,5 की आक्रामक क्षमता में उत्तेजक भूमिका निभाता है।
इस समस्या का एक उपयुक्त समाधान एक ऑर्गेनोटाइपिक ब्रेन स्लाइस कल्चर मॉडल का उपयोग करके विवो और इन विट्रो दोनों तरीकों में ब्रिजिंग करके पहुंचा जा सकता है, जिसे एक्स विवो मॉडल के रूप में जाना जाता है। इस पूर्व विवो मॉडल में, जीवित मस्तिष्क ऊतक को कुछ हफ्तों तक कई सौ माइक्रोन की मोटाई पर बनाए रखा जा सकता है, जिससे कैंसर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना, समय के साथ वास्तविक ऊतक में उनके व्यवहार का निरीक्षण करना और फिर प्रयोग के समापन बिंदु पर अधिक विस्तृत मार्कर विश्लेषण करना संभव हो जाता है।
एक लोकप्रिय ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस कल्चर विधि एक पारभासी या पारदर्शी छिद्रपूर्ण झिल्ली के शीर्ष पर कई सौ माइक्रोन-मोटी मस्तिष्क स्लाइस को कल्चर करने के लिए है, जिससे ऊतक हवा के संपर्क में आ जाता है, फिर भी पोषक तत्व मीडिया को झिल्ली के नीचे से ऊतक को बनाए रखने की अनुमति मिलती है (स्टॉपिनी एट अल 6 देखें)। इस विधि के विभिन्न रूपों का उपयोग विभिन्न अध्ययनों के लिए किया गया है, जिसमें विभिन्न मीडिया या विभिन्न झिल्ली आवेषण का उपयोग करना शामिल है। विभिन्न झिल्ली आवेषण में 30 मिमी व्यास, छिद्रपूर्ण (0.4 μm) झिल्ली 35 मिमी कल्चर डिश 6 में सम्मिलित होती है, और6-वेल प्लेटों 7 के लिए सेल कल्चर इंसर्ट (0.4 μm)शामिल होती है। विभिन्न मीडिया में 50% एमईएम / एचईपीईएस + 25% गर्मी-निष्क्रिय घोड़े सीरम + 25% हैंक्स संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) 8, 50% कम सीरम मीडिया + 25% घोड़े सीरम + 25% एचबीएसएस9, साथ ही अन्य शामिल हैं। यदि फ्लोरोसेंटली लेबल जीबीएम कोशिकाओं के साथ एक पारभासी या पारदर्शी झिल्ली का उपयोग किया जाता है, तो ऐसी संस्कृतियों को उल्टे वाइडफील्ड या कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप10,11,12,13,14,15 का उपयोग करके नीचे से चित्रित किया जा सकता है।
जबकि विवो ऑर्थोटोपिक ब्रेन ट्यूमर जेनोग्राफ्ट और एक्स विवो ऑर्गेनोटाइपिक ब्रेन स्लाइस कल्चर मॉडल में कई कृन्तकों का उपयोग करके स्थापित किए गए हैं, जैसा कि ऊपर उद्धृत किया गया है, चूजा भ्रूण (गैलस गैलस) को इन उद्देश्यों के लिए कम उपयोग किया गया है। हालांकि, चूजे के भ्रूण को मानव और चूहे के ग्लियोमा आक्रमण 1,2,5 दोनों के अध्ययन के लिए विवो ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट मॉडल के रूप में उपयोग करने में सक्षम दिखाया गया है। चूजे के भ्रूण के दिमाग में जेनोग्राफ्ड कोशिकाओं ने कृंतक मॉडल में देखे गए आक्रमण पैटर्न का प्रदर्शन किया है, जो जीबीएम ट्यूमर सेल विश्लेषण के लिए विवो मॉडल के रूप में चूजे के भ्रूण के उपयोग का समर्थन करता है। चूजा भ्रूण भी सस्ती हैं, कृन्तकों की तुलना में अधिक आसानी से बनाए रखा जा सकता है (यानी, एक प्रयोगशाला इनक्यूबेटर में उनके अंडे के छिलके में), और उनके साथ काम करना बहुत आसान है, जिससे उन्हें विवो जीबीएम अध्ययनों में अल्पकालिक के लिए एक आकर्षक विकल्प बना दिया जाता है। एक हालिया लेख ने सामान्य मस्तिष्क विकास के दौरान अक्षतंतु के गठन और विकास के लिए चूजे के भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग का वर्णन किया है जहां स्लाइस कम से कम7 दिनों के लिए व्यवहार्य थे। हालांकि, ऊतक वातावरण में जीबीएम सेल व्यवहार के पूर्व विवो विश्लेषण के लिए ऐसे चिक भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों के उपयोग की कमी है। इस लेख में, विवो में प्रारंभिक चूजा भ्रूण मस्तिष्क में मानव जीबीएम कोशिकाओं और जीबीएम स्टेम कोशिकाओं (जीएससी) के प्रत्यारोपण के साथ-साथ जीवित चूजा भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों पर जीबीएम कोशिकाओं की शुरूआत दोनों का वर्णन किया गया है। इन तैयारियों से प्राप्त परिणामी ट्यूमर और सेल आक्रमण पैटर्न के कुछ प्रतिनिधि उदाहरण भी प्रदान किए गए हैं।
मिडब्रेन (ऑप्टिक टेक्टम) वेंट्रिकल में कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में अंडे में कोरियोलांटोइक झिल्ली में रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं पहुंचाना या इंजेक्शन से पहले और दौरान भ्रूण के आसपास शामिल नहीं है, हालांकि भ्रूण के तुरंत आसपास की एमनियन झिल्ली को धीरे से खींचा जा सकता है और कोशिकाओं को मिडब्रेन में इंजेक्ट करते समय सिर को स्थिति में रखा जा सकता है। एमनियन अपेक्षाकृत कठिन है और इसे सिर को रखने और इसे एक हाथ से स्थिर रखने के लिए ठीक बल के साथ खींचा जा सकता है, दूसरे हाथ से कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए ऑप्टिक टेक्टम में, जो मस्तिष्क के बीच में बड़ी, गोल संरचना है। आम तौर पर, अज्ञात कारकों के आधार पर इंजेक्शन वाले भ्रूण की व्यवहार्यता 25% से 75% तक होती है, और व्यावहारिक रूप से हर भ्रूण जो जीवित रहता है उसमें ऑप्टिक टेक्टम में कम से कम एक छोटा ट्यूमर होता है। व्यवहार्य मस्तिष्क स्लाइस उत्पन्न करने में महत्वपूर्ण कदमों में अतिरिक्त तरल के ऊतक को सोखना शामिल है ताकि अगारोस स्लाइस िंग के दौरान मस्तिष्क का पालन करे और झिल्ली डालने पर रखे जाने तक ऊतक और स्लाइस को ठंडा रखे। चूंकि विभिन्न सेल प्रकार अलग-अलग (गति और आकार में) स्फेरॉइड बनाते हैं, पॉली-हेमा प्लेटों पर प्लेटेड सेल घनत्व और स्फेरॉइड की कटाई से पहले समय की लंबाई को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
यहां काम मस्तिष्क स्लाइस व्यवहार्यता के औपचारिक अनुदैर्ध्य अध्ययन के अधीन नहीं है। यांग एट अल ने यहां उपयोग किए जाने वाले लोगों के समान चिक भ्रूण मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों का उपयोग किया और कम से कम7 दिनों के लिए स्लाइस की अच्छी व्यवहार्यता दिखाई। पिछले काम से पता चला है कि जब ओटी ऊतक को उप-मानक मीडिया में रखा गया था, तो ऊतक में कई पाइनॉटिक नाभिक दिखाई दिए, जो यहां काम में स्लाइस में नहीं हुए थे। इसके अतिरिक्त, जब स्लाइस उप-मानक परिस्थितियों में खराब हो जाते हैं, तो रक्त वाहिकाएं टुकड़े हो जाती हैं और लैमिनिन-पॉजिटिव गोले की पंक्तियों के रूप में दिखाई देती हैं (दिखाया नहीं गया है)। इस प्रकार, हालांकि यहां व्यवहार्यता को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या सक्रिय कैसपेज़ -3 अभिव्यक्ति जैसे तरीकों से जांचनहीं की गई है, कोशिका मृत्यु के संकेतकों में से कोई भी जो उप-संस्कृति स्थितियों के तहत देखा गया था, यहां दिखाई नहीं दिया।
विवो ब्रेन ट्यूमर प्रयोगों में ओटी पर ध्यान केंद्रित किया गया है क्योंकि यह सबसे बड़े वेंट्रिकल के साथ सबसे आसानी से इंजेक्शन वाला क्षेत्र है। ई 5 में, जो नवीनतम दिन है कि भ्रूण जर्दी के शीर्ष पर सुलभ रहने के लिए काफी छोटा है, इंजेक्शन को वेंट्रिकल में बनाया जाना चाहिए, क्योंकि सभी मस्तिष्क क्षेत्र एक पतले वेंट्रिकुलर क्षेत्र से ज्यादा कुछ नहीं हैं। फिर भी, इन इंजेक्शनों के परिणामस्वरूप कोशिकाओं के साथ एम्बेडेड ट्यूमर सफलतापूर्वक होते हैं जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा पर आक्रमण करते हैं। कभी-कभी, परिणामी ट्यूमर फोरब्रेन या सेरिबैलम में पाए जाते हैं, लेकिन यह आम नहीं है। ई 15 ऑप्टिक टेक्टम के एक्स विवो स्लाइस का उपयोग मुख्य रूप से यहां प्रयोगों के लिए किया गया है, ताकि पूर्व विवो सह-संस्कृति परिणामों को विवो इंजेक्शन प्रयोगों के साथ सहसंबद्ध किया जा सके। हालांकि, फोरब्रेन स्लाइस भी उपयुक्त हैं और ऑप्टिक टेक्टम की तुलना में एक बड़ा सतह क्षेत्र और एक बहुत पतला वेंट्रिकल है, जो फोरब्रेन को पूर्व विवो सह-संस्कृतियों के लिए अधिक उपयुक्त बना सकता है जो विवो इंजेक्शन में सहसंबद्ध नहीं हो रहे हैं।
यहां यह प्रदर्शित किया गया है कि विवो इंजेक्शन में, ऊतक निर्धारण, कंपन ऊतक स्लाइसर सेक्शनिंग, और लैमिनिन और अन्य मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग के परिणामस्वरूप, रक्त वाहिकाओं के करीब मस्तिष्क के ऊतकों में जीबीएम कोशिकाओं और जीएससी की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां हुईं। ट्यूमर कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं के बीच अंतर्संबंधों को निर्धारित करने की क्षमता को कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर और निर्माता के निर्देशों का उपयोग करके कॉन्फोकल ऑप्टिकल वर्गों के जेड-स्टैक्स से 3 डी वॉल्यूम रेंडर बनाकर बहुत सुविधाजनक बनाया गया था। जीएफपी, एमचेरी और डीआईडी लेबल कोशिकाओं के वाइडफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग संभव थी; हालांकि, माइग्रेटिंग कोशिकाएं जो अत्यधिक फ्लोरोसेंट स्फेरॉइड के करीब थीं, कभी-कभी स्फेरॉइड से “चमक” से अस्पष्ट थीं। वाइडफील्ड छवियों को इकट्ठा करने के लिए एक्सपोजर समय को सावधानीपूर्वक समायोजित करके इस अवांछित प्रभाव को कुछ हद तक कम किया जा सकता है। समय के साथ कॉन्फोकल जेड-स्टैक्स (4 डी) का उपयोग करके टाइम-लैप्स इमेजिंग ने स्फेरॉइड से आउट-ऑफ-फोकस चमक को समाप्त कर दिया और इसके परिणामस्वरूप अंधेरे पृष्ठभूमि के साथ तेजी से परिभाषित माइग्रेटिंग कोशिकाएं हुईं। यह प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया गया था, लेकिन वाइडफील्ड टाइम-लैप्स इमेजिंग के समान किया गया था, जो तब किया गया था जब मस्तिष्क के स्लाइस 6-वेल प्लास्टिक प्लेट में पारदर्शी झिल्ली सम्मिलित पर थे। यद्यपि कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग के परिणामस्वरूप व्यक्तिगत कोशिकाओं और उनके व्यवहार की स्पष्ट रूप से स्पष्ट छवियां होती हैं, लेकिन 20 घंटे की अवधि में 10 मिनट के अंतराल पर 10 जेड-प्लेन / पॉइंट के जेड-स्टैक एकत्र करने वाला एक बहु-बिंदु टाइम-लैप्स प्रयोग, स्कैन हेड गैल्वेनोमीटर का व्यापक उपयोग है। चूंकि यह गैल्वेनोमीटर के जीवनकाल को काफी कम कर सकता है, इसलिए इस विधि का उपयोग विवेकपूर्ण रूप से किया जाता है।
यद्यपि चूजा भ्रूण प्रणाली विवो इंजेक्शन और पूर्व विवो सह-संस्कृति प्रयोगों दोनों के लिए बहुत उपयुक्त है जो जीबीएम सेल व्यवहार की जांच करते हैं, इस मॉडल प्रणाली की कई सीमाएं हैं। किसी भी जेनोग्राफ्ट सिस्टम के साथ, जिस वातावरण में मानव कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया जाता है वह मानव मस्तिष्क नहीं है, लेकिन जीबीएम सेल व्यवहार कृंतक मॉडल और मानव रोगियों में इसकी नकल करता प्रतीत होता है। ई 5 पर विवो इंजेक्शन प्रयोगों में प्रदर्शन करने के बाद, ट्यूमर को आम तौर पर ई 15 तक 10 दिनों के लिए बनने की अनुमति दी जाती है। यह स्पष्ट रूप से ट्यूमरजेनिसिस और सेल आक्रमण के सभी पहलुओं का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त समय नहीं है। हालांकि, यहां यह प्रदर्शित किया गया है कि मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ठोस ट्यूमर बनते हैं, कोशिकाएं ट्यूमर के भीतर खुद को बातचीत और पुनर्व्यवस्थित करती हैं, और महत्वपूर्ण मस्तिष्क आक्रमण रक्त वाहिकाओं के साथ और इस अपेक्षाकृत कम समय अवधि के भीतर फैलता है। विवो चिक भ्रूण प्रणाली में एक और सीमा यह है कि यह बड़ी जर्दी और एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक संचार प्रणाली के कारण दवा या अन्य उपचारों के लिए उपयुक्त नहीं है जो चूजे के भ्रूण के विकास के दौरान संचालित होता है। सामयिक तरल दवा उपचार के परिणामस्वरूप भ्रूण से बहुत बड़े जर्दी द्रव्यमान में प्रसार के कारण मस्तिष्क में अत्यधिक परिवर्तनशील और अज्ञात एकाग्रता होगी। इसी तरह, बहुत नाजुक एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक संचार प्रणाली में दवाओं के अंतःशिरा इंजेक्शन रक्त वाहिकाओं से लीक या फैल जाएंगे और इसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क में अज्ञात सांद्रता भी होगी। यह मुख्य कारणों में से एक है कि एक्स विवो स्लाइस कल्चर विधि को अपनाया गया था- ताकि न केवल सेल व्यवहार को टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा और ट्रैक किया जा सके, बल्कि यह भी कि डिश4 में जीबीएम सेल व्यवहार को बदलने में सफल रहे उपचारों को अधिक प्रासंगिक मस्तिष्क ऊतक वातावरण में परीक्षण किया जा सके।
चूजा भ्रूण ऑर्थोटोपिक ब्रेन ट्यूमर मॉडल सिस्टम के विकास को जीबीएम ट्यूमर गठन और आक्रामक सेल व्यवहार के अध्ययन के लिए उपलब्ध प्रणालियों और उपकरणों के लिए एक महत्वपूर्ण अतिरिक्त के रूप में देखा जाता है। अधिकांश क्षेत्रों में निषेचित चिकन अंडे आसानी से उपलब्ध होने की संभावना है, वे कृन्तकों की तुलना में सस्ती हैं, कोई पशु देखभाल लागत नहीं है, भ्रूण बहुत लचीला और संक्रमण के लिए प्रतिरोधी हैं (यानी, अधिकांश काम बेंच टॉप पर किया जाता है), भ्रूण अत्यधिक मैनिपुलेबल होते हैं और शेल-लेस कल्चर19 में उगाए जा सकते हैं, और चूजे के भ्रूण को कशेरुक जानवर नहीं माना जाता है और इसलिए एनआईएच दिशानिर्देशों (संस्थागत आवश्यकताओं) द्वारा आईएसीयूसी अनुमोदन की आवश्यकता नहीं होती है। भिन्न हो सकते हैं)। इस प्रकार, ये कई फायदे चूजा भ्रूण प्रणाली को बहुत आकर्षक बनाते हैं यदि कोई अपने प्रश्नों और प्रयोगों को उन लोगों तक सीमित करता है जो इसकी सीमाओं के भीतर आते हैं। चूजे के भ्रूण का उपयोग करके दूसरों द्वारा कई जीबीएम सेल अध्ययन किए गए हैं, लेकिन ये लगभग विशेष रूप से भ्रूण 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 और अंग कली 30 के कोरियोलांटोइक झिल्ली (सीएएम) का उपयोग करते हैं।और मस्तिष्क नहीं। ई 231 पर चूजे के मस्तिष्क में मेडुलोब्लास्टोमा प्रत्यारोपित करने की भी रिपोर्ट आई है। निस्संदेह, एक ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट मॉडल सिस्टम के रूप में चूजे के भ्रूण का उपयोग, जैसा कि यहां वर्णित है, ऐसे परिणाम प्राप्त करना चाहिए जो सीएएम का उपयोग करने वाले अध्ययनों की तुलना में मानव जीबीएम ट्यूमर जीव विज्ञान के लिए अधिक सार्थक हैं।
यद्यपि इन अध्ययनों ने केवल मानव जीबीएम सेल और जीएससी व्यवहार के अध्ययन के लिए चूजा भ्रूण मस्तिष्क ट्यूमर मॉडल प्रणाली का पूरी तरह से उपयोग करना शुरू कर दिया है, यह आशा की जाती है कि अन्य उपयोग का विस्तार करेंगे और आगे संभावित अनुप्रयोग पाएंगे। कोई कल्पना कर सकता है कि न केवल यह प्रणाली जीबीएम ट्यूमर गठन और सेल व्यवहार को विनियमित करने वाले तंत्र को उजागर करेगी, बल्कि विशिष्ट रोगियों की कोशिकाओं पर विशिष्ट दवाओं और पदार्थों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण की भी अनुमति देगी। उदाहरण के लिए, यदि मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों को पहले से स्थापित किया गया था, तो ट्यूमर कोशिकाओं, सर्जिकल ट्यूमर रिसेक्शन के टुकड़े, या रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम ऑर्गेनोइड्स32 को सीधे पूर्व विवो सह-संस्कृति में रखा जा सकता है, और कुछ ही दिनों में विभिन्न उपचारों का आकलन किया जा सकता है। इसी तरह, अलग रोगी कोशिकाओं को ट्यूमर बनाने और मस्तिष्क पैरेन्काइमा पर आक्रमण करने की उनकी क्षमता का आकलन करने के लिए ओवो में ई 5 मिडब्रेन में सीधे इंजेक्ट किया जा सकता है। इस प्रकार, यह आशा की जाती है कि यहां विधियों और प्रतिनिधि परिणामों का विवरण मस्तिष्क कैंसर अनुसंधान के लिए इस अत्यधिक अप्रयुक्त प्रणाली के बढ़ते उपयोग को सुविधाजनक और प्रोत्साहित करेगा।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R03CA227312) से DSG को अनुदान और लिसा डीन मोसेले फाउंडेशन से उदार अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हेलेन एफ ग्राहम कैंसर सेंटर एंड रिसर्च इंस्टीट्यूट के ऊतक खरीद केंद्र के माध्यम से रोगी की सहमति के साथ जीवित जीबीएम नमूने प्राप्त किए गए थे। एआर को फंडिंग नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्सेज और नेशनल सेंटर फॉर एडवांस्ड ट्रांसलेशनल साइंसेज, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (यूएल 1टीआर 003107) द्वारा प्रदान की गई थी। डेलावेयर अंडरग्रेजुएट रिसर्च प्रोग्राम विश्वविद्यालय द्वारा एनपी, ए.एल., जेडडब्ल्यू, और के.एस. को ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप प्रदान की गई थी।
1 cm x 1 cm square hole paper punch | Birabira | N/A | |
1 mm biopsy punch pen | Robbins Instruments | 20335 | |
6 well insert plate (Corning Transwell) | Millipore Sigma | CLS3450 | |
9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
24 well plate | Corning Costar | 3526 | |
50 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-9 | |
Agar | Fisher BioReagents | BP1423-500 | for embedding fixed brains |
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-605-146 | |
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-146 | |
Aluminum foil | ReynoldsWrap | N/A | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A-9518 | |
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19622 | |
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53386 | |
anti-laminin monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
anti-nestin monoclonal antibody 10c2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
B27 supplement without vitamin A | GIBCO | 17504-044 | |
bisbenzimide (Hoechst 33258) | Sigma-Aldrich | B2883 | nuclear stain |
Cell culture incubator | Forma | standard humidified CO2 incubator | |
Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Confocal microscope | Nikon Instruments | C2si+ | With custom-made cell incubator chamber |
Confocal microscope objective lenses | Nikon Instruments | Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging | |
Confocal microscope software | Nikon Instruments | NIS Elements | Version 5.2 |
Curved foreceps | World Precision Intruments | 504478 | |
Curved scissors | Fine Science Tools | ||
Curved spatula | Fisher Scientific | 14-375-20 | |
Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | KG-585 12R | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270 | |
DiD far red fluorescent dye | Invitrogen | V22887 | Vybrant DiD |
DMEM | Sigma Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Sigma Aldrich | D8437 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
egg incubator | Humidaire | ||
electrical tape (10 mil thick/254 µm) | Scotch | N/A | |
Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
Fast green FCF dye | Avocado Research Chemicals | 16520 | |
FBS | Gemini Bio-products | 900-108 | |
filter paper | Fisher Scientific | ||
Gauze | Dynarex | 3353 | |
Glass Capillaries for microinjection | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP228-1 | for mounting media |
GSCs (human glioblastoma stem cells) | Not applicable | Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector. Cells used were between passage 10 and 30. | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
Hemacytometer | Hausser scientific | ||
Heparin | Fisher Scientific | BP2524-100 | |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
Horse Serum (HI) | Gibco | 26050-088 | |
Human FGF-2 | BioVision | 4037-1000 | |
Human TGF-α | BioVision | 4339-1000 | |
Inverted phase contrast microscope | Nikon Instruments | TMS | for routine viewing of cultured cells |
KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
Laboratory film | Parafilm | ||
Labquake Shaker | LabIndustries | T400-110 | |
L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-products | 400-110 | |
Low-melt agarose | Fisher Scientific | BP1360 | for embedding live brains |
Matrix | Corning Matrigel | 354234 | |
Medium 199 | GIBCO | 11150-059 | |
MEM | Corning | 10-010-CV | |
Metal vibratome block | |||
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) | Fisherbrand | ||
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) | Gilson | ||
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) | Fisherbrand | 12544A | |
NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
NaH2PO4 + H2O | Fisher Scientific | S369 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | 526-M | |
N-propyl gallate | Sigma Aldrich | P3130 | for mounting media |
Parafilm | Parafilm | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
Pencil | |||
Plain Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Plastic 35 mm Petri dish | Becton Dickinson | 351008 | |
pneumatic picopump | World Precision Intruments | PV830 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | P-3932 | |
razor blade- double edge | PACE | for cutting fixed brain slices | |
sapphire knife | Delaware Diamond Knives | for cutting live brain slices | |
Scalpel | TruMed | 1001 | |
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
Specimen chamber for vibratome | custom-made | ||
Stereo Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | Equipped with epifluorescence |
straight foreceps | World Precision Intruments | 500233 | |
straight scissors | Fine Science Tools | ||
Sucrose | Mallinckrodt | 7723 | |
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) | Nikon Instruments | TE2000-E | With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006) |
Tissue culture dish polystyrene 100 mm | Thermo Fisher Scientific | 130182 | for cell culturing |
Tissue culture dish polystyrene 60 mm | Becton Dickinson | 353004 | for cell culturing |
Transfer pipette | American Central Scientific Co. | FFP011 | |
Transparent tape | Scotch | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T-8787 | |
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
U-118 MG human GBM cell line | ATCC | HTB-15 | Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry. Passage numbers are unknown. |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-07532-40 | "Air Cadet" |
Vibrating tissue slicer | Vibratome | 3000 | for cutting live and fixed brain slices |